Bioquímica Experimental

Professor Responsável: Me. Kevin Felipe Ramos

CINÉTICA ENZIMÁTICA

EMILLY SANCHEZ BARROS

LÍVIA GONZALEZ BRUNETTI
MARIA CLARA COSTA GOUVEIA

PRESIDENTE PRUDENTE
03/ ABRIL – 2023
 SUMÁRIO

INTRODUÇÃO 3
OBJETIVOS 6
PARTE EXPERIMENTAL 6
RESULTADOS E DISCUSSÃO 9
CONCLUSÕES 18
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 19
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INTRODUÇÃO

As enzimas são uma classe de proteínas que possuem um alto poder de catálise, ou
seja, atuam como catalisadores no sistema biológico favorecendo com que as reações
aconteçam de forma mais rápida possível (NELSON; COX, 2014). Sem a presença destas,
diversas reações, mesmo que termodinamicamente favoráveis, demorariam meses ou até
mesmo anos para ocorrer de forma natural, sendo então a presença das enzimas
indispensáveis para o bom funcionamento do organismo (NELSON; COX, 2014).
Como todas as enzimas são proteínas, diversas de suas propriedades são semelhantes à
última, o que significa que a desnaturação ocasiona a perda da função enzimática (NELSON;
COX, 2014). Cada enzima possui uma faixa de temperatura e pH no qual conseguem realizar
suas funções sem grandes problemas, embora do mesmo modo cada uma possua uma
temperatura e pH na qual funcionam com toda capacidade, sendo esta condição chamada de
temperatura ótima e pH ótimo (NELSON; COX, 2014). Além dos valores desta faixa, as
estruturas secundárias e terciárias das proteínas começam a sofrer alteração, perdendo sua
forma e, consequentemente, perdendo a função enzimática (NELSON; COX, 2014).
Um outro importante componente dos organismos vivos são os carboidratos, que
podem ser classificados como monossacarídeos, cuja estrutura é simples, ou como
carboidratos complexos os quais podem ser oligossacarídeos, dissacarídeos ou polissacarídeos
(TEIXEIRA, 2022). Estes, por sua vez, são constituídos por cadeias de monossacarídeos
unidas por ligações denominadas de glicosídicas (NELSON; COX, 2014).
Os carboidratos, também denominados como açúcares, podem ainda ser divididos em
redutores e não redutores. Os redutores, segundo Santos et al. (2017) podem ser descritos
como:

Açúcares redutores são carboidratos que possuem seu grupo carbonílico livre,
capazes de se oxidar na presença de agentes oxidantes em soluções alcalinas. Essa
oxidação ocorre apenas com o monossacarídeo em sua forma linear - que está em
equilíbrio com sua estrutura cíclica (SANTOS et al., 2017, p. 1).

Assim, todos os monossacarídeos e boa parte dos dissacarídeos podem ser

classificados como redutores (NELSON; COX, 2014). Por outro lado os não redutores são
aqueles que não possuem seu carbono anomérico livre, o qual em geral está envolvido na
formação das ligações glicosídicas, gerando moléculas como a sacarose, por exemplo
 4

(TEIXEIRA, 2022). Entretanto, o uso de reações de hidrólise (ocasionando a quebra da

ligação glicosídica), seja pelo emprego de enzimas seja pelo uso de reagente ácidos,
possibilita por vezes a reconstituição do carbono anomérico, fazendo assim com que açúcares
não redutores possam dar origem a açúcares redutores (TEIXEIRA, 2022).
Este é o caso da sacarose, um açúcar não redutor que sofre hidrólise dando origem a
D-glicose e a D-frutose, ambos redutores (MALDONADE; CARVALHO; FERREIRA, 2013)
como demonstrado na Figura 1:

Figura 1 - Hidrólise da sacarose gerando D-glicose e D-frutose

Fonte: Moura et al. (2014)

Assim, após esta reação é possível a obtenção de produtos redutores os quais podem
ser empregados em testes para a quantificação da quantidade de açúcar presente na amostra
(TEIXEIRA, 2022).
Um dos métodos mais amplamente utilizados é o de Miller (1959), no qual o reagente
ácido 3,5-dinitro-salicílico (DNS) sofre redução pelos açúcares em meio alcalino gerando o
ácido 3-amino-5-nitrosalicílico, de coloração alaranjada.
 5

Figura 2 - Processo reacional do método utilizando DNS.

Fonte: Maldonade, Carvalho e Ferreira (2013)

Deste modo, o reagente DNS, de cor amarela, pode ser classificado como um agente
oxidante que, quando exposto a meio alcalino, reage diretamente com o carbono anomérico
(com o grupamento carbonílico) da D-glicose e da D-frutose, sendo assim reduzido a ácido
3-amino-5-nitrosalicílico, de coloração laranja, o qual possui absorção máxima de 540 nm
(Santos, A. A. et al., 2017).
Considerando isso, o presente relatório tem como objetivo a observação e análise de
como as alterações de tempo, temperatura e pH reacional influenciam no funcionamento da
enzima Invertase, a qual realiza a hidrólise da sacarose (MARQUEZ, 2007). Por meio da
geração dos açúcares redutores o DNS é adicionado ao meio e aquecido, sendo a amostra
posteriormente analisada em um espectrofotômetro a fim de observar a quantidade de
açúcares presente no meio, valor que tem relação direta com a capacidade enzimática de
hidrólise da invertase nas situações reacionais propostas.
 6

OBJETIVOS

Os objetivos da prática realizada consiste em demonstrar experimentalmente o estudo

da cinética enzimática utilizando a invertase, avaliar a atividade pela formação de produtos,
verificar os efeitos do tempo, concentração de enzima, pH e concentração do substrato sobre a
atividade enzimática da invertase, determinar e relacionar a constante Km e os demais
parâmetros cinéticos estudados à literatura sobre a catálise enzimática e fisiologia celular.

PARTE EXPERIMENTAL

Materiais e Métodos

- Solução - Tampão acetato 0,05 M pH 4,0;

3,5-di-nitro-salicilato(DNS);
- Solução de sacarose 0,2 M; 0,01
M; 0,02 M; 0,05M; 0,1M
- Enzima invertase (0,1 mg proteína/
mL);
- Tampão acetato 0,05 M; pH 4,7;
- Tampão citrato- fosfato 0,05 M pH
2,0;
- Tampão acetato 0,05 M pH 5,0;
- Tampão fosfato 0,05 M pH 6,0;
- Tampão fosfato 0,05 M pH 7,0;
- Tampão fosfato 0,05 M pH 8,0;
- Tampão bicarbonato 0,05 M pH
9,0.

Listagem das vidrarias e equipamentos utilizados.

- 25 tubos de ensaio; - 1 pipeta volumétrica de 10 mL;

- 2 pinças de madeira; - Espectrofotômetro;
- 15 pipeta volumétrica de 2 mL; - Banho termostático;
- 1 pipeta volumétrica de 5 mL; - 1 béquer de 100 mL.
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Procedimento Experimental
1. Efeito de concentração da enzima
Utilizando 6 tubos de ensaio, foram adicionados em cada um deles 1,0 mL do reativo
tampão acetato 0,05 M pH 4,7, logo em seguida adicionou-se 1,0; 0,9; 0,8; 0,7; 0,6 e 0,5 mL
de água destilada respectivamente nos tubos 1; 2; 3; 4; 5 e 6, em seguida, utilizando a
sacarose 0,2 M, colocou-se 0,5 mL em cada tubo. Desse modo, foi adicionado aos tubos 2; 3;
4; 5 e 6 (não adicionou no tubo 1) 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 e 0,5 mL da solução da enzima invertase
0,1 mg/ mL. A seguir, os 6 tubos foram mantidos em temperatura ambiente por 5 minutos,
após o tempo de incubação, foram adicionados 1,0 mL da solução de DNS em todos os tubos
e levou-se para o banho termostático durante mais 5 minutos. Dado esse tempo, retirou-se os
tubos e acrescentou-se 6,5 mL de água destilada, homogeneizou os tubos e foram levados
para fazer a leitura no espectrofotômetro em 540 nm.

2. Efeito do tempo de incubação

Nesse experimento, foram utilizados 5 tubos de ensaio onde foi adicionado 1,0 mL de
solução tampão de acetato 0,05 M pH 4,7 em cada um deles. No tubo 1 adicionou-se 1,0 mL
de água destilada, e os outros 4 tubos, foram 0,8 mL de água adicionadas. Em seguida foi
adicionado 0,5 mL da solução de sacarose 0,2 M em todos os tubos, após foi adicionado ao
tubo 3, 4 e 5 um volume de 0,2 mL da enzima invertase e deixou cada tubo em temperatura
ambiente em repouso por um tempo indicado no quadro abaixo:

Quadro 1: Tempo de incubação de cada tubo

Tubos 1 2 3 4 5

Tempo de zero zero 10 20 30

incubação
(min)

Fonte: RAMOS, F. K

Após o tempo de incubação do tubo 3, adicionou-se 0,2 mL de invertase no tubo 2 e

em seguida 1,0 mL de DNS no tubo 1, 2 e 3 e foram levados juntos para o banho termostático.
Passado o tempo do tubo 4 e 5, adicionou-se também 1,0 mL de DNS e foram levados para o
banho a 10°C. Cada tubo ficou 5 minutos em banho maria e em seguida adicionou-se 6,5 mL
de água destilada e homogeneizou-se para fazer as leituras.
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3. Efeito do pH
Utilizando 8 tubos de ensaio para esse experimento, no tubo 1 e 2 foi adicionado 1,0
mL do tampão citrato 0,05 M pH 2,0, no tubo 3 adicionou-se 1,0 mL do tampão acetato 0,05
M pH 4,0, no tubo 4, 1,0 mL do tampão acetato 0,05 M pH 5,0, no tubo 5, 1,0 mL do tampão
fosfato 0,05 M pH 6,0, no tubo 6 foram adicionados 1,0 mL do mesmo tampão no pH 7, no
tubo 7 adicionou 1 mL desse mesmo tampão no pH 8, e por fim o tubo 8 foi adicionado 1,0
mL de Tampão Bicarbonato 0,05 M pH 9,0. Após a adição dos tampões, foi adicionado 1,0
mL de água destilada no tubo 1 e no restante dos tubos foram adicionados 0,8 mL, em seguida
a adição da sacarose foi feita, adicionou 0,2 mL em todos os tubos. Logo após, a invertase foi
adicionada 0,2 mL em todos os tubos com exceção do tubo 1 e manteve-os em repouso por 5
minutos depois da homogeneização. Posteriormente, 1,0 mL de DNS foi adicionado em cada
tubo de ensaio que foram levados para o banho termostático por 5 minutos. Logo depois,
adicionou-se 6,5 mL de água destilada e homogeneizou-se para fazer as leituras.

4. Efeito da concentração do substrato

Utilizando 6 tubos de ensaio, foi adicionado 1,0 mL do tampão acetato 0,05 M pH 4,7
em cada um desses tubos, em seguida adicionou-se 1,3 mL de água destilada no primeiro tubo
e aos outros foi adicionado 0,3 mL de água. No tubo 2, adicionou 1,0 mL de sacarose 0,01 M
(4 nM), ao tubo 3 foi adicionado 1,0 mL de sacarose 0,02 M (8 nM), ao tubo 4 foi adicionado
1,0 mL de sacarose 0,05 M (20 nM), ao tubo 5 foi 1,0 mL de sacarose 0,1 M (40 nM) e por
fim no tubo 6 adicionou 1,0 mL de sacarose 0,2 M (80 nM), logo em seguida foi adicionado
0,2 mL da invertase em cada tubo e deixou 5 minutos de incubação em temperatura ambiente.
Após, adicionou-se 1,0 mL de DNS em cada tubo e levou para o banho termostático durante 5
minutos e depois adicionou 6,5 mL de água destilada e homogeneizou-se para fazer as
leituras.
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RESULTADOS E DISCUSSÃO

Nesta prática em todos os experimentos realizados a ação da enzima invertase pode ser
avaliada considerando-se a quantidade de açúcares redutores obtidos após a hidrólise da
sacarose. A forma utilizada de quantificação para tal foi com o emprego do DNS, já que o
mesmo pode ser reduzidos pelos açúcares de ácido 3,5-dinitro-salicílico para ácido
3-amino-5-nitrosalicílico, sendo este último muito útil devido sua interação com a luz,
possibilitando a realização de medidas espectrofotométricas para a sua quantificação, o que
por consequência leva a quantificação dos açúcares redutores totais presentes em solução
(VASCONCELOS; PINTO; ARAGÃO, 2013).
Em todos os ensaios foram necessários, além do tempo determinado de incubação, a
adição do reagente DNS e o aquecimento por 5 minutos de todo o sistema em banho fervente
a 100 °C. A necessidade de aquecimento da solução após a adição de DNS é explicada por
Vasconcelos, Pinto e Aragão (2013):

Os dados obtidos confirmam a observação de Ghose (1987) sobre a deterioração

progressiva da amostra após homogeneização com reagente de DNS. Embora não
explique o motivo dessa deterioração, o autor indica submeter a mistura reacional ao
aquecimento o mais rápido possível. Sumner (1924) e Miller (1959) indicam que
essa degradação ocorre pela oxidação do açúcar devido ao oxigênio dissolvido no
reagente de DNS, onde o meio é muito alcalino. (VASCONCELOS, PINTO e
ARAGÃO, 2013, p.16)

Diante dos testes realizados pelos autores em laboratório foi notado que as amostras
sofrem deterioração com o tempo após a adição do DNS, sendo este o motivo pelo qual assim
que o reagente é adicionado o sistema todo é submetido ao aquecimento, para evitar ao
máximo a perda de açúcar do meio e, consequentemente, influenciar erroneamente a
quantidade real de amostra presente.
Todas as amostras foram submetidas a análise de espectrofotometria usando o
comprimento de onda de 540 nm no filtro verde, já que o ácido 3-amino-5-nitrosalicílico
segundo Santos, A. A. et al. (2017) é “um composto corado cuja absorção máxima de luz se
dá a 540 nm”. Assim, todas as amostras foram expostas às situações para análise de como
diversos fatores podem interferir na atividade enzimática, sendo a primeira análise visando
observar como a concentração da enzima tem relação com a quantidade de produto gerado.
 10

1. Efeito de concentração da enzima

Na tabela 1 estão representados os dados adquiridos no experimento para verificar o
efeito da concentração da invertase. Para o cálculo da concentração da invertase foi preciso
calcular a diluição que foi feita utilizando a fórmula Cf . Vf = Ci . Vi:

Tabela 1 - Dados da leitura da absorbância e volume da enzima utilizado

Tubos Absorbância Invertase
(nm) mL
1 0 0
2 0,511 0,001
3 1,237 0,002
4 1,712 0,003
5 1,873 0,004
6 2,119 0,005
Fonte: Autoria própria

A partir desses valores, foi possível plotar o gráfico a seguir da absorbância em função
da concentração da enzima. Levando em consideração que o gráfico foi plotado a partir do
primeiro ponto, o qual é o tubo em branco, as análises foram realizadas a partir do segundo
ponto.
 11

Gráfico 1 - Variação da concentração da invertase

Fonte: Autoria própria

Há alguns fatores que podem influenciar na atividade enzimática, tais como a

temperatura, pH e concentração. O aumento da concentração enzimática faz com que a reação
acelere, a partir do momento que ainda possua sacarose disponível para que a invertase possa
se ligar e formar um complexo para parar a reação.
A partir da leitura do gráfico, pode-se afirmar que conforme maior for a concentração
de invertase maior a formação do produto, sendo isso é confirmado com o aumento dos
valores da absorbância. Para o segundo tubo de ensaio, o valor obtido de absorbância deveria
ser mais próximo de 0, entretanto o valor obtido durante a prática foi de 0,511, o teste foi
realizado mais de uma vez obtendo resultados longes do esperado, confirmando uma
continuidade da reação da sacarose com a enzima, mesmo com a adição do DNS, tornado o
substrato em produto.
A linha no gráfico representa a melhor reta que deveria ser traçada, com um aumento
linear de absorbância acompanhando a concentração da enzima adicionada.

2. Efeito do tempo de incubação

A partir dos valores da tabela abaixo, foi plotado um gráfico da absorbância em função
do tempo logo a seguir:
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Tabela 2 - Dados da leitura da absorbância

Tubos Absorbância Tempo
(nm)
1 0 0
2 0,044 0
3 1,836 10
4 2,137 20
5 2,160 30
Fonte: Autoria própria

Conforme analisado no teste anterior, neste também pode-se confirmar que conforme
maior o tempo de incubação maior a atividade da enzima, sendo duas grandezas diretamente
ligadas, podendo ser confirmada com a leitura do gráfico 2.

Gráfico 2 - Variação do tempo de incubação

Fonte: Autoria própria

Ou seja, quanto maior o tempo sem a adição do reagente DNS que tinha a função de
desnaturação da enzima, bloqueando a reação de formação de produto, maior foi a
concentração do mesmo na solução, sendo maior a leitura de absorbância. Novamente o ponto
 13

2 deveria obter um valor mais próximo do zero devido a ausência de tempo de incubação, mas
mesmo com adição do reagente, houve ainda a reação entre a sacarose e a invertase.

3. Efeito do pH
Com os valores obtidos com a terceira experimentação foi plotado um gráfico do
efeito do pH em relação a atividade da enzima:

Tabela 3 - Dados da leitura da absorbância

Tubos Absorbância pH
(nm)
1 0 2
2 0,011 2
3 0,421 4
4 1,187 5
5 1,027 6
6 0,759 7
7 0,270 8
8 0,080 9
Fonte: Autoria própria

Para este experimento, diferente dos anteriores, a quantidade e concentração de

enzimas, água destilada e o tempo de aquecimento foram os mesmos, havendo a variação do
pH nas soluções, já que é um fator de desnaturação das proteínas.
Com a análise do gráfico 3, Pode se observar um pico sendo formado a partir do
quarto tubo de ensaio obtendo uma maior valor de absorbância, para o tampão de pH 5,
podendo ser considerado o “pH ótimo” da enzima invertase, tendo a maior parte do
carboidrato sendo hidrolisado pela catálise da invertase.
Com isso, podemos concluir que a faixa específica da enzima utilizada está no pH 5,
onde alcança o máximo de sua atividade. Ainda analisando o gráfico é possível observar que a
invertase sofre desnaturação no pH das extremidades.
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Gráfico 3 - Variação do pH

Fonte: Autoria própria

4. Efeito da concentração do substrato

A partir dos valores da tabela abaixo, foi plotado um gráfico da absorbância em função
a concentração da sacarose adicionada:

Tabela 4 - Dados da leitura da absorbância

Tubos Absorbância [Sacarose]
(nm)
1 0 0
2 0,148 4
3 0,388 8
4 0,900 20
5 1,276 40
6 1,301 80
Fonte: Autoria própria
 15

Com a plotagem do gráfico pode se observar que a velocidade da reação depende da

concentração do substrato, formando uma curva, se encaixando na cinética de
Michaelis-Menten (figura 3), formando uma hipérbole na representação gráfica. Com os
pontos obtidos e o gráfico representados podemos calcular a constante da equação (Km).

Gráfico 4 - Variação da concentração do substrato

Fonte: Autoria própria

Figura 3: Equação de Michaelis-Menten

Fonte: Wikipedia
Onde:
V0= Velocidade da reação enzimática [S]= Concentração do substrato
Vmax= Velocidade máxima da reação, Km= Constante de Michaelis-
alcançada com a saturação total da enzi- Menten
ma com o substrato
 16

Com isso, utilizando esta equação para ajustar os dados experimentais da cinética
enzimática, podemos calcular o Km para determinar a afinidade a invertase com a sacarose.
Os cálculos foram realizados a partir da linearização dos pontos no gráfico.

Tabela 5 - Dados da linearização do gráfico

1/Abs 1/[Substrato]
0 0
6,756 0,25
2,577 0,125
1,111 0,05
0,768 0,0125
Fonte: Autoria própria

Gráfico 5 - Gráfico linearizado

Fonte: autoria própria.

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Para os cálculos:

Achando o valor de Km, e sendo este um valor baixo, é considerado que há uma alta
afinidade entre a invertase e a sacarose, pois é preciso uma baixa concentração para atingir a
metade da saturação da enzima. (FERRIER, Denise)
 18

CONCLUSÕES
Após a realização de todos os experimentos em questão, pode-se analisar as
influências da variação da concentração de substrato e da enzima, bem como a influência da
temperatura e pH na velocidade da reação enzimática da invertase. Para o gráfico 4 (efeito da
concentração do substrato) foi retirado o ponto 5 por ser um outline, estando fora dos padrões
dos outros pontos, atrapalhando a análise e pode ser devido a algum erro experimental durante
a realização da prática.
Com a construção da curva de velocidade inicial da reação em função da concentração
de substrato foi possível analisar e descrever o comportamento da enzima invertase, bem
como relacionar a velocidade máxima para a sua atuação com a concentração de substrato.
Além disso, analisou-se as condições mais propícias para o funcionamento enzimático
para uma determinada concentração de enzima, sendo que o aumento da concentração de
substrato (S) causa um aumento gradual na velocidade inicial (V0) da reação catalisada. Para
efeitos da concentração da enzima, temperatura e pH os resultados também foram obtidos e
analisados, atingindo os objetivos do relatório em questão.
Em suma, o aprofundamento e o trabalho prático acerca de enzimas são essenciais
para a compreensão de diversos mecanismos biológicos conhecidos.
Ademais, outros fatores como a ação do DNS, reagente que possibilita a quantificação
dos açúcares em solução por meio de análises de espectrofotometria e o próprio conceito de
açúcar redutor e não-redutor foram elucidados durante a realização da prática. Assim, com
este experimento vários conceitos e situações foram compreendidas de forma satisfatória,
embora nem todos os dados experimentais tenham sido satisfatórios.
 19

REFERÊNCIAS
FERRIER, Denise R. Bioquímica ilustrada. (Ilustrada).: Grupo A, 2019. E-book. ISBN
9788582714867. Disponível em:
https://integrada.minhabiblioteca.com.br/#/books/9788582714867/. Acesso em: 05 abr. 2023.

MALDONADE, Iriani R.; CARVALHO, Patrícia G. B.; FERREIRA, Nathalie A.. Protocolo
para determinação de açúcares totais em hortaliças pelo método de DNS. Brasília:
Embrapa Hortaliças, 2013. 4 p. 4 f. Disponível em:
<https://www.embrapa.br/busca-de-publicacoes/-/publicacao/956032/protocolo-para-determin
acao-de-acucares-totais-em-hortalicas-pelo-metodo-de-dns>. Acesso em: 05 abr. 2023.

MARQUEZ, Líbia Diniz Santos. Produção de açúcar invertido pelo uso de invertase
imobilizada em resinas. 2007. 137 f. Dissertação (Mestrado em Engenharias) - Universidade
Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2007. Disponível em:
<https://repositorio.ufu.br/handle/123456789/15260>. Acesso em: 04 abr. 2023.

MOURA, Daniel Sherer de et al. BIOQUÍMICA – LCB 208: roteiro de aulas práticas.
Piracicaba: Universidade de São Paulo Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”
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<https://edisciplinas.usp.br/pluginfile.php/3935666/mod_resource/content/1/Apostila%20Bio
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NELSON, David L.; COX, Michael M.. Princípios de Bioquímica de Lehninger. 6. ed.
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SANTOS, Angela Alves dos et al. Dosagem de açúcares redutores com o reativo DNS em
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FapUNIFESP (SciELO). <http://dx.doi.org/10.1590/1981-6723.11315>. Disponível em:
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TEIXEIRA, Gustavo Galastri. DETERMINAÇÃO DE AÇÚCAR EM AMOSTRAS

ALIMENTÍCIAS A PARTIR DE IMAGENS DIGITAIS. 2022. 61 f. Dissertação
(Mestrado) - Curso de Química Analítica, Programa de Pós-Graduação em Química,
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VASCONCELOS, Natália Moura de; PINTO, Gustavo Adolfo Saavedra; ARAGÃO,

Fernando Antônio de Souza. Determinação de Açúcares Redutores pelo Ácido
3,5-Dinitrosalicílico: Histórico do Desenvolvimento do Método e Estabelecimento de um
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2013. Disponível em:
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em: 05 abr. 2023.