UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAIBA

CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA
MESTRADO EM AGRONOMIA
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: SEMENTES

PROPAGAÇÃO E ARMAZENAMENTO DE SEMENTES DE

MANGABEIRA (Hancornia speciosa Gomes)

Edna de Oliveira Silva

AREIA-PB
FEVEREIRO-2010
 i

EDNA DE OLIVEIRA SILVA

PROPAGAÇÃO E ARMAZENAMENTO DE SEMENTES DE

MANGABEIRA (Hancornia speciosa Gomes)

Dissertação apresentada ao Programa

de Pós-Graduação em Agronomia da
Universidade Federal da Paraíba, como
parte dos requisitos exigidos para a
obtenção do título de Mestre em
Agronomia.

Orientador: Dr. Francisco de Assis Cardoso Almeida

AREIA-PB
FEVEREIRO-2010
 i

Ficha Catalográfica Elaborada na Seção de Processos Técnicos da

Biblioteca Setorial do CCA, UFPB, Campus II, Areia – PB.

S 586p Silva, Edna de Oliveira.

Propagação e armazenamento de sementes de mangabeira

(Hancornia speciosa Gomes). / Edna de Oliveira Silva. - Areia:
UFPB/CCA, 2010.
105 f. : il.

Dissertação (Mestrado em Agronomia) - Centro de Ciências Agrárias.

Universidade Federal da Paraíba, Areia, 2010.
Bibliografia.
Orientador: Francisco de Assis Cardoso Almeida.

1. Sementes - mangaba 2. Sementes - qualidade fisiológica 3.

Sementes – espécie recalcitrante 4. Sementes – micropropagação I.
Almeida, Francisco de Assis Cardoso, (Orientador) II.Título.

UFPB/CCA CDU:
631.531(043.3)
 ii

EDNA DE OLIVEIRA SILVA

PROPAGAÇÃO E ARMAZENAMENTO DE SEMENTES DE

MANGABEIRA (Hancornia speciosa Gomes)

Aprovado em: 24 de fevereiro de 2010

BANCA EXAMINADORA

_______________________________________
Prof. Dr. Francisco de Assis Cardoso Almeida
(UFCG/DEAG)
Orientador

______________________________________

Profa. Dra. Edna Ursulino Alves

(UFPB/CCA)
Examinadora

______________________________________

Dr. Ailton Melo de Moraes

(EMEPA-PB)
Examinador
 iii

OFERECIMENTO

À DEUS

Todas as minhas realizações só são possíveis porque lá no céu existe

alguém muito especial que me concedeu a vida, o amor de meus pais, a força e
coragem para lutar e vencer os desafios da vida .
Nos caminhos por onde andei encontrei muitos obstáculos e se não fosse
a força divina que me acompanha talvez tivesse fraquejado e desistido de
lutar pelos meus objetivos. Por isso, tenho muito a agradecer à Deus,
principalmente por todos os dias de vida que me concedeu para trilhar nesta
longa estrada de flores e espinhos.
Dedico este trabalho:
À Deus,
À meus pais que são tudo para mim, que me ensinaram a ser uma pessoa de
caráter, e mesmo com dificuldades financeiras nunca me deixaram desistir dos
estudos (Marly e Manoel) Obrigado por tudo...
Meus irmãos (Edson e Silmara),
Meu noivo (Ricardo) pelo amor, carinho, compreensão e incentivo...
Avós (in memorian), tios e primos,
Clemilda e família pelo incentivo,
Oziane e familia pelo apoio
Ao Prof. Dr. Diassis e Dr. Ailton.
A todos aqueles que valorizam o espírito e
o caráter humano e não as riquezas
materiais mundanas que são passageiras.
 iv

AGRADECIMENTOS

Ao meu orientador na realização deste trabalho, meus sinceros

agradecimentos e admiração: Dr. Francisco de Assis Cardoso Almeida por toda
atenção e presteza. A Dra. Edna Ursulino Alves e Dr. Ailton Melo de Moraes, por
terem aceito o convite para participar como examinadores deste trabalho.
Agradeço ao Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal da
Paraíba, em especial ao Programa de Pós-Graduação em Agronomia, pela
oportunidade de realização do curso, ao Coordenador do Programa: Prof. Dr.
Ademar Pereira de Oliveira, ao Vice-Coordenador: Prof. Dr. Ivandro de França da
Silva. Aos funcionários: Eliane Araújo, Jacob e Francisco pela amizade.
Agradeço a CAPES pela concessão de bolsa, para a realização deste
trabalho.
À Empresa Estadual de Pesquisa Agropecuária do Estado da Paraíba, pela
disponibilização do Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais e fornecimento
das sementes, em especial ao Dr. Ailton Melo de Moraes, ao Dr. Jorge Case
Filho, a Oziane e Ana Paula.
Ao Departamento de Engenharia Agrícola da Universidade Federal de
Campina Grande, pela liberação do nitrogênio líquido para a realização da
pesquisa.
Aos Professores pelo incentivo:

Profa. Dra. Riselane de Lucena Alcântara Bruno

Prof. Dr. Walter Esfrain
Prof. Dr. José Barbosa
À todos os funcionários do prédio central e aos funcionários da biblioteca, a
todos os funcionário da limpeza (Por manterem nosso ambiente limpo), aos
funcionários do Laboratório de Sementes na pessoa de Ruy, Severino e Antônio
Alves, pela prestimosa ajuda.
À todos os professores e funcionários do CCA/UFPB.
Á todos os meus amigos do Programa de Pós-Graduação em Agronomia,
Zootecnia, Solos e do Programa de Pós-Graduação em Engenharia Agrícola. Em
especial, pelo convívio e amizade à Gilmara Gurjão Carneiro, Flávio Farias
 v

Gurjão, Glayciane Góis, Patrícia, Fabricio, Evio, Luís, Cibele, Lucicléia, Evio,
Leandra, Cosmo, Severino, Suely, Roberta, Kelina, Carina, Danielle e Joel.
Aos estagiários, bolsistas, mestrandos e doutorandos do Laboratório de
Análise de Sementes minha devida atenção, pela amizade e convívio harmonioso.
A todos os meus tios e primos pela amizade e incentivo, em especial a
Danielle Lima de Oliveira, Rogério Moreira e Dra. Maria Alves de Oliveira.
 vi

SUMÁRIO

LISTA DE TABELAS.................................................................................... viii

LISTA DE FIGURAS..................................................................................... ix
RESUMO ...................................................................................................... Xi
ABSTRACT .................................................................................................. Xii
1. INTRODUÇÃO .......................................................................................... 1
2. REVISÃO DE LITERATURA .................................................................... 3
2.1 Descrição Botânica ................................................................................. 3
2.2 Aspectos socioeconômicos ..................................................................... 4
2.3 Produção no Brasil .................................................................................. 4
2.4 Propagação da mangabeira .................................................................... 5
2.5 Armazenamento ...................................................................................... 7
2.6 Técnica da Vitrificação ............................................................................ 8
2.7 Micropropagação ou Cultivo in vitro ........................................................ 9
2.8 Meio de Cultivo ..................................................................................... 11
3. MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................... 13
3.1 Local da pesquisa ................................................................................... 13
3.1.2 Sementes ............................................................................................. 13
3.2 Armazenamento ...................................................................................... 13
3.3 Determinação do teor de umidade ......................................................... 14
3.4 Teste de germinação .............................................................................. 15
3.4.1 Testes de vigor .................................................................................... 15
3.5 Procedimentos estatísticos ..................................................................... 15
4. Cultivo in vitro de embriões ....................................................................... 16
4.1 Método da vitrificação ............................................................................. 16
4.2 Procedimentos para a desinfestação ...................................................... 17
4.3 Estabelecimento ..................................................................................... 18
4.4 Alongamento e multiplicação .................................................................. 19
4.5 Enraizamento .......................................................................................... 19
5 RESULTADOS .......................................................................................... 20
5.1 Análises iniciais........................................................................................ 20
5.1 Teor de umidade ..................................................................................... 20
 vii

5.2 Germinação ............................................................................................ 22

5.3 Vigor ........................................................................................................ 29
5.4 Germinação de embriões submetidos à DMSO e sacarose ................... 32
5.5 Desinfestação de sementes de mangabeira ........................................... 37
5.6 Estabelecimento das gemas apicais e laterais ....................................... 39
5.7 Alongamento e multiplicação .................................................................. 40
5.8 Enraizamento .......................................................................................... 43
6. CONCLUSÕES ......................................................................................... 48
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................... 49
8. ANEXOS ................................................................................................... 61
 viii

LISTA DE TABELAS

Tabela 5.1 Teor de umidade das sementes de mangabeira (H.

speciosa) armazenadas nos substratos úmidos..................... 21

Tabela 5.2 Teor de umidade das sementes de mangabeira (H.

speciosa) armazenadas nos substratos úmidos por dois
meses nas temperaturas de 0 e -22°C................................... 21

Tabela 5.3 Teor de umidade das sementes de mangabeira (H.

speciosa) armazenadas nos substratos úmidos por dois
meses..................................................................................... 22

Tabela 5.4 Germinação (%) de sementes de mangabeira (H. speciosa)

armazenadas em substratos úmidos submetidas a três
temperaturas durante dois meses........................................... 24

Tabela 5.5 Massa seca de plântulas de mangabeira (H. speciosa)........ 31

Tabela 5.6 Resumo da análise de variância do estabelecimento das

gema apicais e laterais de mangabeira (H. speciosa) em
meio MS com doses de carvão ativo...................................... 42

Tabela 1 Resumo da análise de variância do teor de umidade das

do Anexo sementes de mangabeira (H.speciosa) armazenadas em
substrato súmidos ................................................................. 62

Tabela 2 Resumo da análise de variância da germinação de

do Anexo sementes de mangabeiras (H.speciosa) armazenadas em
substratos úmidos................................................................... 63

Tabela 3 Resumo das análises de variância dos testes de vigor

do Anexo (comprimento e massa seca de plântulas de mangabeira).... 64

Tabela 4 Comprimento das plântulas resultantes da germinação das

do Anexo sementes de mangabeira (H. speciosa) após o primeiro e
segundo mês de armazenamento à 0°C................................. 64
 ix

LISTA DE FIGURAS

Figura 5.1 Germinação (%) de sementes de mangabeira

(H.speciosa) armazenadas em substratos úmidos
submetidas a temperatura de 0°C durante o primeiro
mês................................................................................... 25

Figura 5.2 Germinação (%) de sementes de mangabeira (H.

speciosa) armazenadas em substratos úmidos
submetidas a temperatura de 0°C durante o segundo
mês .................................................................................. 27

Figura 5.3 Germinação (%) de sementes de mangabeira

(Hancornia speciosa G.) armazenadas em substratos
úmidos submetidas a temperatura de 25°C durante o
primeiro mês .................................................................... 28

Figura 5.4 Comprimento das plântulas resultantes da germinação

das sementes de mangabeira (H. speciosa G.) após o
primeiro e segundo mês de armazenamento à
0°C.................................................................................... 29

Figura 5.5 Germinação in vitro de embriões de mangabeira (H.

speciosa) submetidos ao tratamento com DMSO e
sacarose antes de serem colocados no meio MS ........... 34

Figura 5.6 Quantidade de folhas em percentagem, provenientes

dos embriões de mangabeira (H. speciosa) submetidos
ao tratamento com DMSO e sacarose antes de serem
colocados no meio MS .................................................... 35

Figura 5.7 Comprimento das plântulas provenientes dos embriões

de mangabeira (H. speciosa) submetidos ao tratamento
com DMSO e sacarose antes de serem colocados no
meio MS ........................................................................... 36

Figura 5.8 Contaminação de sementes de mangabeira (H.

speciosa) submetidas a desinfestação ............................ 38

Figura 5.9 Germinação de sementes de mangabeira (H. speciosa)

submetidas a desinfestação ............................................ 39

Figura 5.10 Alongamento e multiplicação de brotações apicais de

mangabeira (H. speciosa) em função das doses de ANA
e BAP .............................................................................. 41

Figura 5.11 Alongamento e multiplicação de brotações laterais de

mangabeira (H. speciosa) em função de doses de ANA
 x

e BAP................................................................................ 42

Figura 5.12 Comprimento de brotações apicais de mangabeira (H.

speciosa) em função das doses de BAP...................... 43

Figura 5.13 Número de raízes nas brotações apicais de mangabeira

(H.speciosa) em função das doses de AIB................. 44

Figura 5.14 Número de raízes nas brotações laterais de mangabeira

(H. speciosa) em função das doses de AIB.................... 45

Figura 5.15 Comprimento de raízes das brotações apicais de

mangabeira (H. speciosa) em função das doses de
AIB.................................................................................... 46

Figura 5.16 Comprimento de raízes das brotações laterais de

mangabeira (H. speciosa) em função das doses de
AIB.................................................................................... 47
 xi

PROPAGAÇÃO E ARMAZENAMENTO DE SEMENTES DE MANGABEIRA

(Hancornia speciosa Gomes)

SILVA, Edna de Oliveira. PROPAGAÇÃO E ARMAZENAMENTO DE

SEMENTES DE MANGABEIRA (Hancornia speciosa Gomes). Areia:
UFPB/CCA, 2010. 105p. (Dissertação de Mestrado em Agronomia)

RESUMO - A mangabeira (Hancornia speciosa Gomes) é uma Apocynaceae

originária do Brasil, cujos frutos são muito consumidos e suas sementes perdem
rapidamente o poder germinativo assim que são retiradas do fruto. Desta forma,
essa pesquisa teve por objetivo avaliar o armazenamento de sementes de
mangabeira em substratos e temperaturas diferentes, e desenvolver técnicas de
vitrificação e micropropagação dessa espécie. A pesquisa foi realizada na UFPB,
campus II Areia-PB e na EMEPA-PB, no armazenamento em substrato utilizou-se
os substratos areia (A), vermiculita (V) e a combinação de areia mais vermiculita
(A+V), e a umidade acrescida nos substratos foram de 30, 40, 50 e 60 de acordo
com a capacidade de campo de cada substrato, nessas condições as sementes
foram colocadas em bandejas plásticas contendo os substratos úmidos e foram
submetidas às temperaturas de ± 25 °C (ambiente), 0 °C (geladeira) e -22 °C
(freezer), no período de 7 meses. Em cada mês de armazenamento foram
realizados os testes de germinação e vigor. No método da vitrificação foram
utilizadas concentrações de sacarose (0, 0,25, 0,50 e 0,75 M) e de DMSO (0, 5,
10 e 15%). Na desinfestação das sementes utilizou-se concentrações de
hipoclorito de sódio (1, 2, 3, 4, 5%) em função do tempo (5, 10,15, 20 min.). O
estabelecimento das sementes in vitro foi realizado no meio MS, sendo as gemas
obtidas colocadas em meio MS com carvão ativo. Na multiplicação e
alongamento das gemas utilizou-se as concentrações de BAP (0; 1,0; 1,5; 2,0 e
2,5 mg.L-1) e de ANA(0; 0,25; 0,50; 0,75 e 1,0 mg.L-1). Para o enraizamento
utilizou-se as concentrações de AIB (0; 1,0; 1,5; 2,0 mg/L-1). Diante dos resultados
obtidos na pesquisa pode-se afirmar que o armazenamento em substrato úmido à
0 °C foi eficiente até dois meses. As doses elevadas de DMSO afetaram a
germinação e o vigor dos embriões. O efeito isolado do BAP e ANA aumentaram
o número de brotações apicais e laterais de mangabeira. O número de raízes
variou de acordo com as doses de AIB.

Palavras-chave: Espécie recalcitrante, qualidade fisiológica, micropropagação.

 xii

SPREAD STORAGE OF SEED MANGABEIRA

(Hancornia speciosa Gomes)

SILVA, Edna de Oliveira. SPREAD AND STORAGE OF SEED MANGABEIRA

(Hancornia speciosa Gomes). Areia: UFPB/CCA, 2010. 105p. (Dissertação de
Mestrado em Agronomia)

ABSTRACT - Mangabeira (Hancornia speciosa Gomes) is a Apocynaceae

originating in Brazil, its fruits are widely consumed and its seeds quickly lose their
germination so they are removed from the fruit. Thus, this research was to
evaluate the storage of seeds of mangabeira and substrates at different
temperatures, and develop techniques for glazing and micropropagation of this
specie. The survey was conducted in UFPB, campus II Areia-PB and EMEPA-PB,
in storage substrate were used as substrates sand (S), vermiculite (V) and the
combination of sand plus vermiculite (S + V), and moisture the substrates were
increased 30, 40, 50 and 60% according to field capacity of each substrate under
these conditions the seeds were placed in plastic trays containing moist substrates
and were subjected to temperatures of ± 25 ° C (environment), 0 ° C (refrigerator)
and -22 ° C (freezer), the period of 7 months. In each month of storage was
analyzed for germination and vigor. In the vitrification method was used sucrose
concentrations (0, 0.25, 0.50 and 0.75 M) and DMSO (0, 5, 10 and 15%). In seed
sterilization was used concentrations of sodium hypochlorite (1, 2, 3, 4, 5%) as a
function of time (5, 10.15, 20 min.). The establishment of seeds in vitro was
performed in MS medium, and placed the egg obtained in MS medium with
activated charcoal.The multiplication and shoot elongation was used
concentrations of BAP (0, 1.0, 1.5, 2.0 and 2.5 mg.L-1) and ANA (0, 0.25, 0.50;
0.75 and 1.0 mg.L-1). For rooting we used concentrations of AIB (0, 1.0, 1.5, 2.0
mg.L-1). Results obtained in research can be said that the storage in moist
substrate at 0 ° C was effective up to two months. High doses of DMSO affected
the germination and vigor of embryos. The isolated effect of BAP and ANA
increased the number of apical shoots and lateral tegument. The number of roots
varied with doses of AIB.

Keywords: Recalcitrant specie, physiological quality, micropropagation.

 1

1. INTRODUÇÃO

As frutas mais importantes do ponto de vista econômico têm participação

muito significativa no cenário agrícola do Nordeste, dentre elas pode-se ressaltar
a mangaba, o abacaxi, o caju, a banana, a manga, a goiaba, o coco, o mamão, a
graviola, o cajá e o maracujá (BARROS, 2006).
A mangabeira (Hancornia speciosa Gomes) é uma Apocynaceae originária
do Brasil, encontrada em várias regiões, sendo que os estados da Paraíba, Bahia
e Sergipe figuram entre os maiores produtores do país, onde os frutos são obtidos
de forma extrativista (FONSECA et al., 1994).
A mangabeira produz frutos para o consumo in natura e para a
industrialização nas formas de polpa, principalmente de sucos, batidas, coquitéis,
doces, geléias, sorvetes, licores, vinhos e xaropes. Ainda, pode-se extrair o látex
para a borracha, e também tem ampla aplicação na farmacologia, caracterizando
seu potencial diversificado de aproveitamento (FERREIRA et al., 2008)
A oferta do produto não atende à demanda de mercado, confirmando o
seu potencial agro-socio-econômico e as poucas informações técnicas de cultivo
ainda limitam a expansão de pomares comerciais (EPSTEIN, 2004).
A cultura está em fase de domesticação e, portanto, todos os aspectos
relacionados ao seu cultivo necessitam ser estudados, podendo-se citar:
propagação vegetativa, seleção de genótipos promissores, desenvolvimento e
adaptação de práticas culturais, estudos sobre a fenologia da planta e aspectos
relacionados com a pré e pós-colheita do fruto (LÉDO et al., 2007).
As sementes de mangaba perdem rapidamente o poder germinativo assim
que são retiradas do fruto, sendo referenciada na literatura como uma espécie
recalcitrante, onde informam que a porcentagem de germinação de sementes é
baixa devido à presença de inibidores na polpa como também pelo fato da
recalcitrância (LORENZI, 2002; VIEIRA NETO, 2002; OLIVEIRA e VALIO, 1992).
A totalidade dos recursos genéticos da mangabeira é quase que
completamente desconhecida e, sua conservação, caracterização e uso ainda
necessitam de muitas ações a serem desenvolvidas (SILVA JUNIOR, 2004).
Como a mangaba é uma espécie recalcitrante e em fase de domesticação há a
necessidade de mais estudos com relação ao tema e, principalmente, com
 2

relação às técnicas de armazenagem, e o estudo de métodos para a conservação

e propagação que é de fundamental importância para os produtores de mangaba.
Desta forma, essa pesquisa teve por objetivo avaliar o armazenamento de
sementes de mangabeira (Hancornia speciosa) em substratos e temperaturas
diferentes, e desenvolver técnicas de vitrificação e micropropagação dessa
espécie.
 3

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Descrição botânica

A mangabeira (Hancornia speciosa Gomes), que significa em tupi-guarani,

"fruta boa de comer" é uma frutífera arbórea de porte médio, da família das
Apocináceas que atinge de 5 a 10 metros de altura. Nativa do Brasil é encontrada
vegetando espontaneamente em várias regiões do país, desde os tabuleiros
costeiros e baixadas litorâneas do Nordeste, onde é mais abundante, até as áreas
sob Cerrado da Região Centro-Oeste; verifica-se ainda sua ocorrência nas
Regiões Norte e Sudeste (VIEIRA NETO, 2002).
Na Paraíba, ocorre, predominantemente, na mesorregião da Mata
Paraibana, com maior freqüência nas áreas compreendidas pelas microrregiões
de João Pessoa e dos litorais Norte e Sul (AGUIAR FILHO et al., 1998).
As folhas são simples, alternas e opostas, de forma e tamanho variado, são
pilosas ou glabras e curto-pecioladas. As flores são hermafroditas, brancas, em
forma de campânula alongada (tubular). A inflorescência é do tipo dicásio ou
cimeira terminal com uma a sete flores (ALMEIDA et al.,1998). Os frutos são
arredondados ou piriformes (forma de pêra), com variações no tamanho, de
coloração verde, quando imaturo, e amarelo com manchas vermelhas, quando
maduros, os quais são aromáticos, delicados e com sabor agradável ao paladar
humano. A polpa é branca, fibrosa e recobre as sementes arredondadas
(LORENZI, 2002). O peso dos frutos varia de 5 a 50 g no Nordeste (AGUIAR
FILHO et al., 1998) e de 30 a 260 g no Cerrado (SILVA et al., 2001).
O fruto é bastante apreciado em virtude das excelentes características
organolépticas e do elevado valor nutritivo, notadamente com relação ao teor
protéico superior ao da maioria dos frutos (LEMOS et al., 1989). É possível
encontrar em 100 gramas de polpa 0,7g de proteínas; 41 mg de cálcio; 18 mg de
fósforo; 28 mg de ferro; 30 mg de vitamina A; 0,04 mg de vitamina B1 e 33 mg de
vitamina C. A polpa possui 43 calorias. As sementes são achatadas e discóides,
com 7 a 8 mm de diâmetro, cor castanho-clara e peso médio variando de 18,4 g
até 40g por 100 sementes (LEDERMAN et al., 2000 e SILVA et al., 2001).
A despolpa das sementes consiste numa leve maceração com água
corrente em peneiras, até a remoção da mucilagem, que tem efeito prejudicial na
 4

germinação. Como são recalcitrantes, as sementes de mangaba não podem ser

secas, e devem ser semeadas imediatamente (PEREIRA et al., 2006a). Sementes
poliembriônicas ocorrem na espécie, com duas e três plântulas por semente com
desenvolvimento uniforme.

2.2 Aspectos socioeconômicos

A exploração da mangabeira é feita de forma extrativa, em pomares

nativos, ocupando mão-de-obra não qualificada, caracterizando a sua importância
socioeconômica para as populações da zona rural, que a tem como fonte de
renda, sem nenhum investimento prévio, uma vez que essa fruteira se encontra
em estado silvestre. Por ser uma cultura que está despontando no cenário da
fruticultura pelas suas qualidades e aplicações, demonstra forte demanda
(FERREIRA, 2006).
Apesar do seu grande potencial e da inexistência de plantios racionais e
tecnificados, o extrativismo da mangabeira é atualmente a única forma de
exploração, constituindo-se assim numa barreira ao aproveitamento de todas as
suas propriedades (LEDERMAN et al., 2000).
O aproveitamento sócio-econômico e a demanda de pesquisas de espécies
frutíferas nativas, têm sido inibidos tanto pela forte pressão do mercado
consumidor de frutas tradicionais de clima tropical e subtropical, já adaptadas,
como também pelo mercado de frutas de clima temperado, aclimatadas (Souza,
2001). Porém, a oferta de novas alternativas de frutas frescas para consumo in
natura e matéria-prima para agroindústrias constituem uma preciosa fonte de
alimento e riqueza para o país.

2.3 Produção no Brasil

A mangabeira é muito apreciada na região Nordeste, devido ao ótimo

aroma e sabor, boa digestibilidade e alto valor nutritivo, com teor de proteínas
superior ao de grande parte das frutíferas (PARENTE et al., 1985). Além das
formas de sucos e polpas congeladas, o fruto da mangabeira ainda é consumido
in natura e utilizado para a fabricação de doces, compotas, geléias, licores,
xaropes, vinhos e vinagres (SOARES et al., 2004). Típica da faixa litorânea
 5

nordestina, sua população vem sendo drasticamente reduzida, juntamente com o

restante da vegetação nativa, devido à especulação imobiliária e ao
desmatamento para o cultivo de monoculturas, principalmente coqueiro, cana-de-
açúcar e pastagens (VIEIRA NETO, 1998).
O Brasil é um grande produtor mundial de mangaba chegando a produzir
mais de 1222 toneladas (IBGE, 2008). Atualmente, a produção brasileira é de
aproximadamente 811 toneladas, com uma redução da produção de 33,66%, com
significativa participação da região Nordeste, seguida da região Sudeste e Centro-
Oeste (FERREIRA et al., 2008).
Do volume total de frutos comercializados durante o período de 1993 a
2002, cerca de 96% vieram dos Estados do Rio Grande do Norte (60%) e Paraíba
(36%), sendo os municípios de Ceará-Mirim (RN) e Mamanguape (PB), os
responsáveis pela maior parte dessa produção extrativista (LEDERMAN e
BEZERRA, 2003).
De acordo com Silva Júnior (2004), o Estado de Sergipe, apesar da
pequena extensão é o maior produtor do fruto do país, sendo destaque os
municípios de Indiaroba, Barra dos Coqueiros, Pirambu, Itaporanga e Estância,
sendo que o volume produzido não atende à demanda. No pico da safra, o quilo
da fruta custa em torno de R$ 0,50 e, quando a safra diminui, o preço pago ao
produtor chega a R$ 1,50. Nos supermercados, esses valores são superiores. Os
ganhos podem ser ainda maiores, caso o processamento da fruta seja feito na
propriedade.

2.4 Propagação da mangabeira

A semente é o único meio que se tem usado para a obtenção de mudas,

devendo-se lavar bem as sementes para remover a polpa, pois ela tem ação
inibidora sobre a germinação e, o poder germinativo das sementes reduz
rapidamente entre o quarto e oitavo dias após a extração das mesmas
(ANDERSEN e ANDERSEN, 1998).
Vieira Neto (2002) informou que para se obter um percentual de
germinação de 90% com sementes da mangabeira estas, devem ser semeadas
com no máximo quatro dias depois de colhidas e retiradas do fruto. Observação
que concorda com as de Pimentel e Santos (1978) ao afirmarem que as sementes
 6

da mangabeira devem ser semeadas o mais rapidamente após extraídas do fruto,

não sendo recomendado o uso de sementes que tenham sido despolpadas a
mais de sete dias, pois a sua viabilidade pode está comprometida. Normalmente a
percentagem de germinação de sementes de mangaba é baixa, a emergência e o
desenvolvimento das mudas são lentos (Lorenzi 2002).
A escolha do substrato e da temperatura adequados para o teste de
germinação da maioria das espécies nativas são requisitos ainda desconhecidos,
desta forma, vários trabalhos têm enfatizado a interação do substrato e da
temperatura para condução de testes de germinação e vigor de sementes de
espécies frutíferas e florestais, a exemplo, Nascimento (2005), que avaliou
substratos e temperaturas para condução dos testes de germinação e vigor em
sementes de Bauhinia divaricata L., constatou que a combinação do substrato
areia, nas temperaturas de 20-30, 25 e 30°C foram responsáveis pelas menores
percentagens de germinação e níveis de vigor.
Soares et al. (2007b), utilizando os substratos areia, vermiculita e areia
mais vermiculita, na germinação de sementes de mangaba observaram que as
sementes apresentam elevada taxa de germinação, independente do tipo de
substrato utilizado.
Cardoso (1999) sugere que a germinação diminui em temperaturas acima
de 35°C, devido ao aumento da inativação do fitocromo endógeno (forma ativa)
ocorre fluidificação de lipídeos e desordenação das membranas (BORGES e
RENA, 1993); por outro lado, em baixas temperaturas, pode estar havendo
desativação de enzimas e limitação do crescimento do embrião. Baixas
temperaturas podem inibir atividades catabólicas em sementes que requerem
temperaturas mais altas para germinar, ou impedir a ativação de enzimas. E
também podem alterar o metabolismo de sementes imaturas, após a embebição,
aumentando a síntese de nucleotídeos, e as taxas de crescimento e
desenvolvimento (CARVALHO e CAMARGO, 2003).
Temperaturas muito altas para a propagação podem inativar enzimas e
desnaturar proteínas (MAGUIRE, 1973). De acordo com Carvalho e Nakagawa
(2000) a temperatura influencia na germinação, tanto por agir sobre a velocidade
de absorção de água, como também, sobre as reações bioquímicas que
determinam todo o processo.
 7

2.5 Armazenamento

A maioria das espécies possui sementes cujo período de viabilidade pode

manter-se, quando o teor de água e a temperatura são reduzidos durante o
armazenamento, sendo estas chamadas de ortodoxas (ROBERTS, 1973). Porém,
existe um outro grupo de espécies para as quais não se aplica a regra geral de
redução da temperatura e umidade no armazenamento, e, cujo período de
viabilidade é bem mais reduzido são as sementes recalcitrantes.
As sementes recalcitrantes não sofrem secagem natural na planta matriz e
são liberadas com elevado teor de água, e se for reduzido a um nível considerado
crítico, geralmente elevado, ocorrerá a perda rápida da viabilidade, podendo levar
até a morte (CARVALHO e NAKAGAWA, 2000).
Quando as sementes recalcitrantes são desidratadas após a coleta ocorre
a perda gradual da viabilidade com o dessecamento, passando por um ponto
crítico até atingir o teor de água chamado letal, esse comportamento foi
observado por Andrade et al. (2005) em sementes de Archantophoenix
alexandrae (Wendl e Drude) e por Nazário et al. (2008) em sementes de
Cynometra bauhiniifolia (Benthan).
Tendo em vista que somente as sementes ortodoxas podem ser
conservadas por longos períodos sem perderem a viabilidade, surge a
necessidade de identificação do comportamento de armazenagem das espécies
para a escolha de uma estratégia de conservação, sendo o teor de água das
sementes um fator crítico nessa identificação (FONSECA e FREIRE, 2003).
De acordo com Koster (1991), os métodos atuais de conservação e
armazenamento de sementes recalcitrantes são baseados na manutenção do teor
de água elevado. Existe um limite para o teor de água valor mínimo abaixo do
qual não há dano à germinação de sementes recalcitrantes. No conteúdo de água
elevado, há muitas reações metabólicas e de desenvolvimento de
microrganismos, que impedem a redução da temperatura. Assim, o teor de água
das sementes recalcitrantes e temperatura de armazenamento deve ser reduzida
até perto do teor de água crítico mínimo.
A longevidade das sementes armazenadas é influenciada principalmente
pelos seguintes fatores: qualidade inicial, teor de umidade; tempo decorrido entre
colheita e o armazenamento, tratamentos fitossanitários e térmicos aplicados, tipo
 8

de embalagem, temperatura de armazenamento e umidade relativa de

armazenamento (HONG e ELLIS, 2003; BONNER,1984).

2.6 Técnica da vitrificação

O armazenamento em baixas temperaturas é recomendado para sementes

recalcitrantes, o que inclui a crioconservação em nitrogênio líquido, que é um
método prático para a conservação dos recursos genéticos. Uma alternativa
importante para a aplicação da criopreservação é submeter o material a agentes
crioprotetores, à base de dimetilsulfóxido (DMSO), glicerol, etileno glicol, metanol,
e propileno glicol, entre outros (SALOMÃO, 2002).
A criopreservação de material biológico em nitrogênio líquido (-196°C) pode
assegurar a sua conservação, por longo período de tempo, uma vez que nessas
temperaturas ultra-baixas o metabolismo celular fica tão reduzido que a
deterioração biológica é virtualmente paralisada (SANTOS, 2004). Sendo que o
grande desafio da criobiologia é realizar um congelamento sem a formação de
cristais de gelo no interior das células, que causa ruptura do sistema de
membranas celulares, resultando em perda da semi-permeabilidade e da
compartimentação celular; em consequência disso, as células entram em colapso
e morrem (SANTOS, 2001).
A desidratação pode ser obtida por evaporação da água ou por tratamento
com uma solução altamente concentrada de crioprotetores químicos (solução de
vitrificação) (SANTOS, 2000). Entretanto, os crioprotetores podem causar
citotoxicidade e estresse osmótico, levando à morte das células ou modificando
sua resposta morfogenética em cultura (KARTHA, 1985; SAKAI, 1995).
Existem alguns fatores inerentes ao embrião que afetam a criopreservação,
como o estágio de desenvolvimento, a espécie a qual pertence e o método de
produção, que ainda não estão completamente elucidados. Os fatores da
criopreservação propriamente ditos, como tipo de crioprotetor, velocidade da
curva de congelação e tipo de suporte físico para o embrião formam outro grande
leque de alternativas que influenciam na manutenção da viabilidade de embriões
submetidos ao processo de criopreservação (SANTIN et al., 2009).
O processo de vitrificação tornou-se um dos principais métodos de
crioproteção, tendo sido aplicado a uma ampla variedade de tecidos vegetais. Do
 9

ponto de vista prático, uma grande vantagem desse método é poder congelar
rapidamente os tecidos vitrificados pelo mergulho direto em nitrogênio líquido,
eliminando a necessidade de se usarem congeladores programáveis (SANTOS,
2001).

2.7 Micropropagação ou cultivo in vitro

A micropropagação ou clonagem é a propagação vegetativa in vitro,

utilizada principalmente naquelas plantas de difícil multiplicação pelos métodos
convencionais, permitindo a obtenção de grande número de plantas sadias e
geneticamente uniformes, em curto período de tempo (CARVALHO e VIDAL,
2003).
A micropropagação é um procedimento significante na propagação de
diferentes espécies, consistindo na retirada de partes da planta ou então da
utilização de sementes ou embriões em meios de cultivos apropriados. No
entanto, alguns problemas têm sido identificados na micropropagação da
mangabeira e, dentre eles, destacam-se os contaminantes fúngicos e bacterianos
presentes em explantes oriundos de plantas adultas que dificultam o
estabelecimento de protocolos de micropropagação (ALOUFA, 2003; LEMOS et
al., 2006).
A micropropagação é uma técnica importante na multiplicação de plantas
que só são propagadas por sementes, pois na propagação por meio de sementes
há desvantagens, como longo período de imaturidade das plantas e a
variabilidade genética das progênies em desenvolvimento, quantidade e
qualidade dos frutos produzidos, além de outros caracteres agronômicos
importantes na produção comercial (PEREIRA et al., 2006b). Desta forma,
técnicas de cultura de tecidos vegetais vêm sendo largamente aplicadas não só
pela possibilidade de se obter plantas mais resistentes a fatores de estresses
bióticos (fusariose) e abióticos (salinidade), mas, também, pela rápida propagação
clonal in vitro de plantas de novas variedades (MACÊDO et al., 2003).
As condições ambientais apropriadas para o processo de germinação
podem ser fornecidas em laboratórios, por meio da micropropagação, tendo em
vista que a germinação de sementes in vitro permite uma maior germinabilidade
em comparação com os viveiros (GOMES, 2003), pois as condições da sala de
 10

crescimento são mais adequadas aos processos de germinação e

desenvolvimento inicial da plântula (NOLETO e SILVEIRA, 2004).
O cultivo in vitro de sementes ou embriões é um método apropriado para
que o processo de germinação ocorra; além disso, a presença de reguladores de
crescimento e de fontes exógenas de carboidratos no meio de cultura,
possibilitam contornar fatores que inibem a germinação de diversas sementes,
como a presença de inibidores químicos, imaturidade de embriões e pobre
acúmulo de reservas nutritivas, aumentando, assim, a percentagem de
germinação ou fazendo com que o processo seja mais efetivo, rápido e uniforme
(DECETTI, 2000).
Os explantes oriundos da fase de estabelecimento são inoculados em meio
de cultura contendo combinações de auxinas e citocininas, dependendo da
espécie e do tipo de explante (DUTRA et al., 2009). O benzilaminopurina (BAP)
tem sido o fitorregulador mais utilizado para induzir a proliferação de gemas em
eucalipto, Eucalyptus spp. (DELPONTE et al., 2001).
Alvarenga e Carvalho, 1983 informa que as auxinas são substâncias que
controlam o crescimento e o alongamento celular, onde as principais auxinas
utilizadas são o ácido indolbutírico (AIB), o ácido naftaleno acético (ANA), o ácido
indolacético (AIA) e o ácido diclorofenóxiacético (2,4-D).
As citocininas (BAP) estimulam a divisão celular e auxiliam na quebra de
dormência das gemas axilares, até então inibidas pela dominância apical (BRUM
et al., 2002). O balanço entre estes dois tipos de reguladores controla muitos
aspectos da diferenciação celular e organogênese nas culturas de tecidos e
orgãos (PASQUAL, 2001).
As brotações multiplicadas e alongadas são induzidas ao enraizamento, o
qual pode ser realizado in vitro ou ex vitro. Para o enraizamento in vitro utiliza-se
auxinas, geralmente o AIB. Alfenas et al. (2004), indicaram a permanência dos
explantes por 7 a 15 dias em meio de cultura contendo 1,0 mg.L -1 de AIB. Para
Xavier e Comério (1997), o enraizamento in vitro pode ser dispensado, fazendo-
se com que as gemas alongadas in vitro em meio de cultura sejam enraizadas em
condições de casa de vegetação.
A última fase do processo de micropropagação é a aclimatação que
objetiva reduzir o estresse causado pela diferença entre os ambientes in vitro e ex
vitro e constituí-se numa etapa na qual ocorrem grandes perdas de explantes,
 11

sendo realizada em ambiente sombreado, onde as plantas ficam por um período

variável de 15-30 dias e, posteriormente, são levadas para área de pleno sol,
onde ocorre a rustificação e o crescimento (DUTRA et al., 2009).
As plantas lenhosas, que contemplam grande parte das frutíferas, inclusive
a mangabeira, tem dificuldades relevantes para o estabelecimento in vitro,
principalmente devido à contaminação e oxidação, por isso a utilização de
técnicas de micropropagação são estratégias importantes para solucionar
problemas de propagação, também melhoramento genético e da biotecnologia
das plantas, principalmente de lenhosas e perenes (ERIG e SCHUCH, 2003).

2.8 Meio de cultivo

De acordo com Pasqual et al. (1998) toda a planta de uma forma geral, é
autotrófica, necessitando para o seu desenvolvimento de um substrato que
contenha os sais minerais essenciais, água, gás carbônico e luz. No entanto, ao
se cortar parte desta planta para cultivá-la in vitro ou a utilização de sementes e
embriões observa-se que os explantes não são autotróficos e por isso necessitam
também de elementos essenciais, constituintes orgânicos e energia (sacarose).
O meio de cultivo é composto por seis componentes básicos, são eles:
macronutrientes (N, P, K, S, Ca, Mg, Fe), micronutrientes (Mn, Zn, B, Cl, Mb, Co e
I), açúcares (sacarose, glicose ou frutose), vitaminas e aminoácidos (tiamina,
niacina, piridoxina, glicina e Mio-inositol.) e reguladores de crescimento (auxinas e
citocininas) (PASQUAL et al.,1998; TOMBOLATO e COSTA, 1998).
O meio MS (MURASHIGE e SKOOG, 1962) é um dos mais utilizados
porque contém todos os nutrientes essenciais ao desenvolvimento do explante e
por ser responsável por bons resultados para várias espécies.
O carvão ativado também é recomendado no cultivo in vitro sendo
importante para evitar a oxidação que é a reação do oxigênio com íons metálicos
(+) dos outros compostos do meio de cultivo. Os explantes ao serem inoculados
no meio de cultura podem liberar exudatos que tornam o meio de cultivo escuro,
sendo conseqüência da liberação de fenóis dos ferimentos ocasionados no
processo de extração dos explantes (SANTOS, 2001).
Portanto, as sementes, embriões, gemas e tecidos são estabelecidos em
meios de cultivos diversos, alguns estudos com diferentes espécies apontam que
 12

a utilização de água de coco e carvão ativado, em suplementação ao meio de

cultura, é requerida para suprir as exigências nutricionais e fisiológicas dos
embriões (RIBEIRO et al., 2000; CARVALHO et al., 2003; CHAGAS et al., 2005).
 13

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Local da pesquisa

A pesquisa foi desenvolvida no Laboratório de Análise de Sementes da

Universidade Federal da Paraíba, Campus II, Areia-PB, e no Laboratório de
Cultura de Tecidos Vegetais (LCTV) da Estação Experimental de Mangabeira,
pertencente à Empresa Estadual de Pesquisa Agropecuária do Estado da
Paraíba-EMEPA/PB.

3.1.2 Sementes

Os frutos de mangaba (Hancornia speciosa G.) foram colhidos na Estação

Experimental de Mangabeira EMEPA/PB, sendo as sementes extraídas
manualmente com o auxilio de uma peneira para facilitar a retirada da polpa e,
lavadas seguidamente em água corrente.

Para o início dos trabalhos a qualidade inicial das sementes foi avaliada
mediante análise de emergência, determinação da umidade e peso de 1000
sementes. A emergência foi realizada em casa de vegetação e o substrato
utilizado foi areia em bandejas plásticas de 60 x 40 x 40 cm, sendo 4 repetições
de 25 sementes. A umidade das sementes foi realizada com 2 repetições de 25
sementes em estufa por 24 horas a 105 ± 3 ºC de acordo com as Regras para
análise de sementes (BRASIL, 2009).

3.2 Armazenamento

O armazenamento foi realizado no Laboratório de Cultura de Tecidos da

EMEPA-PB, onde as sementes foram armazenadas em recipientes plásticos de 4
x 12 x 8 cm contendo os substratos de areia, vermiculita e areia (50%) +
vermiculita (50%) umedecidos com água destilada, onde cada substrato foi
submetido a quatro porcentagens de umedecimento. A quantidade de água
fornecida a cada substrato foi determinada depois de submetê-los a saturação.
 14

O cálculo da quantidade de água adicionada a cada substrato foi efetuado

pesando-se inicialmente certa quantidade de cada substrato (200 g) que foi
colocado em um filtro de papel tipo coador de café comercial. Em seguida
adicionou-se uma 100 ml de água previamente determinada. Depois que todo o
excesso de água foi drenado; este volume foi então determinado e, assim, por
diferença, calculado a quantidade de água que ficou retida no substrato (100%).
Desta quantidade calcularam-se as percentagens a serem irrigados os substratos
(testados): 60, 50, 40 e 30%, sendo definida a quantidade em ml através de regra
de três.

Os substratos foram distribuídos em bandeja plásticas de 4 x 12 x 8 cm,

posteriormente estes foram irrigados com as respectivas porcentagens de água.
Depois foi removida uma parte do substrato e distribuíram-se 150 sementes por
bandeja, sendo estas cobertas com a parte do substrato removido. Em seguida,
as bandejas com as sementes foram colocadas em geladeira à 0°C, no freezer à -
22°C e ambiente de laboratório a 25°C, onde permaneceram armazenadas por 7
meses. Durante este tempo, a cada 30 dias, retirava-se uma bandeja de cada
tratamento para análise de viabilidade das sementes (germinação e vigor)

3.3 Determinação do teor de umidade

O teor de umidade (%) das sementes foi determinado em duas sub-

amostras, de 25 sementes cada, por tratamento, depois de permanecerem por 24
horas em estufa a 105 ± 3 ºC. Após o período de permanência na estufa, as
sementes foram retiradas, colocadas em um dessecador contendo sílica gel por
um período de 20 a 30 minutos para serem resfriadas e em seguida novamente
pesadas, obtendo-se a porcentagem em peso, expressa em base úmida através
da expressão analítica contida nas Regras para Análise de Sementes (BRASIL,
2009).
 15

3.4 Teste de emergência

O teste de emergência foi realizado no Laboratório de Análise de sementes

da Universidade Federal da Paraíba, em casa de vegetação, sendo conduzido
com quatro repetições de 25 sementes por tratamento, semeadas em sulcos com
aproximadamente 2 cm de profundidade, em bandejas plásticas, contendo areia
como substrato (Figura 1 do anexo), em que a emergência iniciou aos 30 dias
após a semeadura e a classificação das plântulas como normais e anormais foi
realizada aos 57 dias após a semeadura.

3.4.1 Testes de vigor

Comprimento (cm) e massa seca de plântulas (g) - após a contagem no teste

de germinação, as plântulas normais foram submetidas a medições com régua
graduada em centímetro da raiz a parte aérea, em seguida, a secagem em estufa
regulada a 65 °C por 24 horas, conforme recomendações de Vieira e Carvalho
(1994).

3.5 Procedimentos estatísticos

Para o armazenamento em substratos úmidos a análise estatistica foi

realizada no Programa SAS versão 9.2, utilizando-se um DIC no esquema fatorial:
4 x 3 x 3 x 2, sendo 4 percentagens de água nos substratos (60, 50, 40 e 30%) x
3 ambientes (ambiente de laboratório 25 °C ± 3 °C, geladeira 0 °C e freezer -22
°C) x 3 substratos (areia, vermiculita e areia + vermiculita) x 2 períodos de
conservação (2 meses de avaliação), em 4 repetições de 25 sementes por
tratamento. As médias foram submetidas ao Teste de Tukey a 5%, e os dados
quantitativos foram submetidos a análise de regressão.
 16

4. CULTIVO IN VITRO DE EMBRIÕES

4.1 Método da vitrificação

As sementes de mangaba foram retiradas dos frutos manualmente de

forma a evitar a contaminações, sendo em seguidas lavadas em água destilada e
desinfestadas com álcool (70%) por 1 minuto e hipoclorito de sódio (5%) durante
15 minutos, o excesso de hipoclorito de sódio foi eliminado submetendo-se à
lavagem com água destilada e deionizada estéril por três vezes.

Após a assepsia realizou-se a remoção dos embriões das sementes em

câmara de fluxo laminar com o auxílio de pinças e bisturís.

Os embriões foram colocados em frascos contendo agentes crioprotetores

o dimetilsufoxido (DMSO): 0, 5, 10 e 15% e sacarose: 0, 0,25, 0,50 e 0,75 M; em
seguida, transferidos os embriões cultivados em meio MS para a sala de
crescimento, por 48 horas em agitador a 180 rpm.

Decorrido o período de exposição aos agentes crioprotetores, parte dos

embriões foram cultivados em meio MS (MURASHIGE e SKOOG, 1962), com o
pH ajustado para 5,7 antes da esterilização em autoclave a 120 ºC com 1Kgf.cm-2
de pressão por 30 minutos. A incubação foi realizada em sala de crescimento com
temperatura de 25 ± 5 ºC e fotoperíodo de 16 horas de luz a uma intensidade
luminosa de 30 µmol.m-2.s-1, pelo tempo de 30 dias.

A outra parte dos embriões foi acondicionada em tubos criobiológicos de

polipropileno estéril de 4,5 mL, os quais foram selados com parafilme e imersos
diretamente no nitrogênio líquido (-196 ºC) por 15 dias.

O cultivo e a criopreservação dos embriões foi realizado sob condições

assépticas, em câmara de fluxo laminar, em recipientes de vidro contendo 25 mL
de meio MS sólido, adicionado de 30 g.L -1 de glucose, 10 ml.L-1 de cloreto de
magnésio hexahidratado, os quais foram transferidos para a sala de crescimento,
sob as condições citadas anteriormente, por 30 dias.

A viabilidade dos embriões foi avaliada semanalmente e, os dados

computados após 30 dias de cultivo, levando-se em consideração a porcentagem
de embriões que produziram plântulas normais.
 17

No procedimento estatístico empregou-se o Programa SAS versão 9.2,

utilizando-se o delineamento inteiramente casualizado (DIC), em esquema fatorial
4 x 4, sendo 4 concentrações de DMSO (0, 5, 10 e 15%) e 4 concentrações de
sacarose (0, 0,25, 0,50 e 0,75 M). Utilizou-se 10 repetições contendo um embrião
por frasco.

4.2 Procedimentos para a desinfestação

As sementes foram extraídas dos frutos manualmente com o auxilio de

uma peneira para facilitar a retirada da polpa, sendo em seguida lavadas em água
destilada e colocadas em álcool a 70% por um minuto. Após esse procedimento
as sementes foram submetidas aos tratamentos de desinfestação referidos na
Tabela 4.1.

Tabela 4.1 Concentrações da solução e tempos de exposição utilizados na

desinfestação de sementes de mangabeira (H. speciosa).
Tempo de Hipoclorito de sódio (NaClO) %
exposição (min.) 1 2 3 4 5
5 T1 T2 T3 T4 T5
10 T6 T7 T8 T9 T10
15 T11 T12 T13 T14 T15
20 T16 T17 T18 T19 T20

O excesso de hipoclorito de sódio foi eliminado submetendo-se as

sementes à lavagem com água destilada e deionizada estéril, 3 vezes;
posteriormente, as sementes foram inoculadas em meio MS básico, sendo três
sementes por recipiente, com 15 repetições e 20 tratamentos, totalizando 300
recipientes.
Os experimentos foram realizados em condições assépticas, utilizando-se
como meio de cultura, o MS (MURASHIGE e SKOOG, 1962), suplementado com
sacarose a 30 g.L-1 e o solidificante ágar a 7 g.L-1, com pH ajustado para 5,7
antes da autoclavagem a 120 ºC com 1Kgf.cm -2 de pressão, durante 30 minutos,
enquanto a incubação foi realizada em sala de crescimento com temperatura de
25 ± 5 ºC e fotoperíodo de 16 horas de luz a uma intensidade luminosa de 30
μmol.m-2.s-1.
 18

A avaliação foi realizada aos 20 dias de cultivo considerando o número de

sementes contaminadas e germinadas.
Para a desinfestação das sementes foi utilizado o Programa SAS versão
9.2, através de um DIC com esquema fatorial: 5 x 4 (5 concentrações de
hipoclorito de sódio x 4 tempos de exposição ao hipoclorito de sódio), sendo 15
repetições contendo 3 sementes por frasco. Os dados foram submetidos a análise
de regressão exponencial múltipla e a interação representada através de gráficos
de superfície de resposta.

4.3 Estabelecimento

As sementes foram estabelecidas em Meio MS básico onde germinaram

obtendo-se 90% de germinação com pouca contaminação (Figura 2 do Anexo),
sendo as plântulas utilizadas para extração das gemas apicais e laterais com a
utilização de bisturis e placas de petri.
As gemas apicais e laterais provenientes de plântulas originárias de
sementes cultivadas em meio MS básico foram estabelecidas em meio MS com
diferentes concentrações de carvão ativado de acordo com a Tabela 4.2,
obedecendo às condições assépticas, onde todo o material utilizado foi
autoclavado a 1 atm de pressão e 120°C por 30 min. Os meios de cultivo foram
ajustado para pH 5,7.
As gemas foram submetidas à lavagem com ácido ascórbico 3 g L -1
durante 1 minuto para diminuir a oxidação, sendo posteriormente submetidas a
três lavagens em água destilada. As gemas apicais e laterais foram cultivadas em
meio MS básico contendo carvão ativado a 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 e 1,0%. Em cada
frasco foi inoculado uma gema lateral e uma gema apical. As avaliações foram
realizadas após 30 dias, levando em consideração a percentagem de brotações e
o comprimento das brotações.
O programa utilizado foi o SAS 9.2, procedimento estatístico foi um DIC,
com 6 tratamentos e 15 repetições, sendo uma gema lateral e uma gema apical
em cada frasco. Os dados foram submetidos à análise de regressão polinomial.
 19

4.4 Alongamento e multiplicação de brotações apicais e laterais

As brotações apicais e laterais estabelecidas em meio MS e carvão ativado

in vitro foram transferidas para o meio de cultura MS básico, suplementado com
reguladores de crescimento, o BAP (6-benzilaminopurina) e o ANA (ácido
naftaleno acético) conforme Tabela 4.3.

Tabela 4.3 Concentrações de reguladores de crescimento em meio MS básico

para alongamento e multiplicação de gemas apicais e laterais de
mangabeira (H. speciosa)
TRATAMENTOS
ANA (mg.L -1)
BAP (mg.L -1) 0 0,25 0,50 0.75 1,0
0 T1 T2 T3 T4 T5
1,0 T6 T7 T8 T9 T10
1,5 T11 T12 T13 T14 T15
2,0 T16 T17 T18 T19 T20
2,5 T21 T22 T23 T24 T25

Para o alongamento e multiplicação das brotações foi utilizado o Programa

SAS versão 9.2, através de um DIC com esquema fatorial: 5 x 5 (5 concentrações
de BAP x 5 concentrações de ANA), sendo 6 repetições contendo 1 brotação
apical e uma brotação lateral por recipiente. Os dados foram submetidos a
análise de regressão exponencial múltipla e a interação representada através de
gráficos de superfície de resposta.

4.5 Enraizamento

As plântulas alongadas nos hormônios ANA e BAP foram colocadas para

enraizar no meio MS contendo o hormônio de enraizamento ácido indolbutírico
AIB. Utilizou-se 8 repetições e 5 concentrações de AIB (0; 0,5; 1,0; 1,5 e 2,0 mg.L-
1
).
 20

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Análises iniciais

Os resultados da caracterização inicial das sementes referentes ao teste de

emergência, teor de umidade das sementes e peso de mil sementes foram
satisfatórios, sendo a percentagem de emergência obtida de 85%, teor de
umidade das sementes de 46,06% e peso de mil sementes de 187,36 g.

5.2 Teor de umidade

Os resultados do teor de umidade das sementes de mangaba durante o

armazenamento variaram com os substratos, a umidade dos substratos, a
temperatura e meses de armazenamento, houve interação entre todos os fatores
analisados sendo significativo a 1 e 5% de probabilidade (Tabela 1 do anexo e
nas Tabelas 5.1, 5.2 e 5.3.).
No terceiro mês de armazenamento a deterioração foi muito grande
(generalizada) e a germinação média foi inferior a 4%, este fato deve-se
provavelmente a fermentação das sementes que foi tanto maior quanto maior foi à
umidade do substrato, razão pela qual somente os resultados dos dois primeiros
meses foram analisados.
Estatisticamente o maior teor de umidade ocorreu para as sementes
armazenadas nos substrato com umidade de 60%, seguido do substrato com 50%
(Tabela 5.1). O teor de umidade das sementes para as demais condições de
umidade dos substratos (30 e 40%) e variáveis estudadas (substratos, meses e
temperatura) não diferiu estatisticamente, com exceção das sementes
armazenadas na areia mais vermiculita com 30% de umidade que obtiveram
umidade inferior. Igual comportamento teve as sementes armazenadas no
segundo mês.
Com relação aos substratos de armazenamento, na vermiculita foi as
sementes que estavam com maior teor de umidade, sendo estatisticamente
superior a areia e a areia mais vermiculita para cada teor de umidade no
substrato, seguido do substrato areia mais vermiculita irrigados com 40, 50 e 60%
de umidade.
 21

Com relação aos meses, o segundo mês foi onde se obteve sementes com
maior teor de umidade, superando estatisticamente o primeiro mês para cada
condição de umidade nos substratos.
O efeito da temperatura em cada substrato de armazenamento revelou
para os substratos de 30 e 40% de umidade igualdade estatística a 0 °C e a -22°C
e superioridade estatística para o teor de umidade das sementes nos substratos
com 60% de umidade.

Tabela 5.1 Teor de umidade das sementes de mangabeira (H. speciosa)

armazenadas nos substratos úmidos.
Umidade Substratos Meses Temperatura
Substratos Areia (A) Vermic.(V) A+V 1 2 0°C -22°C
(%)
30 47,33 cB 52,60 cA 46,71 dC 48,43 cB 49,34 dA 48,47 cB 49,29 cA
40 47,17 cB 52,77 cA 47,39 cB 48,42 cB 49,80 cA 48,80 cB 49,42 cA
50 48,93 bC 53,45 bA 51,21 bB 50,76 bB 51,63 bA 51,40 bA 51,00 bB
60 49,50 aC 54,37 aA 52,52 aB 51,85 aB 52,41 aA 52,18 aA 52,08 aA
Médias 48,24 c 53,30 a 49,46 b 49,86 b 50,79 a 50,22 b 50,45 a
Médias seguidas de mesma letra minúscula na coluna e maiúscula na linha não diferem entre si pelo teste de
tukey a 5%.

Mediante os dados da interação meses x temperatura (Tabela 5.2) tem-se

superioridade estatística no mês 2 para ambas as temperaturas estudadas, e
dentro deste mês, as sementes armazenadas à -22°C (51,08%) se mantiveram
com maior teor de umidade que as armazenadas na temperatura de 0°C
(50,51%).
Para o mês 1 não se registrou diferença estatística para temperatura, as
sementes de mangaba mantiveram-se durante 30 dias a 0 e -22°C com o mesmo
teor de umidade.

Tabela 5.2 Teor de umidade das sementes de mangabeira (H. speciosa)

armazenadas nos substratos úmidos por dois meses nas
temperaturas de 0 e -22°C.
Meses Temperaturas
0°C -22°C
1 49,91 bA 49,81 bA
2 50,51 aB 51,08 aA
Médias 50,21 b 50,45 a
Médias seguidas de mesma letra minúscula na coluna e maiúscula na linha não diferem entre
si pelo teste de tukey a 5%.
 22

Em observação aos dados relativos a interação dos substratos de

armazenamento x meses (Tabela 5.3) tem-se superioridade estatística do
substrato vermiculita seguido do substrato areia mais vermiculita que
estatisticamente foi superior a areia para os meses estudados. Com relação aos
substratos dentro de cada mês, verifica-se que o mês 2 armazenou as sementes
de mangaba com maior teor de umidade que o mês 1. O fato da vermiculita ter
sido o substrato que proporcionou maior umidade das sementes, deve-se,
provavelmente, a sua composição física e a condição de armazenamento de água
no substrato, assim como a permissividade de troca de água do substrato com
semente.

Tabela 5.3 Teor de umidade das sementes de mangabeira (H. speciosa)

armazenadas nos substratos úmidos por dois meses.
Meses
Substratos 1 2
Areia (A) 47,76 cB 48,70 cA
Vermiculita (V) 53,06 aB 53,54 aA
A+V 48,77 bB 50,15 bA
Médias 49,86 b 50,79 a
Médias seguidas de mesma letra minúscula na coluna e maiúscula na linha não diferem entre si
pelo teste de tukey a 5%.

Em resumo os resultados do teor de umidade das sementes evidenciam

que a absorção de água pelas mesmas foi influenciado pelos substratos, umidade
dos substratos e tempo de armazenamento, sendo que quanto maior o percentual
de água no substrato de armazenamento, maior foi o ganho de umidade pelas
sementes; esses resultados concordam com as afirmativas de Koster (1991), ao
ressaltar que os métodos atuais de conservação e armazenamento de sementes
recalcitrantes são baseados em alta manutenção do teor de umidade das
mesmas.

5.3 Germinação

O resumo da análise de variância e o coeficiente de variação referente a

germinação obtido em função das temperaturas, substratos, teores de umidade
do substrato e tempo de armazenamento se encontram na Tabela 2 do anexo,
onde se obteve efeito significativo para todos os fatores e suas interações.
 23

Mediante os resultados da Tabela 5.4, observa-se variação da germinação

das sementes de mangabeira ao longo do período de armazenamento. No
primeiro mês de armazenamento a germinação das sementes foi maior sob
temperatura de 25 ± 3 °C e menor para a temperatura de -22 °C, em que não se
registrou germinação (0,0%), confirmando que a manutenção da baixa
temperatura reduz a atividade das enzimas envolvidas no processo respiratório
sendo um dos principais fatores responsáveis pela perda da viabilidade das
sementes durante o armazenamento (HARRINGTON, 1972).
Observa-se manutenção da germinação de 85% para o substrato A+V com
30% de umidade (bu) mantido à temperatura de 25 °C; germinação essa que se
reduziu à medida que se elevou a umidade do substrato de armazenamento.
Para o armazenamento nos substratos mantidos com 30% de umidade a
segunda melhor germinação tem-se no substrato vermiculita, e a umidade de 40,
50 e 60%, a areia superou estatisticamente a vermiculita nas temperaturas de
armazenamento em que as sementes germinaram (0 e 25 °C).

Tabela 5.4. Germinação (%) de sementes de mangabeira (H. speciosa)

armazenadas em substratos úmidos submetidas a três
temperaturas durante dois meses.
Períodos (Meses)
Umidade 1 2
Temperatura
substrato Substratos Substratos
(°C)
(%) Vermiculita Vermiculita
Areia (A) A+V Areia (A) A+V
(V) (V)
0 36 b B α 60 a A α 59 b A α 14 a A β 15 a A β 18 a A β
30 -22 0cAα 0bAα 0cAα 0bAα 0bAα 0bAα
25 63 a B α 69 a B α 85 a A α 0bAβ 0bAβ 0bAβ

0 32 b B α 13 b C α 56 b A α 7aAβ 4aAβ 7aAβ

40
-22 0cAα 0cAα 0cAα 0bAα 0bAα 0bAα
25 64 a B α 84 a A α 79 a A α 0bAβ 0bAβ 0bAβ

0 18 b B α 3bCα 36 b A α 5aAβ 0aBβ 3 a AB β

50
-22 0cAα 0bAα 0cAα 0bAα 0aAα 0aAα
25 52 a B α 64 a AB α 72 a A α 0bAβ 0aAβ 0aAβ

0 17 b B α 2bCα 39 b A α 3aAβ 3aAβ 3aAβ

60
-22 0cAα 0bAα 0cAα 0aAα 0aAα 0aAα
25 49 a B α 66 a A α 65 a A α 0aAβ 0aAβ 0aAβ
Médias seguidas de mesma letra minúscula na coluna, maiúscula na linha (substrato em cada temperatura e
mês) e grega na linha (mês em substrato e temperatura) não diferem a 5% de probabilidade pelo teste de
Tukey.

Aos sessenta dias de armazenamento, os registros de germinação

ocorreram somente para a temperatura de 0°C, com os maiores percentuais de
 24

germinação para os substratos submetidos à 30% de umidade, onde o substrato

A+V se destacou no armazenamento das sementes de mangabeira, mas que
estatisticamente não diferiu a germinação (18%) das sementes armazenadas no
substrato areia (14%) e vermiculita (15%). Assim, pode-se afirmar que a
tolerância à dessecação é provavelmente devido a interação dos fatores e
processos que estão ocorrendo no armazenamento, e não por qualquer um
agindo isoladamente, onde a ausência de qualquer fator que confere tolerância a
desidratação pode ter consequências profundas na capacidade de sobrevivência
das sementes em um nível de desidratação inferior ao tolerável (BERJAK e
PAMMENTER, 2003).
De acordo com estes resultados fica evidenciado a manutenção da
viabilidade até 60 dias do armazenamento das sementes de mangabeira na
temperatura de 0 °C que em condições naturais é de apenas de 2 a 4 dias depois
de desligadas da planta-mãe após a maturação (ESPÍNDOLA et al., 1993; VIEIRA
NETO, 2002).
Estes resultados em parte concordam com os de Black et al. (2002) ao
tratar as sementes entre as ortodoxas e recalcitrantes que não podem ser
armazenadas usando-se os padrões de protocolos recomendados para
armazenamento.
Os resultados obtidos com esta pesquisa permitem afirmar que as
sementes de mangabeira podem ser armazenadas em ambientes bem definidos e
controlados por um prazo médio, concordando com a afirmação de Salomão et al.
(2005), ao informarem que a viabilidade das sementes de H. speciosa pode ser
parcialmente conservada, por cerca de 6 meses quando armazenadas a 20° C ou
15°C com conteúdo de umidade em torno de 50%.
Para estimar a germinação das sementes de mangabeira armazenadas em
cada teor de umidade dos substratos testaram-se equações polinomiais e elegeu-
se a que melhor representou cada situação, comprovando-se a significância do
teste F e o valor do coeficiente de regressão (R2), conforme Tabela 2 do anexo.
Verifica-se na figura 5.1 o comportamento linear de germinação das
sementes de mangaba armazenadas nos substratos areia (A) e areia mais
vermiculita (A+V) com perda do poder germinativo à medida que se aumentou o
teor de água do substrato de armazenamento e, efeito quadrático para a
germinação das sementes armazenadas no substrato vermiculita (V), onde se
 25

registrou a maior perda na capacidade germinativa das sementes armazenadas

nos diferentes substratos estudados; onde a partir de 50% de água no mesmo as
sementes praticamente não germinaram. Os 3% de germinação obtidos com as
sementes do substrato vermiculita com 60% de umidade deveu-se,
provavelmente, a variabilidade das sementes dentro do lote, fato também
observado por Fernandes et al. (1999) que registraram variações quanto ao vigor
individual de sementes de pimentão da cultivar Ikeda, dentro do lote devido a
genética.
Observa-se ainda na Figura 5.1 germinação de 60% para as sementes
armazenadas em substrato de areia e areia mais vermiculita umedecidas com
30% de água, enquanto a germinação das sementes provenientes do
armazenamento no substrato vermiculita com este mesmo teor de umidade (30%)
foi de aproximadamente 36%.

Areia Vermiculita Areia+vermiculita

100 y Areia = 57,7 - 0,71x
R² = 0,90
y Vermiculita = 320,8 - 12,19x + 0,115x2
80 R² = 0,98
Germinação (%)

y Areia+vermiculita = 83,5 - 0,8x

R² = 0,78
60

40

20

0
30 40 50 60
Teor de umidade no substrato (%)

Figura 5.1 Germinação (%) de sementes de mangabeira (H.speciosa)

armazenadas em substratos úmidos submetidas a temperatura de
0°C durante o primeiro mês.

No levantamento bibliográfico realizado não foram encontradas

informações sobre o armazenamento em substratos úmidos (com diferentes
teores de umidade) desta forma, a discussão se limita a comparação dos
resultados obtidos com os observados para testes de germinação com sementes
de interesse agrícola.
 26

Estes resultados são importantes por vislumbrar a possibilidade de

aprimorar esta técnica para a conservação ex situ de sementes de mangaba por
um período maior de 30-60 dias, permitindo, em um primeiro momento, ser usada
para fins exclusivos de pesquisa, oferecendo facilidades para introdução,
multiplicação, regeneração, caracterização, avaliação, documentação e
distribuição de acessos aos pesquisadores em particular.
Salienta-se que após a maturação e desprendimento dos frutos da planta-
mãe as sementes de mangabeira devem ser semeadas imediatamente ou até 48
horas depois de retiradas dos frutos, uma vez que, a partir do quarto dia, o poder
germinativo cai rapidamente (ESPÍNDOLA et al., 1993).
Com relação à Figura 5.2 observa-se comportamento linear da germinação
das sementes de mangabeira armazenadas no substrato areia (A) com perda do
poder germinativo à medida que se elevou o teor de água do substrato de
armazenamento, e houve efeito quadrático para a germinação de sementes
armazenadas nos substratos vermiculita (V) e areia mais vermiculita. De maneira
geral, a germinação das sementes em todos os substratos de armazenamento foi
baixa, chegando a 19% para as sementes provenientes do armazenamento em
areia mais vermiculita (A+V) com 30% de teor de água no substrato. As
sementes do armazenamento em areia (A) e vermiculita (V) com 30% de umidade
obtiveram 17% de germinação, a qual se reduziu à medida que se elevou o teor
de água nos substratos.
As sementes provenientes do armazenamento em vermiculita com 50 e
60% de teor de umidade a germinação foi nula. Isso pode ser explicado, pois,
durante a condução do experimento observou-se que a partir do segundo mês as
sementes encontravam-se fermentadas dentro do armazenamento. Segundo
Carvalho e Camargo (2003), a deterioração das sementes demonstra ser o
resultado de um complexo conjunto de disfunções metabólicas e reações
químicas, que atuam no sentido de alterar as funções específicas de cada
constituinte celular.
 27

Areia Vermiculita Areia+vermiculita

100

80 y Areia = 23 - 0,35x
Germinação (%)

R² = 0,89

60 y Vermiculita = 79,05 - 2,965x + 0,027x2

R² = 0,99
y Areia+vermiculita = 82,05 - 2,965x + 0,027x2
40 R² = 0,99

20

0
30 40 50 60
Teor de umidade no substrato (%)

Figura 5.2 Germinação (%) de sementes de mangabeira (H. speciosa)

armazenadas em substratos úmidos submetidas a temperatura de
0°C durante o segundo mês.

Na Figura 5.3 observa-se comportamento linear na germinação das

sementes de mangabeira armazenadas nos substratos úmidos de areia (A) e
areia mais vermiculita (A+V). Os dados de germinação das sementes
armazenadas em vermiculita (V) úmida não se ajustaram ao modelo de regressão
linear ou quadrática, obtendo-se um valor médio de 71%.
As sementes armazenadas em areia mais vermiculita (A+V) foram as que
obtiveram maior percentagem de germinação atingindo 83% e as sementes da
areia úmida obtiveram 70% de germinação quando ambos os substratos tinham
30% de teor de umidade.
 28

Areia Vermiculita Areia+vermiculita

100

80
Germinação (%)

60

40 y Areia = 81,3 - 0,54x y Areia+vermiculita = 105,4 - 0,67x

R² = 0,84 y Vermiculita = 71
R² = 0,99

20

0
30 40 50 60
Teor de umidade no substrato (%)

Figura 5.3 Germinação (%) de sementes de mangabeira (Hancornia speciosa G.)

armazenadas em substratos úmidos submetidas a temperatura de 25
°C durante o primeiro mês.

Observa-se também que o teor de umidade nos substratos de

armazenamento e, consequentemente, das sementes poderia ser diminuído, vez
que houve germinação na temperatura de 25 °C durante o armazenamento;
sugerindo que se deve testar menores teores de umidade no substrato de
armazenamento, assim como, novos intervalos de temperaturas e novas técnicas.
Sobre o tema de novas técnicas, Ferraz e Sampaio (1996) obtiveram germinação
de 82 a 96% para Carapa guinensis e de 55 a 99% para C. procera com estas
sementes acondicionadas e armazenadas em sacos que foram enterradas pela
fauna do solo, permitindo a embebição das sementes, e resultando em
germinação durante o armazenamento. Lecointe (1939) recomendou armazenar
sementes de andiroba em água corrente para conservar a viabilidade das
mesmas; técnica que aplicada por Ferraz e Sampaio (1996) não manteve a
viabilidade das sementes de duas espécies de andiroba por um período de sete
meses, tendo estes pesquisadores recomendado estudar menores períodos de
exposição das sementes em água.
Fonseca e Freire (2003) revisando sobre o tema do armazenamento de
sementes úmidas, dizem ser o suprimento de oxigênio essencial à respiração,
que produzirá energia metabólica necessária à ativação e sustentação de
 29

mecanismos de reparo e de substituição celular, tendo como conseqüência a

ampliação do período de conservação e, que se deve evitar o acúmulo de gás
carbônico, por ser prejudicial à qualidade fisiológica das sementes. Afirmações
que em parte concordam com os resultados deste trabalho, vez que as sementes
de mangaba foram armazenadas em substratos úmidos e acondicionados em
caixas plásticas ermeticamente fechadas.
Desta forma, o sucesso da conservação das sementes de mangaba está
intimamente relacionado com as condições do armazenamento, em especial, com
o teor de umidade das sementes, que neste trabalho foi fornecido pela umidade
dos substratos de armazenamento e, que apesar da manutenção da viabilidade
das sementes para a melhor condição do armazenamento (0 e 25 °C a 30% do
teor de umidade no substrato) o período de manutenção da germinação inicial foi
de apenas 60 dias. Resultados que recomendam ser testadas novas condições
de armazenamento.
Salomão et al. (2005) apóiam esses resultados quando afirmaram que as
sementes de mangaba para manter sua viabilidade durante o armazenamento a
curto prazo (cerca de seis meses) devem ser conservadas com umidade em torno
de 50% nas temperaturas de 15 e 20 °C.

5.4 Vigor

Mediante o resumo da análise de variância para o vigor (Tabela 3 do

anexo), observa-se efeito significativo do comprimento de plântulas para o teor de
água nos substratos, mês e a interação teor de água nos substratos e meses (TA
x meses). Para a massa seca tem-se valor significativo da interação dupla TA x
SUBS e para TA x SUBS x T.
Em análise aos dados contidos na Tabela 4 do anexo e Figura 5.3 observa-
se igualdade estatística para o comprimento de plântulas dentro dos tempos
(meses) para as sementes armazenadas no substrato com 30% de umidade à
temperatura de 0 °C, e superioridade estatística do comprimento de plântulas na
primeira avaliação (mês 1) do armazenamento para as demais umidades (40, 50
e 60%) nos substratos de armazenamento. Dentro de cada tempo (mês) o
comprimento de plântulas no mês 1 variou de 9,93 cm para as sementes
armazenadas no substrato com 50% de umidade à 11,07 cm para o
 30

armazenamento em substrato com 40% de umidade e 10,15 cm de comprimento

de plântulas no substrato com 60% de umidade. Na segunda avaliação (mês 2), o
comprimento das plântulas diminuíram à medida em que se elevou a umidade do
substrato de armazenamento tendo variado de 10,08 cm (30% de umidade no
substrato) à 7,20 cm (60% de umidade no substrato). Em termos médios a perda
total do vigor determinado pelo comprimento de plântulas foi de 30% durante o
armazenamento para os teores de umidade nos substratos.

Figura 5.4 Comprimento das plântulas resultantes da germinação das sementes

de mangabeira (H. speciosa) após o primeiro e segundo mês de
armazenamento à 0°C.

Para temperatura, especificamente, os resultados são em parte

concordantes com as afirmações de King e Roberts (1979) de que a germinação
no armazenamento pode apresentar perdas significativas na conservação das
sementes recalcitrantes quando mantidas úmidas e sob temperaturas
inadequadas, e Almeida et al. (2000) dizem ser necessário aprimorar o
conhecimento científico sobre os mecanismos fisiológicos recomendados a
sensibilidade, a dessecação e as baixas temperaturas para determinar métodos
eficientes de armazenagem das sementes recalcitrantes.
Ademais, Faiad et al. (1998) tratando o tema de conservação de sementes
recalcitrantes informam que não existe métodos disponíveis na atualidade na
 31

conservação a longo prazo dessas sementes. Afirmativa que põe em manifesto a

importância dos resultados obtidos neste trabalho em procurar soluções viáveis e
simplificadas de conservação à curto prazo, do germoplasma da mangabeira por
meio de métodos alternativos de conservação.
De maneira geral, verifica-se mediante os dados que as plântulas
obtiveram um bom vigor quando se compara aos dados da literatura uma vez que
Nogueira et al. (2003) obtiveram em plântulas de mangabeira comprimento
inferior aos observados neste trabalho.
De acordo com a Tabela 5.5 observa-se que a massa seca das plântulas
obtidas das sementes provenientes do armazenamento no substrato areia na
temperatura de 0 °C com 30% do teor de água no substrato teve diferença
significativa com relação às sementes obtidas dessa combinação na temperatura
de 25 °C. Já as plântulas obtidas das sementes provenientes do armazenamento
nas temperaturas de 0 e 25 °C em todas as combinações de teor de água nos
substratos e em todos os substratos não diferiram estatisticamente,
representados pelas letras minúsculas nas colunas.

Tabela 5. 5 Massa seca de plântulas de mangabeira (H. speciosa)

Períodos (Meses)
Umidade 1 2
Temperatura
nos Substratos Substratos
(°C)
substratos Vermiculita
Areia (A) Vermiculita (V) A+V Areia (A) A+V
(V)
0 0,045 b A α 0,050 a A α 0,069 a A α 0,033 A α 0,039 A α 0,033 A α
30 -22
25 0,286 a A 0,054 a B 0,050 a B

0 0,054 a A α 0,049 a A α 0,066 a A α 0,118 A α 0,020 A α 0,035 A α

40
-22
25 0,059 a A 0,061 a A 0,058 a A

0 0,065 a A α 0,058 a A α 0,064 a A α 0,027 A α 0,023 A α

50
-22
25 0,045 a A 0,058 a A 0,053 a A

0 0,068 a A α 0,060 a A α 0,064 a A α 0,022 B α 0,0257 A α

60
-22
25 0,059 a A 0,054 a A 0,049 a A
Médias seguidas de mesma letra minúscula na coluna, maiúscula na linha (substrato em cada temperatura e mês) e grega
na linha (mês em substrato e temperatura) não diferem a 5% de probabilidade pelo teste de Tukey.

Os resultados do vigor revelados pela massa seca das plântulas de

mangaba foram estatisticamente iguais com exceção do substrato de
armazenamento areia com 30% de umidade que mantido à 25 °C foi superior a
massa seca das sementes armazenadas à temperatura de 0 °C nesse mesmo
substrato e no primeiro mês de armazenamento.
 32

Os resultados da massa seca não foram tão esclarecedores quanto a

consistência das variações reveladas por meio do estudo estatístico,
provavelmente, devido ao peso das plântulas analisadas revelado pelo
desenvolvimento das plântulas nos substratos de armazenamento irrigados com
30% de umidade, e acondicionados à 25 °C que ficou na casa dos décimos de
gramas (0,286 g) contra os centésimos de gramas (neste caso específico de
0,045 g) em todas as demais condições de armazenamento; exigindo, assim,
maiores pesquisas sobre o tema da massa seca, vir a ser utilizada como teste de
viabilidade de mangaba, nestas condições de conservação. No entanto, os
resultados permitem comentar que o armazenamento à temperatura negativa (-22
°C) não se mostrou favorável ao armazenamento da mangaba para as condições
do estudo, e ser possível nas temperaturas de 0 °C e 25 °C, sendo a exceção
deste tratamento (areia com umidade de 30% a temperatura de 25 °C)
ressaltando para todos os demais comportamento iguais estatisticamente.
Salomão et al. (2005) em estudo sobre a conservação de mangaba
concluíram ser possível manter a viabilidade de sementes de mangaba por cerca
de seis meses quando armazenadas à 15 ou 20 °C com conteúdo de umidade de
50% e perda total de viabilidade quando se reduziu o conteúdo de umidade para
valores inferiores a 11%. Afirmativa que encontra apóio nas de Andrade et al.
(2005) quando dizem que as sementes recalcitrantes desidratadas após a colheita
perdem gradualmente a viabilidade, passando por um ponto crítico até atingir um
teor de água chamado letal. Borges e Rena (1993) relatam que em temperaturas
baixas pode está havendo desativação de enzimas e limitação do crescimento do
embrião, e que temperaturas baixas pode inibir atividades catabólicas em
sementes que requerem temperaturas mais altas para germinar ou impedir a
ativação de enzimas (MAGUIRE, 1973).

5.5 Germinação de embriões submetidos à DMSO e sacarose

Os embriões provenientes da vitrificação que foram criopreservados por 15

dias em nitrogênio liquido a -196°C não germinaram, provavelmente a ação do
crioprotetor DMSO pode ter afetado os tecidos dos embriões, tendo em vista que
os principais fatores limitantes da vitrificação são o estresse osmótico e a
 33

toxicidade química do crioprotetor os quais causam danos às células embrionárias

(PAPADOPOULOS et al., 2002).
Apesar da vitrificação ter se mostrado uma boa alternativa para
criopreservar embriões produzidos in vitro em outras pesquisas, devido a sua
rápida passagem para o estágio vitreo e a não necessidade de congeladores
biológicos que controlam a curva de temperatura, existe dificuldades de se
estabelecer um protocolo padrão de criopreservação de embriões de várias
espécies (SANTIN et al., 2009).
Os embriões que germinaram foram os colocados em DMSO e sacarose e
posteriormente cultivados em meio MS, sendo que a germinação desses
embriões variou de acordo com as doses de DMSO e sacarose a que foram
submetidos.
Avaliando-se os fatores isoladamente na Figura 5.5, observa-se que a
medida que se elevou as dosagens de DMSO a germinação reduziu, enquanto
que com relação as concentrações de sacarose praticamente mantiveram a
germinação. Ao se analisar a interação das dosagens de DMSO com as
concentrações de sacarose observa-se que os maiores percentuais de
germinação foram obtidos dos embriões que foram submetidos às concentrações
mais elevadas de sacarose (0,75 e 0,50 M) com redução das dosagens de
DMSO. Na concentração máxima de sacarose (0,75 M) combinada com a
ausência de DMSO (0%) os embriões obtiveram uma germinação de 98%, na
ausência de DMSO e sacarose os embriões obtiveram aproximadamente 90% de
germinação, já os embriões provenientes da combinação de 15% de DMSO com
a ausência de sacarose não germinaram.
 34

2 2 2
Y= exp(378,46 + 24,81D+1111,61S +1976,1S + 7,489D S- 179DS )/
2 2 2
1+ exp(378,46 + 24,81D+5,04D +1111,61S +1976S -179,7DS

R2 =0,93

Figura 5.5 Germinação in vitro de embriões de mangabeira (H. speciosa)

submetidos ao tratamento com DMSO e sacarose antes de serem
colocados no meio MS.

A percentagem de folhas das plântulas provenientes dos embriões de

mangabeira variou de acordo com as concentrações de sacarose e percentagens
de DMSO. Analisando os fatores isoladamente na Figura 5.6, observa-se que a
medida que se elevou as dosagens de DMSO e diminuiu as concentrações de
sacarose a percentagem de folhas reduziram. Obteve-se a maior percentagem de
folha que foi de 93%, nas plântulas provenientes dos embriões que estavam na
concentração máxima de sacarose (0,75 M) combinado com a ausência de
DMSO, reduzindo-se o número de folhas à medida que as percentagens de
DMSO aumentaram, sendo que na ausência de DMSO e sacarose obteve-se
aproximadamente 80% de folhas, chegando a zero na dose máxima de DMSO
(15%) com ausência de sacarose (Figura 5.6).
 35

2 2 2 2 2
Y= exp(199,02-40,65D-4,004D -68,24S+210,38S +80,7DS-3,418 D S +9,098D S/
2 2 2 2 2
1+exp(199,02-40,65D-4,004D -68,24S+210,38S -80,7DS-3,418D S +9,098D S

R2 = 0,85

Figura 5.6 Quantidade de folhas em percentagem, provenientes dos embriões de

mangabeira (H. speciosa) submetidos ao tratamento com DMSO e
sacarose antes de serem colocados no meio MS.
.

O comprimento das plântulas originadas dos embriões submetidos ao

tratamento com DMSO e sacarose também teve um desempenho parecido com o
percentual de germinação e percentagem de folhas, onde observa-se através da
Figura 5.7 que a medida que se elevou as dosagens DMSO e reduziu-se as
concentrações de sacarose o comprimento das plântulas também diminuíram,
sendo o maior comprimento de 7,8 cm nas plântulas provenientes dos embriões
submetidos a dose máxima de sacarose e ausência de DMSO, na ausência de
DMSO e sacarose o comprimento das plântulas foi de aproximadamente 5cm
chegando a zero na dose máxima de DMSO (15%) com ausência de sacarose.
 36

Y= exp(36,64+33,9D-3,448D2+409,48S-240,06DS+18,62D2S2+19,39D2S+237,51DS2)/
1+exp(36,64+33,9D-3,448D2+409,48S-240,06DS+18,62D2S2+19,39D2S+237,51DS2)

R2=0,67

Figura 5.7 Comprimento das plântulas provenientes dos embriões de mangabeira

(H. speciosa) submetidos ao tratamento com DMSO e sacarose antes
de serem colocados no meio MS.
.

De forma geral, no presente trabalho, quanto maior foi a concentração de

sacarose aplicada melhor a viabilidade dos eixos embrionários, ocorrendo o
contrário para as dosagens de DMSO aplicadas, onde observa-se nas Figuras 5.5
, 5.6 e 5.7, uma germinação de 98%, 95% de folhas e 8cm de comprimento das
plântulas, respectivamente, para a concentração de 0,75M de sacarose
combinada com ausência de DMSO. O comportamento do DMSO, no qual quanto
menor a dose maior a viabilidade da sementes representados por essas variáveis
(germinação, percentagens de folhas e comprimento de plântulas) deve-se
provavelmente ao efeito fitotóxico como também ao estresse osmótico que este
pode promover levando as células à morte ou modificando sua morfogenética
conforme observado por Sakai (1995).
Entretanto, conforme os resultados os crioprotetores apesar de agir
reduzindo os danos celulares causados pelos efeitos das concentrações de sais
no meio e possuírem estruturas que lhes permitem fazer ligações de hidrogênio
com a molécula de água, diminuindo assim, a formação de cristais de gelo, não
 37

permitindo o aumento do tamanho desses cristais e diminuindo a concentração de

solutos nos meios extra e intra-celulares (SIMIONE e SHEEHAN, 1998). Para
isso, de acordo com os resultados desse trabalho faz-se necessário estabelecer
quantidades para cada material a ser utilizado como no caso em estudo em que
0,75 M de sacarose na ausência de DMSO foi onde obteve-se os melhores
resultados para a germinação, percentagem de folhas e comprimento de
plântulas.

5.6 Desinfestação de sementes de mangabeira

A contaminação das sementes variou de acordo com a concentração de

hipoclorito de sódio e o tempo de exposição. Na Figura 5.7 consta decréscimo na
contaminação, com o aumento da concentração de hipoclorito de sódio, além da
tendência de diminuição da contaminação com o aumento do tempo de exposição
ao agente desinfestante, chegando a contaminação de 0% na concentração de
hipoclorito à 5% no tempo de 20 minutos. Estes resultados concordam com os de
Moraes (2007), que observou em gemas de abacaxizeiro cv.EMEPA 1 que com o
aumento das concentrações de hipoclorito de sódio e do tempo de exposição
houve diminuição da contaminação.
Os gêneros de fungos encontrados na contaminação das sementes de
mangabeira foram: Curvularia, Rhizopus e Penicillium, esses fungos são alguns
dos principais que causam problemas nos tecidos cultivados in vitro segundo
Oliveira et al. (2000). A ilustração dos fungos detectados nesse experimento
encontra-se na Figura 3 do anexo.
 38

2 2 2 2 2 2
Y= exp(-1078,43+323,54T-12,96T 792H-140,28H -185,09TH-1,424T H +7,54T H+32,83TH )/
2 2 2 2 2 2
1+exp(-1078,43+323,54T-12,96T 792H-140,28H -185,09TH-1,424T H +7,54T H+32,83TH )

R2 = 0,89

Figura 5.8 Contaminação de sementes de mangabeira (H. speciosa) submetidas

a desinfestação.

A germinação das sementes submetidas a desinfestação variou de acordo

com a concentração de hipoclorito de sódio e tempo de exposição (Figura 5.9). A
medida que a concentração de hipoclorito e o tempo de exposição aumentou
também aumentou a percentagem de germinação, observando-se que a
desinfestação com hipoclorito à 5% por 20 minutos promoveu 98% de germinação
das sementes de mangabeira. Na combinação de 1% de hipoclorito por 5 minutos
a germinação foi de 82%.
 39

2 2 2 2 2 2
Y= exp(-23,41+47,16T-2,183T +115,4H-6,662H -34,57TH-0,219T H +1,778T H+4,032TH )/
2 2 2 2 2 2
1+exp(-23,41+47,16T-2,183T +115,4H-6,662H -34,57TH-0,219T H +1,778T H+4,032TH )

R2= 0,66

Figura 5.9 Germinação de sementes de mangabeira (H. speciosa) submetidas a

desinfestação.

5.7 Estabelecimento das gemas apicais e laterais

No estabelecimento das gemas apicais e laterais a presença do carvão

ativo pode ter contribuído para diminuir a oxidação (Figuras 4 a 15 do anexo),
uma vez que o carvão ativado adicionado ao meio de cultura, possui a
capacidade de adsorver substâncias tóxicas liberadas pelos explantes ou
impurezas de outros componentes (GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1998).
Na Tabela 5.7, observa-se através da análise de variância que não houve
diferença estatistica dos dados analisados, ou seja, as concentrações de carvão
ativado (0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0%) no meio de cultivo não interferiram nas
brotações apicais e laterais. Desta forma, Pan e Standen (1998) indicaram a
hipótese de que a adição de carvão ativado no meio de cultura pode promover ou
inibir o crescimento in vitro, a depender da concentração utilizada, fato confirmado
por Nunes et al. (2008).
 40

Tabela 5.6 Resumo da análise de variância do estabelecimento das gemas

apicais e laterais de mangabeira (Hancornia speciosa G.) em meio
MS com doses de carvão ativo.
Quadrados médios
Fonte de variação GL
*COMPAP COMPLAT NUMFA NUMFLAT
Tratamentos (5) 0,149711 NS 0,095467 NS 0,171111NS 0,151111 NS
Linear 1 0,072086 NS 0,018438 NS 0,214286 NS 0,003810 NS
Quadrática 1 0,012698 NS 0,016071 NS 0,134127 NS 0,003175 NS
Resíduo 84 0,229317 0,079508 0,066667 0,077778
CV (%) 34,84 49,18 23,96 25,61
*COMPAP (Comprimento das gemas apicais), COMPLAT (Comprimento das gemas laterais), NUMFA
(Número de folhas das gemas apicais), NUMFLAT (Número de folhas das gemas laterais)

5.8 Alongamento e multiplicação

De acordo com a Figura 5.10 e Figura 16 do anexo, observa-se que na

ausência de BAP em todas as doses de ANA obteve-se aproximadamente 70%
de brotações apicais. As menores percentagens de brotações ocorreram quando
a concentração de BAP foi de 0,83 mg.L-1 e a concentração de ANA de 1 mg.L-1 e
já com a dose máxima de BAP de 2,5 mg.L-1 independentemente das doses de
ANA ocorreram as maiores percentagens de brotações, aproximadamente de
85%. Esses dados colaboram com os de Fonseca et al., (2003) que obtiveram o
maior número de brotações em mangabeira com as concentrações de 1,0 e 2,0
mg.L-1 de BAP, já com a utilização de 4,0 mg.L-1 de BAP reduziu em até quatro
vezes a indução de novos brotos.
O efeito benéfico do BAP na multiplicação das brotações pode ser
relacionado com a influência desse regulador na divisão celular e na quebra de
dormência das gemas axilares, até então inibidas pela dominância apical (BRUM
et al., 2002).
 41

2 2 2 2
Y= exp(105,08-155,56B+54,14B -156,48A+76,06A +43,67B A-38,98BA )/
2 2 2 2
1+exp(105,08-155,56B+54,14B -156,48A+76,06A +43,67B A-38,98BA )

R2= 0,66

Figura 5.10 Alongamento e multiplicação de brotações apicais de mangabeira

(H. speciosa) em função das doses de ANA e BAP.

De acordo com a Figura 5.11 e Figura 17 do anexo, observa-se que as

percentagens de brotações laterais foram baixas em relação as brotações apicais,
tendo em vista que na dose mais elevada de BAP de 2,50 mg.L-1 e ausência de
ANA, as brotações foram de aproximadamente 27,8%. Silva et al. (2005) em
trabalho com Citrus reshni Hort. ex Tan., também constataram que as brotações
apicais mostraram-se mais eficientes na indução da organogênese in vitro que as
laterais.
Quando utilizou-se 1 mg.L-1 de BAP e 1 mg.L-1 de ANA as brotações foram
iguais a zero. Com ausência de BAP e elevação das dosagens de ANA observa-
se que as brotações aumentaram. Da mesma forma, Andrade et al. (2006)
verificaram que o aumento no número de brotações de Eucalyptus grandis Wood
foi inversamente proporcional ao aumento da dosagem e do tempo de exposição
ao BAP, o que evidencia que as concentrações mais elevadas dessa citocinina
foram inibitórias para o processo de multiplicação.
 42

2 2 2
Y= exp(94,47+248,62B+91,01B + 34,18A + 45,29A +12,28B A)/
2 2 2
1+exp(94,47+248,62B+91,01B + 34,18A + 45,29A +12,28B A)

R2=0,67

Figura 5.11 Alongamento e multiplicação de brotações laterais de mangabeira (H.

speciosa) em função de doses de ANA e BAP.

Não houve efeito significativo das doses de ANA e BAP para o

comprimento das brotações laterais. Porém, houve efeito significativo das doses
de BAP para o comprimento das gemas apicais (Figura 5.12), a medida que as
doses de BAP aumentaram o comprimento das brotações apicais diminuíram,
assim o BAP interferiu no comprimento das brotações. Apesar da utilização de
citocinina ser essencial à multiplicação da parte aérea, o seu excesso é tóxico e
pode resultar, entre outros efeitos, na redução do tamanho das folhas e
encurtamento dos entrenós (LESHEN et al., 1988). Grattapaglia e Machado
(1998) relatam também que a tendência de diminuição do comprimento de
brotações a partir de determinada concentração pode decorrer de um possível
efeito fitotóxico da citocinina.
Esse efeito tóxico das citocininas pode provocar encurtamento dos caules
e interferir até no enraizamento, pois segundo Pasqual (2001) altas taxas de
citocininas podem reduzir o tamanho das brotações e estimular a ocorrência de
hiperidricidade e formação de folhas anormais.
 43

Figura 5.12 Comprimento de brotações apicais de mangabeira (H. speciosa)

em função das doses de BAP.

5.9 Enraizamento

De acordo com as Figuras 5.13, 5.14 e também na Figura 18 do anexo,

observa-se que ocorreu indução de raízes nas brotações apicais e laterais
utilizando-se as doses de AIB de 0 à 2,5 mg.L-1, opondo-se aos resultados de
Soares et al. (2007b) que informam que o AIB induziu a formação de raízes em
brotações de mangabeira somente na concentração de 3,0 mg.L-1.
O número de raízes das brotações apicais variaram de acordo com as
dosagens de AIB, observa-se que o tratamento com 1,0 mg.L-1 foi o que
apresentou maior média para o número de raízes chegando a 2,5 média de
raízes, enquanto nos demais tratamentos obteve-se em média 2,0 raízes por
tratamento (Figura 5.13). Certas espécies, principalmente as lenhosas, enraízam
com dificuldade ou não enraízam, mesmo na presença de auxinas e algumas
espécies até dispensam o uso de reguladores de crescimento no seu
enraizamento (ROHR e HANUS, 1987).
 44

Figura 5.13 Número de raízes nas brotações apicais de mangabeira (H.speciosa)

em função das doses de AIB.

O número de raízes das brotações laterais variaram de acordo com as

doses de AIB, observa-se que na dose 1 e 1,5 mg.L-1 de AIB ocorreu a indução
de 2 raízes por tratamento, na dose de 0,5 mg.L-1 de AIB ocorreu a indução de
apenas uma raiz, em 2,0 mg.L-1 de AIB ocorreu uma média de 1,6 raízes (Figura
4.14). Alfenas et al. (2004) indicaram a permanência dos explantes por 7 a 15
dias em meio de cultura contendo 1,0 mg.L-1 de AIB para se obter melhores
respostas.
 45

Figura 5.14 Número de raízes nas brotações laterais de mangabeira (H.

speciosa) em função das doses de AIB.

O comprimento das raízes provenientes das brotações apicais variaram

com relação as doses de AIB, observa-se que as raízes provenientes de 0 e 1
mg.L-1 de AIB obtiveram aproximadamente 1,3 cm de comprimento; as raízes
oriundas de 0,5 mg.L-1 de AIB obtiveram 2,8 cm de comprimento; as raízes que
estavam em 1,5 mg.L-1 de AIB obtiveram 2,3 cm e as que estavam submetidas a
2 mg.L-1 de AIB obtiveram 1,5 cm de comprimento (Figura 5.15).
 46

Figura 5.15 Comprimento de raízes das brotações apicais de mangabeira (H.

speciosa) em função das doses de AIB.

O comprimento das raízes provenientes das brotações laterais variaram

com relação as doses de AIB, observa-se que em 0 e 1,5 mg.L-1 de AIB as raízes
obtiveram 1cm de comprimento; já à 0,5 e 1,0 mg.L-1 de AIB as raízes obtiveram
0,5 cm de comprimento e em 2,0 mg.L-1 de AIB as raízes obtiveram 1,2 cm de
comprimento (Figura 5.16).
 47

Figura 5.16 Comprimento de raízes das brotações laterais de mangabeira (H.

speciosa) em função das doses de AIB.

Os resultados obtidos neste trabalho concordam ainda com as afirmações

de Silva Júnior e Lédo (2006), de que o sucesso de um sistema de
micropropagação depende do controle de grande número de fatores endógenos e
exógenos, pois ocorre uma variação nas respostas morfogenéticas da
mangabeira nas diferentes condições de cultivo in vitro, e também deve-se
considerar o fato de que as plantas lenhosas, que contemplam grande parte das
frutíferas, inclusive a mangabeira, apresentam dificuldades relevantes para o
estabelecimento in vitro (ERIG e SCHUCH, 2003).
 48

6. CONCLUSÕES

 A umidade do substrato, a temperatura e o tempo de armazenamento

influenciam no vigor das plântulas;

 As sementes de mangaba apresentam melhor viabilidade quando

armazenadas no substrato areia mais vermiculita mantido com teor de
umidade de 30% à temperatura de 0°C por 60 dias;

 A temperatura de -22°C não foi satisfatória para o armazenamento das

sementes de mangaba nos substratos (areia, vermiculita e areia mais
vermiculita) e teores de umidades estudados (30, 40, 50 e 60%);

 O método da vitrificação não foi eficiente para a conservação dos

embriões, havendo porém, efeito para germinação, percentagem de folhas
e comprimento de plântulas originadas dos embriões que foram
submetidos a DMSO e sacarose e colocados em meio MS;

 A concentração de 5% de hipoclorito de sódio por 20 minutos proporcionou

o menor índice de contaminação e uma percentagem de germinação de
98%;

 O efeito isolado do BAP e ANA (mg.L-1) aumentaram o número de

brotações apicais e laterais de mangabeira;

 A combinação das doses de BAP e ANA (mg.L-1) interferem no número

de brotações apicais e laterais de mangabeira;

 O número de raízes provenientes das brotações apicais e laterais variou de

2 a 3 raízes por tratamento e tanto o número de raízes quanto o seu
comprimento variaram de acordo com as doses de AIB (mg.L-1).
 49

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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 61

ANEXOS
 62

Tabela 1. Resumo da análise de variância do teor de umidade das sementes de

mangabeira (H. speciosa) armazenadas em substratos úmidos.
 63

Tabela 2. Resumo da análise de variância da germinação de sementes de mangabeiras

(H.speciosa) armazenadas em substratos úmidos
Quadrados médios
Fonte de variação GL
Germinação
TA 3 0,35117008**
SUBS 2 0,18835413**
TA x SUBS 6 0,01265229**
TP 2 11,21179963**
TA x TP 6 0,18327365**
SUBS x TP 4 0,18814143**
TA x SUBS x TP 12 0,04017131**
MES 1 1,42166559**
TA x MES 3 0,00791590*
SUBS x MES 2 0,10067742**
TA x SUBS x MES 6 0,01584393**
TP x MES 1 1,42166559**
TA x TP x MES 3 0,00791590*
SUBS x TP x MES 2 0,10067742**
TA x SUBS x TP x MES 6 0,01584393**
SUBS=1 TP=0°C MES=1
Linear 1 0,13450125**
NS
Quadrática 1 0,00086569
SUBS=1 TP=0°C MES=2
Linear 1 0,13081759**
NS
Quadrática 1 0,00030392
SUBS=1 TP=-22°C MES=1
Linear 0 0,00
Quadrática 0 0,00
SUBS=1 TP=-22°C MES=2
Linear 0 0,00
Quadrática 0 0,00
SUBS=1 TP=25°C MES=1
Linear 1 0,06000833**
NS
Quadrática 1 0,00163030
SUBS=2 TP=0°C MES=1
Linear 1 1,35258443**
Quadrática 1 0,24901649*
SUBS=2 TP=0°C MES=2
Linear 1 0,36582230**
Quadrática 1 0,04883718**
SUBS=2 TP=-22°C MES=1
Linear 0 0,00
Quadrática 0 0,00
SUBS=2 TP=-22°C MES=2
Linear 0 0,00
Quadrática 0 0,00
SUBS=2 TP=25°C MES=1
Linear 1 0,02182179**
Quadrática 1 0,02528776**
SUBS=3 TP=0°C MES=1
Linear 1 0,13057546**
NS
Quadrática 1 0,00377858
SUBS=3 TP=0°C MES=2
Linear 1 0,23256692**
Quadrática 1 0,03042101**
SUBS=3 TP=-22°C MES=1
Linear 0 0,00
Quadrática 0 0,00
SUBS=3 TP=-22°C MES=2
Linear 0 0,00
Quadrática 0 0,00
SUBS=3 TP=25°C MES=1
Linear 1 0,12425885**
NS
Quadrática 1 0,00000947
Resíduo 180 0,00282185
CV % 15,34216
 64

NS, * e ** = não significativo, significativo a 5 e 1% de probabilidade, respectivamente, pelo teste F.

Tabela 3. Resumo das análises de variância dos testes de vigor (comprimento e

massa seca de plântulas de mangabeira)
Quadrados médios do vigor
Fonte de variação GL
Comprimento (cm) Massa seca (g)
Teor de água nos substratos(TA) 3 30,18056317** 0,00873539 NS
Substratos (SUBS) 2 9,83132152 NS 0,00469881 NS
TA x SUBS 6 3,28135737 NS 0,01438344**
Temperatura (TP) 1 4,91115385 NS 0,00473850 NS
TA x TP 3 5,94860882 NS 0,00968685 NS
SUBS x TP 2 9,22848214 NS 0,00973675 NS
TA x SUBS x TP 6 4,54894407 NS 0,01049075*
MÊS 1 81,01180700** 0,00001945 NS
TA x MÊS 3 12,50928810* 0,00781488 NS
SUBS x MÊS 2 7,21529874 NS 0,00190787 NS
TA x SUBS x MÊS 4 1,07605857 NS 0,01345607*
TP x MÊS 0 - -
TA x TP x MÊS 0 - -
SUBS x TP x MÊS 0 - -
TA x SUBS x TP x MÊS 0 - -
MÊS=1
Linear 1 7,14188997 NS 0,01199516 NS
Quadrática 1 0,53262600 NS 0,00770097 NS
MÊS=2
Linear 1 54,80723250** 0,03109232**
Quadrática 1 4,53139031 NS 0,01568250 NS
Resíduo 94 3,7967199 0,00428034
CV % 19,63860 101,5068
** Significativo a 1%, * Significativo a 5% e NS não siginificativo.

Tabela 4. Comprimento das plântulas resultantes da germinação das sementes

de mangabeira (H. speciosa) após o primeiro e segundo mês de
armazenamento à 0°C.
Teor de água (%)
Meses
30 40 50 60
1 10,60 a 11,07 a 9,93 a 10,15 a
2 10,08 a 8,78 b 6,57 b 7,20 b
Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem a 5% de probabilidade pelo teste F.
 65

Figura 1. Germinação em areia após armazenamento à 0°C (geladeira).

Figura 2. Plântulas originadas de sementes estabelecidas em meio MS.

 66

Curvularia

Rhizopus

Penicillium
m

Figura 3. Fungos detectados na contaminação das sementes.

 67

T1 T1

-1 -1
Figura 4. Brotação apical em 0mgL de CA Figura 5. Brotação lateral em 0mg.L de CA

T2 T2

-1 -1
Figura 6. Brotação apical em 0,2mg.L de CA Figura 7. Botação lateral em 0,2mg.L de CA

T3 T3

-1 -1
Figura 8. Brotação apical em 0,4 mg.L de CA Figura 9. Brotação lateral em 0,4 mg.L de CA
 68

T4 T4

-1 -1
Figura 10. Brotação apical em 0,6mg.L de CA Figura 11.Brotação lateral em 0,6mg.L de CA

T5 T5

-1 -1
Figura 12. Brotação apical em 0,8mg.L de CA Figura 13 .Brotação lateral em 0,8mg.L de CA

T6 T6

-1 -1
Figura 14. Brotação apical em 1,0 mg.L de CA Figura 15. Brotação lateral em 1,0mg.L de CA
 69

Figura 16. Brotações apicais alongadas e multiplicadas no meio MS contendo os

hormônios ANA e BAP.
 70

Figura 17. Brotações laterais alongadas e multiplicadas no meio MS contendo ANA e

BAP.
 71

Figura 18. Brotações laterais e apicais enraizadas no meio MS contendo AIB.

 72

The SAS System 22:19 Thursday, September 25, 2008

9

The GLIMMIX Procedure

Model Information

Data Set WORK.VITR

Response Variable (Events) GER
Response Variable (Trials) N
Response Distribution Binomial
Link Function Logit
Variance Function Default
Variance Matrix Diagonal
Estimation Technique Maximum Likelihood
Degrees of Freedom Method Residual

Number of Observations Read 160

Number of Observations Used 160
Number of Events 9900
Number of Trials 16000

Dimensions

Columns in X 15
Columns in Z 0
Subjects (Blocks in V) 1
Max Obs per Subject 160

Optimization Information

Optimization Technique Newton-Raphson

Parameters in Optimization 13
Lower Boundaries 0
Upper Boundaries 0
Fixed Effects Not Profiled

Iteration History

Objective Max
Iteration Restarts Evaluations Function Change Gradient

0 0 4 5434.3961917 . 83.22037
1 0 4 4471.0227726 963.37341908 66.43683
2 0 3 3933.0786212 537.94415140 24.32387
3 0 3 3841.981954 91.09666718 2.845725
4 0 3 3827.8750229 14.10693108 6.010414
5 0 3 3821.1779598 6.69706316 3.521187
6 0 3 3818.5824223 2.59553748 1.437806
7 0 3 3817.6198096 0.96261269 0.537463
8 0 3 3817.2653758 0.35443378 0.198178
9 0 6 3817.2150013 0.05037451 0.149781

The SAS System 22:19 Thursday, September 25, 2008

10

The GLIMMIX Procedure

Iteration History

Objective Max
Iteration Restarts Evaluations Function Change Gradient

10 0 6 3817.1769296 0.03807173 0.113204

11 0 6 3817.1481559 0.02877366 0.085559
12 0 143 3817.1432644 0.00489154 0.080859
13 0 11 3817.1432644 -0.00000000 0.080859
 73

Convergence criterion (FCONV=2.220446E-16) satisfied.

Fit Statistics

-2 Log Likelihood 7634.29

AIC (smaller is better) 7660.29
AICC (smaller is better) 7662.78
BIC (smaller is better) 7700.26
CAIC (smaller is better) 7713.26
HQIC (smaller is better) 7676.52
Pearson Chi-Square 9000.08
Pearson Chi-Square / DF 61.23

Parameter Estimates

Standard
Effect Estimate Error DF t Value Pr > |t|

Intercept 2.1972 0.1054 147 20.84 <.0001

DMO -7.5169 3.3593 147 -2.24 0.0267
SAC 107.76 61.2886 147 1.76 0.0808
DMO^2 2.0390 0.9042 147 2.26 0.0256
DMO*SAC -4.5407 8.8129 147 -0.52 0.6072
SAC^2 -394.01 220.98 147 -1.78 0.0767
DMO^3 -0.1071 0.04741 147 -2.26 0.0253
DMO^2*SAC -5.2829 2.4131 147 -2.19 0.0302
DMO*SAC^2 91.9116 40.5864 147 2.26 0.0250
SAC^3 356.97 207.20 147 1.72 0.0870
DMO^4 0 . . . .
DMO^3*SAC 0.2847 0.1279 147 2.23 0.0275
DMO^2*SAC^2 -1.1693 0.9426 147 -1.24 0.2167
DMO*SAC^3 -63.8639 29.9487 147 -2.13 0.0346
SAC^4 0 . . . .

The SAS System 22:19 Thursday, September 25, 2008

11

The GLIMMIX Procedure

Type I Tests of Fixed Effects

Num Den
Effect DF DF Chi-Square F Value Pr > ChiSq Pr > F

DMO 1 147 3.84 3.84 0.0501 0.0520

SAC 1 147 0.68 0.68 0.4110 0.4123
DMO^2 1 147 3.66 3.66 0.0556 0.0575
DMO*SAC 1 147 0.05 0.05 0.8233 0.8236
SAC^2 1 147 2.12 2.12 0.1457 0.1478
DMO^3 1 147 0.00 0.00 0.9747 0.9747
DMO^2*SAC 1 147 0.73 0.73 0.3941 0.3955
DMO*SAC^2 1 147 0.16 0.16 0.6925 0.6930
SAC^3 1 147 2.52 2.52 0.1125 0.1147
DMO^4 0 . . . . .
DMO^3*SAC 1 147 4.96 4.96 0.0260 0.0275
DMO^2*SAC^2 1 147 1.54 1.54 0.2148 0.2167
DMO*SAC^3 1 147 4.55 4.55 0.0330 0.0346
SAC^4 0 . . . . .

The SAS System 22:19 Thursday, September 25, 2008

12

The GLIMMIX Procedure

Model Information

Data Set WORK.VITR

Response Variable (Events) GER
Response Variable (Trials) N
Response Distribution Binomial
 74

Link Function Logit

Variance Function Default
Variance Matrix Diagonal
Estimation Technique Maximum Likelihood
Degrees of Freedom Method Residual

Number of Observations Read 160

Number of Observations Used 160
Number of Events 9900
Number of Trials 16000

Dimensions

Columns in X 7
Columns in Z 0
Subjects (Blocks in V) 1
Max Obs per Subject 160

Optimization Information

Optimization Technique Newton-Raphson

Parameters in Optimization 7
Lower Boundaries 0
Upper Boundaries 0
Fixed Effects Not Profiled

Iteration History

Objective Max
Iteration Restarts Evaluations Function Change Gradient

0 0 4 6139.0404647 . 873.9867
1 0 4 5480.395913 658.64455167 772.0535
2 0 3 4951.7943613 528.60155180 381.9079
3 0 3 4877.9947536 73.79960768 35.02621
4 0 3 4877.0717543 0.92299931 0.367119
5 0 3 4877.0715264 0.00022790 0.000085
6 0 2 4877.0715264 0.00000000 1.36E-11

Convergence criterion (GCONV=1E-8) satisfied.

The SAS System 22:19 Thursday, September 25, 2008

13

The GLIMMIX Procedure

Fit Statistics

-2 Log Likelihood 9754.14

AIC (smaller is better) 9768.14
AICC (smaller is better) 9768.88
BIC (smaller is better) 9789.67
CAIC (smaller is better) 9796.67
HQIC (smaller is better) 9776.88
Pearson Chi-Square 21136.17
Pearson Chi-Square / DF 138.14

Parameter Estimates

Standard
Effect Estimate Error DF t Value Pr > |t|

Intercept 3.7846 0.1143 153 33.10 <.0001

DMO 0.2481 0.02472 153 10.04 <.0001
DMO*DMO -0.05046 0.002182 153 -23.13 <.0001
SAC -11.1161 0.6202 153 -17.92 <.0001
SAC*SAC 19.7610 1.1545 153 17.12 <.0001
DMO*DMO*SAC 0.07489 0.005161 153 14.51 <.0001
DMO*SAC*SAC -1.7970 0.1114 153 -16.13 <.0001
 75

Type I Tests of Fixed Effects

Num Den
Effect DF DF Chi-Square F Value Pr > ChiSq Pr > F

DMO 1 153 3094.58 3094.58 <.0001 <.0001

DMO*DMO 1 153 259.80 259.80 <.0001 <.0001
SAC 1 153 0.93 0.93 0.3343 0.3359
SAC*SAC 1 153 159.57 159.57 <.0001 <.0001
DMO*DMO*SAC 1 153 13.66 13.66 0.0002 0.0003
DMO*SAC*SAC 1 153 260.16 260.16 <.0001 <.0001

The SAS System 22:19 Thursday, September 25, 2008

14

The LOGISTIC Procedure

Model Information

Data Set WORK.VITR

Response Variable (Events) GER GER
Response Variable (Trials) N N
Model binary logit
Optimization Technique Fisher's scoring

Number of Observations Read 160

Number of Observations Used 160
Sum of Frequencies Read 16000
Sum of Frequencies Used 16000

Response Profile

Ordered Binary Total

Value Outcome Frequency

1 Event 9900
2 Nonevent 6100

Model Convergence Status

Convergence criterion (GCONV=1E-8) satisfied.

Model Fit Statistics

Intercept
Intercept and
Criterion Only Covariates

AIC 21271.528 9768.143

SC 21279.208 9821.905
-2 Log L 21269.528 9754.143

R-Square 0.5131 Max-rescaled R-Square 0.6978

Testing Global Null Hypothesis: BETA=0

Test Chi-Square DF Pr > ChiSq

Likelihood Ratio 11515.3849 6 <.0001

Score 9491.4066 6 <.0001
Wald 4231.3595 6 <.0001

The SAS System 22:19 Thursday, September 25, 2008

15

The LOGISTIC Procedure

 76

Analysis of Maximum Likelihood Estimates

Standard Wald
Parameter DF Estimate Error Chi-Square Pr > ChiSq

Intercept 1 3.7846 0.1143 1095.5220 <.0001

DMO 1 0.2481 0.0247 100.7377 <.0001
DMO*DMO 1 -0.0505 0.00218 534.9370 <.0001
SAC 1 -11.1161 0.6202 321.2403 <.0001
SAC*SAC 1 19.7609 1.1545 292.9529 <.0001
DMO*DMO*SAC 1 0.0749 0.00516 210.5366 <.0001
DMO*SAC*SAC 1 -1.7970 0.1114 260.1556 <.0001

Association of Predicted Probabilities and Observed Responses

Percent Concordant 92.0 Somers' D 0.863

Percent Discordant 5.7 Gamma 0.883
Percent Tied 2.3 Tau-a 0.407
Pairs 60390000 c 0.931

The SAS System 22:19 Thursday, September 25, 2008

16

The GLIMMIX Procedure

Model Information

Data Set WORK.VITR

Response Variable COMP
Response Distribution Gaussian
Link Function Identity
Variance Function Default
Variance Matrix Diagonal
Estimation Technique Restricted Maximum Likelihood
Degrees of Freedom Method Residual

Number of Observations Read 160

Number of Observations Used 102

Dimensions

Covariance Parameters 1
Columns in X 15
Columns in Z 0
Subjects (Blocks in V) 1
Max Obs per Subject 102

Optimization Information

Optimization Technique None

Parameters 14
Lower Boundaries 1
Upper Boundaries 0
Fixed Effects Not Profiled

Fit Statistics

-2 Res Log Likelihood 147.53

AIC (smaller is better) 175.53
AICC (smaller is better) 181.20
BIC (smaller is better) 210.37
CAIC (smaller is better) 224.37
HQIC (smaller is better) 189.57
Pearson Chi-Square 14.44
Pearson Chi-Square / DF 0.16
 77

Parameter Estimates

Standard
Effect Estimate Error DF t Value Pr > |t|

Intercept 0.4704 0.1270 89 3.71 0.0004

DMO 0.08771 0.1797 89 0.49 0.6266
SAC -2.8843 1.8436 89 -1.56 0.1212
DMO^2 0.03689 0.05238 89 0.70 0.4830
DMO*SAC -1.1603 0.4575 89 -2.54 0.0130

The SAS System 22:19 Thursday, September 25, 2008

17

The GLIMMIX Procedure

Parameter Estimates

Standard
Effect Estimate Error DF t Value Pr > |t|

SAC^2 23.6130 6.4466 89 3.66 0.0004

DMO^3 -0.00482 0.003521 89 -1.37 0.1748
DMO^2*SAC 0.1694 0.07480 89 2.26 0.0260
DMO*SAC^2 -2.6268 1.3325 89 -1.97 0.0518
SAC^3 -24.7227 5.6583 89 -4.37 <.0001
DMO^4 0 . . . .
DMO^3*SAC 0.006366 0.006011 89 1.06 0.2924
DMO^2*SAC^2 -0.2805 0.05668 89 -4.95 <.0001
DMO*SAC^3 5.1357 1.0684 89 4.81 <.0001
SAC^4 0 . . . .
Scale 0.1623 0.02432 . . .

Type I Tests of Fixed Effects

Num Den
Effect DF DF Chi-Square F Value Pr > ChiSq Pr > F

DMO 1 89 34.81 34.81 <.0001 <.0001

SAC 1 89 8.47 8.47 0.0036 0.0046
DMO^2 1 89 1.14 1.14 0.2852 0.2881
DMO*SAC 1 89 5.04 5.04 0.0248 0.0273
SAC^2 1 89 0.12 0.12 0.7269 0.7277
DMO^3 1 89 3.24 3.24 0.0717 0.0751
DMO^2*SAC 1 89 23.17 23.17 <.0001 <.0001
DMO*SAC^2 1 89 6.61 6.61 0.0102 0.0118
SAC^3 1 89 1.74 1.74 0.1876 0.1909
DMO^4 0 . . . . .
DMO^3*SAC 1 89 3.52 3.52 0.0608 0.0640
DMO^2*SAC^2 1 89 27.13 27.13 <.0001 <.0001
DMO*SAC^3 1 89 23.11 23.11 <.0001 <.0001
SAC^4 0 . . . . .

The SAS System 22:19 Thursday, September 25, 2008

22

The LOGISTIC Procedure

Model Information

Data Set WORK.VITR

Response Variable COMP COMP
Number of Response Levels 19
Model cumulative logit
Optimization Technique Fisher's scoring

Number of Observations Read 160

Number of Observations Used 102

Response Profile
 78

Ordered Total
Value COMP Frequency

1 0 1
2 0.2 10
3 0.3 16
4 0.4 6
5 0.5 14
6 0.6 4
7 0.7 6
8 0.8 1
9 0.9 1
10 1 22
11 1.1 2
12 1.2 5
13 1.3 1
14 1.5 5
15 2 2
16 2.3 2
17 2.5 2
18 2.7 1
19 3 1

Probabilities modeled are cumulated over the lower Ordered Values.

NOTE: 58 observations were deleted due to missing values for the response or explanatory variables.

Model Convergence Status

Convergence criterion (GCONV=1E-8) satisfied.

Score Test for the Proportional Odds Assumption

Chi-Square DF Pr > ChiSq

456.0663 119 <.0001

The SAS System 22:19 Thursday, September 25, 2008

23

The LOGISTIC Procedure

Model Fit Statistics

Intercept
Intercept and
Criterion Only Covariates

AIC 537.449 509.450

SC 584.698 575.074
-2 Log L 501.449 459.450

R-Square 0.3375 Max-rescaled R-Square 0.3400

Testing Global Null Hypothesis: BETA=0

Test Chi-Square DF Pr > ChiSq

Likelihood Ratio 41.9992 7 <.0001

Score 35.5020 7 <.0001
Wald 35.5491 7 <.0001

Analysis of Maximum Likelihood Estimates

Standard Wald
Parameter DF Estimate Error Chi-Square Pr > ChiSq

Intercept 0 1 -5.6630 1.2019 22.1994 <.0001

 79

Intercept 0.2 1 -2.8279 0.6135 21.2470 <.0001

Intercept 0.3 1 -1.3794 0.5214 6.9994 0.0082
Intercept 0.4 1 -1.0117 0.5093 3.9467 0.0470
Intercept 0.5 1 -0.2651 0.4964 0.2851 0.5934
Intercept 0.6 1 -0.0624 0.4956 0.0158 0.8998
Intercept 0.7 1 0.2481 0.4966 0.2496 0.6173
Intercept 0.8 1 0.3010 0.4970 0.3667 0.5448
Intercept 0.9 1 0.3545 0.4975 0.5078 0.4761
Intercept 1 1 1.6805 0.5379 9.7616 0.0018
Intercept 1.1 1 1.8279 0.5454 11.2318 0.0008
Intercept 1.2 1 2.2459 0.5708 15.4838 <.0001
Intercept 1.3 1 2.3409 0.5774 16.4366 <.0001
Intercept 1.5 1 2.9210 0.6268 21.7162 <.0001
Intercept 2 1 3.2379 0.6619 23.9274 <.0001
Intercept 2.3 1 3.6717 0.7232 25.7724 <.0001
Intercept 2.5 1 4.3925 0.8744 25.2348 <.0001
Intercept 2.7 1 5.1021 1.1129 21.0162 <.0001
DMO 1 -0.1729 0.1924 0.8077 0.3688
DMO*DMO 1 0.0448 0.0202 4.9388 0.0263
SAC 1 -0.1908 2.7603 0.0048 0.9449
SAC*SAC 1 -3.5727 3.6465 0.9599 0.3272
DMO*DMO*SAC*SAC 1 -0.0944 0.0733 1.6597 0.1976
DMO*DMO*SAC 1 -0.0441 0.0489 0.8135 0.3671
DMO*SAC*SAC 1 1.5236 0.5771 6.9687 0.0083

The SAS System 22:19 Thursday, September 25, 2008

24

The LOGISTIC Procedure

Association of Predicted Probabilities and Observed Responses

Percent Concordant 63.8 Somers' D 0.345

Percent Discordant 29.3 Gamma 0.371
Percent Tied 6.9 Tau-a 0.308
Pairs 4604 c 0.673

The SAS System 22:19 Thursday, September 25, 2008

27

The GLIMMIX Procedure

Model Information

Data Set WORK.VITR

Response Variable COMP
Response Distribution Gaussian
Link Function Identity
Variance Function Default
Variance Matrix Diagonal
Estimation Technique Restricted Maximum Likelihood
Degrees of Freedom Method Residual

Number of Observations Read 160

Number of Observations Used 102

Dimensions

Covariance Parameters 1
Columns in X 9
Columns in Z 0
Subjects (Blocks in V) 1
Max Obs per Subject 102

Optimization Information

Optimization Technique None

Parameters 10
Lower Boundaries 1
Upper Boundaries 0
 80

Fixed Effects Not Profiled

Fit Statistics

-2 Res Log Likelihood 162.94

AIC (smaller is better) 182.94
AICC (smaller is better) 185.63
BIC (smaller is better) 208.27
CAIC (smaller is better) 218.27
HQIC (smaller is better) 193.17
Pearson Chi-Square 19.91
Pearson Chi-Square / DF 0.21

Parameter Estimates

Standard
Effect Estimate Error DF t Value Pr > |t|

Intercept 0.3664 0.1426 93 2.57 0.0117

DMO 0.3390 0.07239 93 4.68 <.0001
DMO*DMO -0.03448 0.006955 93 -4.96 <.0001
SAC 4.0948 0.9096 93 4.50 <.0001
SAC*SAC -3.8298 1.1611 93 -3.30 0.0014

The SAS System 22:19 Thursday, September 25, 2008

28

The GLIMMIX Procedure

Parameter Estimates

Standard
Effect Estimate Error DF t Value Pr > |t|

DMO*SAC -2.4006 0.4109 93 -5.84 <.0001

DMO*DMO*SAC*SAC -0.1862 0.04474 93 -4.16 <.0001
DMO*DMO*SAC 0.1939 0.03714 93 5.22 <.0001
DMO*SAC*SAC 2.3751 0.5069 93 4.69 <.0001
Scale 0.2141 0.03140 . . .

Type I Tests of Fixed Effects

Num Den
Effect DF DF Chi-Square F Value Pr > ChiSq Pr > F

DMO 1 93 26.38 26.38 <.0001 <.0001

DMO*DMO 1 93 1.09 1.09 0.2956 0.2983
SAC 1 93 6.19 6.19 0.0129 0.0146
SAC*SAC 1 93 0.00 0.00 0.9542 0.9543
DMO*SAC 1 93 3.90 3.90 0.0482 0.0511
DMO*DMO*SAC*SAC 1 93 14.23 14.23 0.0002 0.0003
DMO*DMO*SAC 1 93 5.32 5.32 0.0211 0.0233
DMO*SAC*SAC 1 93 21.96 21.96 <.0001 <.0001

The SAS System 22:19 Thursday, September 25, 2008

29

The GLIMMIX Procedure

Model Information

Data Set WORK.VITR

Response Variable NF
Response Distribution Gaussian
Link Function Identity
Variance Function Default
Variance Matrix Diagonal
Estimation Technique Restricted Maximum Likelihood
 81

Degrees of Freedom Method Residual

Number of Observations Read 160

Number of Observations Used 102

Dimensions

Covariance Parameters 1
Columns in X 15
Columns in Z 0
Subjects (Blocks in V) 1
Max Obs per Subject 102

Optimization Information

Optimization Technique None

Parameters 14
Lower Boundaries 1
Upper Boundaries 0
Fixed Effects Not Profiled

Fit Statistics

-2 Res Log Likelihood 269.68

AIC (smaller is better) 297.68
AICC (smaller is better) 303.35
BIC (smaller is better) 332.52
CAIC (smaller is better) 346.52
HQIC (smaller is better) 311.72
Pearson Chi-Square 56.97
Pearson Chi-Square / DF 0.64

Parameter Estimates

Standard
Effect Estimate Error DF t Value Pr > |t|

Intercept 1.8106 0.2522 89 7.18 <.0001

DMO 0.5598 0.3568 89 1.57 0.1203
SAC -2.2662 3.6617 89 -0.62 0.5376
DMO^2 -0.04449 0.1040 89 -0.43 0.6699
DMO*SAC -2.7514 0.9087 89 -3.03 0.0032

The SAS System 22:19 Thursday, September 25, 2008

30

The GLIMMIX Procedure

Parameter Estimates

Standard
Effect Estimate Error DF t Value Pr > |t|

SAC^2 15.3515 12.8043 89 1.20 0.2337

DMO^3 -0.00095 0.006993 89 -0.14 0.8924
DMO^2*SAC 0.2910 0.1486 89 1.96 0.0533
DMO*SAC^2 1.6174 2.6467 89 0.61 0.5427
SAC^3 -15.0680 11.2385 89 -1.34 0.1834
DMO^4 0 . . . .
DMO^3*SAC -0.00081 0.01194 89 -0.07 0.9462
DMO^2*SAC^2 -0.2570 0.1126 89 -2.28 0.0248
DMO*SAC^3 0.9795 2.1221 89 0.46 0.6455
SAC^4 0 . . . .
Scale 0.6401 0.09596 . . .

Type I Tests of Fixed Effects

Num Den
 82

Effect DF DF Chi-Square F Value Pr > ChiSq Pr > F

DMO 1 89 1.12 1.12 0.2905 0.2934

SAC 1 89 1.10 1.10 0.2938 0.2966
DMO^2 1 89 2.91 2.91 0.0879 0.0914
DMO*SAC 1 89 3.18 3.18 0.0745 0.0779
SAC^2 1 89 0.56 0.56 0.4530 0.4550
DMO^3 1 89 2.25 2.25 0.1337 0.1373
DMO^2*SAC 1 89 9.40 9.40 0.0022 0.0029
DMO*SAC^2 1 89 0.00 0.00 0.9780 0.9781
SAC^3 1 89 2.66 2.66 0.1031 0.1066
DMO^4 0 . . . . .
DMO^3*SAC 1 89 5.18 5.18 0.0229 0.0253
DMO^2*SAC^2 1 89 5.34 5.34 0.0209 0.0232
DMO*SAC^3 1 89 0.21 0.21 0.6444 0.6455
SAC^4 0 . . . . .

The SAS System 22:19 Thursday, September 25, 2008

31

The GLIMMIX Procedure

Model Information

Data Set WORK.VITR

Response Variable NF
Response Distribution Gaussian
Link Function Identity
Variance Function Default
Variance Matrix Diagonal
Estimation Technique Restricted Maximum Likelihood
Degrees of Freedom Method Residual

Number of Observations Read 160

Number of Observations Used 102

Dimensions

Covariance Parameters 1
Columns in X 8
Columns in Z 0
Subjects (Blocks in V) 1
Max Obs per Subject 102

Optimization Information

Optimization Technique None

Parameters 9
Lower Boundaries 1
Upper Boundaries 0
Fixed Effects Not Profiled

Fit Statistics

-2 Res Log Likelihood 274.15

AIC (smaller is better) 292.15
AICC (smaller is better) 294.29
BIC (smaller is better) 315.04
CAIC (smaller is better) 324.04
HQIC (smaller is better) 301.40
Pearson Chi-Square 64.68
Pearson Chi-Square / DF 0.69

Parameter Estimates

Standard
Effect Estimate Error DF t Value Pr > |t|

Intercept 1.9902 0.2407 94 8.27 <.0001

 83

DMO 0.4065 0.1099 94 3.70 0.0004

DMO*DMO -0.04004 0.01082 94 -3.70 0.0004
SAC -0.6824 1.3172 94 -0.52 0.6056
SAC*SAC 2.1038 1.6510 94 1.27 0.2057

The SAS System 22:19 Thursday, September 25, 2008

32

The GLIMMIX Procedure

Parameter Estimates

Standard
Effect Estimate Error DF t Value Pr > |t|

DMO*SAC -0.8070 0.2145 94 -3.76 0.0003

DMO*DMO*SAC*SAC -0.03418 0.02936 94 -1.16 0.2472
DMO*DMO*SAC 0.09098 0.03084 94 2.95 0.0040
Scale 0.6881 0.1004 . . .

Type I Tests of Fixed Effects

Num Den
Effect DF DF Chi-Square F Value Pr > ChiSq Pr > F

DMO 1 94 1.04 1.04 0.3080 0.3106

DMO*DMO 1 94 2.86 2.86 0.0909 0.0942
SAC 1 94 0.88 0.88 0.3493 0.3517
SAC*SAC 1 94 0.87 0.87 0.3508 0.3532
DMO*SAC 1 94 2.61 2.61 0.1060 0.1094
DMO*DMO*SAC*SAC 1 94 3.38 3.38 0.0659 0.0691
DMO*DMO*SAC 1 94 8.70 8.70 0.0032 0.0040

The SAS System 22:19 Thursday, September 25, 2008

33

The LOGISTIC Procedure

Model Information

Data Set WORK.VITR

Response Variable NF NF
Number of Response Levels 5
Model cumulative logit
Optimization Technique Fisher's scoring

Number of Observations Read 160

Number of Observations Used 102

Response Profile

Ordered Total
Value NF Frequency

1 0 1
2 1 3
3 2 88
4 4 7
5 6 3

Probabilities modeled are cumulated over the lower Ordered Values.

NOTE: 58 observations were deleted due to missing values for the response or explanatory variables.

Model Convergence Status

Convergence criterion (GCONV=1E-8) satisfied.

Score Test for the Proportional Odds Assumption

 84

Chi-Square DF Pr > ChiSq

7042.0615 21 <.0001

Model Fit Statistics

Intercept
Intercept and
Criterion Only Covariates

AIC 123.057 113.114

SC 133.557 141.988
-2 Log L 115.057 91.114

R-Square 0.2092 Max-rescaled R-Square 0.3094

The SAS System 22:19 Thursday, September 25, 2008

34

The LOGISTIC Procedure

Testing Global Null Hypothesis: BETA=0

Test Chi-Square DF Pr > ChiSq

Likelihood Ratio 23.9434 7 0.0012

Score 21.0386 7 0.0037
Wald 16.1415 7 0.0239

Analysis of Maximum Likelihood Estimates

Standard Wald
Parameter DF Estimate Error Chi-Square Pr > ChiSq

Intercept 0 1 -3.5498 1.3010 7.4446 0.0064

Intercept 1 1 -1.9685 0.8951 4.8359 0.0279
Intercept 2 1 5.7017 1.5755 13.0974 0.0003
Intercept 4 1 7.1958 1.6644 18.6917 <.0001
DMO 1 -1.8947 0.5679 11.1314 0.0008
DMO*DMO 1 0.1666 0.0528 9.9758 0.0016
SAC 1 -4.7533 5.9970 0.6282 0.4280
SAC*SAC 1 -2.0900 6.7248 0.0966 0.7560
DMO*SAC 1 3.6139 1.1276 10.2724 0.0014
DMO*DMO*SAC*SAC 1 0.1330 0.1093 1.4814 0.2236
DMO*DMO*SAC 1 -0.3548 0.1361 6.7919 0.0092

Association of Predicted Probabilities and Observed Responses

Percent Concordant 81.9 Somers' D 0.704

Percent Discordant 11.6 Gamma 0.752
Percent Tied 6.5 Tau-a 0.177
Pairs 1296 c 0.852

The SAS System 01:09 Thursday, September 25, 2008

18

The GLIMMIX Procedure

Model Information

Data Set WORK.INFEST

Response Variable (Events) CONTAM
 85

Response Variable (Trials) N

Response Distribution Binomial
Link Function Logit
Variance Function Default
Variance Matrix Diagonal
Estimation Technique Maximum Likelihood
Degrees of Freedom Method Residual

Number of Observations Read 321

Number of Observations Used 300
Number of Events 25199.78
Number of Trials 30000

Dimensions

Columns in X 15
Columns in Z 0
Subjects (Blocks in V) 1
Max Obs per Subject 300

Optimization Information

Optimization Technique Newton-Raphson

Parameters in Optimization 14
Lower Boundaries 0
Upper Boundaries 0
Fixed Effects Not Profiled

Iteration History

Objective Max
Iteration Restarts Evaluations Function Change Gradient

0 0 4 6605.5364602 . 4109.083
1 0 3 4064.8310534 2540.7054069 956.6964
2 0 3 3785.4371675 279.39388590 171.5706
3 0 3 3771.1517042 14.28546324 11.18329
4 0 3 3771.0431696 0.10853468 0.095792
5 0 3 3771.043145 0.00002453 0.000023
6 0 2 3771.043145 0.00000000 6.04E-12

Convergence criterion (GCONV=1E-8) satisfied.

Fit Statistics

-2 Log Likelihood 7542.09

AIC (smaller is better) 7570.09

The SAS System 01:09 Thursday, September 25, 2008

19

The GLIMMIX Procedure

Fit Statistics

AICC (smaller is better) 7571.56

BIC (smaller is better) 7621.94
CAIC (smaller is better) 7635.94
HQIC (smaller is better) 7590.84
Pearson Chi-Square 12033.17
Pearson Chi-Square / DF 42.07

Parameter Estimates

Standard
Effect Estimate Error DF t Value Pr > |t|

Intercept 5.7511 3.2531 286 1.77 0.0781

 86

TEMP -1.6253 0.9420 286 -1.73 0.0856

HIPOC 2.9333 2.4234 286 1.21 0.2271
TEMP^2 0.3234 0.08794 286 3.68 0.0003
TEMP*HIPOC -1.5524 0.3216 286 -4.83 <.0001
HIPOC^2 1.3349 1.1294 286 1.18 0.2382
TEMP^3 -0.01266 0.002470 286 -5.12 <.0001
TEMP^2*HIPOC 0.06579 0.02293 286 2.87 0.0044
TEMP*HIPOC^2 0.2185 0.04555 286 4.80 <.0001
HIPOC^3 -0.5508 0.2495 286 -2.21 0.0281
TEMP^4 0 . . . .
TEMP^3*HIPOC 0.000376 0.000606 286 0.62 0.5358
TEMP^2*HIPOC^2 -0.01394 0.001146 286 -12.16 <.0001
TEMP*HIPOC^3 0.01133 0.003360 286 3.37 0.0008
HIPOC^4 0.03753 0.01986 286 1.89 0.0597

Type I Tests of Fixed Effects

Num Den
Effect DF DF Chi-Square F Value Pr > ChiSq Pr > F

TEMP 1 286 430.24 430.24 <.0001 <.0001

HIPOC 1 286 560.02 560.02 <.0001 <.0001
TEMP^2 1 286 722.97 722.97 <.0001 <.0001
TEMP*HIPOC 1 286 690.47 690.47 <.0001 <.0001
HIPOC^2 1 286 1.79 1.79 0.1809 0.1819
TEMP^3 1 286 223.21 223.21 <.0001 <.0001
TEMP^2*HIPOC 1 286 3.50 3.50 0.0614 0.0625
TEMP*HIPOC^2 1 286 39.47 39.47 <.0001 <.0001
HIPOC^3 1 286 3.93 3.93 0.0475 0.0485
TEMP^4 0 . . . . .
TEMP^3*HIPOC 1 286 0.42 0.42 0.5163 0.5168
TEMP^2*HIPOC^2 1 286 147.94 147.94 <.0001 <.0001
TEMP*HIPOC^3 1 286 11.41 11.41 0.0007 0.0008
HIPOC^4 1 286 3.57 3.57 0.0587 0.0597

The SAS System 01:09 Thursday, September 25, 2008

20

The GLIMMIX Procedure

Model Information

Data Set WORK.INFEST

Response Variable (Events) CONTAM
Response Variable (Trials) N
Response Distribution Binomial
Link Function Logit
Variance Function Default
Variance Matrix Diagonal
Estimation Technique Maximum Likelihood
Degrees of Freedom Method Residual

Number of Observations Read 321

Number of Observations Used 300
Number of Events 25199.78
Number of Trials 30000

Dimensions

Columns in X 9
Columns in Z 0
Subjects (Blocks in V) 1
Max Obs per Subject 300

Optimization Information

Optimization Technique Newton-Raphson

Parameters in Optimization 9
Lower Boundaries 0
Upper Boundaries 0
 87

Fixed Effects Not Profiled

Iteration History

Objective Max
Iteration Restarts Evaluations Function Change Gradient

0 0 4 7471.0300053 . 4478.9
1 0 3 4535.934683 2935.0953222 1068.468
2 0 3 4167.5651397 368.36954332 205.2475
3 0 3 4145.8035393 21.76160046 15.52288
4 0 3 4145.6385206 0.16501864 0.136957
5 0 3 4145.6385042 0.00001644 0.000014

Convergence criterion (GCONV=1E-8) satisfied.

Fit Statistics

-2 Log Likelihood 8291.28

AIC (smaller is better) 8309.28
AICC (smaller is better) 8309.90

The SAS System 01:09 Thursday, September 25, 2008

21

The GLIMMIX Procedure

Fit Statistics

BIC (smaller is better) 8342.61

CAIC (smaller is better) 8351.61
HQIC (smaller is better) 8322.62
Pearson Chi-Square 18496.25
Pearson Chi-Square / DF 63.56

Parameter Estimates

Standard
Effect Estimate Error DF t Value Pr > |t|

Intercept -10.7843 1.1069 291 -9.74 <.0001

TEMP 3.2354 0.2584 291 12.52 <.0001
TEMP*TEMP -0.1296 0.01036 291 -12.51 <.0001
HIPOC 7.9200 0.6880 291 11.51 <.0001
HIPOC*HIPOC -1.4028 0.1017 291 -13.80 <.0001
TEMP*HIPOC -1.8509 0.1555 291 -11.90 <.0001
TEMP*TEMP*HIPO*HIPOC -0.01424 0.000930 291 -15.31 <.0001
TEMP*TEMP*HIPOC 0.07541 0.006280 291 12.01 <.0001
TEMP*HIPOC*HIPOC 0.3283 0.02267 291 14.49 <.0001

Type I Tests of Fixed Effects

Num Den
Effect DF DF Chi-Square F Value Pr > ChiSq Pr > F

TEMP 1 291 1759.04 1759.04 <.0001 <.0001

TEMP*TEMP 1 291 1185.07 1185.07 <.0001 <.0001
HIPOC 1 291 676.91 676.91 <.0001 <.0001
HIPOC*HIPOC 1 291 2.53 2.53 0.1119 0.1130
TEMP*HIPOC 1 291 1181.64 1181.64 <.0001 <.0001
TEMP*TEMP*HIPO*HIPOC 1 291 143.45 143.45 <.0001 <.0001
TEMP*TEMP*HIPOC 1 291 0.56 0.56 0.4537 0.4543
TEMP*HIPOC*HIPOC 1 291 209.86 209.86 <.0001 <.0001

The SAS System 01:09 Thursday, September 25, 2008

22

The LOGISTIC Procedure

Model Information
 88

Data Set WORK.INFEST

Response Variable (Events) CONTAM CONTAM
Response Variable (Trials) N N
Model binary logit
Optimization Technique Fisher's scoring

Number of Observations Read 321

Number of Observations Used 300
Sum of Frequencies Read 30000
Sum of Frequencies Used 30000

Response Profile

Ordered Binary Total

Value Outcome Frequency

1 Event 25199.78
2 Nonevent 4800.22

NOTE: 21 observations were deleted due to missing values for the response or explanatory variables.

Model Convergence Status

Convergence criterion (GCONV=1E-8) satisfied.

Model Fit Statistics

Intercept
Intercept and
Criterion Only Covariates

AIC 26382.922 12959.092

SC 26391.231 13033.873
-2 Log L 26380.922 12941.092

R-Square 0.3611 Max-rescaled R-Square 0.6173

Testing Global Null Hypothesis: BETA=0

Test Chi-Square DF Pr > ChiSq

Likelihood Ratio 13439.8300 8 <.0001

Score 15898.9264 8 <.0001
Wald 4225.2800 8 <.0001

The SAS System 01:09 Thursday, September 25, 2008

23

The LOGISTIC Procedure

Analysis of Maximum Likelihood Estimates

Standard Wald
Parameter DF Estimate Error Chi-Square Pr > ChiSq

Intercept 1 -10.7833 1.1068 94.9204 <.0001

TEMP 1 3.2352 0.2584 156.8042 <.0001
TEMP*TEMP 1 -0.1296 0.0104 156.3817 <.0001
HIPOC 1 7.9195 0.6880 132.5144 <.0001
HIPOC*HIPOC 1 -1.4028 0.1017 190.3373 <.0001
TEMP*HIPOC 1 -1.8508 0.1555 141.6701 <.0001
TEMP*TEMP*HIPO*HIPOC 1 -0.0142 0.000930 234.2752 <.0001
TEMP*TEMP*HIPOC 1 0.0754 0.00628 144.1997 <.0001
TEMP*HIPOC*HIPOC 1 0.3283 0.0227 209.8552 <.0001
 89

Association of Predicted Probabilities and Observed Responses

Percent Concordant 87.8 Somers' D 0.777

Percent Discordant 10.0 Gamma 0.795
Percent Tied 2.2 Tau-a 0.209
Pairs 120964487.95 c 0.889

The SAS System 01:09 Thursday, September 25, 2008

1

The GLIMMIX Procedure

Model Information

Data Set WORK.INFEST

Response Variable (Events) GERM
Response Variable (Trials) N
Response Distribution Binomial
Link Function Logit
Variance Function Default
Variance Matrix Diagonal
Estimation Technique Maximum Likelihood
Degrees of Freedom Method Residual

Number of Observations Read 321

Number of Observations Used 300
Number of Events 27032.97
Number of Trials 30000

Dimensions

Columns in X 15
Columns in Z 0
Subjects (Blocks in V) 1
Max Obs per Subject 300

Optimization Information

Optimization Technique Newton-Raphson

Parameters in Optimization 14
Lower Boundaries 0
Upper Boundaries 0
Fixed Effects Not Profiled

Iteration History

Objective Max
Iteration Restarts Evaluations Function Change Gradient

0 0 4 8167.2443257 . 4928.069
1 0 3 5613.0617311 2554.1825946 1011.768
2 0 3 5399.0409951 214.02073598 136.6761
3 0 3 5389.8946484 9.14634674 7.287605
4 0 3 5389.7873741 0.10727425 0.098274
5 0 3 5389.7873017 0.00007248 0.000069
6 0 3 5389.7873017 0.00000000 4.8E-11

Convergence criterion (GCONV=1E-8) satisfied.

The SAS System 01:09 Thursday, September 25, 2008

2

The GLIMMIX Procedure

Fit Statistics
 90

-2 Log Likelihood 10779.57

AIC (smaller is better) 10807.57
AICC (smaller is better) 10809.05
BIC (smaller is better) 10859.43
CAIC (smaller is better) 10873.43
HQIC (smaller is better) 10828.33
Pearson Chi-Square 14470.82
Pearson Chi-Square / DF 50.60

Parameter Estimates

Standard
Effect Estimate Error DF t Value Pr > |t|

Intercept 6.2800 1.1435 286 5.49 <.0001

TEMP -2.6517 0.2430 286 -10.91 <.0001
HIPOC 4.3898 1.4656 286 3.00 0.0030
TEMP^2 0.2665 0.02130 286 12.51 <.0001
TEMP*HIPOC 0.3462 0.1174 286 2.95 0.0035
HIPOC^2 -3.0030 0.7969 286 -3.77 0.0002
TEMP^3 -0.00773 0.000580 286 -13.34 <.0001
TEMP^2*HIPOC -0.04795 0.007340 286 -6.53 <.0001
TEMP*HIPOC^2 0.04851 0.02606 286 1.86 0.0637
HIPOC^3 0.6270 0.1849 286 3.39 0.0008
TEMP^4 0 . . . .
TEMP^3*HIPOC 0.001692 0.000188 286 9.01 <.0001
TEMP^2*HIPOC^2 -0.00162 0.000519 286 -3.12 0.0020
TEMP*HIPOC^3 -0.00214 0.002451 286 -0.87 0.3845
HIPOC^4 -0.04536 0.01530 286 -2.96 0.0033

Type I Tests of Fixed Effects

Num Den
Effect DF DF Chi-Square F Value Pr > ChiSq Pr > F

TEMP 1 286 189.25 189.25 <.0001 <.0001

HIPOC 1 286 323.11 323.11 <.0001 <.0001
TEMP^2 1 286 31.10 31.10 <.0001 <.0001
TEMP*HIPOC 1 286 9.23 9.23 0.0024 0.0026
HIPOC^2 1 286 14.63 14.63 0.0001 0.0002
TEMP^3 1 286 110.10 110.10 <.0001 <.0001
TEMP^2*HIPOC 1 286 69.37 69.37 <.0001 <.0001
TEMP*HIPOC^2 1 286 17.78 17.78 <.0001 <.0001
HIPOC^3 1 286 18.35 18.35 <.0001 <.0001
TEMP^4 0 . . . . .
TEMP^3*HIPOC 1 286 81.30 81.30 <.0001 <.0001
TEMP^2*HIPOC^2 1 286 9.72 9.72 0.0018 0.0020
TEMP*HIPOC^3 1 286 0.79 0.79 0.3752 0.3760

The SAS System 01:09 Thursday, September 25, 2008

6

The GLIMMIX Procedure

Model Information

Data Set WORK.INFEST

Response Variable (Events) GERM
Response Variable (Trials) N
Response Distribution Binomial
Link Function Logit
Variance Function Default
Variance Matrix Diagonal
Estimation Technique Maximum Likelihood
Degrees of Freedom Method Residual

Number of Observations Read 321

Number of Observations Used 300
Number of Events 27032.97
 91

Number of Trials 30000

Dimensions

Columns in X 9
Columns in Z 0
Subjects (Blocks in V) 1
Max Obs per Subject 300

Optimization Information

Optimization Technique Newton-Raphson

Parameters in Optimization 9
Lower Boundaries 0
Upper Boundaries 0
Fixed Effects Not Profiled

Iteration History

Objective Max
Iteration Restarts Evaluations Function Change Gradient

0 0 4 8448.7626557 . 5161.388
1 0 3 5760.7114333 2688.0512224 1058.128
2 0 3 5545.6461806 215.06525265 136.7154
3 0 3 5536.6063294 9.03985126 7.203842
4 0 3 5536.509698 0.09663135 0.088279
5 0 3 5536.5096627 0.00003531 0.000033
6 0 2 5536.5096627 -0.00000000 7.54E-12

Convergence criterion (GCONV=1E-8) satisfied.

The SAS System 01:09 Thursday, September 25, 2008

7

The GLIMMIX Procedure

Fit Statistics

-2 Log Likelihood 11073.02

AIC (smaller is better) 11091.02
AICC (smaller is better) 11091.64
BIC (smaller is better) 11124.35
CAIC (smaller is better) 11133.35
HQIC (smaller is better) 11104.36
Pearson Chi-Square 14551.57
Pearson Chi-Square / DF 50.01

Parameter Estimates

Standard
Effect Estimate Error DF t Value Pr > |t|

Intercept -0.2341 0.4610 291 -0.51 0.6119

TEMP 0.4716 0.08687 291 5.43 <.0001
TEMP*TEMP -0.02183 0.003499 291 -6.24 <.0001
HIPOC 1.1540 0.3790 291 3.04 0.0025
HIPOC*HIPOC -0.06662 0.06593 291 -1.01 0.3131
TEMP*HIPOC -0.3457 0.07160 291 -4.83 <.0001
TEMP*TEMP*HIPO*HIPOC -0.00219 0.000512 291 -4.28 <.0001
TEMP*TEMP*HIPOC 0.01778 0.002930 291 6.07 <.0001
TEMP*HIPOC*HIPOC 0.04032 0.01244 291 3.24 0.0013

Type I Tests of Fixed Effects

Num Den
Effect DF DF Chi-Square F Value Pr > ChiSq Pr > F

TEMP 1 291 203.22 203.22 <.0001 <.0001

 92

TEMP*TEMP 1 291 70.61 70.61 <.0001 <.0001

HIPOC 1 291 393.64 393.64 <.0001 <.0001
HIPOC*HIPOC 1 291 4.38 4.38 0.0364 0.0372
TEMP*HIPOC 1 291 14.49 14.49 0.0001 0.0002
TEMP*TEMP*HIPO*HIPOC 1 291 0.01 0.01 0.9409 0.9409
TEMP*TEMP*HIPOC 1 291 108.56 108.56 <.0001 <.0001
TEMP*HIPOC*HIPOC 1 291 10.50 10.50 0.0012 0.0013

The SAS System 01:09 Thursday, September 25, 2008

10

The LOGISTIC Procedure

Model Information

Data Set WORK.INFEST

Response Variable (Events) GERM GERM
Response Variable (Trials) N N
Model binary logit
Optimization Technique Fisher's scoring

Number of Observations Read 321

Number of Observations Used 300
Sum of Frequencies Read 30000
Sum of Frequencies Used 30000

Response Profile

Ordered Binary Total

Value Outcome Frequency

1 Event 27032.97
2 Nonevent 2967.03

NOTE: 21 observations were deleted due to missing values for the response or explanatory variables.

Model Convergence Status

Convergence criterion (GCONV=1E-8) satisfied.

Model Fit Statistics

Intercept
Intercept and
Criterion Only Covariates

AIC 19361.689 18555.239

SC 19369.998 18630.019
-2 Log L 19359.689 18537.239

R-Square 0.0270 Max-rescaled R-Square 0.0569

The SAS System 01:09 Thursday, September 25, 2008

11

The LOGISTIC Procedure

Testing Global Null Hypothesis: BETA=0

Test Chi-Square DF Pr > ChiSq

Likelihood Ratio 822.4510 8 <.0001

Score 741.3238 8 <.0001
Wald 653.1128 8 <.0001
 93

Analysis of Maximum Likelihood Estimates

Standard Wald
Parameter DF Estimate Error Chi-Square Pr > ChiSq

Intercept 1 -0.2341 0.4610 0.2580 0.6115

TEMP 1 0.4716 0.0869 29.4737 <.0001
TEMP*TEMP 1 -0.0218 0.00350 38.9378 <.0001
HIPOC 1 1.1540 0.3790 9.2693 0.0023
HIPOC*HIPOC 1 -0.0666 0.0659 1.0213 0.3122
TEMP*HIPOC 1 -0.3457 0.0716 23.3113 <.0001
TEMP*TEMP*HIPO*HIPOC 1 -0.00219 0.000512 18.2868 <.0001
TEMP*TEMP*HIPOC 1 0.0178 0.00293 36.8272 <.0001
TEMP*HIPOC*HIPOC 1 0.0403 0.0124 10.5001 0.0012

Association of Predicted Probabilities and Observed Responses

Percent Concordant 63.3 Somers' D 0.315

Percent Discordant 31.8 Gamma 0.331
Percent Tied 4.8 Tau-a 0.056
Pairs 80207632.979 c 0.658

The SAS System 21:41 Monday, November 19, 2001 1

The GLM Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

BAP 5 0 1 1.5 2 2.5

ANA 5 0 0.25 0.5 0.75 1

REP 6 1 2 3 4 5 6

Number of observations 250

NOTE: All dependent variables are consistent with respect to the presence or absence of missing
values. However only 151 observations can be used in this analysis

The SAS System 21:41 Monday, November 19, 2001 2

The GLM Procedure

Dependent Variable: COMP COMP

Sum of
Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 24 6074.62795 253.10950 2.37 0.0011

Error 126 13441.05881 106.67507

Corrected Total 150 19515.68675

R-Square Coeff Var Root MSE COMP Mean

0.311269 468.4838 10.32836 2.204636

Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F

BAP 4 949.717101 237.429275 2.23 0.0699

ANA 4 990.621387 247.655347 2.32 0.0603
 94

BAP*ANA 16 4136.871050 258.554441 2.42 0.0033

Contrast DF Contrast SS Mean Square F Value Pr > F

BL 1 129.8892000 129.8892000 1.22 0.2719

BQ 1 50.6905663 50.6905663 0.48 0.4919
AL 1 0.6686451 0.6686451 0.01 0.9370
AQ 1 348.2527685 348.2527685 3.26 0.0732
BLAL 1 0.2360167 0.2360167 0.00 0.9626

The SAS System 21:41 Monday, November 19, 2001 3

The GLM Procedure

Dependent Variable: COMPLAT COMPLAT

Sum of
Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 24 14.39815043 0.59992293 1.37 0.1327

Error 126 54.98357143 0.43637755

Corrected Total 150 69.38172185

R-Square Coeff Var Root MSE COMPLAT Mean

0.207521 127.5561 0.660589 0.517881

Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F

BAP 4 7.09358452 1.77339613 4.06 0.0039

ANA 4 0.11525118 0.02881280 0.07 0.9919
BAP*ANA 16 7.24069901 0.45254369 1.04 0.4230

Contrast DF Contrast SS Mean Square F Value Pr > F

BL 1 0.43320000 0.43320000 0.99 0.3210

BQ 1 5.72345875 5.72345875 13.12 0.0004
AL 1 0.03242189 0.03242189 0.07 0.7856
AQ 1 0.03241017 0.03241017 0.07 0.7857
BLAL 1 0.32201667 0.32201667 0.74 0.3920

The SAS System 14:35 Thursday, September 25, 2008

1

The GLIMMIX Procedure

Model Information

Data Set WORK.ANABAP

Response Variable (Events) BAPICAL
Response Variable (Trials) N
Response Distribution Binomial
Link Function Logit
Variance Function Default
Variance Matrix Diagonal
Estimation Technique Maximum Likelihood
Degrees of Freedom Method Residual

Number of Observations Read 250

Number of Observations Used 151
Number of Events 8300
Number of Trials 15100

Dimensions
 95

Columns in X 15
Columns in Z 0
Subjects (Blocks in V) 1
Max Obs per Subject 151

Optimization Information

Optimization Technique Newton-Raphson

Parameters in Optimization 15
Lower Boundaries 0
Upper Boundaries 0
Fixed Effects Not Profiled

Iteration History

Objective Max
Iteration Restarts Evaluations Function Change Gradient

0 0 4 11306.888143 . 890.0247
1 0 4 9885.1391698 1421.7489735 444.019
2 0 3 9547.1317481 338.00742168 96.10034
3 0 3 9536.0462489 11.08549917 1.763236
4 0 3 9536.041749 0.00449994 0.000939
5 0 3 9536.041749 0.00000000 5.25E-10

Convergence criterion (GCONV=1E-8) satisfied.

The SAS System 14:35 Thursday, September 25, 2008

2

The GLIMMIX Procedure

Fit Statistics

-2 Log Likelihood 19072.08

AIC (smaller is better) 19102.08
AICC (smaller is better) 19105.64
BIC (smaller is better) 19147.34
CAIC (smaller is better) 19162.34
HQIC (smaller is better) 19120.47
Pearson Chi-Square 15093.75
Pearson Chi-Square / DF 110.98

Parameter Estimates

Standard
Effect Estimate Error DF t Value Pr > |t|

Intercept 0.6106 0.08349 136 7.31 <.0001

BAP 0.9912 0.7463 136 1.33 0.1864
ANA 4.1963 1.0717 136 3.92 0.0001
BAP^2 -1.8103 1.3032 136 -1.39 0.1671
BAP*ANA -0.9289 0.9420 136 -0.99 0.3258
ANA^2 -26.2312 4.5126 136 -5.81 <.0001
BAP^3 0.3182 0.7438 136 0.43 0.6695
BAP^2*ANA 5.7294 0.6206 136 9.23 <.0001
BAP*ANA^2 -11.6288 1.3543 136 -8.59 <.0001
ANA^3 44.3939 6.8103 136 6.52 <.0001
BAP^4 0.1094 0.1370 136 0.80 0.4257
BAP^3*ANA -1.9871 0.1481 136 -13.41 <.0001
BAP^2*ANA^2 2.8742 0.2606 136 11.03 <.0001
BAP*ANA^3 3.9454 0.7776 136 5.07 <.0001
ANA^4 -22.4060 3.3537 136 -6.68 <.0001

Type I Tests of Fixed Effects

Num Den
Effect DF DF Chi-Square F Value Pr > ChiSq Pr > F

BAP 1 136 87.53 87.53 <.0001 <.0001

 96

ANA 1 136 9.31 9.31 0.0023 0.0027

BAP^2 1 136 894.26 894.26 <.0001 <.0001
BAP*ANA 1 136 106.08 106.08 <.0001 <.0001
ANA^2 1 136 3.14 3.14 0.0764 0.0786
BAP^3 1 136 2.17 2.17 0.1411 0.1435
BAP^2*ANA 1 136 167.61 167.61 <.0001 <.0001
BAP*ANA^2 1 136 42.65 42.65 <.0001 <.0001
ANA^3 1 136 61.09 61.09 <.0001 <.0001
BAP^4 1 136 1.82 1.82 0.1769 0.1791
BAP^3*ANA 1 136 184.98 184.98 <.0001 <.0001
BAP^2*ANA^2 1 136 122.00 122.00 <.0001 <.0001
BAP*ANA^3 1 136 25.73 25.73 <.0001 <.0001

The SAS System 14:35 Thursday, September 25, 2008

3

The GLIMMIX Procedure

Type I Tests of Fixed Effects

Num Den
Effect DF DF Chi-Square F Value Pr > ChiSq Pr > F

ANA^4 1 136 44.63 44.63 <.0001 <.0001

The SAS System 14:35 Thursday, September 25, 2008

4

The GLIMMIX Procedure

Model Information

Data Set WORK.ANABAP

Response Variable (Events) BAPICAL
Response Variable (Trials) N
Response Distribution Binomial
Link Function Logit
Variance Function Default
Variance Matrix Diagonal
Estimation Technique Maximum Likelihood
Degrees of Freedom Method Residual

Number of Observations Read 250

Number of Observations Used 151
Number of Events 8300
Number of Trials 15100

Dimensions

Columns in X 7
Columns in Z 0
Subjects (Blocks in V) 1
Max Obs per Subject 151

Optimization Information

Optimization Technique Newton-Raphson

Parameters in Optimization 7
Lower Boundaries 0
Upper Boundaries 0
Fixed Effects Not Profiled

Iteration History

Objective Max
Iteration Restarts Evaluations Function Change Gradient

0 0 4 11339.879074 . 571.624
1 0 4 9902.1527154 1437.7263584 70.99405
2 0 3 9821.1411532 81.01156223 17.39145
 97

3 0 3 9820.814074 0.32707920 0.080608

4 0 3 9820.8140693 0.00000465 1.294E-6

Convergence criterion (GCONV=1E-8) satisfied.

The SAS System 14:35 Thursday, September 25, 2008

5

The GLIMMIX Procedure

Fit Statistics

-2 Log Likelihood 19641.63

AIC (smaller is better) 19655.63
AICC (smaller is better) 19656.41
BIC (smaller is better) 19676.75
CAIC (smaller is better) 19683.75
HQIC (smaller is better) 19664.21
Pearson Chi-Square 15120.39
Pearson Chi-Square / DF 105.00

Parameter Estimates

Standard
Effect Estimate Error DF t Value Pr > |t|

Intercept 1.0508 0.05963 144 17.62 <.0001

BAP -1.5556 0.08142 144 -19.10 <.0001
BAP*BAP 0.5414 0.03608 144 15.01 <.0001
ANA -1.5648 0.2200 144 -7.11 <.0001
ANA*ANA 0.7606 0.2407 144 3.16 0.0019
BAP*BAP*ANA 0.4367 0.05368 144 8.14 <.0001
BAP*ANA*ANA -0.3898 0.1310 144 -2.97 0.0034

Type I Tests of Fixed Effects

Num Den
Effect DF DF Chi-Square F Value Pr > ChiSq Pr > F

BAP 1 144 66.09 66.09 <.0001 <.0001

BAP*BAP 1 144 865.44 865.44 <.0001 <.0001
ANA 1 144 11.53 11.53 0.0007 0.0009
ANA*ANA 1 144 1.68 1.68 0.1943 0.1964
BAP*BAP*ANA 1 144 164.18 164.18 <.0001 <.0001
BAP*ANA*ANA 1 144 8.85 8.85 0.0029 0.0034

The SAS System 14:35 Thursday, September 25, 2008

6

The LOGISTIC Procedure

Model Information

Data Set WORK.ANABAP

Response Variable (Events) BAPICAL BAPICAL
Response Variable (Trials) N N
Model binary logit
Optimization Technique Fisher's scoring

Number of Observations Read 250

Number of Observations Used 151
Sum of Frequencies Read 15200
Sum of Frequencies Used 15100

Response Profile

Ordered Binary Total

Value Outcome Frequency

1 Event 8300
 98

2 Nonevent 6800

NOTE: 99 observations were deleted due to missing values for the response or explanatory variables.

Model Convergence Status

Convergence criterion (GCONV=1E-8) satisfied.

Model Fit Statistics

Intercept
Intercept and
Criterion Only Covariates

AIC 20785.792 19655.628

SC 20793.415 19708.985
-2 Log L 20783.792 19641.628

R-Square 0.0729 Max-rescaled R-Square 0.0975

The SAS System 14:35 Thursday, September 25, 2008

7

The LOGISTIC Procedure

Testing Global Null Hypothesis: BETA=0

Test Chi-Square DF Pr > ChiSq

Likelihood Ratio 1142.1641 6 <.0001

Score 1099.4373 6 <.0001
Wald 1029.6997 6 <.0001

Analysis of Maximum Likelihood Estimates

Standard Wald
Parameter DF Estimate Error Chi-Square Pr > ChiSq

Intercept 1 1.0508 0.0596 310.4949 <.0001

BAP 1 -1.5556 0.0814 364.9972 <.0001
BAP*BAP 1 0.5414 0.0361 225.1650 <.0001
ANA 1 -1.5648 0.2200 50.5982 <.0001
ANA*ANA 1 0.7606 0.2407 9.9886 0.0016
BAP*BAP*ANA 1 0.4367 0.0537 66.1933 <.0001
BAP*ANA*ANA 1 -0.3898 0.1310 8.8458 0.0029

Association of Predicted Probabilities and Observed Responses

Percent Concordant 64.3 Somers' D 0.320

Percent Discordant 32.3 Gamma 0.331
Percent Tied 3.4 Tau-a 0.158
Pairs 56440000 c 0.660

The SAS System 14:54 Thursday, September 25, 2008

1

The GLIMMIX Procedure

Model Information

Data Set WORK.ANABAP

Response Variable (Events) BLATERAL
Response Variable (Trials) N
Response Distribution Binomial
 99

Link Function Logit

Variance Function Default
Variance Matrix Diagonal
Estimation Technique Maximum Likelihood
Degrees of Freedom Method Residual

Number of Observations Read 250

Number of Observations Used 152
Number of Events 6700
Number of Trials 15200

Dimensions

Columns in X 15
Columns in Z 0
Subjects (Blocks in V) 1
Max Obs per Subject 152

Optimization Information

Optimization Technique Newton-Raphson

Parameters in Optimization 15
Lower Boundaries 0
Upper Boundaries 0
Fixed Effects Not Profiled

Iteration History

Objective Max
Iteration Restarts Evaluations Function Change Gradient

0 0 4 11882.012253 . 593.8308
1 0 4 9888.6007414 1993.4115120 223.9844
2 0 3 9342.7318125 545.86892881 40.40833
3 0 3 9319.346043 23.38576959 0.561398
4 0 3 9319.3297735 0.01626941 0.000401
5 0 3 9319.3297735 0.00000002 8.54E-10

Convergence criterion (GCONV=1E-8) satisfied.

The SAS System 14:54 Thursday, September 25, 2008

2

The GLIMMIX Procedure

Fit Statistics

-2 Log Likelihood 18638.66

AIC (smaller is better) 18668.66
AICC (smaller is better) 18672.19
BIC (smaller is better) 18714.02
CAIC (smaller is better) 18729.02
HQIC (smaller is better) 18687.09
Pearson Chi-Square 15028.09
Pearson Chi-Square / DF 109.69

Parameter Estimates

Standard
Effect Estimate Error DF t Value Pr > |t|

Intercept 0.6511 0.08396 137 7.75 <.0001

BAP -9.7857 0.7653 137 -12.79 <.0001
ANA 3.4850 1.0904 137 3.20 0.0017
BAP^2 17.0985 1.3470 137 12.69 <.0001
BAP*ANA -1.3341 0.9259 137 -1.44 0.1519
ANA^2 -17.4792 4.6232 137 -3.78 0.0002
BAP^3 -10.6137 0.7745 137 -13.70 <.0001
BAP^2*ANA 1.8213 0.6243 137 2.92 0.0041
 100

BAP*ANA^2 0.5331 1.3252 137 0.40 0.6881

ANA^3 25.1141 6.9898 137 3.59 0.0005
BAP^4 2.1510 0.1435 137 14.99 <.0001
BAP^3*ANA -1.0038 0.1537 137 -6.53 <.0001
BAP^2*ANA^2 2.5378 0.2544 137 9.98 <.0001
BAP*ANA^3 -3.9069 0.7624 137 -5.12 <.0001
ANA^4 -11.3454 3.4383 137 -3.30 0.0012

Type I Tests of Fixed Effects

Num Den
Effect DF DF Chi-Square F Value Pr > ChiSq Pr > F

BAP 1 137 19.18 19.18 <.0001 <.0001

ANA 1 137 102.61 102.61 <.0001 <.0001
BAP^2 1 137 1445.95 1445.95 <.0001 <.0001
BAP*ANA 1 137 15.32 15.32 <.0001 0.0001
ANA^2 1 137 13.80 13.80 0.0002 0.0003
BAP^3 1 137 89.72 89.72 <.0001 <.0001
BAP^2*ANA 1 137 45.73 45.73 <.0001 <.0001
BAP*ANA^2 1 137 20.49 20.49 <.0001 <.0001
ANA^3 1 137 23.00 23.00 <.0001 <.0001
BAP^4 1 137 231.53 231.53 <.0001 <.0001
BAP^3*ANA 1 137 43.12 43.12 <.0001 <.0001
BAP^2*ANA^2 1 137 99.79 99.79 <.0001 <.0001
BAP*ANA^3 1 137 26.27 26.27 <.0001 <.0001

The SAS System 14:54 Thursday, September 25, 2008

3

The GLIMMIX Procedure

Type I Tests of Fixed Effects

Num Den
Effect DF DF Chi-Square F Value Pr > ChiSq Pr > F

ANA^4 1 137 10.89 10.89 0.0010 0.0012

The SAS System 14:54 Thursday, September 25, 2008

4

The GLIMMIX Procedure

Model Information

Data Set WORK.ANABAP

Response Variable (Events) BLATERAL
Response Variable (Trials) N
Response Distribution Binomial
Link Function Logit
Variance Function Default
Variance Matrix Diagonal
Estimation Technique Maximum Likelihood
Degrees of Freedom Method Residual

Number of Observations Read 250

Number of Observations Used 152
Number of Events 6700
Number of Trials 15200

Dimensions

Columns in X 6
Columns in Z 0
Subjects (Blocks in V) 1
Max Obs per Subject 152

Optimization Information
 101

Optimization Technique Newton-Raphson

Parameters in Optimization 6
Lower Boundaries 0
Upper Boundaries 0
Fixed Effects Not Profiled

Iteration History

Objective Max
Iteration Restarts Evaluations Function Change Gradient

0 0 4 12033.48852 . 742.8604
1 0 4 9706.5271455 2326.9613750 26.59134
2 0 3 9605.621007 100.90613845 7.722543
3 0 3 9605.2090819 0.41192514 0.051759
4 0 3 9605.2090782 0.00000373 7.105E-7

Convergence criterion (GCONV=1E-8) satisfied.

The SAS System 14:54 Thursday, September 25, 2008

5

The GLIMMIX Procedure

Fit Statistics

-2 Log Likelihood 19210.42

AIC (smaller is better) 19222.42
AICC (smaller is better) 19223.00
BIC (smaller is better) 19240.56
CAIC (smaller is better) 19246.56
HQIC (smaller is better) 19229.79
Pearson Chi-Square 15200.02
Pearson Chi-Square / DF 104.11

Parameter Estimates

Standard
Effect Estimate Error DF t Value Pr > |t|

Intercept 0.9447 0.05945 146 15.89 <.0001

BAP -2.4862 0.06651 146 -37.38 <.0001
BAP*BAP 0.9101 0.02758 146 33.00 <.0001
ANA -0.3418 0.1821 146 -1.88 0.0625
ANA*ANA -0.4529 0.1656 146 -2.74 0.0070
BAP*BAP*ANA 0.1228 0.02170 146 5.66 <.0001

Type I Tests of Fixed Effects

Num Den
Effect DF DF Chi-Square F Value Pr > ChiSq Pr > F

BAP 1 146 24.42 24.42 <.0001 <.0001

BAP*BAP 1 146 1424.39 1424.39 <.0001 <.0001
ANA 1 146 87.45 87.45 <.0001 <.0001
ANA*ANA 1 146 7.66 7.66 0.0056 0.0064
BAP*BAP*ANA 1 146 32.02 32.02 <.0001 <.0001

The SAS System 14:54 Thursday, September 25, 2008

6

The LOGISTIC Procedure

Model Information

Data Set WORK.ANABAP

Response Variable (Events) BLATERAL BLATERAL
Response Variable (Trials) N N
Model binary logit
Optimization Technique Fisher's scoring
 102

Number of Observations Read 250

Number of Observations Used 152
Sum of Frequencies Read 15200
Sum of Frequencies Used 15200

Response Profile

Ordered Binary Total

Value Outcome Frequency

1 Event 6700
2 Nonevent 8500

NOTE: 98 observations were deleted due to missing values for the response or explanatory variables.

Model Convergence Status

Convergence criterion (GCONV=1E-8) satisfied.

Model Fit Statistics

Intercept
Intercept and
Criterion Only Covariates

AIC 20860.015 19222.418

SC 20867.644 19268.192
-2 Log L 20858.015 19210.418

R-Square 0.1027 Max-rescaled R-Square 0.1376

The SAS System 14:54 Thursday, September 25, 2008

7

The LOGISTIC Procedure

Testing Global Null Hypothesis: BETA=0

Test Chi-Square DF Pr > ChiSq

Likelihood Ratio 1647.5972 5 <.0001

Score 1609.5226 5 <.0001
Wald 1513.9139 5 <.0001

Analysis of Maximum Likelihood Estimates

Standard Wald
Parameter DF Estimate Error Chi-Square Pr > ChiSq

Intercept 1 0.9447 0.0594 252.5508 <.0001

BAP 1 -2.4862 0.0665 1397.2217 <.0001
BAP*BAP 1 0.9101 0.0276 1088.9279 <.0001
ANA 1 -0.3418 0.1821 3.5237 0.0605
ANA*ANA 1 -0.4529 0.1656 7.4807 0.0062
BAP*BAP*ANA 1 0.1228 0.0217 32.0171 <.0001

Association of Predicted Probabilities and Observed Responses

Percent Concordant 65.5 Somers' D 0.344

Percent Discordant 31.2 Gamma 0.355
Percent Tied 3.3 Tau-a 0.169
Pairs 56950000 c 0.672
 103

The SAS System 14:54 Thursday, September 25, 2008

8

The GLIMMIX Procedure

Model Information

Data Set WORK.ANABAP

Response Variable COMP
Response Distribution Gaussian
Link Function Identity
Variance Function Default
Variance Matrix Diagonal
Estimation Technique Restricted Maximum Likelihood
Degrees of Freedom Method Residual

Number of Observations Read 250

Number of Observations Used 83

Dimensions

Covariance Parameters 1
Columns in X 15
Columns in Z 0
Subjects (Blocks in V) 1
Max Obs per Subject 83

Optimization Information

Optimization Technique None

Parameters 16
Lower Boundaries 1
Upper Boundaries 0
Fixed Effects Not Profiled

Fit Statistics

-2 Res Log Likelihood 136.39

AIC (smaller is better) 168.39
AICC (smaller is better) 179.05
BIC (smaller is better) 203.90
CAIC (smaller is better) 219.90
HQIC (smaller is better) 182.46
Pearson Chi-Square 26.72
Pearson Chi-Square / DF 0.39

Parameter Estimates

Standard
Effect Estimate Error DF t Value Pr > |t|

Intercept 2.2168 0.3070 68 7.22 <.0001

BAP -3.5246 3.2636 68 -1.08 0.2840
ANA -5.4023 4.2196 68 -1.28 0.2048
BAP^2 5.7725 5.8606 68 0.98 0.3281
BAP*ANA 3.8235 3.5728 68 1.07 0.2883

The SAS System 14:54 Thursday, September 25, 2008

9

The GLIMMIX Procedure

Parameter Estimates

Standard
Effect Estimate Error DF t Value Pr > |t|

ANA^2 15.5965 18.7022 68 0.83 0.4072

BAP^3 -3.3484 3.3854 68 -0.99 0.3261
 104

BAP^2*ANA -0.2768 2.5789 68 -0.11 0.9148

BAP*ANA^2 -8.1676 5.0845 68 -1.61 0.1128
ANA^3 -17.6957 28.8922 68 -0.61 0.5423
BAP^4 0.6244 0.6262 68 1.00 0.3222
BAP^3*ANA -0.00713 0.6696 68 -0.01 0.9915
BAP^2*ANA^2 0.2634 1.0994 68 0.24 0.8114
BAP*ANA^3 4.4555 2.7752 68 1.61 0.1130
ANA^4 7.4083 14.3181 68 0.52 0.6066
Scale 0.3930 0.06740 . . .

Type I Tests of Fixed Effects

Num Den
Effect DF DF Chi-Square F Value Pr > ChiSq Pr > F

BAP 1 68 4.44 4.44 0.0350 0.0387

ANA 1 68 0.58 0.58 0.4450 0.4477
BAP^2 1 68 0.48 0.48 0.4864 0.4888
BAP*ANA 1 68 0.25 0.25 0.6146 0.6162
ANA^2 1 68 1.29 1.29 0.2568 0.2608
BAP^3 1 68 0.03 0.03 0.8711 0.8716
BAP^2*ANA 1 68 0.01 0.01 0.9331 0.9333
BAP*ANA^2 1 68 1.47 1.47 0.2260 0.2302
ANA^3 1 68 1.81 1.81 0.1787 0.1832
BAP^4 1 68 1.08 1.08 0.2990 0.3027
BAP^3*ANA 1 68 0.01 0.01 0.9102 0.9105
BAP^2*ANA^2 1 68 0.03 0.03 0.8685 0.8690
BAP*ANA^3 1 68 2.59 2.59 0.1075 0.1122
ANA^4 1 68 0.27 0.27 0.6049 0.6066

The SAS System 14:54 Thursday, September 25, 2008

10

The GLIMMIX Procedure

Model Information

Data Set WORK.ANABAP

Response Variable COMPLAT
Response Distribution Gaussian
Link Function Identity
Variance Function Default
Variance Matrix Diagonal
Estimation Technique Restricted Maximum Likelihood
Degrees of Freedom Method Residual

Number of Observations Read 250

Number of Observations Used 70

Dimensions

Covariance Parameters 1
Columns in X 15
Columns in Z 0
Subjects (Blocks in V) 1
Max Obs per Subject 70

Optimization Information

Optimization Technique None

Parameters 16
Lower Boundaries 1
Upper Boundaries 0
Fixed Effects Not Profiled

Fit Statistics

-2 Res Log Likelihood 99.45

AIC (smaller is better) 131.45
 105

AICC (smaller is better) 145.77

BIC (smaller is better) 163.57
CAIC (smaller is better) 179.57
HQIC (smaller is better) 143.87
Pearson Chi-Square 18.21
Pearson Chi-Square / DF 0.33

Parameter Estimates

Standard
Effect Estimate Error DF t Value Pr > |t|

Intercept 0.9499 0.2826 55 3.36 0.0014

BAP -1.1170 3.3919 55 -0.33 0.7432
ANA 1.6498 4.0420 55 0.41 0.6847
BAP^2 2.9541 6.0952 55 0.48 0.6298
BAP*ANA -0.8711 3.6458 55 -0.24 0.8120

The SAS System 14:54 Thursday, September 25, 2008

11

The GLIMMIX Procedure

Parameter Estimates

Standard
Effect Estimate Error DF t Value Pr > |t|

ANA^2 -3.0087 17.9615 55 -0.17 0.8676

BAP^3 -2.0212 3.5345 55 -0.57 0.5698
BAP^2*ANA -0.3077 2.7747 55 -0.11 0.9121
BAP*ANA^2 1.5125 5.0804 55 0.30 0.7670
ANA^3 0.7017 27.8195 55 0.03 0.9800
BAP^4 0.4087 0.6572 55 0.62 0.5366
BAP^3*ANA 0.2893 0.7229 55 0.40 0.6905
BAP^2*ANA^2 -0.7257 1.1471 55 -0.63 0.5295
BAP*ANA^3 -0.2744 2.7375 55 -0.10 0.9205
ANA^4 1.5867 13.8746 55 0.11 0.9094
Scale 0.3311 0.06314 . . .

Type I Tests of Fixed Effects

Num Den
Effect DF DF Chi-Square F Value Pr > ChiSq Pr > F

BAP 1 55 2.95 2.95 0.0860 0.0917

ANA 1 55 0.26 0.26 0.6097 0.6117
BAP^2 1 55 0.44 0.44 0.5064 0.5092
BAP*ANA 1 55 4.37 4.37 0.0366 0.0412
ANA^2 1 55 0.00 0.00 0.9621 0.9623
BAP^3 1 55 1.43 1.43 0.2318 0.2370
BAP^2*ANA 1 55 0.56 0.56 0.4536 0.4568
BAP*ANA^2 1 55 0.95 0.95 0.3298 0.3341
ANA^3 1 55 1.26 1.26 0.2608 0.2657
BAP^4 1 55 0.33 0.33 0.5678 0.5701
BAP^3*ANA 1 55 0.05 0.05 0.8234 0.8242
BAP^2*ANA^2 1 55 0.39 0.39 0.5335 0.5360
BAP*ANA^3 1 55 0.01 0.01 0.9252 0.9255
ANA^4 1 55 0.01 0.01 0.9090 0.9094