DISS - 2015 - Pâmila Nayana Ferreira Ramos

1
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO – UFMT

FACULDADE DE ARQUITETURA E
TECNOLOGIAS– FAET
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS
HÍDRICOS
DENSIDADE E CARACTERIZAÇÃO GENOTÍPICA DAS LINHAGENS DE

FERROBACTÉRIAS ISOLADAS DE ÁGUA DE POÇOS RASOS EM CUIABÁ-
MATO GROSSO
PÂMILA NAYANA FERREIRA RAMOS
Cuiabá – Mato Grosso

Fevereiro – 2015
1
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO – UFMT

FACULDADE DE ARQUITETURA E
TECNOLOGIAS– FAET
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS
HÍDRICOS
PÂMILA NAYANA FERREIRA RAMOS
DENSIDADE E CARACTERIZAÇÃO GENOTÍPICA DAS LINHAGENS DE

FERROBACTÉRIAS ISOLADAS DE ÁGUA DE POÇOS RASOS EM CUIABÁ-
MATO GROSSO
Orientadora: Dr.ª Zoraidy Marques de Lima
Co-orientador: Prof. Dr. Eduardo Beraldo de Morais
Dissertação apresentada à Faculdade de Arquitetura e

Tecnologias, da Universidade Federal de Mato Grosso,
como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação
em Recursos Hídricos, para obtenção do título de Mestre
em Recursos Hídricos.
Cuiabá – Mato Grosso
Fevereiro – 2015
2
BANCA EXAMINADORA
_____________________________________________________
Orientadora: Profª Drª Zoraidy Marques de Lima
Universidade Federal de Mato Grosso
Departamento de Engenharia Sanitária e Ambiental
_____________________________________________________
Prof. Dr. Eduardo Beraldo de Morais (Titular)
Departamento de Engenharia Sanitária e Ambiental
_____________________________________________________
Prof. Dr. Renato Blat Migliorini (Interno)
Departamento de Geologia Geral
____________________________________________________
Profª Drª Selma Baia Batista (Externo)
Centro Universitário de Várzea Grande

iii
DEDICATÓRIA
Aos meus pais.

iv
AGRADECIMENTOS
A Deus pelas maravilhas que fez e continua fazendo em minha vida, por me
fortalecer nos momentos de dificuldade;
Aos meus pais pelo exemplo de amor e por construírem peças fundamentais na
minha vida; por dividirem comigo as alegrias de minhas conquistas e pelo apoio nos
momentos de dificuldades; por sempre acreditarem em mim;
Aos meus irmãos pela força, amizade e apoio;
À Dr.ª Zoraidy Marques de Lima, pela orientação, atenção, paciência,

confiança e carinho. Serei imensamente grata por sempre me ajudar nessa árdua tarefa;
Aos Professores Dr. Eduardo Beraldo de Morais e Dr.ª Selma Baia Batista pelo
apoio durante o desenvolvimento;
Aos Professores do Mestrado em Recursos Hídricos que me proporcionaram o

aprendizado;
A todos que fazem parte da equipe do Laboratório de Microbiologia Sanitária

Ambiental – LAMSA pelo aprendizado e pelas ajudas indispensáveis;
Aos meus colegas de sala, pelo convívio durante os últimos anos,

principalmente Anderson Michiura, Bruno Brum, Luana Gomes e Rogério Santos pelo
companheirismo, amizade, paciência, carinho e apoio durante todo este período;
A todos meus amigos e as pessoas que acompanharam minha trajetória, quando

distantes não deixaram de torcer e acreditar em mim.
Agradeço a Universidade Federal de Mato Grosso - UFMT.

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SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................................12
2.OBJETIVOS.........................................................................................................................12
2.1 GERAL .............................................................................................................................12
2.2 ESPECÍFICO ....................................................................................................................12
3. REFERENCIAL TEÓRICO ...............................................................................................12
3.1 ASPECTOS DO MEIO FÍSICO .......................................................................................12
3.2 ÁGUAS SUBTERRÂNEAS .............................................................................................14
3.3 BACTÉRIAS HETEROTRÓFICAS .................................................................................16
3.4 FERROBACTÉRIAS ........................................................................................................17
3.5 FISIOLOGIA DE FERROBACTÉRIAS ..........................................................................17
3.6 IDENTIFICAÇÃO DE FERROBACTÉRIAS .................................................................18
3.7 TÉCNICAS MOLECULARES .........................................................................................20
3.8 MÉTODO DA PCR EM ESTUDOS GENÉTICOS .........................................................21
4. MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................................. .22
4.1 DESCRIÇÃO DA ÁREA DO ESTUDO ........................................................................ .22
4.2 FRENQUÊNCIA AMOSTRAL ...................................................................................... .22
4.3 COLETA DAS AMOSTRAS ........................................................................................... 24
4.4 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE FERRO ...............................................46
4.5 DETERMINAÇÃO DA DENSIDADE DE FERROBACTÉRIAS ...................................26
4.6 EXTRAÇÃO DE DNA DOS ISOLADOS DE FERROBACTÉRIAS ............................ .28
4.7CARACTERIZAÇÃO GENOTÍPICA DAS FERROBACTÉRIAS ATRAVÉS DA
TÉCNICA DE BOX-PCR ...................................................................................................... .29
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................ 31
5.1 FERRO TOTAL .................................................................................................................31
5.2 ANÁLISE MICROBIOLÓGICOS NAS ÁGUAS DOS POÇOS RASOS DO BAIRRO
PEDRA NOVENTA ............................................................................................................... 33
5.3 ISOLAMENTO DE ESTIRPES BACTERIANAS .......................................................... 35
5.4 EXTRAÇÃO DE DNA DOS ISOLADOS ....................................................................... 36
5.5 AMPLIFICAÇÃO DO DNA BACTERIANO ..................................................................36
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS................................................................................................ 50
7 REFERÊNCIAS ................................................................................................................... 51
6
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Mapa geológico de Cuiabá ....................................................................................14

Figura 2- Mapa de localização da área de estudo ................................................................... 23
Figura 3- Mapa de distribuição espacial dos pontos amostrais ............................................... 24
Figura 4- Coleta de água de poços rasos para análise de Metal Ferro .................................... 26
Figura 5- Coleta de água em poços rasos para análise microbiológica ................................... 26
Figura 6- Medição de temperatura e pH na água de poços rasos ............................................ 26
Figura 7- Coletor (bailers) de água de poços rasos ................................................................. 26
Figura 8- Inoculação das amostras de água para cultivo dos microrganismos analisados pela
técnica de Espalhamento Superficial ...................................................................................... 28
Figura 9- Crescimento de Ferrobactérias cultivadas da água .................................................. 28
Figura 10- Fluxograma esquemático de metodologia utilizada nas análises microbiológicas e
de biologia molecular através de técnicas dependentes de cultivo ......................................... 29
Figura 11- Concentração de ferro (Fe) no início do período de chuva Novembro/ 2013 e no
período de chuvas regular Janeiro/2014 no Bairro Pedra Noventa ......................................... 32
Figura 12 - Densidade de Ferrobactérias no início do período de chuva (2013) e no período de
chuvas regulares (2014) no Bairro Pedra Noventa. .............................................................. 34
Figura 13- Padrão de amplificação das estipes do Ponto amostral P1primeira e segunda coleta
início de chuva Novembro/2013 e chuvas regulares Janeiro/2014 respectivamente .............. 38
Figura 14- Padrão de amplificação das estirpes do Ponto amostral P2 primeira e segunda
coleta início de chuva Novembro de 2013 e chuvas regulares Janeiro 2014 ...........................39
coleta início de chuva Novembro de 2013 e chuvas regulares Janeiro 2014 .......................... 40
7
coleta início de chuvas Novembro de 2013 e chuvas regulares Janeiro 2014 ........................ 43
coleta início de chuva Novembro de 2013 e chuvas regulares Janeiro de 2014 ..................... 48
Figura 27- Padrão de amplificação das estirpes do Ponto amostrais P15 e 16 primeira e
segunda coleta início de chuva Novembro de 2013 e chuvas regulares Janeiro 2014
respectivamente ....................................................................................................................... 48
Figura 28- Padrão de amplificação das estirpes dos Pontos amostrais P16 e 17 primeira e
segunda coleta início de chuva Novembro de 2013 e chuvas regulares Janeiro 2014
respectivamente ....................................................................................................................... 49
8
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Coordenadas geográficas dos pontos de coleta no Bairro Pedra 90 Cuiabá-MT. ... 25
Tabela 2 - Isolados de Ferrobactérias. ...................................................................................... 36
9
RESUMO
A utilização de poços rasos como fonte de abastecimento de água é uma prática comum em
todo o mundo devido à qualidade dos aquíferos serem adequadas para diversos usos,
principalmente ao consumo humano. Todavia, a poluição desse recurso pode ocorrer por
diversas formas, como a contaminação bacteriológica, mais especificamente por
Ferrobactérias. Assim sendo, este estudo tem como objetivo analisar o perfil genotípico de
Ferrobactérias isoladas da água de poços rasos no Bairro Pedra Noventa, Cuiabá-MT. As
coletas de água nos pontos amostrais foram realizadas em novembro de 2013 (início do
período chuvoso) e janeiro de 2014 (chuvas regulares), no Bairro Pedra Noventa, em
Cuiabá, utilizando como amostrador o manual tipo bailer. Após a quantificação das
Ferrobactérias, via meio seletivo, foram isoladas para extração de DNA e caracterização
genotípica utilizando o iniciador BOX-PCR. A partir do produto da eletroforese do BOX-
PCR, foram gerados dezesseis géis que contabilizam dezessete pontos para cada período
amostral. A similaridade das amostras foi determinada por matrizes binárias de presença e
ausência para cada um dos pontos de análise, em função da posição que as bandas ocupavam
no gel. A partir da matriz de dissimilaridade foram agrupados em dendrogramas UPGMA e
análise de similaridade de Jaccard (2%) para o percentual de similaridade entre os isolados
de cada ponto. Para análises do metal ferro foram realizadas duas coletas em dois períodos
distintos os pontos P2, P7, P10 e P16, apresentaram concentrações acima aos Valores
Máximos Permissíveis para consumo humano. Para análises microbiológicas todas as
amostras analisadas apresentaram contaminação por Ferrobactérias. Através dos
dendrogramas de dissimilaridade, notou-se que 10,9% dos isolados obtiveram uma
similaridade acima de 70%, o que leva a inferir que 89,1% dos isolados apresentaram
diversidade gênica.
Palavras-chave: Água Subterrânea. Bactéria. DNA. Similaridade Gênica.

10
ABSTRACT
The use of shallow wells as water source is a common practice worldwide for the quality of
aquifers are suitable for various uses, mainly for human consumption. However, pollution of
this resource can occur in various forms, such as bacterial contamination, specifically by Iron
Bacteria. Therefore, this study aims to analyze the genotypic profile of Iron Bacteria isolated
from water from shallow wells in the neighborhood Stone Ninety, Cuiaba-MT. The water
sampling in the sampling points were held in November 2013 (the beginning of the rainy
season) and January 2014 (regular rainfall), in the neighborhood Stone Ninety in Cuiaba, as
sampler using the manual type bailer. After quantification of Iron Bacteria, via selective
medium, were isolated for DNA extraction and genotypic characterization using BOX-PCR
primer. From the product of BOX-PCR electrophoresis, gels were generated which account
sixteen seventeen points for each sampling period. The similarity of the samples was
determined by binary matrices presence and absence for each of the analysis points,
depending on the position occupied bands in the gel. From the dissimilarity matrix were
grouped into UPGMA dendrograms and Jaccard similarity analysis (2%) to the percentage of
similarity among isolates of each point. To iron metal analyzes were performed two
collections into two distinct periods points P2, P7, P10 and P16 showed concentrations above
the Maximum Allowable Values for human consumption. For microbiological analyzes all
samples were contaminated by Iron Bacteria. Through dendrograms dissimilarity, it was
noticed that 10.9% of the isolates obtained a similarity greater than 70%, which leads to the
inference that 89.1% of the isolates showed genetic diversity.
Key-words: Groundwater. Bacteria. DNA. Gene similarity.

11
1 INTRODUÇÃO
Um das alternativas para o abastecimento de água de consumo humano são as águas

subterrâneas e o seu uso tem crescido de forma acelerada nas últimas décadas. Fato que pode
ser observado pelo crescimento das empresas privadas e órgãos públicos com atuação na
pesquisa e captação desse recurso.
As águas subterrâneas representam uma opção para comunidades que não possuem
serviços de saneamento básico, onde técnicas rudimentares são desenvolvidas para suprir
necessidades básicas de abastecimento de água (JAMEEL et al., 2006) como acontece em
bairros da grande Cuiabá. Integrante dessa realidade, o bairro Pedra Noventa enfrenta
problemas de saneamento básico desde a sua implantação, sendo uma das alternativas da
população para usufruir da água a abertura de poços rasos (MOURA et al., 2013).
Porém, as águas obtidas nas perfurações desses poços possivelmente não apresentam
qualidade adequada para consumo humano, devido sua disposição e forma de exploração
gerando contaminação por fontes de poluições difusas. Para que se possa garantir uma boa
qualidade deste recurso são necessárias técnicas de construção de poços e cumprimento dos
padrões estabelecidos na legislação para água de consumo humano, evitando assim
contaminações (SILVA et al.,2014).
A contaminação de poços rasos é ocasionada por microrganismos, neste caso as

Ferrobactérias. O metal ferro, substância química que está presente nas reações de
composição da água devido a sua abundância na natureza, oxida liberando íons e, a partir da
oxidação do ferro na água, microrganismos utilizam ferro ou íons de ferro como fonte de
energia. A bactéria responsável pela utilização desse processo metaboliza e transforma o ferro
em hidratos de ferro, formando precipitados de cor marrom que se apresentam em forma de
flocos, provocando, então, a contaminação.
Microrganismos, como as bactérias heterotróficas Ferrobatérias, desempenham papel

importante no estudo dos impactos ambientais (GIMENES, et al., 2010). Dessa maneira, o
conhecimento da diversidade microbiana é essencial para entender a relação entre os
parâmetros ambientais que, associados à biologia molecular, permitem investigar a
diversidade, o perfil de comunidade e as características específicas da espécie microbiana de
interesse (CARVALHO; PARANHOS, 2010).
12
Portanto, a justificativa da realização deste trabalho foi a partir de pesquisas realizadas

por Silva et al., (2014) no Bairro Pedra Noventa, Cuiabá- MT que detectou uma densidade
elevada de bactérias heterotróficas e valores significativos de ferro na água, sendo assim, essa
pesquisa despertou o interesse de estudar a relação da presença de bactéria heterotrófica que
utilizam fonte de energia do metal ferro dissolvido em água.
2 OBJETIVO
2.1 GERAL
 Analisar o perfil genotípico de Ferrobactérias isoladas da água de poços rasos

no Bairro Pedra Noventa, Cuiabá-MT.
2.2 ESPECÍFICOS
 Quantificar Ferro total na água dos poços rasos ou tipo cacimba no Bairro Pedra
Noventa;
 Quantificar e isolar estirpes de Ferrobactérias na amostra de água dos poços rasos no

Bairro Pedra Noventa;
 Caracterizar geneticamente representantes dos grupos bacterianos Ferrobactérias na

água dos poços rasos no Bairro Pedra Noventa.
13
3 REFERENCIAL TEÓRICO
3.1 ASPECTOS DO MEIO FÍSICO
A Depressão Cuiabana apresentam três unidades morfológicas caracterizadas por:

dissecação média a forte, amplitude média, e controlada por estruturas da faixa de
dobramentos Paraguai-Araguaia. As formas de relevos fortemente dissecadas dão origem às
colinas, morrotes e morros. Os relevos têm suave dissecação, apresentam pequena amplitude,
declividade baixa e baixa densidade de drenagem. Além das formas dissecadas, a Depressão
Cuiabana possui uma unidade de origem agradacional, constituída por uma superfície plana
do Rio Cuiabá, com inundações ocorridas em períodos de cheias excepcionais (CASTRO
JÚNIOR et al., 2007).
Na Depressão Cuiabana (OLIVEIRA et al., 1982), ocorre predomínio de solos

caracterizados por Neossolos Litólicos, Cambissolos e Plintossolos. Esses dificultam a
infiltração de água de chuva e favorecem o escoamento superficial, que ocorrem associados às
formas de relevo do tipo colinas e rampas pediplanadas com cotas variando de 160 a 240m
(CASTRO JÚNIOR et al., 2007).
A cidade de Cuiabá se situa nos domínios geológicos do Grupo Cuiabá, pertencente à

Faixa Interna de Dobramentos Paraguai, com a diferenciação das unidades litoestratigráficas e
suas subunidades (LUZ et al., 1980; BARROS et al., 1982).
Migliorinni (1999) caracterizou as faces das rochas metamórficas do Grupo Cuiabá,

existentes em afloramentos de rochas observados na cidade de Cuiabá e Várzea Grande
(Figura 1).
14
Figura 1- Mapa geológico de Cuiabá (MOURA, 2013).
Migliorini (1999) diferenciou as rochas nessas áreas em cinco unidades caracterizadas

pelas suas litofácies da Formação Miguel Sutil e Formação Rio Coxipó.
Migliorini (1999) e Apoitia (2009) utilizaram dados existentes de poços, análises de

água e caracterização construtivas dos poços tubulares que abordam a hidrogeologia das
rochas do Grupo Cuiabá, em Cuiabá e Várzea Grande.
De acordo com estudos realizados por Silva et al. (2014) e Moura et al. (2013) no
Bairro Pedra, em Cuiabá, percebe-se que, para a maioria dos poços perfurados, não são
elaborados estudos de viabilidade técnica e, como consequência disso, estes poços são em
geral mal locados, produzindo baixas vazões e ficando vulneráveis à contaminação.
3.2 ÁGUAS SUBTERRÂNEAS
A água é um componente natural e essencial para diversos elementos (vegetais,

animais e minerais) e desempenha o papel de manutenção da vida dos seres humanos (PINTO
et al., 2004). Sua gestão é regida por leis, como a Estadual n. 9.612 de 12 de Setembro de
15
2011, que dispõe sobre a administração e a conservação das águas subterrâneas de domínio do
Estado de Mato Grosso. O gerenciamento dessas águas é compreendido pela avaliação
quantitativa e qualitativa e o planejamento de seu uso racional, a outorga e fiscalização dos
seus direitos de uso e pela adoção de medidas que visem a sua conservação, preservação e
recuperação.
De maneira geral, a utilização das águas subterrâneas no Brasil é realizada de forma

empírica, improvisada e não controlada, resultando em frequentes problemas de interferências
entre poços, redução dos fluxos de base dos rios, impactos em áreas encharcadas e redução
das descargas de fontes e nascentes (APOITIA, 2003). Tal fato pode ser observado no bairro
Pedra Noventa, onde os poços, inadequadamente construídos, operados e abandonados sem
controle, transformam-se em verdadeiros focos de poluição das águas subterrâneas,
especialmente, aqueles localizados no meio urbano.
O impacto da cidade na qualidade das águas superficial e subterrânea altera a

qualidade e o ciclo hidrológico, com mudanças nos padrões de fluxo e quantidade de água.
Provoca o aumento da geração de esgotos domésticos, aumento da atividade industrial e da
poluição por ela gerada. A piora da qualidade da água dos recursos hídricos urbanos é,
portanto, uma consequência que pode ser observada em praticamente todas as cidades do
Brasil (FINOTI et al., 2009).
De acordo com a lei estadual n.9612/09/2011(SEMA, 2011) é de responsabilidade da

Secretaria de Estado de Meio Ambiente (SEMA) promover o gerenciamento das águas
subterrâneas, realizando o cadastramento dos poços, implantação de sistemas de outorga e a
implantação de programas permanentes de conservação e proteção dos aquíferos. Cabe à
SEMA, juntamente com o Conselho Estadual de Recursos Hídricos (CEHIDRO), o
estabelecimento da escala de prioridades de atendimento quando houver restrição à extração
de águas subterrâneas oriundo da escassez ou prejuízos causados pelos aproveitamentos. O
Plano Estadual de Recursos Hídricos foi lançado em setembro de 2009 e quanto às águas
subterrâneas traz, em suas diretrizes, projetos para realização de campanhas de adequação
técnica das obras de captação de águas subterrâneas (poços tubulares) e implantação do
programa de monitoramento da qualidade desse recurso (PERH/MT, 2009).
De forma genérica, a poluição das águas decorre da adição de substâncias ou de

formas de energia que, diretamente ou indiretamente, alteram as características físicas,
16
químicas e biológicas do corpo d‟água de uma maneira tal que prejudique a utilização das
suas águas para usos benéficos (TUCCI, 1998).
A água para consumo humano pode ser obtida tanto em mananciais de águas
superficiais, quanto de mananciais subterrâneos. O manancial subterrâneo é um recurso
amplamente utilizado por uma parcela da população brasileira. A água subterrânea pode ser
captada no aquífero confinado ou livre, localizado entre duas camadas relativamente
impermeáveis, o que dificulta a sua contaminação, ou ser captada no aquífero não confinado
ou livre, que fica próximo à superfície, e está, portanto, mais suscetível à contaminação.
Em função do baixo custo e facilidade de perfuração, a captação de água livre, mesmo

que mais vulnerável à contaminação, é mais frequentemente utilizada no Brasil (VARNIER et
al., 2002). A poluição das águas é indicativo de sua utilização incorreta e de descaso quanto
aos cuidados necessários. As fontes de contaminação podem ser diversas: despejos
domésticos, industriais, animais e chorumes oriundos de aterros sanitários (FRANCIELI et
al., 2008).
A água subterrânea é considerada contaminada quando os teores de substâncias

introduzidas ficam acima dos valores máximos permitidos pelos padrões de qualidade para
consumo humano, no entanto, poluição e contaminação são dois conceitos que normalmente
se confundem. Poluição representa um conjunto de ações e interferências diretas (naturais) e
indiretas (antrópicas) sobre a qualidade da água e a contaminação se caracteriza por elementos
na água que possam prejudicar a saúde (BRANCO 1991; APOITIA, 2003).
Nas áreas urbanas, a contaminação das águas subterrâneas, e também superficiais, por
microrganismos patogênicos, parasitas, substâncias orgânicas e inorgânicas está relacionada
ao destino final do esgoto doméstico, industrial e postos de combustíveis e de lavagem. A
maioria das grandes cidades não alcança 50% de tratamento dos seus resíduos e o país tem
menos de 10% de municípios que tratam alguma parte de seus esgotos (FINOTI et al., 2009).
A contaminação nos aquíferos pode levar muito tempo até manifestar-se claramente,
devido à lenta circulação das águas subterrâneas, capacidade de absorção dos terrenos e
pequeno tamanho dos canalículos. O notável poder de depuração dos aquíferos, em relação a
muitos contaminantes, e o grande volume de água que armazenam fazem com que as
contaminações extensas se manifestem muito lentamente e as contaminações localizadas
somente apareçam depois de algum tempo (SILVA et al.,2014).
17
3.3 BACTÉRIAS HETEROTRÓFICAS
Bactérias heterotróficas estão universalmente presentes em todos os tipos de água,

alimento, solo, vegetação e ar. A contagem de bactérias isoladas, a partir de um método
particular, inclui algumas variáveis como meio de cultura, tempo e temperatura de incubação,
e a forma de inoculação no meio (ALLEN, 2004).
As bactérias heterotróficas constituem uma parcela substancial da biomassa de

ecossistemas aquáticos, contribuindo com a produção secundária total e exercendo um
importante papel na cadeia alimentar e no ecossistema (Pomeroy, 1974; AZAM et al., 1987;
COLE et al., 1988). Esses microrganismos apresentam a capacidade de transformar
compostos orgânicos particulados disponíveis no ambiente em matéria orgânica dissolvida
(MOD) (CARISON et al., 1996). A MOD representa a principal reserva de carbono orgânico
desses ecossistemas e é consumida como fonte de energia quando as bactérias absorvem
nutrientes do ambiente.
As bactérias heterotróficas, genericamente definidas como microrganismos que

requerem carbono orgânico como fonte de nutrientes, fornecem informações sobre a
qualidade bacteriológica da água de uma forma ampla. Servindo, portanto, de indicador
auxiliar da qualidade da água ao fornecer informações adicionais sobre eventuais falhas na
desinfecção, colonização e formação de biofilmes no sistema de distribuição (GUERRA,
2006).
3.4 FERROBACTÉRIAS
As águas subterrâneas, em geral, são ricas em ferro, o quarto elemento mais abundante
na crosta terrestre e pode ser facilmente encontrado em águas subterrâneas na forma de
bicarbonato ferroso [Fe (HCO3)2] (SUNG et al., 1980). As reações de óxido-redução ou redox
acontecem pela transferência de elétrons entre reagente e produtos. Muitas reações são
catalisadas por microrganismos, do tipo bactérias, e determinam a natureza de espécies
químicas nas águas, como: carbono, nitrogênio, oxigênio, enxofre, ferro e manganês.
Segundo Cordoville (2005), ferrobactérias dos gêneros Sphaerotilus, Leptothrix,

Gallionella e Crenothrix utilizam a energia resultante da conversão do óxido ferroso em
18
hidróxido férrico, formando compostos que se depositam no microrganismo sob a forma de

bainhas que, por sua vez, acumulam-se nas paredes das tubulações. Estas bactérias têm
importância econômica e sanitária, causando a formação de crostas de ferrugem no interior de
tubulações. Elas chegam a formar extensos depósitos geológicos de ferro e, nas canalizações,
constituem frequentes causas de obstruções, além de dar uma coloração parda avermelhada à
água.
A distribuição bacteriana é estreitamente relacionada às propriedades do solo e a sua

abundância pode ser utilizada como um forte indicativo de mudanças no fluxo de nutrientes,
resultante de variações dos contaminantes e de mudanças ambientais (CABRAL, 2010).
3.5 FISIOLOGIA DE FERROBACTÉRIAS
Muitas bactérias relacionadas ao processo de corrosão fazem parte do ciclo do enxofre

na natureza. Este ciclo é composto por microrganismos com diversidade metabólica, capazes
de metabolizar compostos de enxofre por duas formas: Quimioautotrófica e
Quimioheterotrófica.
Os quimioautotróficos utilizam os elétrons de compostos orgânicos reduzidos como

fonte de energia, utilizando CO2 como sua principal fonte de carbono. As fontes inorgânicas
de energia incluem sulfeto de hidrogênio (H2S) para Beggiatoa; enxofre elementar (S) para
Thiobacillus thiooxidans; íons de ferro (Fe2+) para Thiobacillus ferrooxidans. A energia
derivada da oxidação destes compostos inorgânicos é eventualmente armazenada em ATP,
que é produzido pela fosforilação oxidativa (COETSER et al., 2005).
Os quimioheterotróficos utilizam, especificamente, elétrons a partir de átomos de

hidrogênio de compostos orgânicos como fonte de energia. Esta categoria de microrganismos
pode utilizar vários compostos como aceptores finais da cadeia respiratória: nitrato, nitrito,
sulfato, férrico, enxofre, exceto oxigênio (respiração anaeróbica) (TORTORA et al., 2002).
De acordo com Freitas; Inez e Joroski (2002), a presença de microrganismos com

características de retirar sua fonte de energia de reações químicas de oxidação é muito comum
na natureza. No caso das Ferrobactérias, a fonte de energia são os sais solúveis de ferro que,
após a metabolização, transformam-se em hidratos de ferro, formando precipitados de cor
marrom que, normalmente, apresentam-se em forma de flocos. As características físicas e
19
organolépticas da água estão relacionadas às condições de tratamentos da água, ao tipo de

solo, ao local de armazenamento e aos contaminantes presentes.
A diversidade genética de microrganismos ultrapassa em muito a encontrada em

plantas e animais superiores. Historicamente, a taxonomia microbiana tem sido realizada com
a utilização de uma variedade de testes físicos e bioquímicos que permitem o agrupamento de
isolados microbianos em gêneros e espécies. Esta perspectiva laboratorial requer o cultivo de
microrganismos, a fim de separar os vários isolados em monoculturas. Esta abordagem
clássica tem sido usada para identificar e caracterizar muitos dos microrganismos aquáticos,
notadamente, as bactérias (BRASIL et al., 2005).
3.6 IDENTIFICAÇÃO DE FERROBACTÉRIAS
Segundo Carvalho (1995), os principais fatores de ocorrência de Ferrobactérias na

água de consumo estão relacionados a questões de contaminação de aquíferos, operação
inadequada dos poços e práticas de perfuração.
As formas de Ferrobactérias mais comumente encontradas em águas de poços são:
 Tipo filamentoso: Filamentos simples, que lembram um tubo plástico, fino,

com ou sem precipitados, sem ramificações, apresentando ou não células ao longo do
filamento, gêneros Leptothrix e Spahaerotilus. Tipo filamentoso com diferença de diâmetros
ao longo do filamento e, caracteristicamente, liberando, nas extremidades, um conjunto de
células ou tipo de esporos (conídios) Crenothrix (MULDER, 1964).
 Tipo não filamentoso: Observa-se um entrelaçado de fios, lembrando uma

trança de cabelos. Não se observam, comumente, as células formadoras das fitas- Gênero
Gallionella (KUCERA et al., 1957).
 Tipo não filamentoso: células. Dificilmente identificáveis ao microscópio.
Em águas superficiais poluídas, as bactérias do gênero Sphaerothilus sp, em especial

S. natans, formam tufos de filamentos que, além de apresentar odor e aspecto desagradável,
causam problemas em filtros e canaletas. Estes filamentos formam flocos imensos de
bactérias. Em tanques, com a presença excessiva do organismo, ocorre a formação de uma
espécie de lodo flutuante, conhecido como bulking. Tal fenômeno é decorrente da má aeração,
20
sobrecarga de nutrientes orgânicos e voláteis, aliados à própria característica (composição

férrica) do solo (CARAVELLI et al., 2008).
São essas bactérias (Gallionella sp, por exemplo) que, na presença de oxigênio,
oxidam o íon ferroso (Fe 2+) a íon férrico (Fe 3+ ) liberando energia e depositando o hidróxido
férrico (Fe(OH)3) marrom-alaranjado (VIDELA, 2003). O aumento da densidade de
comunidades dessas espécies citadas podem ocasionar problemas, tanto para o sistema de
abastecimento quanto para as pessoas que utilizarem a água para consumo, nessas situações se
faz necessário inibir a presença desses microrganismos, evitando assim danos maiores.
Ferrobactérias estão distribuídas em uma variedade de grupos taxonômicos diferentes,

por isso é muito difícil a padronização de método para sua caracterização e identificação. O
método padrão utilizado é baseado em testes bioquímicos que caracterizam o perfil
metabólico do microrganismo. A unidade fundamental da diversidade biológica e a base da
hierarquia taxonômica é a espécie. Entretanto, a maioria dos microrganismos ainda não
podem ser cultivados e isolados por meio de técnicas convencionais. Consequentemente, a
diversidade microbiana natural é ainda relativamente pouco explorada.
Durante os últimos anos, os avanços e a melhoria das técnicas moleculares baseadas

na sequência do gene que codifica a subunidade menor dos ribossomos têm ampliado o
conhecimento acerca da diversidade microbiana (PEDRÓS-ALIÓ, 2006).
3.7 TÉCNICAS MOLECULARES
O uso de técnicas moleculares redimensionou os estudos, conceitos e valores da

diversidade microbiana, além de descobrir novas funções bacterianas que até então eram
indescritível (FRY, 2000; DAHLLÖF, 2002; RODRÍGUEZ-VALERA 2002; TORSVIK et
al., 2002; FORNEY et al., 2004; KELLER et al., 2004; KEMP et al., 2004; LYAUTEY et al.,
2005).
A utilização da biologia molecular como ferramenta para a investigação da ocorrência

e distribuição de microrganismos no ambiente apresenta uma vantagem em relação à
microbiologia convencional. As técnicas empregadas podem apresentar um perfil detalhado
da comunidade onde estão inseridos os microrganismos de interesse, e não apenas fornecer
dados sobre uma pequena fração do biofilme (DALY et al., 2000).
21
As técnicas moleculares, por outro lado, auxiliam na diferenciação dos grupos de

microrganismos, fornecendo informações diretas do DNA do indivíduo. Dessa forma, a
biologia molecular vem sendo utilizada para diferenciação de indivíduos e caracterização
filogenética dos microrganismos de interesse (STRINGARI, 2004).
Ressalta-se que espécies bacterianas são consideradas como um grupo genomicamente

coerente que compartilha de um grau elevado de similaridade em diversas e diferentes
propriedades fenotípicas e genômicas, podendo ser caracterizadas com abordagem polifásica.
Os métodos disponíveis para cultivar as bactérias encontradas em ambientes naturais, tais
como o solo e água doce, trazem ao estudo da diversidade microbiana um avanço tecnológico
(FRY, 2000; RODRÍGUEZ, 2002; TORSVIK et al., 2002; KEMP; ALLER, 2004).
Estudos sobre genomas de microrganismos tiveram grande impulso a partir do início

da década de 1970 com o desenvolvimento da tecnologia do DNA recombinante. Essa
tecnologia permite a replicação (ou amplificação) in vivo de regiões do DNA genômico
inseridas em plasmídeos bacterianos ou clones virais. A descoberta das enzimas de restrição
que são capazes de clivar o DNA em determinados sítios, gerando “pedaços menores” e mais
fáceis de serem estudados e identificados, assim como o desenvolvimento da técnica de
Southern blot em 1975, abriram novas perspectivas e possibilidades de aplicação de DNA
recombinate na biologia molecular (FERREIRA, 2003).
A aplicação de sondas de ácido nucléicos em estudos de populações microbianas

naturais se tornou ainda mais abrangente com o desenvolvimento da técnica de PCR
(Polymerase Chain Reaction), concebida por Kary Mullis em meados da década de 80
(MULLIS et al., 1987; MULLIS, 1990). A técnica requer um conjunto de oligonucleotídeos
iniciadores (primers) de sequência complementar às regiões que flanqueiam o fragmento de
DNA a ser amplificado (MULLIS, 1990). O uso de PCR aumenta significativamente a
probabilidade de detecção de sequências raras em misturas heterogêneas de DNA utilizando a
amplificação exponencial de uma sequência alvo. Um microrganismo pode ser detectado em
amostras complexas utilizando-se oligonucleotideos sintéticos para um gene característico da
espécie ou para regiões espécies-específicas dentro do rDNA 16S ou 23S (RODRIGUEZ et
al., 2009).
Além disso, este uso permite analisar um número significativo de indivíduos de uma
comunidade, produz perfis genotípicos definidos e origina um padrão de bandas altamente
22
complexo (DIMRI et al., 1992, TIKOO et al., 2001; ZILLI et al., 2003). As técnicas
moleculares estão disponíveis para a detecção de variabilidade genética da sequência de
DNA, ou seja, para detecção de polimorfismo genético.
3.8 MÉTODO DA PCR EM ESTUDOS GENÉTICOS
Com o avanço da biologia molecular e da PCR, teve-se uma verdadeira revolução na

biologia, tanto na pesquisa visando o entendimento de processos biológicos fundamentais
como nas áreas aplicadas envolvendo diagnósticos e melhoramento genético de plantas e
animais domésticos (FERREIRA et al., 2004).
A técnica da PCR tornou mais eficiente a detecção de polimorfismos no nível do DNA

ou RNA, traduzida em redução do tempo de execução dos experimentos, do seu custo e de
sua complexidade. Matioli (2001) reforça que a técnica de PCR possibilita a obtenção de
quantidades muito grandes de fragmentos específicos de DNA através da amplificação em
ciclos. Teoricamente, cada ciclo de síntese duplica a quantidade de DNA – alvo. Na prática
esse número é menor, pois não há eficiência 100% na reação.
Logo, a reação em cadeia da polimerase é uma técnica altamente sensível, por meio da
qual, pequenas quantidades de sequências de DNA ou RNA específicas podem ser
enzimaticamente amplificadas até que sejam obtidas milhões de cópias da sequência alvo,
sendo que, na última década, a PCR se tornou a técnica genética mais utilizada em
diagnóstico microbiológico (GANDRA, et al., 2008).
O BOX-PCR, que usa iniciadores com sequências repetitivas altamente conservadas,

caracteriza genótipos por meio de sequência intergênica repetitiva, relata produto espécie
específica e perfis genômico de linhagem-específica. Além disso, permite analisar um número
significativo de indivíduos de uma comunidade, produz perfis genotípicos definidos e origina
um padrão de bandas altamente complexo (ZILLI et al., 2003).
23
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 DESCRIÇÃO DA ÁREA DO ESTUDO
Esta pesquisa foi desenvolvida no município de Cuiabá-MT, na área do Bairro Pedra

Noventa, localizado na região sudeste da cidade. Esta área é delimitada pelas latitudes UTMY
8.273.150m a Norte, e 8.269.500m a Sul, e longitudes UTMX 616.200m a Leste e 611.000m
a Oeste (Datum WGS84, Zona 21) (Figura 2).
Figura 2- Mapa de localização da área de estudo Pedra Noventa em Cuiabá-MT (Imagem do Google Earth,
2012).
4.2 FRENQUÊNCIA AMOSTRAL
Para a seleção dos pontos amostrais, foram realizadas visitas técnicas em outubro de 2013 para a detecção e
identificação de residências que possuíam poços. A seleção dos pontos amostrais se deu a partir de estudo
anterior desenvolvido por Silva et al. (2014), onde foram selecionados 17 poços (Figura 3). A Tabela 1
mostra as coordenadas geográficas dos pontos amostrais analisados.
24
Figura 3- Mapa de distribuição espacial dos pontos amostrais

25
Tabela 1 - Coordenadas geográficas dos pontos de coleta no Bairro Pedra 90 Cuiabá-MT
Coordenadas geográficas Lat/Long (Datum WGS84)

Pontos
Amostrais S W Altitude aproximada
P1 15º38'01.8" 55º57'30.3" 218m
P2 15º38'01.2" 55º57'31.8" 219m
P3 15º37'58.2" 55º57'38.4" 194m
P4 15º38'15.2" 55º56'59.9" 221m
P5 15º38'13.6" 55º57'09.1" 217m
P6 15º37'55.5" 55º56'14.5" 196m
P7 15º38'12.7" 55º56'42.2" 202m
P8 15º38'15.4" 55º56'35.1" 230m
P9 15º38'19.6" 55º56'46.7" 216m
P10 15º38'16.2" 55º56'37.1" 212m
P11 15º37'59.8" 55º56'20.2" 208m
P12 15º37'59.1" 55º56'36.6" 227m
P13 15º38'00.6" 55º56'49.0" 229m
P14 15º38'06.2" 55º56'52.8" 218m
P15 15º38'00.4" 55º56'49.2" 216m
P16 15º37'59.9" 55º56'50.4" 193m
P17 15º37'50.6" 55º57'10.2" 192m
4.3 COLETA DAS AMOSTRAS
A coleta das amostras destinadas às análises de ferro foi feita com a utilização de
frascos descartáveis de polietileno de capacidade de 500mL, previamente separados, rotulados
e armazenados em uma caixa de isopor para posterior realização da coleta, segundo as
metodologias indicadas pelo Guia de coletas de amostras de água (CETESB, 1998).
Foram coletadas amostras de água em dezessete (17) residências em dois períodos, a

primeira coleta foi realizada em início do período chuvoso (Outubro/2013) e o retorno para
uma segunda campanha ocorreu no mês de janeiro, período de chuvas mais regulares
(Janeiro/2014).
26
Na primeira coleta, a amostragem aconteceu em todos os pontos pré-selecionados.

Entretanto, na segunda amostragem, devido à ausência dos moradores, apenas em dezesseis
pontos foi realizada a coleta.
Para a coleta de água para análises microbiológica, foram adotados procedimentos de

acordo com os padrões descritos pelo Standard Methods for Examination of Water and
Wastewater (APHA2012). Para tanto foram utilizados coletores do tipo bailers para
amostragem da água subterrânea e acondicionada em sacos plásticos estéreis próprios para
amostras microbiológicas (Figura 4 a 7).
Figura 5- Coleta de água de poços rasos para análise de

Figura 4- Coleta de água em poços rasos para Metal Ferro
análise microbiológica Fonte: Ramos, (2014).
Fonte: RAMOS, (2014).
Figura 6- Medição de temperatura e pH na água de Figura 7- Coletor (bailers) de água de poços rasos
poços rasos Fonte: RAMOS, (2014)
27
4.4 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE FERRO
Inicialmente, as amostras passaram pelo processo de digestão nitro-sulfúrica para

determinação da concentração de metais totais, utilizando-se a metodologia descrita por
Standard Methods of Examination of Water and Wasterwater (APHA, 2012).
As digestões de metais em água foram realizadas em triplicatas acompanhadas de um

branco analítico, também em triplicata. Com o auxílio de uma proveta, foram medidos 250
mL de água coletada, em seguida, transferiu-se este volume para um béquer com capacidade
de 300 mL e adicionou-se 5 mL de ácido nítrico P.A. (concentração a 70%).
Após adição do ácido a amostra foi levada a uma chapa aquecedora para a redução do
volume da amostra até cerca de 20 mL. Ao final do processo de digestão, as amostras foram
retiradas da chapa aquecedora e reservadas para que atingissem a temperatura ambiente. Após
serem digeridas, foram transferidas para balões volumétricos de 100 mL e completou-se o
volume com água deionizada. Em seguida, foram feitas as medidas por espectrofotometria de
absorção atômica por atomização em chama.
4.5 DETERMINAÇÃO DA DENSIDADE DE FERROBACTÉRIAS
Para determinar a densidade de Ferrobactérias nas amostras de água, utilizou-se o

método de Contagem Padrão em Placas (CPP), fazendo uso da técnica de Espalhamento
Superficial (APHA, 2012). Alíquotas de 0,1mL das amostras de água foram plaqueadas, em
triplicata, em meio Agar Citrato Férrico Amoniacal (ACFA) e incubadas na ausência de luz
(bactéria fotossensível) por 10 dias em temperatura de 23± 2,0ºC (Figura 9).
Após o período de incubação, foram contadas as colônias de bactérias e a densidade

bacteriana calculada para expressão dos resultados em Unidades Formadoras de Colônias por
mililitro (UFC/mL) de água.
28
Figura 8- Inoculação das amostras de água para cultivo

dos microrganismos analisados pela técnica de
Espalhamento Superficial
Fonte: RAMOS, 2014.
Figura 9- Crescimento de Ferrobactérias

cultivadas da água
Após as contagens de colônias, foi observada a pureza das cepas a partir da técnica
morfotintorial e observação microscópica, onde, uma vez, confirmada a pureza dos isolados,
os mesmo foram transferidos para tubo de ensaio com Caldo Nutriente (CN); estes receberam
1mL de glicerina 80% para conservar as células das cepas e serem mantidos congelados para
posterior extração de DNA.
No fluxograma esquemático representa o protocolo utilizado deste cultivo até o

agrupamento genotípico (Figura 10).
29
TÉCNICA
Isolamento- Estrias- Culturas Puras (APHA, 2012).
Análise Morfotintorial por meio da coloração de Gram

Mac FADDIN (1976) ; Bergeys (1994)
Extração de DNA dos isolados de Ferrobactérias (SAMBROOK,

FRITSCH ; MANIATIS,1989)
Caracterização Genotípica BOX-PCR (WANG, et al., 2011)
Análise de Similaridade
(JACCARD,1908, UPGM, BIONUMERICS)
Figura 10- Fluxograma esquemático de metodologia utilizada nas análises microbiológicas e de

biologia molecular através de técnicas dependentes de cultivo
Figura 10- Representação esquemática da metodologia a ser utilizada nas análises

4.6 EXTRAÇÃO DE DNA DOS ISOLADOS DE FERROBACTÉRIAS
microbiológicas e de biologia molecular através de técnicas dependentes de cultivo.
A extração de DNA foi realizada com todos os isolados dos pontos amostrais, a
identificação dos isolados foram a partir de uma sequência de estirpes já armazenada, em
ordem crescente, tendo início em 589 chegando a 911 para identificação gênica. Estas cepas
encontram-se armazenadas em uma biblioteca gênica para posteriores análises.
30
As culturas puras de bactérias foram crescidas em caldo nutriente por 48 h a 30°C. Os

crescimentos bacterianos foram concentrados por centrifugação (10.000 rpm, 5ºC por 5
minutos) e o sobrenadante descartado. O concentrado de células foi ressuspenso em 1,0mL de
água ultra pura estéril para lavagem do material novamente centrifugado nas condições
anteriormente citadas. Depois de descartar o sobrenadante foram adicionados 0,5g de pérolas
de vidro esterilizadas e 500μL de tampão de extração (tampão fosfato de sódio-120 mM). O
material foi agitado em “Fast Prep”(Fast Prep ® 24 MP TM Biomicals.) a 5,0 metros por
segundo (m/s) por 30 segundos e colocados em banho-maria a 65°C por 60 min. para lise
completa das células. Em seguida foi adicionado 500 μL de fenol-clorofórmio-álcool Iso-
amilico (25:24:1) e centrifugados (12000 rpm , 5ºC por 3 mim.). O DNA foi precipitado com
álcool isopropílico e posteriormente centrifugado (15.000 rpm, 5 ºC por 15 min.). O
sobrenadante foi então descartado e o precipitado lavado com Etanol 70%, agitado e
centrifugado (14.000 rpm, 5ºC por 10 minutos). Após 2 min. em placa aquecedora (80ºC) o
DNA foi ressuspendido em 50 μL de água ultrapura estéril (VALENTE, 1996, modificado de
VILGALVS & HESTER, 1990). A pureza e o peso molecular dos DNA extraídos foram
verificados em gel de agarose (1,0%) sob luz UV (254 nm), corados com brometo de etídio e
usado um padrão molecular de 1kb (SAMBROOK et al., 1989).
4.7 CARACTERIZAÇÃO GENOTÍPICA DAS FERROBACTÉRIAS POR MEIO DA

TÉCNICA DE BOX-PCR
As estirpes selecionadas foram caracterizadas genotipicamente por intermédio do

BOXPCR. A técnica foi realizada com o uso do KIT GoTaq® Green Master Mix da Promega
Corporation, de acordo com as recomendações do fabricante. Foram utilizados 12,5μl de
GoTaq® Green Master Mix, 2X (50 units/mL de Taq DNA Polymerase, 400μM de cada
dNTP: dATP, dGTP, dCTP e dTTP, 3mM de MgCl2), 1μl de DNA “Template” e 9,5μl de
água livre de nucleases. O volume final da reação foi de 25μl. O iniciador utilizado foi o
BOXA1R (5‟-CTA CGG CAA GGC GAC GCT GAC TGA CG-3‟) (VERSALOVIC et al.,
1994).
E as condições de corrida no Termociclador (BIO-RAD® T100 Thermal Cycler PCR):

desnaturação a 94°C/7min.; ciclos 94°C/1min.; 53ºC/1min. e 65°C/1min. (35 X); extensão
31
final, 65ºC/16mim. Produtos de PCR foram visualizados através de eletroforese em gel de

agarose (Invitrogen) a 100 Volts por 5 horas; o gel foi corado com brometo de etídio e foi
usado um padrão de peso molecular 100pb (SAMBROOK et al., 1989) e 1Kb (Invitrogen) foi
observado em um transluminador UV (254nm). Os géis foram fotografados usando o sistema
de foto documentação 66-1000 (Loccus Biotecnologia), incluindo um vídeo câmera CCD
(Sony) e a imagem por um capturador Image BW-Plus (versão 4.2).
A técnica utilizada permitiu a visualização de perfis de banda utilizando marcadores

de peso molecular de 1kb (® INVITROGEN), geradas pela amplificação de sequências
repetitivas do DNA genômico bacteriano, utilizando o primer BOX. As análises dos perfis de
BOX-PCR foram realizadas através da análise de agrupamento e construção de dendogramas
para verificar similaridade entre os isolados de Ferrobactérias.
As imagens foram eletronicamente rearranjadas para uma melhor visualização e

comparação dos perfis de BOX-PCR, sendo a similaridade entre as amostras determinada por
matrizes binárias de presença e ausência para cada um dos pontos de análise, em função da
posição que as bandas ocupavam no gel (KOZDRKOJ & Van ESLSAS, 2001), o
dendrograma de similaridade foi calculado pelo coeficiente de Jaccard e agrupado utilizando
o algoritmo UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical Average 1973),
utilizando o software Bionumerics 7.0 (Applied Mathematics, Kortrijk, Bélgica).
Foi determinado o percentual de similaridade entre os isolados de cada ponto

(McCUNE, MEFFORD, 1999). Perfis com 70% de similaridade nos dendrogramas,
considerando uma tolerância de 2% foram considerados semelhantes (WAYNE et al., 1987;
STACKEBRANDT et al., 2002; LIMA, 2009).
32
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 FERRO TOTAL
Os resultados das análises de ferro nas águas subterrâneas foram expressos sob a forma de
ferro total, como pode ser observado na (Figura 11).
Figura 11- Concentração de ferro (Fe) no início do período de chuva- novembro/

2013 e no período de chuvas regular- janeiro/2014, no Bairro Pedra Noventa, Cuiabá-
MT
Foram selecionados dezessete poços para o monitoramento do teor de ferro total, situados
no Bairro Pedra Noventa, na cidade de Cuiabá-MT (Figura 11).
O perfil do solo foi descrito por Silva et al., (2014), compreendendo Plintossolo Pétrico e
Plintosso Argilúvico. Os dois tipos de solos contribuem com o íon férrico e ferroso nas águas
subterrâneas, isso provavelmente se deve às concreções ferruginosas encontradas tanto no
Plintossolo Argilúvico como no Plintossolo Pétrico.
Os resultados encontrados nos poços do Bairro Pedra Noventa apresentaram os valores

elevados do teor de ferro para alguns pontos amostrais (Figura 11). Concentrações de ferro total
33
acima dos valores permissíveis foram observadas nos pontos amostrais para o período do início
de chuvas- P2-, os valores de 0,59mg/L, P7 1,27mg/mL e P10 4,18mg/L e para os pontos no
período de chuva regulares- P6- com 2,56 mg/mL, P7 3,4mg/mL e P13 8,11mg/mL . A presença
de ferro dissolvido em água para os respectivos período pode estar correlacionada ao carreamento
de lixo para dentro dos poços devido suas estruturas rudimentares que permitem o acúmulo de
detritos oriundo de vários lugares (SILVA et al., 2014).
Os metais são elementos químicos que estão presente em grande abundância na água e no
solo. Provavelmente as concentrações elevadas do ferro podem estar associadas à lixiviação do
solo laterítico comum na região em estudo (MIGLIORINI, 2004).
O Plintossolo Pétrico e Plintossolo Argilúvico se caracterizam por apresentarem, na

subsuperfície, camada com elevado teor em plintita e petroplintita, que se constituem em feições
pedológicas com acumulações de ferro na forma oxidada, sendo essa a provável origem do ferro
contido nas águas do aquífero freático. Por outro lado, o substrato rochoso desses solos apresenta
grande quantidade de minerais de pirita, que se constitui, também, como fonte primária do ferro
(SILVA et al., 2014).
Os padrões de potabilidade exigem que uma água de abastecimento público não ultrapasse
os 0,3 mg.L-1 de ferro (BRASIL, 2011), apesar de o organismo humano necessitar de até 19mg
de ferro por dia. Nos pontos amostrais apresentados em dois períodos, distintos os pontos P2, P7,
P10 e P16, as amostras do período de início de chuvas apresentaram o teor de Ferro Total acima
dos Valores Máximos Permissíveis na legislação e, para o período de chuvas regulares, as
amostras que também apresentaram teores acima dos padrões foram os pontos P6, P7, P13.
Foi possível observar que, independente do período, o P7 apresentou teor elevado de ferro
na água. Foi observada na Figura 11 que, para alguns pontos, a presença de ferro não foi
detectada (P1, P4, P8, P9, P11, P14, P15e P17), a ausência de concentração pode estar
relacionada ao período de coleta, quando as concentrações de ferro são inferiores por se
apresentarem em forma dissolvida na água.
Em geral, os menores teores de ferro foram encontrados no Plintossolo Argilúvico,

provavelmente por apresentar, entre as profundidades de 40 a 200 cm, horizonte argiloso com
34
presença de plintita, pouco poroso, e de baixa permeabilidade, o que dificulta a infiltração das
águas de chuva, impedindo a lixiviação e ou a quelação (SILVA et al., 2014).
5.2 ANÁLISE DE MICROBIOLÓGICOS NAS ÁGUAS DOS POÇOS RASOS DO

BAIRRO PEDRA NOVENTA
Com base nos estudos realizados por Silva et al. (2014), foi observado que, no início do
período chuvoso, a densidade das bactérias heterotróficas variou de 25 a 33.600UFC/ml-,
apresentando valores acima dos limites recomendados em 75,86% das amostras analisadas. No
período chuvoso, verificou-se menor ocorrência (68,97%) e menores densidades (70 a
2.650UFC/mL).
Para a determinação da densidade de Ferrobactérias, os resultados podem ser observados

na (Figura 12).
Figura 12- Densidade de Ferrobactérias no início do período de chuva (2013) e no período de

chuvas regulares (2014), no Bairro Pedra Noventa, Cuiabá-MT
35
A densidade de Ferrobatérias apresentou valores mínimos de 2,38Log. de UFC/mL e

máxima de 3,31Log. de UFC/mL, no início do período de chuva e no período de chuvas regulares
a densidade mínima foi de 2,29Log. de UFC/mL e máxima de 3,16Log. de UFC/mL (Figura 12).
A presença de bactérias heterotróficas em quantidades elevadas pode impedir a detecção

de coliformes, seja devido à produção de fatores de inibição, seja por um desenvolvimento mais
intenso das bactérias. A Portaria Nº 2.914, do Ministério da Saúde (BRASIL, 2011), dispõe sobre
os procedimentos de controle e de vigilância de qualidade da água para consumo humano e seu
padrão de potabilidade. Sendo, para as bactérias heterotróficas, recomendado o valor máximo de
500UFC/mL. É de extrema importância determinar a densidade destas bactérias, pois, assim é
possível identificar possíveis causas de deterioração da qualidade da água.
Os resultados da ocorrência de Ferrobactérias, provavelmente, estão relacionados com o

tipo de solo que apesentam, em sua composição, microrganismos aderidos responsáveis por
utilizar o metal ferro como fonte de energia, como mostra a Figura 11. A presença de
Ferrobactéria foi de 100% para os dois períodos de coleta (Figura 12).
De acordo com os resultados obtidos, mesmo sem a detecção do ferro em alguns pontos,
o metal se apresenta dissolvido na água. Isso foi possível observar no gráfico de densidade de
Ferrobactérias que demonstrou a presença do microrganismo.
A localização dos poços, tipos de solos e o período de coleta são fatores determinantes
na proliferação dessa bactéria (SILVA et al.,2014).
Mesmo que a maioria das bactérias heterotróficas da água não seja considerada
patogênica, é importante que sua densidade seja mantida sob controle, pois densidades muito
elevadas dessas bactérias na água podem causar riscos à saúde do consumidor (FILHO; DIAS,
2008). Algumas dessas bactérias podem atuar como patógenos oportunistas, deteriorantes da
qualidade da água; ocasionando odores e sabores desagradáveis e produzindo limbo e películas, e
influência inibidora de alguns microrganismos; pois quando presentes em número elevado podem
impedir a detecção de coliformes (FILHO; DIAS, 2008).
36
5.3 ISOLAMENTO DE ESTIRPES BACTERIANAS
Após a verificação da densidade de Ferrobactérias na área de estudo, foram isoladas 319

cepas de Ferrobactérias (Tabela 2).
A utilização do método morfotintorial proporcionou a confirmação de que 100% eram de

culturas puras com formas bacilares e paredes celulares típicas de Gram negativas, informações
essas correspondentes às características de Ferrobactérias. Todas as cepas de Ferrobactérias
isoladas durante o período amostral estão armazenadas em uma biblioteca gênica para que se
possa dar seguimento a este trabalho.
A Tabela 2 mostra as cepas de Ferrobactérias de cada ponto amostral.
Tabela 2 - Isolados de Ferrobactérias
Identificação do Isolados por coletas Total de

ponto Cepas
1° Coleta 2º Coleta
Ponto 1 9 11 20
Ponto2 8 6 14
Ponto3 11 6 17
Ponto4 16 6 22
Ponto5 7 6 13
Ponto6 4 7 11
Ponto7 15 8 23
Ponto8 17 6 23
Ponto9 3 6 9
Ponto10 9 7 16
Ponto11 18 15 33
Ponto12 18 12 30
Ponto13 14 4 18
Ponto14 11 9 20
Ponto15 6 9 15
Ponto16 12 15 27
Ponto17 8 8
Total Geral 186 133 319

37
5.4 EXTRAÇÃO DE DNA DOS ISOLADOS
Foram extraídos 89,3 % de DNA do total de isolados da primeira coleta e 96,2% de DNA
da segunda coleta. Os produtos da extração dos DNA foram armazenados para realização de
Reação em Cadeia de Polimerase (PCR).
A eficiência do produto de extração de DNA foi confirmada para todos os isolados

bacterianos, sendo os produtos de DNA genômico considerados de boa qualidade e quantidade. A
qualidade do DNA é primordial para dar sequência aos procedimentos moleculares, se estiver
degradado, apenas uma parcela das moléculas-alvo será amplificada (MATIOLI, 2001).
A ocorrência de perda de DNA está relacionada às diversas etapas pelas quais passa o
DNA, pois as amostras podem sofrer alterações adversas, o que acarreta a degradação durante o
processo.
A qualidade da amostra pode influenciar diretamente na positividade da PCR. Quanto

mais representativa for a amostra, melhor será o rendimento da detecção molecular. Quando
ocorre uma baixa sensibilidade da PCR, esta pode ser justificada pela introdução de substâncias
inibidoras durante o procedimento de extração (ASSIS et al., 2007).
5.5 AMPLIFICAÇÃO DO DNA BACTERIANO
A análise de variabilidade genética, pela técnica BOX-PCR foi realizada nos ponto P1 até
P17. A técnica utilizada permitiu a visualização de perfis de banda, geradas pela amplificação de
sequências repetitivas do DNA genômico bacteriano, utilizando o iniciador BOX. O uso de
marcadores de peso molecular de 1kb (® INVITROGEN) possibilitou perceber que produtos de
PCR maiores que 900 pares de bases foram obtidos em todos os isolados.
Buscando observar a diversidade para cada ponto amostral a partir das imagens
digitalizadas dos fragmentos de DNA dos isolados bacterianos, foram gerados agrupados em
dendrogramas UPGMA e análise de similaridade de Jaccard (2%) para cada período da coleta.
A estimativa obtida por meio de simulações utilizando matrizes de distância calculadas

pelo índice de Jaccard, com base em um número crescente de bandas gênicas de marcador de
38
peso molecular, foi utilizada para determinar a confiabilidade e a precisão do agrupamento

produzido (PEJIC et al.,1998).
A análise de similaridade genética permitiu o agrupamento dos biótipos de forma tanto

mais similares quanto mais coincidentes fossem os fragmentos de mesmo peso molecular
amplificados, permitindo as análises de distância genética entre os isolados (SEBASTIÃO et al.,
2010).
O dendrograma, apresentado na Figura 13, representa o padrão gênico das 15 cepas do

ponto amostral P1 e indica uma grande diversidade genética, com 86,6 % de dissimilaridade. A
cepa 594 do período de início de chuva e a cepa 782 do período de chuvas regulares apresentaram
100% de similaridade, correspondendo aos 13,3% de similaridade no sistema BOX-PCR .
Figura 13- Padrão de amplificação das estipes do Ponto amostral P1, primeira e segunda coleta no início
de chuvas em novembro de 2013 e chuvas regulares em janeiro 2014, respectivamente.
No ponto amostral P2 (Figura 14) apresentou nível de similaridade de 80 % entre as cepas

599 e 600 do período de início de chuva baixa similaridades entre as nove cepas analisadas. Sete
39
(7) estirpes não apresentaram similaridade entre si, apresentando uma diversidade gênica entre as
espécies nesse ponto amostral.
Figura 14- Padrão de amplificação das estirpes do Ponto amostral P2, primeira e segunda coleta no
início de chuvas em novembro de 2013 e chuvas regulares em janeiro 2014, respectivamente.
O dendograma, apresentado na Figura 15 para análise gênica entre as cepas bacterianas do

ponto amostral P3, demonstra que as cepas 614 e 615 do período de início de chuva apresentaram
100% de similaridade e todas as demais cepas foram dissimilares.
De acordo com Crespo e Soares-Gomes (2002), o processo de especiação é um processo

de conversão de variação entre os indivíduos dentro de uma população, em variações entre
populações no tempo e no espaço. Portanto a baixa porcentagem de similaridade entre as espécies
para ponto amostral P3 provavelmente está relacionada ao período distinto de realização da
coleta.
40
Figura 15- Padrão de amplificação das estirpes do Ponto amostral P3, primeira e segunda coleta no início
de chuvas em novembro de 2013 e chuvas regulares em janeiro 2014, respectivamente
Nenhuma das cepas do ponto amostral P4 (Figura 16) e do ponto amostral P5 (Figura 17),
apresentaram similaridade acima de 70%, inferindo sobre diversidade gênica dos isolados
independente do período de coleta. A ausência de similaridade entre os isolados podem ter
influência das contaminações de fonte antrópicas, devido aos pontos amostrais estarem
localizados em regiões de vulnerabilidade de contaminantes.
41
Figura 16- Padrão de amplificação das estirpes do Ponto amostral P4, primeira e segunda coleta
no início de chuva em novembro de 2013 e chuvas regulares em janeiro de 2014,
respectivamente
no início de chuva em novembro de 2013 e chuvas regulares em janeiro de 2014,
respectivamente
42
Os diferentes padrões gênicos observados entre as cepas do ponto amostral P6 inferem

sobre a alta diversidade gênica para o ponto amostral analisado, 100% das cepas não
apresentarem similaridade (Figura 18).
Figura 18- Padrão de amplificação das estirpes do Ponto amostral P6, primeira e segunda
coleta no início de chuva em novembro de 2013 e chuvas regulares em janeiro 2014,
respectivamente
No ponto amostral P7 duas cepas apresentaram 100% de similaridade (cepa 659 do

período de início de chuva e a cepa 821 do período de chuvas regulares). Do total de isolados, 13
cepas não apresentaram similaridade, demonstrando a alta diversidade gênica independente do
período de coleta (Figura 19).
43
Figura 19- Padrão de amplificação das estirpes do Ponto amostral P7, primeira e segunda coleta no início
de chuvas em novembro de 2013 e chuvas regulares em janeiro 2014, respectivamente
A análise de similaridade entre as cepas do ponto amostral P8 mostrou que a cepa 661, do
período de início de chuva e a cepa 830 do período de chuvas regulares, apresentaram 70% de
similaridade, as demais não apresentaram similaridade demonstrando a diversidade gênica entre
as bactérias isoladas (Figura 20).
início de chuvas em novembro de 2013 e chuvas regulares em janeiro 2014, respectivamente
44
A análise de similaridade no ponto amostral P9 (Figura 21) e ponto amostral P10 (Figura
22), para os dois períodos de análise, mostrou que as estirpes amplificadas não apresentaram
entre si similaridade igual ou superior a 70%, inferindo, assim, sobre a diversidade bacteriana.
início de chuvas em novembro de 2013 e chuvas regulares em janeiro 2014, respectivamente.
45
O resultado da análise gênica a partir do BOX-PCR, para as estirpes do ponto amostral

P11, está representado no dendograma abaixo e revela que 10 cepas apresentaram 100% de
similaridade (Figura 23) e 6 cepas não apresentaram similaridade.
No dendrograma Figura (24) é possível observar a similaridade gênica em 50% das 16

cepas amplificadas para o ponto amostral P12. De acordo com os agrupamentos com base nas
características observou-se que 3 grupos distintos foram formados em um coeficiente de
similaridade de 100% (Figura 23). Os grupos foram formados por dois até quatro isolados.
Na análise observou-se um elevado grau de similaridade para o ponto amostral em questão,

o que derivou na formação de perfil agrupamento homogêneo das estirpes analisadas.
46
Figura 24- Padrão de amplificação das estirpes do Ponto amostral P12, primeira e segunda
coleta no início de chuvas em novembro de 2013 e chuvas regulares em janeiro 2014,
respectivamente
O coeficiente de similaridade de Jaccard evidenciou grupos distintos (clusters), com baixa

variabilidade entre as linhagens, apresentando similaridade de 100% entre 12 isolados e apenas 4
isolados não apresentam similaridade gênica. É possível inferir para o ponto amostral P13 um
alto nível de isolados da mesma espécie, de acordo com agrupamento formado (Figura 25).
47
De acordo com analise de similaridade apresentada na Figura 26, no ponto amostral P14,
7 cepas apresentaram similaridade de 100% o que as caracteriza geneticamente como sendo da
mesma espécie e 9 cepas não apresentaram similaridade.
48
no início de chuvas em novembro de 2013 e chuvas regulares em janeiro 2014, respectivamente
A partir da análise de similaridade apresentada na Figura 27, é possível inferir que 2 cepas
apresentaram 100% de similaridade gênica e 14 cepas são geneticamente diferentes. Os dados
indicam alta diversidade genética nos pontos amostrais P15 e P16.
Figura 27- Padrão de amplificação das estirpes do Ponto amostrais P15 e 16, primeira e segunda coleta
49
De acordo com análise de agrupamento representado no dendograma (Figura 28), entre as

cepas bacterianas do ponto amostral P 16 e P17, foi possível observar que existe uma distância
genética entre as cepas analisadas e que os isolados analisados possivelmente são de espécies
diferentes. Alta diversidade genética também foi descrita por Lira-Cadette et al., (2012) por meio
de BOX PCR, analisando a diversidade de bactérias.
Figura 28- Padrão de amplificação das estirpes dos Pontos amostrais P16 e 17, primeira e segunda coleta
Os dados obtidos das amostras refletem a diversidade da comunidade e as diferenças

detectadas entre os locais de amostragem, de acordo com a análise do BOX-PCR. Os resultados
estão de acordo com a literatura, os quais apontam a variabilidade da comunidade bacteriana.
A partir da abordagem realizada por Holguin et al. (2001) e Melloni et al. (2006)
compreendemos que estudos de diversidade microbiana são importantes, pois relacionam a
variabilidade genética, bem como verificam a distribuição ecológica dela.
Portanto, o uso de técnicas moleculares deve ser cada vez, mais empregado em estudos
por ser métodos simples e rápidos para a caracterização de populações microbianas, inclusive
para estudos em nível de gênero e espécie (KIRK et al., 2004).
50
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os processos de alteração do substrato rochoso e da pedogênese, envolvendo a remoção

do ferro por lixiviação e quelação, podem explicar a elevada concentração do ferro nas águas do
aquífero freático.
Concluímos, por hora, que o ferro metal analisado, tendo apresentado concentrações fora
dos Valores Máximos Permissíveis para o consumo humano, exigidos pela Portaria 2.914/2011,
provavelmente, originam-se da matéria orgânica em decomposição que cai nos poços abertos e ao
tipo de solo presente na região Plintossolo Pétrico e Plintossolo Argilúvico.
As análises bacteriológicas (bactérias heterotróficas) apresentaram concentrações acima

dos Valores Máximos Permissíveis para o consumo humano exigido pela Portaria 2.914/2011,
provavelmente por causa das fossas sépticas intensamente distribuídas na região. A ocorrência de
elevada concentração de Ferrobactérias confere à água de consumo humano características
organolépticas desagradáveis de cor, sabor e odor e podem favorecer bactérias patogênicas
oportunistas.
A caracterização genética de estirpes representativas, utilizando a técnica de BOX-PCR,

gerou perfis complexos de similaridade entre os genótipos bacterianos, sinalizando elevada
diversidade de espécies e genótipos presentes nas comunidades microbianas dos poços rasos
analisados no Bairro Pedra Noventa em Cuiabá, MT.
51
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO – UFMT

DENSIDADE E CARACTERIZAÇÃO GENOTÍPICA DAS LINHAGENS DE

PÂMILA NAYANA FERREIRA RAMOS

Cuiabá – Mato Grosso

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO – UFMT

PÂMILA NAYANA FERREIRA RAMOS

DENSIDADE E CARACTERIZAÇÃO GENOTÍPICA DAS LINHAGENS DE

Orientadora: Dr.ª Zoraidy Marques de Lima

Co-orientador: Prof. Dr. Eduardo Beraldo de Morais

Dissertação apresentada à Faculdade de Arquitetura e

Cuiabá – Mato Grosso

Orientadora: Profª Drª Zoraidy Marques de Lima

Universidade Federal de Mato Grosso

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Universidade Federal de Mato Grosso

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