Específicas

❖ O que são Vidrarias e Instrumentos de Laboratório?
Os laboratórios possuem vidrarias e instrumentos utilizados para diversas

funções para auxiliar na condução de experimentos e análises.
É feita de vidro ou cristal temperado, são materiais transparentes, resistentes
ao calor e praticamente inertes, não interferindo nas reações.
Alguns instrumentos, podem ser confeccionados em outros materiais, como
plástico, a porcelana, a borracha, metais e madeira.
Algumas vidrarias são usadas para medição de substâncias e por este motivo
apresentam algum tipo de marcação indicativa de volume.
1- Vidrarias volumétricas: possuem apenas uma marcação de volume,
são usadas para medir volumes fixos.
2- Vidrarias graduadas: possuem várias marcações, permitindo a medida
de vários volumes diferentes.
3- Vidrarias que não possuem marcação: Não são usadas para medir, mas
apenas para conter, misturar ou transferir substâncias.
❖ O que são vidrarias de precisão?
Algumas das vidrarias que apresentam marcação são denominadas vidrarias

de precisão: capazes de medir volumes de forma precisa.
Algumas vidrarias de precisão são mais exatas do que outras.
O principal fator que determina a exatidão/precisão que uma vidraria
consegue medir uma substância é o diâmetro da região onde está a
marcação.
Dessa forma, quanto mais estreita a região da marcação, mais exata é a
medição daquela vidraria.
✔ Não podem ser submetidas a altas temperaturas, pois com a expansão
do vidro elas podem perder a sua calibração.
✔ Nunca devem ser esterilizadas em autoclaves e estufas.
O termo precisão está relacionado à ideia de reprodutibilidade: quando é

possível reproduzir um evento nas mesmas condições.
✔ Ao usar uma mesma vidraria de precisão temos a garantia de que
estamos dosando sempre a mesma quantidade.
O termo exatidão diz respeito a algo que está próximo ao valor verdadeiro.
✔ Ao usar uma vidraria mais exata, temos a garantia de estar medindo
um volume que está mais próximo do valor real.
Portanto, é possível que uma vidraria seja precisa sem ser exata, é o que
acontece quando esta vidraria perde a sua calibração em consequência do
aquecimento.
✔ Ela sempre vai indicar o mesmo volume (precisão), mas não
necessariamente este volume estará correto (exatidão).
❖ O que é Menisco?
É a curvatura que um líquido apresenta em sua parte superior quando

colocado em uma vidraria.
Para termos certeza de que estamos medindo o volume da forma correta,
devemos nos abaixar até a altura do menisco e conferir se ele encontra a
região de marcação da vidraria.
✔ Sempre trazer os olhos à altura do menisco, e nunca elevar a vidraria à
altura dos olhos, pois não temos muito controle quanto ao nivelamento
da substância.
✔ Pode conduzir ao erro de paralaxe, que é um erro na leitura devido ao
olho do observador e o menisco não estarem em uma linha.
Quando a solução é incolor, devemos ajustar a parte inferior do menisco à

marcação da vidraria.
Quando a solução colorida, é a parte superior do menisco que deve estar
alinhada à marca de calibração.
❖ Exemplos de vidrarias de laboratório -
Béquer: é uma das mais conhecidas vidrarias do laboratório e é usado para

dissolver substâncias sólidas, realizar reações químicas, aquecer líquidos e
realizar reações de precipitação.
✔ Ele também pode ser aquecido no bico de Bunsen, juntamente com a
manta aquecedora.
Erlenmeyer: é usado para realizar as mesmas funções do béquer, porém seu
formato afunilado permite que o seu conteúdo seja agitado sem que haja risco
de perder o material que nele está contido.
✔ Por esse motivo é muito usado em reações de titulação.
Balão de fundo chato: utilizado para conter líquidos e é muito usado em

reações com desprendimento de gases.
✔ Esta vidraria pode ser aquecida no tripé e manta aquecedora.
Balão de fundo redondo: é principalmente utilizado em sistemas de refluxo e

evaporação a vácuo.
✔ Pode ser utilizado para aquecimento de líquidos e em reações com
desprendimento de gases, assim como o balão de fundo chato.
Balão volumétrico: é uma vidraria de precisão (possui marcação em um

volume definido) para medir líquidos e no preparo de soluções com volumes
precisos.
Balão de destilação: é utilizado acoplado ao condensador em processos de
destilação simples ou fracionada.
Proveta: utilizada para medir e transferir volumes variáveis de líquidos. Ela é

capaz de medir com precisão volumes a partir de 25 ml até 1000 ml.
✔ Por este motivo, a proveta não deve ser aquecida, pois pode perder a
sua calibração.
Tubo de ensaio: utilizado para realizar reações de pequena escala com

pequenos volumes.
✔ Pode ser aquecida diretamente sob a chama de um bico de Bunsen.
Pipeta: utilizada para medição e transferência de volumes precisos de

líquidos.
Pipetas volumétricas: usadas para medir um volume específico.
✔ Vidraria de grande precisão utilizada para medir e transferir volumes
únicos de líquidos.
✔ Não pode ser aquecida
Pipetas graduadas: usadas na medição de volumes variados dentro de um

intervalo.
✔ Não possui tanta precisão quanto a pipeta volumétrica.
✔ Não pode ser aquecida

Pipeta de Pasteur: é geralmente feita de plástico e não possui precisão.
✔ Usada para transferir líquidos a partir da aspiração e dispensação
através do bulbo de sucção
Bureta: vidraria calibrada para transferir volumes de líquidos de forma

precisa.
✔ É usada em análises volumétricas, pois a graduação presente em seu
comprimento facilita a leitura do volume de líquido escoado.
✔ É amplamente utilizada em procedimentos de titulação.
✔ Geralmente possui uma torneira, para controlar o escoamento do

líquido.
Kitassato/balão de Buchner ou balão de vácuo: vidraria usada juntamente

com o funil de Buchner para procedimentos de filtração a vácuo.
✔ A saída lateral dessa vidraria se acopla a uma torneira de vácuo.
Funil de vidro simples: pode ser de haste curta ou de haste longa.

✔ Vidraria utilizada para transferir líquidos entre recipientes diferentes, ou
ainda filtrar soluções juntamente com papel filtro.
Funil de separação ou funil de decantação: utilizado para separar misturas
heterogêneas compostas por líquidos não miscíveis em extrações
líquido/líquido (através da decantação).
✔ Possui uma torneira embutida.
Funil de Buchner: utilizado em procedimentos de filtração a vácuo

juntamente com o kitassato e papel filtro.
Condensador: usado em procedimentos de destilação e tem a função de

condensar vapores oriundos de líquidos aquecidos.
✔ É geralmente utilizado juntamente com o balão de destilação.
Placa de Petri: pode ser feita de vidro ou de plástico e é utilizada para a

realização de meios de cultura, principalmente culturas bacteriológicas
Bastão de vidro: utilizado para misturar ou transferir líquidos de um

recipiente para o outro.
Dessecador: é um recipiente fechado usado para guardar substâncias em
um ambiente com baixo índice de umidade.
✔ Geralmente é utilizado para resfriamento e secagem de substâncias
Conta gotas: utilizado para adicionar pequenos volumes (algumas gotas) de

um determinado líquido a uma solução.
Vidro de relógio: peça de vidro de forma côncava utilizada para pesagem de

substâncias não voláteis e não higroscópicas, usado em análises de
evaporação em pequena escala.
✔ Esta vidraria não pode ser aquecida diretamente
Termômetro: utilizado para medir a temperatura do ambiente ou de

substâncias/soluções.
✔ O mais usado é o termômetro de mercúrio.
Picnômetro: vidraria utilizada na determinação da densidade de líquidos.

✔ Por ser uma vidraria de grande precisão, não pode ser aquecido.
❖ Exemplos de instrumentos de laboratório
Trompa de vácuo: instrumento de metal ou de vidro que se acopla à torneira

de água e cujo fluxo arrasta o ar e produz vácuo no interior do recipiente ao
qual está conectado.
✔ É usado nos processos de filtração a vácuo, pois tem a função de
permitir a geração do vácuo necessário para que a filtração seja
realizada.
Alonga: usada nos processos de destilação para conectar o condensador ao

frasco coletor e para direcionar o fluxo do líquido.
✔ É utilizada também como suporte para o funil nos processos de
filtração.
Tubo falcon: usado no processo de centrifugação, no qual são separados os

componentes de uma mistura heterogênea, como o sangue.
Pisseta: frasco de plástico usado para conter e dispersar líquidos como água
destilada e álcool.
✔ É importante que haja uma etiqueta de identificação da substância que
está contida na pisseta
Cálice de sedimentação: utilizado em exames parasitológicos para

sedimentar a amostra de fezes.
Almofariz e pistilo: (também chamado de gral ou morteiro) é um recipiente

de porcelana utilizado na trituração e pulverização de sólidos em pequena
escala.
✔ É utilizado em conjunto com o pistilo, estrutura também de porcelana
que se assemelha a um bastão.
Cadinho: recipiente geralmente de porcelana (também pode ser de ferro,

chumbo ou platina) utilizado em processos de calcinação (aquecimento a
seco a temperaturas muito altas).
✔ Suporta altas temperaturas (acima de 500°C) e pode ser colocado
diretamente na chama do bico de Bunsen.
✔ Usado em análises gravimétricas, além de ser útil para fundir
substâncias e misturas.
Cápsula de porcelana: usada na evaporação de líquidos e na secagem de

substâncias.
✔ Suporta temperaturas de até 500ºC
Triângulo de Porcelana: utilizado como suporte para cadinhos de porcelana

e são colocados diretamente na chama do bico de Bunsen.
Bico de Bunsen: fonte de calor (quando ligado emite uma chama) utilizada
para promover o aquecimento de soluções.
Tela metálica com amianto: utilizada geralmente em cima do bico de

Bunsen e suportada pelo tripé.
✔ Serve para distribuir o calor de maneira uniforme para os recipientes
que estiverem sobre ela.
Suporte Universal: estrutura utilizada como sustentação para outros

instrumentos de laboratório, como a bureta e o funil.
Anel ou Argola: se prende à haste do suporte universal e é usado para

sustentar o funil durante os processos de filtração.
Garra de Condensador: braçadeira que serve para afixar vidrarias, como o

condensador, balões e erlenmeyers à haste do suporte universal.
Garra dupla para bureta: usada para afixar a bureta à haste do suporte
universal.
Mufa: tipo de adaptador ao suporte universal e forma um sistema de

sustentação, complementado pela garra que fixa a vidraria utilizada no
procedimento.
Manta Aquecedora: fonte de calor utilizada em conjunto com o balão de

fundo redondo.
✔ Sua temperatura pode ser regulada.
Tripé: suporte metálico utilizado na realização de aquecimento de soluções
contidas em vidrarias.
✔ É geralmente utilizado em conjunto com a tela de amianto e sobre o
bico de Bunsen.
Espátula e colheres: instrumentos em aço inox, porcelana ou níquel

utilizados para a transferência de sólidos.
✔ Transferir substâncias em pó para a balança, para realização da
pesagem dessas substâncias.
Papel Filtro: utilizado juntamente com o funil para a separação de sólidos e

líquidos (filtragem).
Pinça Metálica: (também chamada de tenaz) é utilizada na manipulação de

objetos aquecidos, como o cadinho, para evitar queimaduras pelo contato
direto com estes objetos.
Pinça de madeira: usada para segurar vidrarias em aquecimento e evitando

acidentes com queimaduras.
Estante para tubos de ensaio: utilizado para manter os tubos de ensaio de

pé.
Pipetador tipo pera: instrumento de borracha utilizado em conjunto com a

pipeta.
✔ Serve para sugar e expelir (pipetar) líquidos.
Micropipetador: equipamento usado para pipetar volumes de líquido na
escala de microlitros (μl).
❖ Preparo de Soluções - Massa/Volume
Quando vamos resolver uma questão de concentração ou diluição e os dados

são apresentados em unidades diferentes, precisamos uniformizar estas
unidades ou não conseguiremos alcançar o resultado correto.
Precisamos converter uma delas para ficar na mesma unidade da outra.
Vamos ver unidades de massa: KG / G / MG / μG
✔ DO MAIOR PARA MENOR UNIDADE = X1000
✔ DO MENOR PARA MAIOR UNIDADE = /1000
Os cálculos para conversão de unidades de volume funcionam da mesma

forma que os cálculos para conversão de unidades de massa.
Vamos ver unidades de volume: L / ML / μL DO
✔ MAIOR PARA MENOR UNIDADE = X1000
✔ DO MENOR PARA MAIOR UNIDADE = /1000
❖ O que são Misturas?
Compostas por substância pura: amostra de matéria que possui composição

definida e constante e propriedades químicas distintas.
É uma substância química que não pode ser separada por métodos de
separação física, isto é, sem quebrar as ligações químicas.
✔ Ex: água (H2O); sal de cozinha (cloreto de sódio - NaCl); ouro (Au);
etanol (C2H5OH).
Mistura: duas ou mais substâncias puras fisicamente no mesmo local, mas
não são quimicamente combinadas, portanto, as proporções não são
necessariamente consideradas.
As misturas podem ser homogêneas ou heterogêneas: a diferença é o grau
em que os materiais são misturados e a uniformidade de sua composição.
Mistura homogênea: os componentes que a compõem são distribuídos
uniformemente por toda a sua extensão.
1- Existe apenas uma fase da matéria observada.
2- Não é possível separar os componentes por meios mecânicos simples.
✔ Ex: ar puro; água com açúcar; vinagre; aço.
Mistura heterogênea: os componentes não são uniformes ou possuem

regiões com propriedades diferentes.
1- Amostras diferentes da mistura não são idênticas entre si e sempre há
duas ou mais fases.
✔ Ex: ar poluído; sangue; leite; solo.
❖ O que é Solução e seus tipos?
Uma solução é um tipo especial de mistura homogênea: proporção de soluto

(substância dissolvida) para solvente (substância que dissolve) permanece a
mesma em toda a solução e as partículas não são visíveis a olho nu, mesmo
se homogeneizadas.
Os solutos não decantam após um período de repouso e não podem ser
removidos por métodos físicos, como filtragem ou centrifugação.
Única fase, embora as fases do soluto e do solvente possam ter sido
inicialmente diferentes (Por exemplo: solução salina - sal é o soluto dissolvido
em água, que é o solvente.).
A quantidade máxima de soluto que pode ser dissolvida numa certa massa de
solvente a uma dada temperatura é chamada de solubilidade:
✔ Solução insaturada: quantidade de soluto dissolvido no solvente é
menor que sua solubilidade, em uma temperatura específica.
✔ Solução saturada: quantidade de soluto dissolvido é exatamente igual
à sua solubilidade naquela temperatura. Pode ou não apresentar
precipitado, também chamado de corpo de fundo.
✔ Solução supersaturada: quantidade de soluto superior à sua
solubilidade, em uma dada temperatura. Pode ser obtida através do
aquecimento de uma solução saturada com corpo de fundo, seguido
pelo resfriamento lento para evitar a precipitação do excesso de soluto.
❖ O que é Concentração?
Relação entre a quantidade de soluto e a quantidade de solvente, podem ser

expressas: em massa, volume ou quantidade de matéria.
Concentração massa volume (m/v): é utilizada para indicar a relação entre
a massa do soluto (m) e o volume total da solução (v). (ex papel)
✔ Expressa em gramas por litro (g/L) ou miligramas por mililitro (mg/ml)
Concentração em porcentagem (m/m ou v/v): É a relação entre massa de
soluto sobre a massa da solução, ou o volume de soluto sobre o volume da
solução.
✔ Ex: Uma solução de formaldeído a 37% contém 37 g de soluto em 100
g de solução. 37% do volume ou massa total da solução deve ser de
soluto. Algumas alternativas de resposta apresentam massa final da
solução de 100 g, o que facilita os cálculos, já que 37% de 100 é
exatamente 37.
Concentração em partes por milhão (ppm): Indica quantas partes de soluto
existem em um milhão de partes de solução.
Para representar quantidades de soluto em soluções muito diluídas, como
alguns poluentes presentes no ar.
✔ Ex: Certo agente químico tem concentração de 10 ppm na água. Qual
opção que descreve com mais precisão sua concentração. Existem 10
moléculas do agente químico em um milhão de moléculas de água
✔ Dizer que um determinado agente químico tem concentração de 10
ppm (partes por milhão) na água significa dizer que existem 10
moléculas do agente químico em um milhão de moléculas de água.
Concentração molar (mol/L) ou Molaridade: é a razão entre a quantidade
de matéria (mols) e 1 litro de solução, expressa em mol/L.
❖ O que é Diluição?
Para preparar uma solução 1:10 precisamos utilizar 1 parte do soluto para 10
partes da solução total;
Não 1 parte do soluto para 10 partes do solvente.
✔ Ex: Na prática, para preparar um litro dessa solução usaríamos 100 ml
de ácido acético e 900 ml de água, totalizando 1000 ml de solução.
Quando preparamos uma solução, também devemos nos atentar às boas
práticas laboratoriais para evitar acidentes.
✔ Ex: A diluição de um ácido (que gera uma reação exotérmica),
devemos sempre acrescentar o ácido aos poucos à água, e NUNCA o
contrário.
Algumas vezes, partiremos de uma solução mais concentrada para outra
menos concentrada, ou seja, diluiremos uma determinada solução ainda mais
ao adicionar mais solvente.
Qualquer solução tem dois parâmetros: a concentração e o volume.
Se diluirmos uma solução o volume irá aumentar enquanto a concentração irá
diminuir, pois teremos uma proporção menor soluto/solvente.
Contudo, a massa do soluto permanecerá constante, pois não será removida
nem adicionada nenhuma quantidade desta substância, mas apenas de
solvente.
As questões que versam sobre diluição de soluções geralmente contam uma
historinha na qual existe uma solução inicial (solução 1) que será diluída pela
adição de mais solvente e dará origem à solução final (solução 2).
C1 x V1 = C2 x V2
✔ Ex: Desinfecção das bancadas do laboratório pode ser feita utilizando-

se solução de hipoclorito de sódio a 1%, deixando-a agir por 30
minutos.
✔ Essa solução pode ser preparada a partir da diluição da água sanitária
comercial (solução de hipoclorito de sódio a 2,5%). Para a preparação
de 500mL da solução de desinfecção, o volume de água sanitária
utilizado é de:
✔ Logo, para obtermos 500mL da solução de desinfecção, o volume de
água sanitária utilizado deve ser de 200 ml. (conta papel)
❖ O que são Diluições Seriadas?
Uma série de diluições sequenciais que são realizadas para converter uma
solução concentrada (ou uma amostra pura) em uma solução de
concentração menor, de mais fácil aplicação na prática clínica.
Utilizada para a redução da concentração de analitos em amostras para
realização de testes imunológicos (VDRL, Coombs, ASLO), para verificar até
qual diluição o resultado ainda será reativo, também tem aplicação no setor
de microbiologia, para facilitar a contagem das colônias de bactérias em
cultura.
1- O procedimento envolve o processo de retirar uma quantidade pré
estabelecida de uma amostra e diluí-la em uma série de volumes
padronizados de um diluente (como água destilada ou solução salina a
0,9%).
2- Em seguida, um volume pré-definido de cada diluição é usado para
fazer a diluição seguinte de forma que, após o primeiro tubo, cada tubo
seguinte será a diluição do tubo anterior.
3- Vejamos a seguir um exemplo de uma diluição seriada começando
com uma amostra pura e empregando o fator de diluição 2 em um total
de 7 tubos para obtenção de um volume final de 200μl:
4- Cada um dos 7 tubos deve ser previamente preenchido com 200μl de
diluente.
5- Pipete 200μl da amostra pura e transfira para o primeiro tubo com
diluente, que apresentará uma diluição 1/2.
6- Homogeneíze o conteúdo do primeiro tubo, pipete 200μl do seu
conteúdo e transfira para segundo tubo, que apresentará uma diluição
1/4.
7- Repita o processo até chegar no sétimo tubo, que apresentará uma
diluição 1/128.
8- Após homogeneizar, despreze 200μl do último tubo, para que este
fique com um volume final de 200μl
✔ Ex: Uma amostra de soro foi diluída a 1:3 com um tampão e, desta
diluição, foi feita uma nova diluição de 1:8. No final, a amostra foi
diluída a:
✔ Quando nos deparamos com duas diluições seguidas, só o que
precisamos fazer é multiplicar os valores, assim como fazemos em
uma multiplicação de frações: Logo, no final, a amostra foi diluída a
1:24.
❖ Introdução a Microbiologia: O que são Microrganismos?
Organismos microscópicos, ou seja, que não podem ser visualizados a olho

nu, como: bactérias, os fungos e os vírus.
Microbiota residente: o corpo humano é colonizado por vários
microrganismos.
✔ Vivem em tecidos ou fluidos do corpo sem causar mal para o
hospedeiro;
✔ Podem ser benéficos como as bactérias intestinais que auxiliam no
processo de digestão de alguns nutrientes.
O foco são os microrganismos patogênicos: capazes de causar algum tipo de
doença.
❖ Procedimentos Laboratoriais: Coleta, Transporte e Conservação

de Amostra
As etapas devem ser rigidamente controladas: é essencial a confecção de
Procedimentos Operacionais Padrão (POP) descrevendo minuciosamente
cada tarefa, desde a coleta do material, até a emissão do laudo. Os principais
erros observados:
✔ Coleta da amostra (inadequada, frascos não estéreis);
✔ Transporte da amostra (inadequados, tempo acima do estabelecido);
✔ Erros analíticos (meios de cultura não indicados e interpretação

errônea dos resultados).
Quando os procedimentos são realizados de forma correta: garante a
viabilidade do microrganismo de interesse e consequente sucesso nas etapas
de inoculação e análise promovendo a não contaminação da amostra.
Os procedimentos de coleta variam a depender do tipo de amostra que será
coletada.
Já o transporte deve ser realizado o mais rápido possível.
❖ Microscopia e Coloração - O que é?
A análise microscópica pode ser realizada com ou sem coloração,

dependendo do tipo de microrganismo que se deseja investigar.
O método direto sem coloração pode ser realizado com:
Salina (soro fisiológico – 0,85% de cloreto de sódio): Utilizada para
observação da morfologia bacteriana e para avaliação da motilidade.
✔ Indicado para pesquisa a fresco de Trichomonas em secreções e
fungos (leveduriformes ou filamentosos)
Hidróxido de potássio (KOH): Usado para pesquisa de fungos
(leveduriformes e particularmente filamentosos) em amostras contendo muco,
restos celulares, unhas, pelos, dentre outros.
✔ Capaz de dissolver a queratina presente nessas amostras e destacar
as estruturas fúngicas.
Exame em campo escuro: Indicado para observação da motilidade de
bactérias que são de difícil observação com salina, como o Treponema
pallidum e a Leptospira sp. e outras bactérias, como o Campylobacter sp.
Tinta da China (nanquim): é principalmente indicada para a pesquisa do
fungo criptococos em amostras de líquido cefalorraquidiano (LCR), mas
também pode ser utilizada em outros materiais.
✔ Destaca a cápsula de criptococos contra um fundo negro.
A coloração é o primeiro procedimento de análise microbiológica e permite

uma identificação inicial dos tipos de microrganismos.
❖ Microscopia e Coloração - Gram
Dentre os métodos de coloração, temos: Coloração de Gram Amplamente

utilizada na identificação preliminar de bactérias, permitindo observar
características como tamanho, forma, agrupamento e resposta à coloração
(como bactérias Gram-positivas ou Gram-negativas), colorindo esses
microrganismos de violeta ou vermelho
Técnica comum usada para diferenciar bactérias com base em seus
diferentes constituintes da parede celular:
Bactérias Gram-positivas: (com uma camada mais espessa de
peptidoglicano) retêm o corante primário cristal violeta durante o processo de
descoloração.
Bactérias Gram-negativas: (que possuem uma parede de peptidoglicano
mais fina) perdem a coloração do cristal violeta e são coradas pelo
contracorante safranina ou fucsina no processo final de coloração.
Antes da realização da coloração de Gram em si: deve-se preparar
esfregaços em lâminas da amostra que se deseja analisar.
Fixados pelo emprego do calor brando (50ºC) ou pela utilização de etanol ou
metanol.
1. As bactérias são coradas com corante cristal violeta (violeta genciana) por
1 min. Em seguida, uma solução de lugol (solução com iodo - mordente) é
adicionada para formar um complexo entre o cristal violeta e o iodo. Esse
complexo é insolúvel em água por 1 min.
2. Um descolorante, como álcool 95% ou uma solução de álcool-acetona, é
adicionado à amostra, e desidrata a camada de peptidioglicano causando o
seu encolhimento, alternar com água corrente 15s.
✔ O grande complexo de cristal violeta-iodo não é capaz de ultrapassar
essa camada de peptidoglicano reforçado e, portanto, fica preso na
célula em bactérias Gram-positivas.
✔ A membrana externa das bactérias Gram-negativas é degradada e a
camada mais fina de peptidoglicano é incapaz de reter o complexo
cristal violeta-iodo e a cor é perdida.
3. Um contracorante, como a safranina ou fucsina, é adicionado à amostra,
corando-a de vermelho por 30s, lavar em água corrente e deixar secar.
✔ Mais leve que o cristal violeta, não interfere na coloração púrpura nas
células Gram-positivas.
✔ As células Gram-negativas descoloridas são coradas de vermelho.
❖ Microscopia e Coloração - Ziehl-Neelsen
A parede celular das micobactérias contém alta concentração de lipídios,

tornando-as cerosas, hidrofóbicas e impermeáveis a colorações de rotina,
como a coloração de Gram.
Resistentes ao ácido e ao álcool e são descritas como Bacilos Álcool-Ácido
Resistentes (BAAR).
Forma de coloração para corar espécies de Mycobacterium, incluindo M.
tuberculosis, M. ulcerans e M. leprae e micobactérias não tuberculosas
(MNT).
Baciloscopia: é a pesquisa de BAAR por microscopia em esfregaços de
amostras corados pela técnica de Ziehl-Neelsen.
1. Fixar o esfregaço;
2. Colocar as lâminas em suporte de coloração;
3. Cobrir as lâminas com carbolfucsina (As BAAR retêm a carbolfucsina e
ficam vermelhas);
4. Aquecer as lâminas durante 5 minutos, permitindo a saída de vapores e
evitando a fervura da fucsina;
5. Após 5 minutos, escorrer e lavar as lâminas delicadamente com água;
6. Descorar as lâminas com solução de álcool ácido até que ela fique
completamente clara (Quando se realiza a remoção com ácido-álcool, apenas
as bactérias que não são BAAR são descoradas, pois não possuem uma
camada lipídica espessa e cerosa);
7. Lavar as lâminas com água corrente;
8. Corar com Azul de Metileno por 1 minuto (Quando o contracorante (azul de
metileno) é aplicado, as bactérias que não são não BAAR o capturam e
tornam-se azuis quando vistas ao microscópio)
9. Lavar em água corrente e secar.
❖ Semeadura em Meios de Cultura - O que são?
Procedimento importante para posterior análise das colônias que se

desenvolveram.
Meios de cultura diferentes podem ser empregados a depender do tipo de
material clínico e do microrganismo que se deseja investigar.
Técnica de semeadura qualitativa: semeadura pode ser realizada com o
mesmo swab do meio de transporte, ou pode-se usar uma alça estéril para
captar uma fração do material.
Técnica de semeadura quantitativa: deve-se semear um volume conhecido
do material e, após a incubação, realizar a contagem do número de unidades
formadoras de colônia (UFC).
✔ Incubação deve ser realizada em condições ideais de temperatura,
umidade, atmosfera (concentração de O2 e CO2) e tempo, podem
variar a depender do microrganismo que se está cultivando.
O que são Meios de Cultura?
A identificação dos microrganismos é feita principalmente a partir do seu
crescimento em meios de cultura e emprego das chamadas provas de
identificação.
❖ Meios de Cultura e Provas de Identificação
Os microrganismos se comportam de maneiras diferentes quando submetidos

a diferentes situações, é possível determinar qual tipo está presente a partir
destas metodologias de identificação.
Meios de cultura: meios preparados com substâncias nutritivas para os
microrganismos, permitindo que eles cresçam neste ambiente.
A maioria contém uma substância chamada ágar, que se assemelha a uma
gelatina.
Substâncias nutritivas também são acrescentadas ao meio, variando de
acordo com as necessidades do tipo de microrganismo que se deseja cultivar.
❖ Semeaduras em Meio de Cultura – Consistência
Classificados quanto à sua consistência em:

Meios líquidos: apresentam-se sob a forma de caldo, pois não possuem
agente solidificante (ágar).
✔ Pode ser contido em vidrarias como tubos de ensaio, balões ou
ernlenmeyers;
Meios semissólidos: possui uma consistência intermediária por possuir uma
pequena proporção de agente solidificante (0,5 a 1,0%).
✔ Distribuído em tubos de ensaio e empregado na realização de testes
de motilidade;
Meios sólidos: a consistência é mais firme, o que se deve à maior
concentração de agente solidificante no meio (1,5 a 2,0%).
✔ Distribuído em placas de Petri ou em tubos de ensaio (de forma
inclinada)
✔ Meio mais utilizado para observação e avaliação da morfologia de
colônias de microrganismos
❖ Semeaduras em Meio de Cultura - Simples e Enriquecidos
Classificados quanto à sua função em:

1. Meios simples: possuem nutrientes que permitem o crescimento da
maioria dos microrganismos não exigentes.
✔ Usados para o isolamento primário de microrganismos.
✔ Ex: Água peptonada, caldo nutritivo e ágar nutriente.
2. Meios enriquecidos: contêm os nutrientes necessários para favorecer

o crescimento de uma grande variedade de organismos, incluindo alguns
microrganismos mais exigentes (fastidiosos).
Ágar sangue: meio rico oferece ótimas condições de crescimento à
maioria dos microrganismos.
Ágar chocolate: é um meio enriquecido não seletivo no qual cresce a
maioria das bactérias aeróbias e facultativas e microrganismos
microaerófilos (incubado em CO2)
Coloração castanho escura parecida com chocolate.
Obtido a partir da adição de sangue (de cavalo, carneiro ou coelho) que é
"achocolatado" em banho-maria por 15 minutos na temperatura de 80-
85°C.
Neste processo, ocorre a lise das hemácias e liberação de hemina e
hematina que favorecem o crescimento dos microrganismos exigentes.
I. Colônias pequenas e médias com pigmento amarelo são sugestivas:
Neisseria spp., Branhamella catarrhalis ou Moraxella spp.
II. Colônias pequenas e delicadas com pigmento creme claro sugerem:
Haemophilus spp.
III. Colônias de microrganismos alfa-hemolíticos, é possível observar
halos esverdeados.
Meio de Loeffler: usado para o cultivo e isolamento de Corynebacterium
diphtheriae.
Caldo Selenito: utilizado no enriquecimento e isolamento das bactérias
Salmonella spp. e Shigella spp. em amostras de fezes, urina e alimentos.
❖ Semeaduras em Meio de Cultura - Função Seletivo
3. Meios seletivos: formulado para inibir o crescimento de alguns

microrganismos enquanto permite o crescimento de outros.
Promove a supressão diferencial do crescimento.
Podem consistir em reagentes seletivos adicionais, como alta concentração
de sal para selecionar organismos halófilos, ou podem ser empregadas
condições de crescimento seletivo.
Se um microrganismo é resistente a um determinado antibiótico, como
ampicilina ou tetraciclina: pode ser adicionado ao meio para impedir o
crescimento de outros organismos que não possuem resistência, e apenas o
microrganismo resistente será selecionado.
Ágar MacConkey (MC): contém sais biliares e cristal violeta, que inibem o
crescimento de bactérias Gram-positivas (estafilococos e enterococos) e
permitem o crescimento de bactérias Gram-negativas (enterobactérias e não
fermentadores).
Ágar manitol (Meio de Chapman): apresenta alta concentração de cloreto
de sódio (NaCl 7,5%).
✔ Para bactérias halófilas (capazes de viver em altas concentrações de
sal), como espécies do gênero Staphylococcus.
Meio Sabouraud: possui pH ácido (5,6) e alta concentração de glicose (3 a
4%).
✔ Favorece o crescimento de fungos e inibe o crescimento de bactérias.
✔ Pode conter antibióticos (gentamicina, cloranfenicol) para prevenir o

crescimento de bactérias contaminantes.
Meio BDA (batata-dextrose-ágar) acidificado: seu pH é seletivo para

fungos.
Ágar Thayer-Martin: contém antibióticos (vancomicina, colistina e nistatina).
Usado para selecionar Neisseria meningitidis e N. gonorrhoeae.
✔ A adição de colistina, vancomicina e nistatina inibe crescimento de
enterobactérias, bactérias Gram-positivas, fungos e algumas espécies
de Neisserias saprófitas.
Ágar Eosina Azul de Metileno (EMB): contém corantes tóxicos para
bactérias Gram-positivas, permitindo apenas o crescimento de bactérias
Gram-negativas.
✔ Meio seletivo e diferencial para coliformes.
Meio Löwenstein Jensen: contém verde de malaquita que inibe o

crescimento de bactérias Gram-positivas.
✔ Rico em lipídios, por ter ovos em sua composição.
✔ É um meio seletivo para micobactérias, como a M. tuberculosis.
Ágar Hektoen Enteric (HE): seletivo para bactérias Gram-negativas, como

Salmonella e Shigella.
Ágar Salmonella-Shigella (SS): seletivo para Salmonella e Shigella.
Ágar Cetrimide: possui brometo de cetiltrimetilamônio (cetrimida), que inibe o
crescimento de várias bactérias, incluindo espécies de Pseudomonas, com
exceção da P. aeruginosa.
✔ Meio seletivo para P. aeruginosa.
❖ Semeaduras em Meio de Cultura - Diferenciais ou indicadores
Utilizados para distinguir um tipo de microrganismo de outro que cresce no

mesmo meio.
Utiliza as características bioquímicas de um microrganismo, que cresce na
presença de nutrientes ou indicadores específicos adicionados ao meio, para
indicar visivelmente as características morfológicas inerentes a um
determinado microrganismo (como a cor das colônias).
Ágar MacConkey (MC): além de ser um meio seletivo para bactérias Gram-
negativas, é um meio diferencial para a fermentação da lactose e produção de
ácido.
✔ Acidificam o meio e produzem colônias avermelhadas ou rosadas que
reduz o ph ao redor da colônia, enquanto as não fermentadoras de
lactose produzem colônias pálidas ou incolores.
Ágar manitol (Meio de Chapman): meio seletivo pra bactérias halófilas e
meio diferencial por conter manitol, um polissacarídeo.
✔ As bactérias que fermentam o manitol mudam a cor do meio de
vermelho para amarelo.
✔ O S. aureus é a única espécie capaz de fermentar o manitol.
Ágar sangue: contém sangue cardíaco bovino e é usado para identificar

microrganismos causadores dos diferentes tipos de hemólise (hemólise α, β e
γ).
✔ Originalmente vermelho, forma um halo transparente ao redor das
colônias de microrganismos β-hemolíticos, como Streptococcus
pyogenes e Staphylococcus aureus, evidenciando uma hemólise
completa.
✔ Os microrganismos que causam alfahemólise (Streptococcus
pneumoniae e Streptococcus viridans) apresentam um halo
esverdeado ao redor das colônias, o que evidencia a lise parcial de
hemácias.
✔ Os microrganismos gama-hemolíticos (Enterococcus faecalis) não
causam hemólise, logo, não se forma um halo ao redor das colônias.
✔ Neste meio cresce a maioria das bactérias Gram-negativas e Gram-
positivas, além de fungos filamentosos (bolores) e leveduras, exceto
algumas espécies de hemófilos e outros fastidiosos.
Ágar Eosina Azul de Metileno (EMB): meio seletivo para coliformes e

diferencial para a fermentação de lactose.
✔ Microrganismos fermentadores de lactose e produtores de ácido, como
a Escherichia coli, produzem colônias escuras com tom esverdeado e
brilho metálico.
✔ Microrganismos que são produtores fracos de ácido, como Klebsiella,
Enterobacter e Serratia, dão origem a colônias acinzentadas.
✔ Microrganismos que não fermentam lactose (e consequentemente não
produzem ácido), como Salmonella e Shigella, formam colônias
transparentes.
Ágar de tiossulfato, citrato, bílis e sacarose (ágar TCBS): meio diferencial

para Vibrio cholerae, que produz colônias amarelas devido à fermentação da
sacarose.
✔ Originalmente, o meio é verde.
✔ Todas as espécies de Vibrio spp são patogênicas, com exceção de

Vibrio hollisae, crescem no ágar TCBS.
Ágar Salmonella-Shigella (SS): meio seletivo para Salmonella e Shigella e

diferencial para a utilização de lactose (coloração rósea) e produção de H2S
(coloração negra).
✔ Originalmente vermelho alaranjado que contém sais de bile, verde
brilhante e citrato de sódio, que são componentes que inibem o
crescimento de microrganismos Gram-positivos (Staphylococcus e
Enterococcus).
✔ O meio também contém lactose: lactose positivas (que produzem ácido
na presença de um indicador vermelho neutro e formam colônias cor
de rosa) e lactose negativas (colônias transparentes).
✔ A presença de tiossulfato de sódio e citrato férrico na composição
permite a identificação de H2S, que é evidenciado pela formação de
colônias com centro negro (Proteus spp. e algumas espécies de
Salmonella spp.).
✔ Colônias incolores ou com o centro negro (sulfeto de hidrogênio - H2S)
são sugestivas de Salmonella, mas também podem ser Shigella spp.
✔ Espécies de Proteus spp. Produzem colônias com centro negro.
✔ Colônias cor de rosa ou vermelhas são sugestivas de Escherichia coli

ou Klebsiella spp.
Ágar Hektoen Enteric (HE): meio seletivo para espécies enteropatogênicas

de Salmonella e Shigella e diferencial para a utilização de carboidratos
(lactose, sacarose e salicina) e produção de H2S (coloração negra).
✔ Os microrganismos que fermentam os carboidratos presentes no meio
dão origem a colônias amareladas.
✔ Os que não fermentam sacarose formam colônias translúcidas ou
verde-claras. Os que não fermentam lactose e sacarose (mas
acidificam a salicina) podem formar colônias alaranjadas.
Ágar Xilose-Lisina-Desoxicolato (XLD): meio que contém lactose, sacarose

e xilose.
✔ Os microrganismos que fermentam os carboidratos presentes no meio
dão origem a colônias amarelas.
✔ Os que não fermentam dão origem a colônias incolores.
✔ Semelhantemente ao que ocorre no ágar Salmonella- Shigella,

microrganismos que produzem H2S formam um pigmento negro.
✔ Colônias negras sem halo cor de rosa são mais características de
cepas de Proteus spp. produtoras de H2S.
Ágar CLED (Cystine Lactose Electrolyte Deficient): meio originalmente

azul claro usado no isolamento e na quantificação de microrganismos (Gram-
positivos, Gram-negativos e leveduras) em amostras de urina.
✔ Por ser deficiente em eletrólitos, inibe o véu de cepas de Proteus e o
crescimento de espécies de Shigella.
✔ Nesse meio, colônias lactose positivas apesentam coloração amarela,
enquanto colônias lactose negativas apresentam cor azul.
❖ Meios de transporte das amostras
As amostras devem ser transportadas imediatamente após coleta para evitar

o crescimento excessivo de microrganismos ou comensais contaminantes
(microbiota residente).
✔ Evitam a secagem (dessecação) da amostra;
✔ Mantêm a relação patógeno/comensal;
✔ Inibem o crescimento excessivo de bactérias indesejadas, contêm

apenas a quantidade necessária de nutrientes para permitir que os
organismos sobrevivam.
Capazes de conservar as características da amostra: do momento da coleta
até a realização do semeio em laboratório.
Meio Stuart: gel de ágar mole não nutritivo que mantém os microrganismos
vivos.
✔ Impede a sua multiplicação (devido à carência de uma fonte de
nitrogênio).
✔ O meio é de cor branca opalescente e é capaz de conservar
microrganismos patogênicos como: Haemophilus spp., Streptococcus
pneumoniae, Salmonella spp., Shigella spp. etc.
Cary Blair: meio branco opalescente derivado do meio Stuart usado para
transportar fezes de pacientes com suspeita de cólera.
✔ Difere do meio de Stuart pela adição de uma solução salina
balanceada de tampão fosfato inorgânico e pela retirada do azul de
metileno da fórmula.
Salina tamponada: meio líquido tamponado usado para transportar fezes de
pacientes suspeitos de sofrer de disenteria bacilar.
✔ A turbidez do meio é um indicativo de crescimento bacteriano.
Ágar nutriente: meio simples, barato e fácil de preparar.
✔ Possui coloração branca opalescente e é usado principalmente na
manutenção e conservação de amostras;
✔ Possui aplicação na análise de alimentos e água.
❖ Meios de manutenção ou conservação de amostras
Utilizados para manter ou conservar amostras de microrganismos: o

crescimento é limitado, devido há escassez de nutrientes.
Evita-se a formação de compostos tóxicos.
Os meios de transporte supracitados também podem ser utilizados como
meios de manutenção ou conservação.
❖ Escolha do meio de cultura - Provas de Identificação
Dependendo do tipo de amostra clínica a ser investigada, um ou outro meio

de cultura pode ser mais adequado.
O agente que se deseja investigar também influencia na escolha do meio de
cultura, pois alguns meios são seletivos para microrganismos específicos.
Provas de Identificação: serve para identificar microrganismos
(principalmente bactérias), nos baseamos nos testes bioquímicos.
✔ Funciona como uma impressão digital para a sua identificação.
✔ Cada espécie possui uma sequência de DNA única = codifica a síntese

proteica = capazes de sintetizar diferentes enzimas.
✔ Catalisam várias reações químicas = diferentes espécies de
microrganismos respondem de forma única a um conjunto de testes
bioquímicos.
❖ Meios Comerciais para Provas de Identificação
Algumas provas de identificação são realizadas em meios comerciais para

crescimento de microrganismos.
As alterações que microrganismos causam são a base para interpretação e
identificação.
Base de nitrogênio para leveduras – Yeast Nitrogen Base: Identificar as
espécies de leveduras através da prova de assimilação de carboidratos.
✔ Cor original do meio: amarelo palha.
✔ Positivo: halo de crescimento ligeiramente opaco ao redor dos discos,
que significa a assimilação do açúcar pela levedura.
✔ Negativo: Ausência de halo de crescimento. O meio permanece
inalterado.
Ágar Citrato Simmons: Capacidade da bactéria utilizar citrato de sódio, junto
com sais de amônia, alcalinizando o meio.
✔ Diferenciar gêneros e espécies de enterobactérias e não
fermentadores.
✔ Cor original do meio: verde
✔ Positivo: cor azul ou crescimento no local do inóculo.
✔ Negativo: não há crescimento e a cor permanece inalterada.
✔ Se houver crescimento na área do inóculo sem mudança de cor, o

teste pode ser considerado positivo, reincubar por 24 até 72 horas, a
incubação poderá mudar a cor do meio para azul (alcalino).
Ágar Bile- Esculina: A esculetina reage com íons férricos (fornecidos pelo
composto inorgânico do meio – o citrato férrico), formando um complexo
negro.
Separação dos Streptococcus Bile-Esculina positiva dos Bile-Esculina
negativa; Identificação dos Enterococcus spp., que são Bile-Esculina positiva.;
Identificação de bacilos Gram-negativos não fermentadores e enterobactérias,
usar o meio sem bílis (vide prova de esculina).
✔ Cor original do meio: acinzentado.
✔ Positivo: Enegrecimento em pelo menos metade ou mais do meio.
✔ Negativo: Ausência de enegrecimento ou crescimento de menos da

metade do meio após 72 horas de incubação.
Ágar Sangue – CAMP: Consiste na interação da betahemólise secretada
pelo Staphylococcus aureus com o microrganismo em estudo, que secreta
uma proteína, denominada “fator CAMP”, produzindo aumento de hemólise no
local da inoculação.
✔ Positivo: Aumento da área de hemólise em forma de flecha no local
onde estão mais próximas as duas estrias de crescimento.
✔ Negativo: Ausência de aumento da hemólise. Observa-se nitidamente
a hemólise do S. aureus e da cepa em estudo, inalteradas.
Caldo Base de Moeller: Verificar a capacidade de microrganismos usarem
enzimas, auxiliando na identificação.
Utilizado principalmente para identificações de enterobactérias, bacilos Gram-
negativos não fermentadores, estafilococos.
✔ Cor original do meio: púrpura.
✔ Positivo: Tubo controle (sem aminoácido): amarelo e turvo – indica que

o microrganismo é viável e o pH do meio abaixou o suficiente para
ativar as enzimas descarboxilase. Tubo com aminoácido: púrpura e
turvo – indica a formação de aminas a partir da reação de
descarboxilação.
✔ Negativo: Tubos controle e com aminoácido: púrpura.
Ágar DNAse: Cepas de alguns microrganismos produzem DNase e

endonuclease termoestável. Essas enzimas hidrolisam ácido o DNA contido
no meio de cultura após um período de incubação.
Posteriormente esse meio é acidificado com HCl 1N para a revelação da
prova. A) Revelação com HCl 1 N: Cor original do meio: amarelo claro.
Positivo: Presença nítida de halo claro na parte inferior e em volta da colônia.
Negativo: Ausência de halo claro em volta da colônia.
B) Revelação com azul de toluidina O:
✔ Cor original do meio: azul claro
✔ Positivo: Presença de coloração rosa na parte inferior e em volta da

colônia.
✔ Negativo: Ausência de cor rosa. O meio permanece com a cor original,
azul.
Ágar Esculina: Verifica se a bactéria é capaz de hidrolisar a esculina. A
esculetina exige sais de ferro formando precipitado marrom escuro ou preto.
✔ Cor original do meio: palha.
✔ Positivo: marrom escuro ou preto.
✔ Negativo: inalterado (palha).
Ágar Fenilalanina: Verifica a capacidade da bactéria de produzir ácido

fenilpirúvico a partir da fenilalanina por ação enzimática.
Adicionar diretamente o cloreto férrico no tubo inoculado, antes da
interpretação do resultado e distribuir o reagente sobre a superfície do meio.
✔ Positivo: formação de uma coloração esverdeada na superfície do meio

após a adição do cloreto férrico.
✔ Negativo: o meio permanece inalterado
CTA – Cystine Tryticase Ágar: CTA é um meio semissólido, recomendado
para o estudo de fermentação de carboidratos de microrganismos exigentes.
✔ Cor original do meio: alaranjado.
✔ Positivo: cor amarela, indicando acidificação (fermentação) do meio e

turvação.
✔ Negativo: Ausência de crescimento.
✔ O meio permanece com a cor original, alaranjado, e sem turvação.
Caldo Triptona e SIM: Determinam a habilidade do microrganismo de

metabolizar o triptofano em indol.
Triptofano é um aminoácido que pode ser oxidado por certas bactérias
resultando na produção de indol, após a adição de reagentes de Erlich ou
Kovacs.
✔ Motilidade positiva: microrganismos móveis migram pela linha do
inóculo e difundem-se no meio causando turbidez.
✔ Motilidade negativa: bactéria tem um crescimento acentuado ao longo
da linha do inóculo, em volta continua límpido.
✔ H2S positivo: ao longo da linha de inoculação aparecerá a cor negra.
✔ H2S negativo: linha ao longo da inoculação inalterada. Indol positivo:

aparecerá um anel vermelho. Indol negativo: aparecerá um anel
amarelo.
Caldo Malonato: Determina a habilidade do microrganismo de utilizar
malonato de sódio como única fonte de carbono, resultando em alcalinização
do meio.
✔ Cor original do meio: verde.
✔ Positivo: azul.
✔ Negativo: inalterado (verde).
Caldo Nitrato: Determina a habilidade do microrganismo de reduzir o nitrato

(NO3) a nitrito (NO2) ou gás nitrogênio (N2) (denitrificação).
✔ Cor original do meio: incolor a palha.
✔ Bolhas de gás dentro do tubo de Durhan: bactéria reduziu nitrato a gás

= denitrificação.
✔ Adicionar 5 gotas dos reagentes A e B no meio, sem homogeneizar.
✔ Se desenvolver cor vermelho tijolo significa que a bactéria reduziu

nitrato a nitrito.
✔ Se após a adição dos reagentes A e B o tubo continuar incolor,
adicionar uma pitada de pó de zinco no tubo, se desenvolver cor
vermelho tijolo significa que a bactéria não reduziu nitrato a nitrito e o
nitrato ainda permanece no meio.
IMPORTANTE: algumas bactérias não conseguem reduzir nitrato a nitrito e
só conseguem reduzir nitrito, como por exemplo, Alcaligenes Faecalis e
Oligella Uretralis, havendo a necessidade de utilizar o caldo nitrito para esse
fim.
Meio Base Para Oxidação e Fermentação – OF: Verificar a capacidade do
microrganismo em utilizar os carboidratos pela via oxidativa ou fermentativa.
✔ Cor original do meio: verde.
✔ Oxidador: tubo aberto – desenvolvimento de cor amarela.
✔ Tubo fechado – inalterado (verde).
✔ Fermentador: tubo aberto e fechado – desenvolvimento de cor

amarela. Assacarolítico: tubo aberto e fechado – inalterado (verde).
Ágar TSI – Triplo Açúcar Ferro: Diferenciar bacilos Gram-negativos com
base na fermentação de carboidratos, produção de sulfato de hidrogênio e
gás.
✔ Cor original do meio: vermelho laranja, levemente opalescente. Leitura:
entre 18 e 24 horas.
✔ Cor púrpura = alcalino.
✔ Cor amarelo = ácido.
✔ Reações ápice/base: Púrpura/amarelo = fermentação apenas da

glicose (lactose e sacarose negativos).
✔ Amarelo/amarelo = fermentação da glicose + lactose e/ou sacarose (2
ou 3 açucares).
✔ Presença de gás (CO2) = bolhas ou meio fragmentado.
✔ H2S positivo = presença de precipitado negro.
Ágar Base Ureia (Christensen): Determinar a habilidade do microrganismo

de degradar a ureia em duas moléculas de amônia pela ação da enzima
urease, resultando na alcalinização do meio.
✔ Positivo: alteração do meio para cor de rosa, pink.
✔ Negativo: sem alteração de cor do meio.

A) Diferentes graus de hidrólise da ureia podem ocorrer:
✔ Tubo inteiro cor pink.
✔ Superfície do tubo cor pink, base não muda de cor.

o Fracamente positivo: ápice cor pink, restante do tubo não muda
de cor.
o Positivo rápido: 1 – 6 horas para Proteus spp.
o Positivo tardio: 24 horas a 6 dias ou mais tempo de incubação.
✔ Ex: algumas cepas de Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter,
Haemophilus.
❖ O que é quais são as Provas de Identificação?
Se baseiam em reações químicas promovidas por diferentes espécies de

microrganismos.
Elas são amplamente utilizadas em laboratórios de microbiologia e são muito
úteis na identificação de microrganismos.
Prova de catalase: A catalase é uma enzima que decompõe o peróxido de
hidrogênio (H2O2) em água e oxigênio.
✔ Positivo: Presença imediata de bolhas – a produção de efervescência
indica a conversão do H2O2 em água e oxigênio gasoso.
✔ Negativo: Ausência de bolhas ou efervescência.
Prova de coagulase: Verificar a capacidade de microrganismos reagirem

com o plasma e formarem um coágulo, uma vez que a coagulase é uma
proteína com atividade similar à protrombina, capaz de converter o
fibrinogênio em fibrina, que resulta na formação de um coágulo visível.
Coagulase conjugada (prova em lâmina): é também conhecida como fator
de aglutinação, encontra-se unida à parede celular bacteriana e não está
presente em filtrados de cultivos.
✔ Quando as células bacterianas são suspensas em plasma
(fibrinogênio), formam-se cordões de fibrina entre elas, o que causa
agrupamento sob a forma de grumos visíveis.
Coagulase livre (prova em tubo): é uma substância similar à trombina e
está presente em filtrados de cultivos.
É secretada extracelularmente e reage com uma substância presente no
plasma denominada Fator de Reação com a Coagulase – CRF, para formar
um complexo que, por sua vez, reage com fibrinogênio, formando fibrina
(coágulos).
Quando uma suspensão em plasma do microrganismo produtor de coagulase
é preparada em tubo de ensaio, forma-se um coágulo visível após o período
de incubação.
A) Coagulase conjugada:
✔ Positiva: formação de precipitado branco e aglutinação dos
microrganismos da suspensão, após 15 segundos, no círculo que
contém o plasma.
✔ Negativa: ausência de aglutinação no círculo que contém o plasma.
✔ Controle sem plasma: deverá ser leitoso e uniforme, sem presença de

precipitado ou aglutinação.
✔ A presença de precipitado ou aglutinação torna a prova inespecífica,
devendo ser repetida a prova em tubo.
B) Coagulase livre:
✔ Positiva: presença de qualquer grau de coágulo.
✔ Negativa: ausência de coágulo.
Prova de gelatinase: Determina a habilidade do microrganismo de produzir

enzimas proteolíticas (gelatinase) que liquefaz/hidrolisa gelatina.
✔ Positivo: emulsão de gelatina (cor verde) na porção submersa do filme
torna-se transparente (clara).
✔ Negativo: fita permanece verde, emulsão esverdeada permanece na
porção submersa do filme.
Prova de Lecitinase: Cepas produtoras de lecitinase produzem zona opaca
ao redor do inóculo.
✔ Cor original do meio: amarelo.
✔ Positivo: formação de halo branco ao redor das colônias.
✔ Negativo: ausência de halo, meio fica inalterado.
Prova de oxidase: O teste de oxidase é baseado na produção intracelular da

enzima oxidase pela bactéria.
✔ Cor original: branca ou levemente azulada. Oxidase positiva: produção
de cor roxa imediatamente no local da inoculação da bactéria.
✔ Oxidase negativa: não há mudança da cor do papel no local da
inoculação da bactéria.
✔ Não considerar alteração de cor tardia.
Fermentação de carboidratos: A fermentação de carboidratos é
amplamente utilizada para a diferenciação de gêneros e identificação de
espécies bacterianas.
A prova consiste em verificar a capacidade de o microrganismo fermentar ou
não um determinado carboidrato, permitindo assim verificar as suas
características que podem auxiliar na identificação.
✔ Positivo: crescimento bacteriano (turvação do meio) com viragem do

indicador para amarelo.
✔ Negativo: ausência de crescimento. O meio permanece com a cor
original, púrpura e sem turvação.
✔ Cor original do meio: alaranjado.
✔ Positivo: crescimento bacteriano (turvação do meio) com viragem do

indicador para amarelo.
✔ Negativo: ausência de crescimento. O meio permanece com a cor
original, alaranjado e sem turvação.
Prova PYR: teste enzimático que consiste na hidrólise do substrato L-
pyrrolidonyl-alfanaftylamide por uma enzima bacteriana, a L-pyroglutamyl-
aminopeptidase.
A hidrólise do substrato libera ßnaphtylamide, que é detectada com a adição
do reagente, o N,N dimetilaminocinamaldeído, que forma uma base de Schiff,
de coloração vermelha.
✔ Positivo: Desenvolvimento de cor vermelho cereja em 1 minuto (após
adicionar o reagente de PYR).
✔ Negativo: Sem alteração de cor (permanece amarela ou alaranjada).
Crescimento a 42 E 44°C: Verificar a capacidade de o microrganismo

crescer em altas temperaturas.
✔ Positivo: presença de turvação e viragem do indicador de cor púrpura

para amarelo = crescimento bacteriano.
✔ Negativo: ausência de turvação e permanência da cor púrpura =
ausência de crescimento bacteriano.
Teste de motilidade: Determinar se o microrganismo é ou não móvel.
✔ Motilidade positiva: organismos móveis migram pela linha do inóculo e
difundem-se no meio, causando turbidez.
✔ Motilidade negativa: bactéria tem um crescimento acentuado ao longo
da linha de inóculo, em volta continua límpido.
Prova de tolerância ao NaCl 6,5%: capacidade de alguns microrganismos
crescerem em presença do sal.
Meio base utilizado é o BHI caldo, que é um meio nutritivo de uso geral,
empregado para o cultivo de muitas bactérias.
Esse meio normalmente contém 0,5 % de NaCl e aumenta-se a concentração
para 6,5 %, tornando um meio semisseletivo para o desenvolvimento de
alguns microrganismos.
✔ Cor original do meio: amarelo ou púrpura (dependendo do uso do
indicador na composição).
✔ Positivo: Crescimento bacteriano (turvação do meio) com ou sem
viragem do indicador.
✔ Negativo: Ausência de crescimento. O meio permanece com a cor
original, púrpura e sem turvação.
❖ O que é quais são os Discos para Identificação?
Alguns antibióticos também podem ser utilizados no auxílio da identificação

de microrganismos, visto que alguns são naturalmente sensíveis ou
resistentes a diferentes antibióticos.
Bacitracina: Streptococcus beta-hemolíticos do grupo A são sensíveis a
concentrações baixas de bacitracina.
✔ Positivo (Sensível): Presença de qualquer halo ao redor do disco.
✔ Negativo (Resistente): ausência de halo ao redor do disco.
Novobiocina: Separa espécies de Staphylococcus coagulase negativas que

podem ser sensíveis ou não a Novobiocina.
✔ Resistente: Ausência de halo de inibição ou halos ≤ 15 mm.
✔ Sensível: Presença de halo de inibição ≥ 16 mm.
Optoquina: Cloridrato de etil-hidroxicupreína (optoquina), um derivado da

quinina, inibe de forma seletiva o crescimento de Streptococcus pneumoniae
em concentrações muito baixas (5 μg/mL ou menores).
As células do Streptococcus pneumoniae que rodeiam o disco sofrem lise,
devido à variação da tensão superficial, e é produzida uma área de inibição.
⮚ Positivo (Sensível):
✔ Disco de 6 mm: halo de inibição de 14 mm ou mais.

✔ Disco de 10 mm: halo de inibição de 16 mm ou mais.
⮚ Negativo (Resistente):
✔ Disco de 6 mm: halo de inibição inferior à 14 mm ou ausência de halo.
✔ Disco de 10 mm: halo de inibição inferior à 16 mm ou ausência de halo.
❖ Semeadura dos diversos materiais biológicos destinados à cultura

– Hemocultura
Vários tipos de amostras biológicas podem ser semeados em meios de
cultura visando à identificação do agente etiológico de diversas patologias
causadas por microrganismos.
Hemocultura: Técnica microbiológica para cultura de sangue.
Utilizada quando há suspeita de infecção na corrente sanguínea (bacteremia,
fungemia, sepse).
A coleta de sangue para a realização de hemocultura apresenta algumas
particularidades:
✔ Volume de sangue: adultos - 20 a 30 mL por amostra;
✔ Volume de sangue: crianças - não mais do que 1% do volume total de

sangue (calculado a partir do peso da criança).
Quando o volume coletado for inferior ao recomendado, o sangue deve ser
inoculado na garrafa aeróbica e o que restar deve ser inoculado na
anaeróbica.
Amostras transportadas para o laboratório, no máximo, duas horas.
✔ Nunca devem ser refrigeradas ou congeladas, pois temperaturas
baixas podem inviabilizar alguns microrganismos e sim em temperatura
ambiente.
Segundo ANVISA, os fatores que influenciam os resultados de hemocultura:
são o volume de sangue coletado (10% do volume total do frasco) e o método
de antissepsia.

- Procedimentos de Hemocultura
Antissépticos são usados previamente à coleta de hemoculturas: álcool 70%,
tintura de iodo, povidine e clorexidina (mais adequada para finalizar
antissepsia final da pele na hemocultura).
Frasco de hemocultura, garrote, seringa e agulha de coleta, gaze, luva
esterilizada, álcool etílico ou isopropílico a 70%.
A coleta fechada de hemocultura, com o uso de escalpe e adaptador para
coleta de sangue a vácuo, torna o procedimento mais seguro e diminui os
riscos de acidente com perfurocortantes.
I. Antes da coleta da hemocultura: inspecionar todas as garrafas;
II. Preparar o sítio de punção: realizar a antissepsia (álcool 70%
seguido de PVPI, clorexidina ou outra etapa com álcool 70% em
pacientes alérgicos), com movimentos circulares, do centro para a
periferia;
III. Preparar as garrafas: álcool 70% e secagem natural; marcar na
etiqueta o nível de preenchimento de sangue;
IV. Coletar o sangue: preparar o kit de coleta de sangue;
IV. Selecionar a garrafa aeróbia na posição vertical; ajustar e
pressionar o adaptador para perfurá-la; coletar o volume de sangue;
monitorar o volume e o fluxo de sangue;
V. Remover o adaptador da garrafa; assim que o último frasco for
preenchido, retirar a agulha do braço do paciente; cobrir o sítio da
punção com gaze e pressionar levemente; ativar o dispositivo de
segurança do escalpe.
VI. Identificação dos frascos: não escrever ou colar etiquetas sobre o
código de barras que é utilizado como instrumento para reconhecer
a garrafa;
VII. Descarte: descartar o kit de coleta com segurança, de acordo com
regulamentações locais.
VIII. Culturas adicionais podem ser colhidas do mesmo modo; locais de
punção diferentes devem ser utilizados para cada hemocultura
coletada. A coleta de sangue para a hemocultura deve ser realizada
antes da administração de antibióticos.
Caso não seja possível deve ser no momento anterior à administração da
próxima dose da medicação.
Realizar a coleta no início de um episódio febril, é o momento de maior
destruição microbiana.
Pode interferir na recuperação de microrganismos viáveis na hemocultura.
Em relação à investigação laboratorial, é recomendado que se realize a
coloração de Gram e a semeadura nos meios ágar chocolate, ágar
sangue e ágar MacConkey.
Caso tenha sido colhido um frasco para micobactérias, deve-se realizar
também a coloração de Ziehl-Neelsen

– Urinocultura
A amostra de urina deve ser coletada com todos os cuidados de higiene, para
minimizar a ocorrência de contaminação.
Devem ser semeadas com uma alça calibrada de 10 μL em ágar CLED ou
ágar MacConkey e ágar sangue.
Se a contagem for muito elevada, ou suspeita de infecção mista, pode-se
utilizar a alça de 1 μL.
Caso haja solicitação de bacterioscopia: confecção de uma lâmina seguida
pela coloração de Gram e análise ao microscópio.
Casos de investigação de tuberculose: primeira urina da manhã deve
passar por um processo de descontaminação antes de ser semeada.

- Coprocultura
Amostra de fezes deve ser colhida no início da fase aguda da doença e antes
de se iniciar a antibioticoterapia.
O transporte deve ser realizado em meio de transporte Cary Blair ou salina
glicerinada tamponada.
Entregar a amostra em até uma hora ou conservada sobre refrigeração (a
4ºC) por no máximo 12 horas.
Também é possível realizar a coleta através de um swab retal.
A amostra de fezes pode ser semeada em caldo enriquecedor do tipo
Selenito, Tetrationato, etc.

- Cultura de Secreções
Vários tipos de secreções são utilizados para investigação microbiológica:

secreção traqueal, de orofaringe, de ouvido, ocular, de material urogenital
(uretral, cervical, vaginal), anal...
A coleta é realizada por profissionais treinados, evitando intercorrências e

garantindo a qualidade da amostra.
Micobactérias: escarro, urina, aspirado gástrico, lavado brônquio-alveolar e

fezes:
✔ Conservadas em geladeira ou descontaminadas antes de proceder
com a semeadura em meio Lowenstein Jensen.
Trichomonas: secreção vaginal deve ser examinada a fresco e a urina deve
ser centrifugada.
Neisseria gonorrhoeae: utilizar apenas o Ágar- Chocolate; se necessário
melhorar o isolamento, semear material uretral e endocervical em meio
seletivo como Thayer Martin.
✔ Secreção prostática é especial, o material é escasso, ainda ocorre a
contaminação uretral.
✔ Deve ser semeado o mais rápido possível após a coleta, utilizando alça
calibrada 10 μL.
✔ UFC/mL (multiplicando por 100 o número de colônias significativas do
mesmo microrganismo), assim como nas uroculturas.
✔ Materiais escassos são colhidos com swab em meio de transporte:
material de vesículas, swab de córnea ou conjuntiva, uretral...
✔ Diretamente semeado no meio de cultura;
✔ Tentar concentrar o material colocando o swab em tubo estéril com 0,5

mL de salina estéril, seguido de centrifugação e separação do
sedimento.

- S. Orofaringe / S. Vaginal
Coleta de secreção de orofaringe:
✔ Solicitar ao paciente que abra bem a boca.
✔ Raspar a mucosa com swab sobre as amígdalas e faringe posterior,

usando abaixador de língua.
✔ Evitar tocar na língua e na mucosa bucal.
✔ Procurar o material nas áreas com hiperemia ou remover o pus ou a

placa, coletando o material abaixo da placa.
✔ Coletar a amostra exatamente na área inflamada, evitando outros sítios
na cavidade oral.
✔ Coletar dois swabs, um para confecção imediata da lâmina de
bacterioscopia
Coleta de material urogenital: Secreção vaginal
✔ Higienização da genitália externa com água e sabão neutro.
✔ Inserir um espéculo (sem lubrificante, usar somente água morna) na

vagina.
✔ Retirar o excesso de muco cervical com swab de algodão.
✔ Inserir os swabs indicados, rodar por alguns segundos sobre o fundo
do saco, retirar e voltar aos meios indicados: meio de Stuart para
bactérias e fungos.
✔ Utilizar o caldo ToddHewit para pesquisa de S. agalactiae de amostra
do intróito vaginal.
✔ Swab seco: realizar as lâminas para bacterioscopia da secreção fresca.

- S. Endocervical / S. Uretral / Espermocultura
Secreção endocervical:
Inserir um espéculo na vagina e retirar o excesso de muco cervical com swab
de algodão.
Inserir os swabs indicados no canal endocervical até a ponta do swab não ser
mais visível.
Rodar por alguns segundos, retirar evitando o contato com a parede vaginal e
voltar aos meios indicados:
- Mycoplasma/Ureaplasma: mergulhar o swab dentro da solução do tubo
fornecido e agitar. Remover o swab e identificar o tubo.
- Swab do meio de transporte específico para Chlamydia trachomatis:
mergulhar o swab dentro da solução do tubo fornecido e agitar
vigorosamente. Comprimí-lo contra a parede do tubo. Qualquer excesso de
muco deve ser retirado da amostra. Remover o swab e identificar o tubo.
✔ Swab para inserir no meio de transporte de Stuart para cultura de
N.gonorrhoeae.
✔ Swab seco: realizar as lâminas para bacterioscopia da secreção fresca.
Secreção uretral:
✔ Desprezar as primeiras gotas da secreção.
✔ Coletar a secreção purulenta, de preferência pela manhã, antes da

primeira micção ou pelo menos duas horas ou mais sem ter urinado.
✔ Coletar com alça bacteriológica descartável ou swab estéril fino.
✔ Colocar a amostra em meio de transporte (Stuart) e realizar as lâminas

para bacterioscopia da secreção fresca.
✔ Encaminhar imediatamente ao laboratório.
✔ Em pacientes assintomáticos, deve-se coletar a amostra através de
massagem prostática ou com pequeno swab inserido alguns
centímetros na uretra.
Obs: o sucesso da cultura depende da rapidez na entrega da amostra.
Espermocultura:
Microrganismos patogênicos no sêmen: Neisseria gonorrhoeae, Gardnerella
vaginalis, Escherichia coli, espécies de Enterobacter, Klebsiella, Proteus,
Serratia e Enterococcus.
✔ Coleta da amostra não exige abstinência sexual.
✔ Caso haja solicitação para exame de urina, a amostra deve ser colhida
primeiro.
✔ Cultura quantitativa nos meios ágar sangue, ágar chocolate e Thayer
Martin.
✔ Também é realizada a contagem de leucócitos e eritrócitos: quando
elevada é associada a processos inflamatórios.

- Fluídos Corporais/Líquidos Biológicos - LCR/ PL
Fluídos Corporais/Líquidos Biológicos: Líquidos intracelulares (LIC) e
líquidos extracelulares (LEC).
Secreções: urina, saliva, suor, sêmen, lágrimas e leite materno;
Líquidos corporais e cavitários: líquido cefalorraquidiano (LCR), líquido
sinovial, líquido amniótico;
Fluidos serosos: líquido pleural, fluido pericárdico e líquido peritoneal ou
ascético. Líquido cefalorraquidiano (LCR)/ Líquor: Límpido e incolor
encontrado no cérebro e na medula espinhal.
Produzido por células ependimárias especializadas nos plexos coroides dos
ventrículos cerebrais e absorvido nas granulações aracnoides.
O volume de aproximadamente 125mL e gerados cerca de 500 mL por dia.
Proteção Mecânica e imunológica ao cérebro e função vital na autorregulação
do fluxo sanguíneo cerebral.
Ocupa o espaço subaracnóideo (entre a aracnoide e a pia-máter) e o sistema
ventricular em torno e dentro do cérebro e da medula espinhal.
Preenche os ventrículos cerebrais, cisternas e sulcos e canal central da
medula espinhal.
Conexão espaço subaracnóideo com labirinto ósseo do ouvido interno através
do ducto perilinfático que é contínua com o líquido cefalorraquidiano.
Punção lombar:
Diagnóstico de uma variedade de doenças neurológicas.
Realizada em condições estéreis, inserindo uma agulha no espaço
subaracnóideo, entre a terceira e a quarta vértebra lombar. Efeitos colaterais:
um terço das pessoas dor de cabeça após a punção lombar, e dor ou
desconforto no local de entrada da agulha. ← Complicações raras podem
incluir hematomas, meningite ou vazamento contínuo do LCR. Contagem de
células e determinação das concentrações de glicose e proteína ou de acordo
com a suspeita diagnóstica.
✔ Semeadura dos diversos materiais biológicos destinados à cultura

- Fluídos Corporais/Líquidos Biológicos -
Pressão/Citologia/Microbiologia e Imunologia
Pressão:
Aumento da pressão no LCR: insuficiência cardíaca congestiva, edema

cerebral, hemorragia subaracnóidea, hipo-osmolaridade resultante de
hemodiálise, inflamação meníngea, meningite purulenta ou meningite
tuberculosa, hidrocefalia ou pseudotumor cerebral.
✔ Punção lombar com finalidade terapêutica.
Diminuição da pressão no LCR: bloqueio subaracnóideo completo,

vazamento de líquido espinhal, desidratação grave, hiperosmolalidade ou
colapso circulatório (choque).
Alterações: podem indicar tumores ou obstrução da coluna vertebral,
resultando em um grande acúmulo de LCR ou hidrocefalia associada a
grandes volumes de LCR.
Citologia: Presença de leucócitos no LCR é chamada pleocitose.
✔ Monócitos pode ser normal, mas granulócitos é anormal e associada à
meningite bacteriana.
✔ Pode ser reação a punções lombares repetidas, injeções anteriores de
medicamentos ou corantes, hemorragia do sistema nervoso central,
leucemia, convulsão epiléptica recente ou tumor metastático.
✔ Quando o sangue periférico contamina a amostra: leucócitos e
hemácias estarão presentes, e sua proporção será a mesma que do
SP.
✔ Eritrofagocitose (eritrócitos fagocitados): significa uma hemorragia
no LCR que precedeu a punção lombar, como hemorragia
intracraniana e encefalite herpética hemorrágica.
✔ A contagem é realizada em câmara de Fuchs-Rosenthal.
Microbiologia e Imunologia: Vários procedimentos, como esfregaços
seguidos de colorações e culturas microbiológicas.
✔ Exemplo: Meningite bacteriana a coloração de Gram pode ser usada,
mas a cultura microbiológica é o padrão-ouro para o diagnóstico desta
patologia.
✔ Reação em cadeia da polimerase (PCR): avanço no diagnóstico tipos
de meningite, como por herpesvírus e enterovírus.
✔ Alta sensibilidade e especificidade para infecções do SNC, método
rápido que pode ser feito com pequenos volumes de LCR.
✔ Teste caro, mas o emprego em pacientes neonatais demonstra uma
economia devido ao custo reduzido de hospitalização. Imunoensaios
foram desenvolvidos:
✔ Testes rápidos: para antígenos de patógenos bacterianos comuns.
✔ Testes treponêmicos: para o diagnóstico de neurossífilis.
✔ Tinta da China (Nanquim) ainda é usada para a detecção de meningite

causada pelo fungo Cryptococcus neoformans, mas o teste do
antígeno criptocócico (CrAg) tem uma sensibilidade mais alta.
Bioquímica: Substâncias encontradas no LCR com finalidade diagnóstica
Glicose (glicorraquia): níveis de aproximadamente 60% da glicemia.
✔ Punção digital ou punção venosa no momento da PL: avaliar os níveis
plasmáticos de glicose e determinar um valor previsto de glicorraquia.
✔ Níveis reduzidos de glicose (hipoglicorraquia): infecções
bacterianas, fúngicas, ou tuberculosas, além hipoglicemia.
✔ Glicorraquia inferior a um terço dos níveis de glicemia em associação a
baixos níveis de lactato no LCR: deficiência hereditária do
transportador de glicose (GLUT1) doença De Vivo, ou síndrome de
deficiência GLUT1.
✔ Níveis elevados de glicose no LCR (hiperglicorraquia): diabetes,
embora a regra de 60% ainda se aplique.
✔ Níveis elevados de glutamina: nencefalopatias hepáticas, síndrome
de Reye, coma hepático, cirrose, hipercapnia (aumento de CO2 no
sangue) e depressão.
✔ Níveis elevados de lactato: na presença de câncer do SNC,
esclerose múltipla, doença mitocondrial hereditária, hipotensão arterial,
fósforo sérico baixo, alcalose respiratória, convulsões idiopáticas, lesão
cerebral traumática, isquemia cerebral, abscesso cerebral, hidrocefalia,
hipocapnia e meningite bacteriana ou fúngica.
✔ A atividade lactato desidrogenase (LDH): distinguir meningites de
origem bacteriana, associadas a altos níveis da enzima que é baixa ou
ausente.
✔ Alterações níveis de proteínas totais do LCR: permeabilidade
patologicamente aumentada da barreira hematoencefálica, obstruções
da circulação do LCR, meningite, neurossífilis, abscessos cerebrais,
hemorragia subaracnóidea, poliomielite, doença de colágeno ou
síndrome de Guillain-Barré, vazamento de LCR, aumentos na pressão
intracraniana ou hipertireoidismo.
✔ Níveis muito altos: meningite tuberculosa ou bloqueio espinhal.
Ausência de infecções: Límpido Bacteriana: Amarelado e turvo Viral:
Límpido Tuberculosa: Amarelado e viscoso Fúngica: Amarelado e
viscoso

- Fluídos Corporais/Líquidos Biológicos - Meningite
Uma das principais infecções do SNC: Inflamação aguda das meninges,
membranas que recobrem e protegem o cérebro e a medula espinhal.
Sintomas: dor de cabeça, febre e rigidez no pescoço. Outros incluem
confusão ou consciência alterada, vômito e incapacidade de tolerar ruídos
leves ou altos.
Crianças exibem apenas sintomas inespecíficos: irritabilidade, sonolência ou
má alimentação. Causada por bactérias, vírus ou outros microrganismos:
Ocorre próxima ao cérebro e medula espinhal, pode ser fatal, classificada
como uma emergência médica.
Uma amostra de LCR, coletada por punção lombar, pode ser usada para
diagnosticar ou excluir a meningite.

- Fluídos Corporais/Líquidos Biológicos - Sêmen
Composto por espermatozoides, fluido seminal, fluido prostático e das
glândulas bulbouretrais.
Contém frutose, utilizada pelos espermatozoides como fonte de energia, e a
carência ocasiona a falta de motilidade na análise do sêmen.
A opalescência esbranquiçada devido alta quantidade de proteína e aparência
levemente turva relacionada à presença de espermatozoides.
Coleta realizada por masturbação após 2 a 5 dias de abstinência sexual.
Mais de 5 dias aumenta o volume da amostra e diminui motilidade dos
espermatozoides.
Preferencialmente em laboratório ou entregue em no máximo em 1 hora em
temperatura ambiente.
Manter temperatura de 37°C (em estufa) até o momento da análise. Análise
do sêmen/"espermograma": avalia características da amostra e dos
espermatozoides contidos nela.
Fertilidade masculina ou confirmar o sucesso de uma vasectomia.
Análise macroscópica e microscópica são avaliados os seguintes
parâmetros: volume, aspecto, liquefação, viscosidade, pH, concentração e
contagem espermática, morfologia e motilidade
Volume: 2 a 5 mL. Todo o volume do ejaculado deve ser coletado para a
realização do espermograma.
✔ Volumes maiores: longos períodos de abstinência sexual;
✔ Volumes menores: associados à infertilidade.
Aspecto: branco acinzentado, pouco translúcido e com odor rançoso

característico.
O aumento da turbidez: presença de leucócitos (teste da esterase
leucocitária da tira reagente de urina para confirmação).
✔ Coloração avermelhada: presença de hemácias;
✔ Coloração amarelada: após longos períodos de abstinência sexual.
Liquefação: o registro da hora da coleta é fundamental, o sêmen fresco tem

aspecto coagulado e sofre liquefação dentro de um intervalo de 30 minutos a
1 hora.
✔ Análise deve ser iniciada logo após a liquefação.
✔ Se após 2 horas a liquefação não ocorrer espontaneamente (falha

relacionada à deficiência de enzimas prostáticas): adicionar enzimas
proteolíticas como alfaquimotripsina.
Viscosidade: permite que a amostra seja facilmente aspirada com uma
pipeta e deve formar gotículas separadas.
✔ Forma um fino filete (com até 2 cm).
✔ Amostras viscosas ou com liquefação incompleta interferem na

motilidade dos espermatozoides. pH: ligeiramente alcalino 7,2 a 8,0.
O aumento do pH: relacionado com infecções do trato reprodutivo;
✔ Diminuição: associa a um aumento da concentração de fluido
prostático.
Concentração de espermatozoides: concentração superior a 20 milhões de
espermatozoides por mililitro e uma contagem total de espermatozoides
superior a 40 milhões por ejaculado.
✔ Câmara de Neubauer, após diluição da amostra: contém bicarbonato
de sódio e formol, e irá imobilizar os espermatozoides, possibilitando a
contagem.
Morfologia: cabeça em formato oval (cerca de 5 μm de comprimento e 3 μm
de largura) e uma cauda longa (aproximadamente 45 μm de comprimento).
Avaliar pelo menos 200 espermatozoides e a porcentagem de
espermatozoides normais. Motilidade dentro de uma hora após a coleta da
amostra de sêmen.
Avaliada pela velocidade e pela direção do movimento.
Classificados em uma escala de 0 a 4: sendo 0 (zero) os espermatozoides
que não se movimentam e como 4 os que se movimentam rapidamente e em
linha reta.
Normal: 50% dos espermatozoides se movimentam em pelo menos grau 2. O
sêmen possui altas concentrações de fosfatase ácida: avaliação da presença
de sêmen em uma amostra, aplicabilidade em investigações de crimes
sexuais, por exemplo.
Reagente fenolftaleína bifosfato tetrassódio: revelar uma coloração
avermelhada na presença da fosfatase ácida e, possivelmente, de sêmen.

- Fluídos Corporais/Líquidos Biológicos - Liquído Sinovial
Líquido viscoso localizado nas cavidades das articulações sinoviais.
Consistência semelhante à clara de ovo e sua principal função é: reduzir o
atrito entre a cartilagem articular das articulações sinoviais durante o
movimento.
Alterações estão associadas a distúrbios articulares, como artrite reumatoide
e gota.
Amostra pode ser coletada por seringa em um procedimento denominado
artrocentese/aspiração articular.
Normal, não inflamatório, inflamatório, séptico e hemorrágico. Avaliação
realizada por parâmetros para uma amostra normal:
✔ Cor: incolor a amarelo pálido;
✔ Aspecto: límpido;
✔ pH: 7 a 7,8;
✔ Viscosidade: capaz de formar um filamento de 4-6 cm de comprimento;
✔ Leucócitos: < 200 por μL;
✔ Neutrófilos: < 25% do diferencial;

✔ Cristais: nenhum (cristais de urato monossódico são encontrados em
pacientes com gota);
✔ Glicose: < 10 mg/dL menor que a glicemia;
✔ Proteína total: < 3g/Dl.
Teste de coagulação da mucina: Ácido hialurônico: função de lubrificar as

articulações e sua polimerização confere viscosidade ao LS. Adicionada uma
solução de ácido acético de 2 a 5% LS, que deve formar um coágulo sólido,
rodeado por um fluido claro.
✔ Bom (coágulo sólido), razoável (coágulo frouxo), baixo (coágulo friável)
e pobre (sem coágulo).

- Fluídos Corporais/Líquidos Biológicos - Liquído Pleural
Pequenas quantidades entre a membrana pleural parietal da parede torácica
e membrana pleural visceral que cobre o pulmão: derivado do filtrado
plasmático a partir de capilares sanguíneos dos pulmões.
Função lubrificante para o movimento de inspiração e expiração dos pulmões.
Acúmulo excessivo LP: derrame pleural causado por diversas patologias.
✔ De origem exsudatos: desenvolvem por doenças inflamatórias,
infecciosas ou neoplásicas ou
✔ De origem transudatos: ocorrem por processos não inflamatórios.
Coleta pelo procedimento de toracocentese: punção com agulha fina do

espaço pleural, por via transparietal.
Análise laboratorial: exame físico macroscópico, bioquímico, citológico e
microbiológico.
Análise macroscópica: LP transparente ou amarelo pálido na ausência de
patologias.
✔ Amostra com turbidez indica infecções bacterianas, tuberculose ou
distúrbio imunológico.
✔ Amostra sanguinolenta indicativo de hemotórax, derrame hemorrágico,
embolia pulmonar, tuberculose e neoplasia.
Análise citológica: contagem global de células, contagem diferencial de
leucócitos e citologia oncótica.
Tipos celulares mais frequentes nas amostras: eritrócitos e as células
nucleadas, incluem os leucócitos e as células mesoteliais.
✔ Encontro significativo de neutrófilos: há uma infecção bacteriana.
✔ Encontro de linfócitos: sugestiva de tuberculose, neoplasia ou
infecções virais.
Dosagens bioquímicas: Os exames de glicose, pH, adenosina deaminase
(ADA) e amilase.
✔ Redução nos níveis de glicose: indicar tuberculose, inflamação
reumatoide e neoplasia.
✔ Valores acima de 40 U/L de ADA são indicativos de tuberculose.
✔ Amilase elevada significa presença de pancreatite.
✔ E pH baixo se relaciona com tuberculose, neoplasia e ruptura

esofágica.
Exames microbiológicos: Quando clinicamente indicados, os exames de
cultura (micobactérias, bactérias aeróbicas e anaeróbias), coloração de Gram
e para Bacilos Álcool-Ácido Resistentes (BAAR).

- Fluídos Corporais/Líquidos Biológicos - Liquído Pericárdico
Entre as membranas serosas do pericárdio: pequena quantidade no
organismo;
Função de lubrificar as membranas que o envolvem, amortecendo e
permitindo movimentos de sístole e diástole cardíaca.
Aumento LP: inflamações (pericardites), neoplasias, traumas, distúrbios
metabólicos (como uremia e hipotireoidismo) e doenças autoimunes.
✔ Pode ocasionar compressão do coração (tamponamento) e evoluir
para parada cardíaca.
✔ Coleta realizada pelo procedimento médico pericardiocentese.
Análise laboratorial: transparente e amarelo-claro. Na presença de

infecções e neoplasias, encontra-se turvo.
Distúrbios metabólicos: o líquido aspirado é transparente. Diagnóstico
da causa do excesso deste líquido no organismo e distinção entre
transudato e exsudato.
Citometria completa: contagem diferencial de leucócitos, citologia,
exames de microbiologia (Gram, cultura, pesquisa de BAAR), glicose, pH
e ADA. Inclui as relações de proteínas e de desidrogenase lática entre o
líquido e o soro.
✔ Valores elevados de leucócitos indicam infecção: endocardite
bacteriana;
✔ Valores baixos de glicose indicam infecção bacteriana e neoplasia.
- Fluídos Corporais/Líquidos Biológicos - Liquído Ascítico
Entre as membranas do peritônio (revestem o abdome e todos os órgãos
internos)
Ascite para o acúmulo patológico deste líquido:
Função é proteção da cavidade abdominal; irrigação e lubrificação, reduzindo
o atrito entre os diferentes órgãos, possui cerca de 50 mL LA.
Coleta realizada pelo procedimento de paracentese abdominal:
transparente e amarelo-claro.
✔ Peritonite, infecções ou até mesmo cirrose, seu aspecto é turvo.
✔ Cor verde ou marrom-escuro: presença de bile.
✔ Amostra sanguinolenta: indica trauma, tuberculose, doenças intestinais

e neoplasias.
Análise laboratorial: análise macroscópica do líquido, citometria completa,
contagem diferencial de leucócitos e citologia.
✔ Valores elevados hemácias: indica traumatismo hemorrágico.
✔ Numerosos leucócitos: indica cirrose e peritonite bacteriana.
Análise química: principalmente glicose, amilase e fosfatase alcalina.

✔ Índices baixos de glicose: peritonite tuberculosa e neoplasia.
✔ Elevação de amilase: indica quadros de pancreatite ou perfuração

gastrintestinal.
✔ Elevação da fosfatase alcalina: quadros de perfuração intestinal.
✔ Os analitos ureia e creatinina podem ser solicitados: suspeita de

ruptura vesical ou punção acidental da bexiga.
Exames microbiológicos: culturas para micobactérias, bactérias aeróbicas e
anaeróbias, bacterioscopia e pesquisa de BAAR.

- Fluídos Corporais/Líquidos Biológicos - Exsudatos e
Transudatos
Exsudato é fluido liberado pelo organismo através dos poros ou de uma lesão:
forma de um líquido claro ou se assemelhar ao pus.
✔ Lesão na pele: extravasa dos vasos sanguíneos para os tecidos
adjacentes.
✔ Composto por soro, leucócitos e fibrina e pode ser liberado a partir
lesões ou ainda de regiões com algum tipo de infecção ou inflamação.
Transudato é um fluido extravascular que apresenta baixo teor proteico, mais
claros, baixa gravidade específica (<1,012) e baixa contagem de células
nucleadas (<500 a 1000/microlitro).
✔ Células mononucleares: macrófagos, linfócitos e células mesoteliais.
✔ Aumento da pressão hidrostática ou da diminuição da pressão oncótica

no plasma, considerado como um ultrafiltrado do plasma sanguíneo.
Diferenciação laboratorial: determinação da gravidade específica do fluido,
que se relaciona com o conteúdo proteico da amostra.
✔ Quanto maior a gravidade específica, maior a probabilidade de
alterações da permeabilidade capilar em relação às cavidades
corporais.
✔ Geralmente, o transudato apresenta uma gravidade específica <1,012
e uma concentração de proteínas <2 g/100 mL (2g%).
✔ Os níveis de lactato desidrogenase (LDH) ou o teste de Rivalta (que é
positivo na presença de altas concentrações de proteína, fibrina e
mediadores inflamatórios): diferenciação entre transudatos e
exsudatos.

- Fluídos Corporais/Líquidos Biológicos - Identificação da
Microbiologia Oral / TSA
Identificação da Microbiologia Oral: Microbiota da cavidade oral e suas
interações com o hospedeiro, favorece o crescimento de microrganismos: rico
em nutrientes e água e oferecer condições adequadas de temperatura.
Adere às gengivas e aos dentes para não ser deslocada pelo tubo digestivo
até o estômago, onde seria destruída pelo ácido estomacal
Bactérias anaeróbicas e Fungos que vivem na cavidade oral.
Papel no desenvolvimento de duas principais doenças dentárias: cárie
dentária e doença periodontal.
✔ Correlação entre a saúde bucal precária e a capacidade da microbiota
bucal de invadir o corpo e causar doenças cardíacas e afetar a função
cognitiva.
Teste de sensibilidade aos antimicrobianos (TSA):
Antibiograma: forma de avaliar a sensibilidade de um microrganismo a
determinados antimicrobianos.
Prática clínica: antibióticos são prescritos com mais frequência com base em
diretrizes gerais e no conhecimento prévio sobre a sensibilidade de
microrganismos mais comuns.
✔ Ex: infecções do trato urinário (ITUs) não complicadas podem ser
tratadas com quinolona de primeira geração, porque Escherichia coli,
que é o patógeno causador mais provável, é sabidamente sensível ao
tratamento com quinolona.
Muitas bactérias são conhecidas por serem resistentes a várias classes de
antibióticos, e o tratamento nesses casos pode não ser tão simples. Realizado
para determinar qual antibiótico terá mais sucesso no tratamento de uma
infecção bacteriana in vivo.
Método de Kirby-Bauer: difusão em disco e oferece um resultado qualitativo
ou semiquantitativo.
✔ Discos de papel pequenos contendo antibióticos diferentes são
colocados em uma placa de Petri na qual os microrganismos foram
anteriormente inoculados (cerca de 5 minutos antes), sendo o ágar
Müeller-Hinton.
✔ Incubar a placa por 18 horas a 35C em uma estufa bacteriológica.
✔ O antibiótico difunde-se na área ao redor de cada disco e um halo de

inibição (evidenciando lise bacteriana) se formará ao redor do disco se
o microrganismo for sensível ao antibiótico. Este halo deve ser medido
em milímetros.
✔ A concentração do antibiótico é mais alta no centro e mais baixa na
borda dessa zona, o diâmetro do halo é sugestivo da concentração
inibitória mínima (CIM), que é inversamente proporcional à medida do
halo de inibição.
✔ Os antimicrobianos utilizados no antibiograma devem ser escolhidos
segundo recomendação do Clinical and Laboratory Standards Institute
(CLSI) cada antibiótico tem um valor de sensibilidade pré-definido.
❖ Equipamentos de Laboratório.
❖ Microscópio óptico: é um tipo de microscópio que usa luz visível e um

sistema de lentes para ampliar imagens de objetos pequenos.
Oculares: cilindro que contém duas ou mais lentes inseridas na extremidade
superior do tubo do corpo. Sua função é focar a imagem no olho. Os valores
mais comuns de ampliação para oculares são 5 × e 10 ×.
Tubo: Estrutura que dá suporte ao sistema de lentes oculares.
Revólver: parte giratória que contém o conjunto de lentes objetivas. Permite
ao usuário alternar entre as lentes objetivas.
Objetivas: na extremidade inferior de um microscópio óptico existe uma ou
mais lentes objetivas (normalmente três) que permitem ampliar a imagem do
objeto 10x, 40x, 50x, 90x ou 100x. Elas são parafusadas em um revólver
circular que pode ser girado para selecionar a lente objetiva necessária. A
objetiva de 100x é denominada objetiva de imersão, pois é necessário
adicionar uma gota de óleo de imersão para observar a amostra através dela.
Platina: plataforma abaixo da lente objetiva que suporta a amostra sendo
visualizada. No centro da platina há um orifício através do qual a luz passa
para iluminar a amostra.
Macrométrio e micrométrio: Os parafusos de ajuste movem a platina para
cima e para baixo para um ajuste de foco grosseiro (macrométrio) e fino
(micrométrio).
Fonte de luz (lâmpada): A maioria dos microscópios possui sua própria fonte
de luz ajustável e controlável (geralmente uma lâmpada de halogênio),
embora a iluminação usando LEDs e lasers estejam se tornando mais
comum.
Condensador: lente projetada para focalizar a luz da fonte de iluminação na
amostra. O condensador também pode incluir outros recursos, como
diafragma e/ou filtros, para gerenciar a qualidade e a intensidade da
iluminação.
Charriot: Peça acoplada à platina que permite a movimentação da lâmina.
Braço (coluna): elemento fixo à base do microscópio e tem como função dar
suporte aos outros elementos]
Botão liga/desliga: permite ligar e desligar a lâmpada. Geralmente se
localiza na base do microscópio.
As lentes objetivas acromáticas são mais simples e mais baratas. Elas não
apresentam nenhuma sofisticação e corrigem as aberrações no comprimento
de onda do vermelho e do azul.
As lentes apocromáticas apresentam uma ampla correção, pois abrangem
todo o espectro de luz.
As análises microscópicas podem ser realizadas de duas formas:
Método imediato: realizado com material fresco (geralmente uma amostra
em meio líquido) para observação de estruturas in vivo. Alternativamente,
pode-se fazer uso de corantes supravitais, que facilitam a observação de
algumas estruturas.
Método mediato: realizado com material permanente, após fixação e
coloração. Os materiais fixados apresentam longo tempo de vida útil, por isso
dizemos que são técnicas histológicas permanentes. Requer uso de corantes
e equipamentos específicos, o que eleva o custo da técnica.
É importante conhecer as recomendações gerais para o uso de microscópios.
Segue abaixo um passo a passo sobre como manusear este equipamento:
As soluções mais indicadas para a limpeza das lentes do microscópio são o
álcool-éter ou o éterclorofórmio.
❖ Estereomicroscópio: é uma variante do microscópio óptico. Ele foi
projetado para a observação de amostras com baixa ampliação,
geralmente usando uma luz refletida na superfície de um objeto em vez de
transmitida através dele.
O instrumento usa dois caminhos ópticos separados com duas objetivas e
oculares para fornecer ângulos de visão ligeiramente diferentes para os olhos
esquerdo e direito. Este arranjo produz uma visualização tridimensional da
amostra que está sendo examinada.
Ao contrário de um microscópio óptico, geralmente usa iluminação
episcópica (superfície) em vez de iluminação diascópica (contorno). Em
outras palavras, ele usa a luz refletida de cima para baixo (na superfície de
um objeto) em vez da luz transmitida de baixo para cima (através de um
objeto).
❖ O uso de luz refletida no objeto permite a análise de espécimes que
seriam muito espessos ou opacos para microscopia de óptica.
Alguns estereomicroscópios também são capazes de usar luz transmitida de
baixo para cima, normalmente gerada por uma lâmpada ou espelho localizado
por baixo de um suporte transparente onde o objeto é apoiado. Contudo, não
é focalizada por um condensador na maioria dos sistemas.
❖Microscopia confocal: é um tipo especializado de microscopia de

fluorescência que usa componentes ópticos específicos para gerar imagens
de alta resolução de materiais marcados com sondas fluorescentes. Ela foi
desenvolvida para superar as desvantagens da microscopia de fluorescência
(baixa resolução e perda da fluorescência com o tempo).
Dessa forma, a microscopia confocal é uma variação da microscopia de
fluorescência, com duas modificações principais: 1. Usa uma luz de laser ao
invés de uma lâmpada de mercúrio como fonte de luz; 2. As imagens são
obtidas com uma câmera digital com um orifício chamado pinhole, que
permite que apenas a luz de um plano focal seja focalizada na câmera digital.
Funcionamento do microscópio confocal:
1. O laser se focaliza uma região pequena do espécime. A sonda
fluorescente no espécime confere fluorescência que é capturada pela
câmera digital.
2. Usando dois espelhos rotatórios, o laser se focaliza na próxima região
do espécime e a fluorescência é capturada pela câmera digital.
3. O laser escaneia toda a superfície do espécime e imagens de cada
campo são obtidas.
4. Um software combina todas as imagens obtidas em uma única imagem
nítida.
Como o laser realiza um escaneamento ao longo da superfície do espécime,
o microscópio confocal também é chamado de microscópio confocal de
varredura a laser.
O microscópio confocal também é usado para gerar imagens em 3D. Como o
pinhole permite a passagem da luz de apenas um plano focal, imagens de
diferentes planos focais podem ser obtidas e compiladas em uma imagem 3D
usando um software.
❖ Microscopia eletrônica: (electron microscopy - EM) é uma técnica de

obtenção de imagens de alta resolução de espécimes biológicos e não
biológicos. É usada para investigar a estrutura detalhada de tecidos,
células, organelas e macromoléculas.
A alta resolução das imagens geradas por microscopia eletrônica resulta do
uso de elétrons (que têm comprimentos de onda muito curtos) como fonte de
radiação luminosa (em vez de um feixe de luz, como na microscopia ótica).
É usada em conjunto com uma variedade de técnicas auxiliares - como
microtomia, imunomarcação, coloração negativa - para atender a diferentes
necessidades. Existem dois tipos principais de microscópio eletrônico:
Microscópio eletrônico de transmissão: é usado para visualizar espécimes
muito finos (como seções de tecido, moléculas, etc.) através dos quais os
elétrons podem passar gerando uma imagem projetada. Em muitos aspectos,
o TEM é semelhante ao microscópio óptico convencional.
Ele produz imagens bidimensionais de um espécime através de uma seção
fina detectada por um feixe de elétrons. Seções de tecido ultrafinas são
marcadas com metais pesados (como tetróxido de ósmio, urânio ou sais de
chumbo) para aumentar o contraste. As imagens não são coloridas e têm uma
resolução de ~0,1 nm (mais de 1.000x melhor do que um microscópio de luz).
Microscópio eletrônico de varredura: devido à sua grande profundidade de
foco, é mais semelhante ao estereomicroscópio. Ele fornece imagens
detalhadas das superfícies de células e organismos que não são possíveis de
serem obtidas por TEM. Ele também pode ser usado para contagem de
partículas e determinação de tamanho.
É denominado SEM porque a imagem é formada pela "varredura" de um feixe
de elétrons focalizado na superfície da amostra. Produz imagens
tridimensionais de um espécime medindo as diferenças relativas na reflexão
de um feixe focalizado de elétrons que escaneiam através de um espécime.
As amostras biológicas são geralmente revestidas com uma fina camada de
metal (como platina) para formar uma réplica. Isso permite que as estruturas
da superfície dos tecidos e células sejam visualizadas. As imagens não são
coloridas e têm resolução de ~1,0 nm.
❖ Balança: É um equipamento usado no laboratório para determinar o peso

ou a massa de uma amostra. Pode ou não conter uma cabine
(demonstrada na figura à direita).
Como a balança é muito sensível, antes de usá-la, deve-se conferir se não há
nenhum fluxo de ar no laboratório, pois o vento pode interferir na pesagem.
A balança deve ser nivelada e tarada (zerada) antes de se pesar o objeto ou
substância em questão.
Se for necessário o uso de um recipiente para acomodar a substância a ser
pesada, este recipiente deve ser colocado na balança antes de se apertar o
botão "tara". Após se concluir a pesagem, deve-se retirar o recipiente com a
substância, zerar a balança novamente e, em seguida, desligá-la.
❖ Capela de fluxo laminar: É uma plataforma fechada, projetada para evitar
a contaminação de amostras biológicas, reagentes ou soluções que estão
sendo manipulados em seu interior.
O ar é aspirado através de um filtro de ar modelo HEPA (High Efficiency
Particulate Arrestance) e soprado em um fluxo laminar suave em direção ao
usuário. Devido à direção do fluxo de ar, a amostra é protegida do usuário,
mas o usuário não é protegido da amostra.
Antes de usar a capela de fluxo laminar, deve-se descontaminar a sua
superfície interior com gaze estéril embebida em álcool etílico ou isopropílico
a 70% e ligar a cabine e a luz UV em torno de 10 a 15 minutos.
É importante o uso de equipamentos de proteção individual (como jaleco e
luvas) ao manipular amostras ou produtos dentro da capela.
❖ Centrífuga: Aparelho acionado por motor, que gira amostras líquidas em

alta velocidade. As centrífugas funcionam de acordo com o princípio da
sedimentação, separando substâncias de maior e menor densidade. As
centrífugas podem ter diversos tamanhos e capacidades de acomodação
de amostras.
O uso de uma centrífuga não balanceada pode danificar o aparelho e até
causar um acidente no laboratório. Por este motivo, a centrífuga deve ser
cuidadosamente balanceada antes de ser ligada.
Para balancear uma centrífuga, deve-se posicionar os tubos no rotor de forma
equilibrada, pareando tubos de amostras com o mesmo peso, ou usando
tubos com água para equilibrar o peso dos tubos de amostras. Para cada tubo
inserido no rotor, deve-se adicionar um tubo de peso igual na posição
diretamente oposta a ele. Isso irá garantir que o centro de gravidade
permaneça no centro do rotor.
Ainda em relação à biossegurança durante o uso de centrífugas, não se deve
abrir a tampa do equipamento enquanto o rotor ainda estiver girando.
A eficácia do processo de centrifugação depende de variáveis como o tempo,
a força centrífuga, o tamanho dos tubos e a temperatura. A adição de analitos
em todas as amostras não é um fator relacionado ao processo de
centrifugação.
❖ Autoclave: É uma câmara de pressão usada para executar processos

industriais e científicos que exigem temperatura e pressão elevadas,
diferentes da pressão do ar ambiente. O calor úmido e a pressão elevada
no interior das autoclaves são os fatores que promovem a esterilização
(eliminação de microrganismos). Por este motivo, o processo realizado
em uma autoclave é denominado de esterilização por calor úmido.
A autoclave é composta pelos seguintes componentes básicos:

• Cilindro metálico resistente, que pode ser vertical ou horizontal. A resistência
que realiza o processo de aquecimento da água geralmente é encontrada
neste cilindro;
• Tampa com parafusos de orelhas, que permite que a autoclave seja fechada
hermeticamente;
• Válvulas de ar e de segurança;
• Chave de comando, que permite o controle da temperatura;
• Registro indicador da pressão e da temperatura.
• As autoclaves funcionam geralmente a temperaturas de 121°C a 132 ºC
❖ Estufa de esterilização: A função é promover a eliminação de

microrganismos nos objetos colocados em seu interior, através do calor
seco, que promove a eliminação dos microrganismos por meio da
oxidação e desidratação das células. O processo que ocorre na estufa de
esterilização é denominado esterilização por calor seco.
❖ Purificadores de água
Destilador de água: Água destilada é a água que foi fervida em vapor e

condensada novamente em líquido em um recipiente separado. As impurezas
na água original que não fervem abaixo ou perto do ponto de ebulição da
água permanecem no recipiente original. Assim, a destilação é um tipo de
processo de purificação da água.
A água destilada é pura, é praticamente livre de microrganismos e matéria

orgânica e possui pH próximo de 7. A imagem à esquerda representa um
destilador clássico, do tipo que vemos nos laboratórios de química das
escolas e também nos livros didáticos. Os destiladores à direita são os tipos
mais usados atualmente nos laboratórios clínicos e se denominam
destiladores de água do tipo Pilsen.
Deionizador de água: A deionização é um processo que remove quase todos

os íons minerais da água (partículas carregadas eletricamente), como cátions
(partículas com carga positiva) como sódio, cálcio, ferro e cobre, e ânions
(partículas com carga negativa) como cloreto e sulfato. Como resultado,
obtém-se uma água quimicamente pura com baixa condutividade (similar à
água bidestilada).
Osmose reversa: Osmose reversa é um processo de purificação de água

que utiliza uma membrana parcialmente permeável para remover íons,
moléculas indesejadas e partículas maiores da água potável. O
funcionamento destes equipamentos se dá através da aplicação de uma
pressão maior que a pressão osmótica, o que força o solvente (água) a
passar do meio hipertônico (mais concentrado) para o meio hipotônico
(menos concentrado). Este movimento da água é oposto ao que ocorre na
osmose, por este motivo o processo se chama osmose reversa.
Filtração: é um processo empregado na purificação da água, utilizada não só
em laboratórios, como também em estações de tratamento de água e até em
residências. Trata-se de um método físico para separar sólidos dispersos em
líquidos ou gases (misturas heterogêneas). A filtração pode ser de dois tipos:
1. Filtração simples geralmente é realizada com um papel filtro

encaixado em um funil (semelhante ao processo de fazer café). No
entanto, outros materiais também podem ser usados no processo de
filtração, como a areia e o carvão ativado, que realiza adsorção
orgânica (por ser poroso, o carvão retém as impurezas da solução em
seu interior).
2. Filtração a vácuo: a diferença é que é aplicada uma baixa pressão no
interior do recipiente que irá coletar a solução após a filtração, este
vácuo promove uma sucção que faz com que o processo ocorra mais
rapidamente.
A água dura contém alto teor de cálcio e magnésio, causadora de

incrustações dentro de equipamentos e tubulações.
❖ Banho-maria: O banho-maria contém um recipiente no qual a água é

aquecida, sendo possível ajustar a temperatura desejada. Ele tem a função
de aquecer de forma lenta e uniforme substâncias líquidas e sólidas (como
amostras, soluções, reagentes etc.) colocadas no interior do recipiente de
água aquecida.
❖ O monitoramento da temperatura da água do banho-maria faz parte do
controle de qualidade laboratorial, e deve ser realizado rotineiramente
através do uso de um termômetro.
❖Capela de exaustão de gases: A principal função é a eliminação de gases e

vapores, mas ela também funciona como uma barreira física entre o
laboratório e as reações químicas que ocorrem em seu interior. Dessa
forma, este equipamento promove a proteção dos usuários a gases nocivos,
derramamento de produtos tóxicos e fogo.
❖Agitador magnético: Através da agitação, promove a mistura e
homogeneização de soluções líquidas.
❖Agitador vórtex: tem a função de homogeneizar líquidos contidos em tubos

de ensaio, frascos pequenos e microplacas.
❖Potenciômetro/pHmetro: Equipamento que mede a atividade de íons

hidrogênio em soluções líquidas, indicando sua acidez ou alcalinidade,
expressa como pH. O potenciômetro mede a diferença de potencial elétrico
entre um eletrodo de pH e um eletrodo de referência. Essa diferença no
potencial elétrico está relacionada à acidez ou ao pH da solução.
O potenciômetro é calibrado com soluções de pH conhecido, normalmente

antes de cada uso, para garantir a precisão da medição. Para medir o pH de
uma solução, os eletrodos são usados como sondas, que são mergulhadas
nas soluções a serem testadas e mantidas nelas por tempo suficiente para
que os íons de hidrogênio na solução se equilibrem com os íons na superfície
do bulbo no eletrodo de vidro. Este equilíbrio fornece o resultado da medição
do pH da solução.
❖ Citômetro de fluxo: é utilizado para realização de citometria de fluxo, que

é uma técnica usada para detectar e medir características físicas e
químicas de uma população de células ou partículas, o que auxilia na
identificação destas estruturas.
Permite separar, contar, examinar e classificar partículas microscópicas,

tornando possível a avaliação morfológica de uma célula no que diz respeito
ao tamanho e à granulosidade.
❖Espectrofotômetro: é utilizado para a realização da espectrofotometria, que
é uma metodologia de análise óptica amplamente utilizada no laboratório
clínico para a investigação de amostras biológicas e físico-químicas. A
metodologia tem como base a medida quantitativa da luz que é absorvida
pelas soluções, sendo a concentração de determinada substância na
solução proporcional à quantidade de luz absorvida.
Equipamento utilizado para determinar a transmitância e a absorvância de

uma solução em um determinado comprimento de onda
❖Leitores de ELISA: equipamentos utilizados para detecção dos resultados da

técnica imunológica de ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay).
Esses equipamentos utilizam o princípio da espectrofotometria para realizar
a leitura das reações antígeno-anticorpo, evidenciadas pela mudança de cor
da solução.
Se diferenciam dos espectrofotômetros convencionais pois são capazes de

realizar a leitura de placas com vários poços simultaneamente. Além disso,
também são capazes de realizar essas leituras em pequenos volumes de
amostras.
❖ Termociclador: O termociclador é um aparelho utilizado para amplificar

segmentos de DNA via reação em cadeia da polimerase (PCR), uma
técnica de Biologia Molecular. Ele funciona através da repetição de ciclos
de alteração da temperatura.
O termociclador, usado principalmente na amplificação do DNA, por meio da

reação em cadeia da polimerase, também é utilizado em reações que
necessitam de incubação em determinada temperatura ou variações de
temperatura, como na reação de digestão de fragmentos de ácidos nucleicos
com enzimas de restrição.
❖ Biologia Molecular
1 - Extração e purificação do DNA: Como muitas das técnicas de biologia

molecular analisam o DNA, a primeira etapa que temos que realizar ao obter
uma amostra biológica é extrair o material genético presente nesta amostra e
purificá-lo. Hoje em dia, a maioria dos laboratórios utiliza kits comerciais para
realização da extração e purificação, porém é possível realizar estes
procedimentos com ingredientes simples, como detergente, sal de cozinha e
etanol (apesar de o rendimento e a qualidade da amostra serem inferiores).
As três etapas básicas da extração de DNA são:
1º etapa: Lise
Nesta etapa, as membranas celulares são lisadas (rompidas) para liberar o
DNA. Existem duas maneiras de fazer isso, por ação mecânica (agitação,
maceração, sonicação) ou química (detergentes e enzimas).
2º etapa: Precipitação
Ao final da etapa de lise, o DNA se encontra livre, porém está misturado com
detritos celulares. A precipitação separa o DNA desses detritos. Primeiro, os
íons sódio (Na+ ) neutralizam as cargas negativas nas moléculas de DNA, o
que as torna mais estáveis e menos solúveis em água. Em seguida, é
adicionado álcool (etanol ou isopropanol), que faz com que o DNA precipite
na solução aquosa, porque não é solúvel em álcool.
3 etapa: Purificação Depois que o DNA foi separado da fase aquosa, ele
pode ser lavado com álcool para remover materiais indesejados e detritos
celulares restantes. Nesse ponto, o DNA
2 - Enzimas de restrição: As enzimas de restrição são endonucleases

capazes reconhecer e clivar (cortar) o DNA fita dupla em pontos específicos
para formar fragmentos menores.
Os sítios de reconhecimento das enzimas de restrição são palíndromos
(ambas as fitas têm a mesma sequência em orientação antiparalela).
Diferentes enzimas reconhecem diferentes sítios palindrômicos, que podem
variar de tamanho (geralmente de 4 a 8 bases).
Há dois tipos de clivagem: extremidades cegas ou "blunt ends" (os dois cortes
ocorrem no eixo de simetria da sequência específica) e extremidades
coesivas ou "sticky ends" (os cortes são feitos simetricamente, porém fora do
eixo de simetria).
Esta técnica é empregada como forma de preparação da amostra de DNA
para outros procedimentos analíticos, como a hibridização e a reação em
cadeia da polimerase (PCR) RFLP.
3 - Hibridização: A técnica de hibridização consiste no pareamento de

segmentos homólogos (complementares) marcados no material genético
pesquisado. As diferentes técnicas de hibridização seguem os mesmos
procedimentos básicos. Primeiro o material genético (DNA, RNA ou proteína)
é extraído da amostra e purificado. Em seguida ele é digerido por enzimas de
restrição e realiza-se uma eletroforese do material resultante. A seguir o
material é transferido para uma membrana de nitrocelulose ou nylon e por fim
realiza-se a hibridização com sondas marcadas com quimioluminescência ou
com material radioativo.
Veremos nos próximos tópicos diferentes aplicações da técnica de

hibridização:
3.1 – Southern blot: é usado para identificar regiões no DNA através de

sondas com homologia à sequência alvo de ácido nucleico em estudo. Nesta
técnica, inicialmente o DNA genômico é digerido por enzimas de restrição. Os
fragmentos são separados por eletroforese e depois o DNA é desnaturado e
transferido para uma membrana de nylon. Por fim, o DNA é hibridizado com
sondas de ácidos nucleicos marcadas por fluorescência, quimioluminescência
ou radioatividade.
3.2 – Northern blot: é usado para analisar o RNA de um organismo. Esta

técnica é aplicada na identificação da expressão de determinados genes em
diferentes tecidos ou células e para checar se toda a sequência de um cDNA
foi clonada comparando com o tamanho do RNAm.
3.3 – Western blot: é capaz de detectar pequenas quantidades de uma

proteína específica em uma mistura complexa de proteínas. Esta técnica
utiliza como sonda anticorpos policlonais ou monoclonais para detectar
antígenos específicos, se baseia na especificidade da ligação entre antígeno
e anticorpo para identificação e quantificação de moléculas.
Western blot no diagnóstico do HIV: O diagnóstico do HIV se inicia pela
realização de um teste de ELISA, que é um teste de triagem com alta
sensibilidade. Caso seja positivo, realiza-se a confirmação do diagnóstico pela
técnica de Western blot, que é mais específica. Um resultado positivo para
HIV por Western blot irá detectar as seguintes proteínas: gp 160, gp120, gp
41 e p24.
3.4 - Hibridização in situ: é um tipo de hibridação na qual uma sonda de

ácidos nucleicos marcada é utilizada para localizar uma sequência específica
de DNA ou RNA em uma amostra de tecido, ou em cromossomos (no caso do
DNA).
A sonda utilizada deve ser complementar à sequência alvo. Dentre os

marcadores utilizados nesta técnica, pode-se citar: radioisótopo 35 do
enxofre, digoxigenina e radioisótopo 33 do fósforo. Diifere da
imunohistoquímica, que é utilizada para localizar proteínas em seções de
tecido.
3.5 - FISH: (do inglês fluorescence in situ hybridization) é uma variação da

técnica de hibridização in situ que utiliza sondas de DNA ou RNA marcadas
com fluorescência complementares a sequências presentes em células e
tecidos. É comumente chamada de citogenética molecular, pois é muito
usada para detectar e localizar sequências específicas de DNA (ou a
ausência delas) em cromossomos, mas também pode ser usada para
detecção de RNA em células ou tecidos.
3.6 - Hibridização por microarray: (ou microarranjo) é uma ferramenta

usada para detectar a expressão de milhares de genes ao mesmo tempo.
Microarrays de DNA são como lâminas de microscópio impressas com
milhares de pequenos pontos em posições definidas, cada um contendo uma
sequência de DNA conhecida. Essas lâminas também são chamadas de
chips genéticos ou chips de DNA. As moléculas de DNA ligadas a cada
lâmina atuam como sondas para detectar a expressão gênica, também
conhecida como transcriptoma.
Para realizar uma análise de microarray, as moléculas de mRNA são

geralmente obtidas de uma amostra teste e de uma amostra controle. Por
exemplo, a amostra controle pode ser coletada de um indivíduo saudável e a
amostra teste pode ser coletada de um indivíduo com uma doença, como o
câncer.
As duas amostras de mRNA são então convertidas em DNA complementar

(cDNA) e cada amostra é marcada com uma sonda fluorescente de cor
diferente. Por exemplo, a amostra teste de cDNA pode ser marcada com um
corante fluorescente vermelho, enquanto que o cDNA controle pode ser
marcado com um corante fluorescente verde.
As duas amostras são então misturadas e deixadas para se ligar com a

lâmina de microarray. O processo no qual as moléculas de cDNA se ligam às
sondas de DNA na lâmina é chamado hibridização. Após a hibridização, o
microarray é escaneado para medir a expressão de cada gene impresso na
lâmina. Se a expressão de um gene em particular for maior na amostra teste
do que na amostra controle, o ponto correspondente no microarray aparecerá
vermelho. Por outro lado, se a expressão na amostra teste for menor que na
amostra controle, o ponto aparecerá em verde. Porém, se houver expressão
igual nas duas amostras, o ponto aparecerá amarelo.
Os dados coletados através de microarrays podem ser usados para criar

perfis de expressão gênica, que mostram alterações simultâneas na
expressão de muitos genes em resposta a uma condição ou tratamento
específico.
4 - Reação em cadeia da polimerase (PCR): é uma técnica usada para

aumentar exponencialmente o número de cópias do DNA de uma amostra (a
partir de uma pequena amostra pode-se chegar a milhões ou bilhões de
cópias). Esta técnica é realizada em um aparelho chamado termociclador,
que, como o nome sugere, promove alterações da temperatura em ciclos pré-
definidos.
Para se realizar a técnica de PCR, os seguintes elementos são necessários:

• Uma amostra de DNA que contenha a região alvo a ser amplificada;
• DNA polimerase termoestável: enzima responsável pela polimerização de
novas fitas de DNA e que seja capaz de suportar altas temperaturas;
• Um par de primers ou iniciadores (foward e reverse): responsáveis pela
especificidade da reação, devem ser complementares às extremidades 3' da
região alvo de cada uma das fitas de DNA;
• dNTPs (desoxirribonucleotídeos): nucleotídeos que a DNA polimerase irá
utilizar para sintetizar as novas fitas de DNA;
• Solução tampão: mantém as condições do ambiente favoráveis para a
reação;
• Cátions bivalentes: geralmente magnésio e manganês.
A PCR pode ser dividida em 3 etapas:

• Desnaturação (94 a 96o C): nesta etapa ocorre a separação da dupla
hélice.
• Anelamento (55 a 70oC): os primers (ou iniciadores) se ligam ao DNA alvo
por complementariedade de bases.
• Extensão (72oC): a enzima Taq DNA polimerase sintetiza novas fitas de
DNA.
Essas etapas se repetem várias vezes (20 a 40) de forma cíclica, e ao final do
processo é possível obter milhões ou bilhões de cópias da sequência alvo.
Todo o processo é concluído em algumas horas, sendo uma técnica
relativamente rápida.
A PCR é empregada em análises genéticas voltadas para o diagnóstico de

doenças genéticas, identificação de indivíduos (identificação criminal ou teste
de paternidade), detecção de ácidos nucleicos de patógenos associados a
doenças infecciosas, ou ainda na amplificação de material genético para ser
utilizado em uma técnica que exija uma maior quantidade deste material.
Amostras de sangue destinadas à PCR devem ser coletadas em tubos

contendo o anticoagulante EDTA.
Uma desvantagem é que, por ser muito sensível, caso haja contaminação
com DNA que não seja da amostra, ele também pode ser amplificado,
levando a resultados falsos-positivos. Por este motivo, a adição de todos os
reagentes e da amostra deve ser feita em uma "área livre de DNA". Os
amplicons (produtos finais da reação de PCR) não devem retornar às áreas
do laboratório onde as etapas anteriores foram realizadas. Uma outra medida
para prevenir a contaminação da amostra é a utilização de ponteiras com
barreira para pipetar as amostras e reagentes.
A formação de novos ácidos nucleicos, em processos como a técnica de

PCR, envolve a formação de novas ligações fosfodiéster.
4.1 – PCR convencional: Primeira técnica de PCR a ser desenvolvida,

servindo de base para todas as outras que a sucederam, é qualitativa.
4.2 – PCR em tempo real (quantitativa): A PCR quantitativa (qPCR), que

também chamada de PCR em tempo real, é uma extensão da técnica original
(PCR convencional). O objetivo da é medir exatamente quanto do DNA está
sendo produzido ao longo do tempo. Isso permite determinar a quantidade
exata de DNA em uma amostra.
A qPCR funciona de maneira semelhante à PCR convencional, no entanto,
para rastrear a quantidade de DNA produzido, deve-se adicionar algum tipo
de sonda à mistura antes que a reação ocorra. Essas sondas, também
chamadas de oligonucleotídeos, são marcadas com uma molécula
fluorescente que é liberada da sonda quando a fita de DNA é totalmente
copiada.
À medida que milhões de fitas de DNA são sintetizadas, essas moléculas

começam a emitir uma forte resposta fluorescente, que pode ser capturada
diretamente por uma câmera óptica na máquina qPCR. A amplitude dessa
resposta pode então ser plotada em um gráfico, onde a fluorescência é
diretamente proporcional à concentração de DNA amplificado.
4.3 – PCR nested: (que em português significa "aninhada") é outra variação

da técnica de PCR, que visa reduzir os erros que são cometidos durante a
amplificação do DNA. Alguns primers usados na PCR convencional tendem a
se ligar a sítios não específicos do DNA, o que dilui a quantidade de DNA
utilizável na amostra.
Para resolver esse problema, a PCR nested utiliza dois pares de primers. O
primeiro par visa amplificar um fragmento de DNA mais longo do que o
necessário e é direcionado para fora da região de DNA alvo. O segundo par é
então ligado, ou "aninhado" dentro da região de DNA alvo, e apenas
transcreve a área de interesse do primeiro produto de PCR. O uso de pares
duplos reduz bastante a probabilidade de que qualquer produto inespecífico
seja amplificado, basicamente servindo como uma espécie de "verificação
dupla" para o processo.
4.4 – PCR multiplex: é uma alternativa para amplificar várias sequências de

DNA diferentes na mesma amostra, o que seria muito demorado e
dispendioso para ser concluído com várias PCR convencionais.
Resumidamente, a técnica é realizada usando-se vários primers ao mesmo

tempo. No entanto, deve-se tomar cuidado para garantir que haja
sobreposição mínima entre as especificidades dos primers, pois a ligação
inespecífica pode significar o insucesso do processo.
SeptiFast: é uma técnica de PCR multiplex que permite a detecção de 25

patógenos comuns do sangue, possuindo a vantagem de ser uma técnica
consideravelmente mais rápida que uma hemocultura convencional. Por este
motivo, é um método empregado para diagnóstico de infecções da corrente
sanguínea.
4.5 – PCR com transcrição reversa: (RT-PCR, do inglês reverse

transcription PCR) começa com uma amostra de RNA e realiza um processo
inverso à transcrição, produzindo uma molécula de DNA complementar
(cDNA) através do uso de uma enzima conhecida como transcriptase reversa.
Esse cDNA pode então ser amplificado por uma metodologia semelhante ao
processo de PCR convencional.
A RT-PCR é amplamente utilizada no diagnóstico de doenças virais, pois
alguns vírus (como o HIV) possuem RNA como material genético. A sigla RT-
PCR é muitas vezes confundida com PCR em tempo real (real time PCR),
mas o uso correto desta sigla é como abreviação da técnica de PCR com
transcrição reversa.
4.6 – PCR RFLP: (do inglês Restriction Fragment Length Polymorphism) é

uma técnica que utiliza enzimas de restrição para clivar sítios específicos no
DNA alvo (após amplificação por PCR) e assim detectar a presença de
polimorfismos nos fragmentos com diferentes comprimentos. É geralmente
seguida pela técnica de eletroforese, que permite visualizar e analisar os
fragmentos de tamanhos diferentes.
5 - Eletroforese: é um método de separação de moléculas por um campo

elétrico através de uma matriz (gel de agarose ou poliacrilamida). Esta técnica
pode ser usada para separar proteínas e ácidos nucleicos (DNA ou RNA), de
acordo com sua carga e peso molecular.
Uma eletroforese de DNA é comumente realizada após uma PCR, para

visualizar o material genético amplificado em forma de "bandas". Fragmentos
de DNA mais curtos migram mais rapidamente, enquanto os fragmentos mais
longos permanecem mais próximos à origem do gel, resultando em separação
com base no tamanho. Dessa forma, além de poder detectar a presença ou
ausência do DNA, também é possível determinar o tamanho do fragmento, ao
utilizar um padrão de peso molecular.
6 - Teste de Paternidade: O exame genético é um teste extremamente

confiável, atingindo 99,9% de acurácia nos seus resultados, e que permite
excluir ou confirmar com alta precisão a paternidade biológica de alguém pela
análise comparativa do DNA do filho com o do suposto pai.
No genoma humano existem regiões do DNA que são compostas por

sequências repetitivas altamente polimórficas, ou seja, sequências que são
muito variáveis entre indivíduos diferentes, sendo assim altamente improvável
que duas pessoas que não possuam parentesco apresentem o mesmo
genótipo nessas regiões.
O exame de paternidade se baseia na análise de diversas regiões

polimórficas repetitivas espelhadas pelo genoma a fim de determinar a
compatibilidade dos alelos entre o filho e o suposto pai. Sabendo-se que
todos os indivíduos herdam 50% do DNA da mãe e 50% do DNA do pai, os
alelos que não forem maternos são necessariamente paternos. Assim,
quando há compatibilidade de alelos, pode-se afirmar com pelo menos
99,9999% de certeza que existe uma relação de paternidade e, da mesma
forma, quando os alelos não são compatíveis, pode-se excluir a paternidade
com o mesmo nível de certeza.
O método de biologia molecular utilizado para os testes de paternidade é a

PCR, que permite amplificar os fragmentos a serem analisados. Ao final da
técnica, as amostras são aplicadas em um gel para eletroforese e a análise é
realizada através da comparação das bandas. Como veremos no exemplo a
seguir. A figura abaixo mostra um resultado no gel de eletroforese. A posição
das bandas é correspondente ao tamanho da sequência de DNA analisada.
Como as sequências avaliadas são repetitivas, a variabilidade está no
tamanho das repetições. Assim, os alelos são compatíveis se estiverem na
mesma “altura” no gel, ou seja, se apresentarem o mesmo tamanho.
A figura acima mostra um outro exemplo de teste de paternidade, mas dessa

vez temos dois supostos pais representados nas colunas P1 e P2.
Começamos a análise, então, vendo qual dos alelos do filho veio da mãe. Ao
observarmos o gel, fica fácil afirmar que a banda superior do filho é
compatível com a banda superior da mãe, portanto, a banda inferior (o
segundo alelo) tem que ser obrigatoriamente compatível com um alelo
paterno. Dentre os dois supostos pais, vemos que apenas o P1 apresenta
uma banda na mesma altura que a banda inferior do filho e, portanto, ele é o
pai biológico. É importante observar que o P2, também apresenta uma banda
na mesma altura que a do filho, só que já sabemos que esse alelo específico
foi herdado da mãe, portanto, P2 não é o pai biológico e temos um caso de
exclusão da paternidade.
Além da análise em gel, atualmente a PCR em tempo real permite a análise

com marcadores de fluorescência. Nesse método, a intensidade do sinal
corresponde à quantidade de material amplificado.
Os testes de paternidade podem ser realizados ainda no pré-natal, através da
coleta de materiais que tenham DNA do feto, como líquido amniótico ou vilo
corial. As amostras de vilo podem ser coletadas a partir da 10ª semana de
gestação através de uma aspiração de células da placenta. Já a coleta de
líquido amniótico pode ser feita a partir da 14ª semana de gravidez.
7 - NASBA/TMA: A amplificação baseada na transcrição inclui amplificação

mediada pela transcrição (transcriptionmediated amplification - TMA) e
amplificação baseada na sequência de ácido nucleico (nucleic acid sequence-
based amplification - NASBA). Ambas são reações de amplificação isotérmica
que mimetizam a replicação do RNA retroviral. Ambos são específicos para
sequências de RNA alvo e têm ganhado popularidade porque demonstraram
ter uma ampla gama de aplicações para detecção de patógenos em amostras
clínicas, ambientais e de alimentos.
Como alternativa à RT-PCR para amplificação de RNA, NASBA e TMA têm a

vantagem de não exigir ciclos de variação de temperatura. Essas duas
técnicas usam a função de uma RNA polimerase para sintetizar RNA a partir
de um promotor desenvolvido na região do primer, e uma transcriptase
reversa, para produzir DNA a partir dos moldes de RNA.
Na TMA, a própria transcriptase reversa degrada o molde de RNA inicial à

medida que sintetiza seu DNA complementar (cDNA). Na NASBA, esta
tecnologia de amplificação de RNA conta ainda com a uma terceira atividade
enzimática, RNase H, para remover o RNA do cDNA sem a etapa de
desnaturação por calor. Durante a reação, o primer foward hibridiza com
qualquer RNA alvo presente na amostra. As enzimas transcriptase reversa e
RNase H, juntamente com o primer reverse, então, produzem um DNA de fita
dupla (double-stranded DNA - dsDNA) com a sequência alvo e um promotor
T7 (uma sequência promotora que pode ser reconhecida pela RNA
polimerase T7). A RNA polimerase T7 dependente de DNA usa este dsDNA
para produzir muitas fitas de RNA complementares ao RNA alvo original.
Após esta fase inicial da NASBA, cada RNA recém-sintetizado pode ser
copiado em uma fase cíclica, resultando em uma amplificação exponencial do
RNA complementar ao alvo. Assim, a etapa de termociclagem é eliminada,
gerando um método de amplificação isotérmica denominado "replicação de
sequência autossustentada". Os produtos finais de NASBA e TMA podem ser
detectados usando eletroforese em gel, sondas fluorescentes e ensaio
colorimétrico.
8 - bDNA: O ensaio de "DNA ramificado" (branched DNA - bDNA) fornece

uma ferramenta única e poderosa para quantificação confiável de moléculas
de ácido nucleico. Esta técnica difere dos métodos de amplificação de alvo,
como a PCR, porque o ensaio de bDNA mede diretamente as moléculas de
ácido nucleico em níveis fisiológicos, aumentando o sinal de uma "molécula
reporter", em vez de replicar as sequências alvo como forma de detecção, e,
portanto, evita os erros inerentes à extração e amplificação de sequências
alvo.
O ensaio de bDNA emprega amplificação de sinal linear usando sondas de
oligonucleotídeos sintéticos e moléculas de bDNA, e pode medir com acurácia
e precisão entre aproximadamente 500 e 10.000.000 de moléculas.
O ensaio de bDNA usa um formato de microplaca de 96 poços e é baseado

em uma série de reações de hibridização específicas e detecção
quimioluminescente de sondas hibridizadas. Ligadas à superfície de cada
micropoço estão "sondas de captura" que contêm uma sequência de
nucleotídeos específica e se ligam a um subconjunto de "sondas alvo" que
são ligadas a sequências de nucleotídeos específicas na molécula de ácido
nucleico alvo. Esta série de hibridizações ancora a molécula de ácido nucleico
alvo à superfície do micropoço. A detecção do ácido nucleico alvo e a
amplificação do sinal são realizadas por meio de outra série de hibridizações.
Um segundo subconjunto de sondas alvo liga a molécula de ácido nucleico

alvo a moléculas amplificadoras de bDNA. A adição de moléculas de pré-
amplificador fornece um aprimoramento adicional, e uma amplificação de sinal
ainda maior pode ser obtida. Cada molécula amplificadora de bDNA é
projetada para conter 15 braços, cada um dos quais contém três sítios de
ligação para "sondas de marcação" conjugadas com fosfatase alcalina. Um
sinal quimioluminescente é gerado após a introdução de um substrato de
dioxetano que é ativado pela fosfatase alcalina. Este sinal pode ser
quantificado pela contagem do número de fótons emitidos em um
luminômetro. O ensaio de bDNA é inerentemente quantitativo, uma vez que o
número de fótons emitidos está diretamente relacionado à quantidade de
ácido nucleico alvo na amostra.
9 - Teste de ácido nucleico (NAT): é um sistema capaz detectar a presença

de microrganismos (como o vírus da imunodeficiência humana - HIV - e o
vírus da hepatite C - HCV) em amostras de sangue e hemoderivados,
permitindo a detecção precoce de infecções em doadores e conferindo maior
segurança aos procedimentos hemoterápicos.
Apresenta maior sensibilidade diagnóstica em comparação aos testes

sorológicos, porque detecta material genético em vez de antígenos ou
anticorpos. A detecção realizada principalmente por PCR em tempo real,
permite a detecção precoce da infecção, uma vez que o surgimento de
anticorpos requer tempo para que o doador desenvolva uma resposta imune,
e a detecção de antígenos requer tempo para que um nível mais alto dos
organismos seja detectável na corrente sanguínea.
Esta tecnologia detecta quantidades muito pequenas de material genético,

copiando-o várias vezes, resultando na amplificação do material alvo. Por
exemplo, o NAT pode detectar os RNAs de HIV-1 e HCV em pools de
amostras obtidas de vários doadores simultaneamente. Também é possível
testar amostras de doadores individuais.
Se a testagem de um pool for positiva para qualquer um dos vírus, as

amostras devem ser testadas individualmente para identificar qual(is) está(ão)
infectada(s) e evitar a contaminação dos receptores.
A realização do teste NAT envolve as seguintes etapas:
1. Preparação das amostras de sangue e pooling;
2. Extração do ácido nucleico viral e sua purificação ou captura;
3. Amplificação do RNA ou do DNA alvo e detecção do produto amplificado.
É importante que não visa substituir os testes sorológicos, mas sim

complementá-los, uma vez que, com a evolução da infecção, a carga viral
pode se tornar muito baixa e não ser detectada pelo NAT. Lembre-se de que
nenhum teste é 100% sensível ou específico.
❖ BIOLOGIA MOLECULAR: MÉTODOS DE ANÁLISE DO DNA
❖Sequenciamento de DNA - Uma breve revisão da estrutura e função do

DNA:
O DNA (ácido desoxirribonucleico) é uma molécula presente em todas as

células do corpo (com exceção das hemácias) e contém o código genético
utilizado para regular a síntese de proteínas.
A unidade básica do DNA é o nucleotídeo, que contém uma base nitrogenada

que pode ser de quatro tipos diferentes: adenina (A), citosina (C), guanina (G)
e timina (T). Nucleotídeo é uma molécula que apresenta três componentes:
um açúcar de cinco carbonos (pentose), uma base nitrogenada e um grupo
fosfato.
O genoma humano contém aproximadamente 3 bilhões de pares de bases,

sendo que cada célula diploide (2n) do corpo contém 2 cópias do genoma:
uma cópia herdada da mãe e uma cópia herdada do pai.
O DNA serve de molde para a síntese do RNA (ácido ribonucleico) durante

um processo denominado transcrição. As sequências de DNA que controlam
a transcrição encontram-se na região 5 'do gene. Durante a transcrição, as
regiões codificantes, denominadas éxons, são unidas para formar o RNA
mensageiro maduro (mRNA), que é então traduzido em proteína através de
um processo chamado tradução
A tradução do mRNA é realizada pelo RNA ribossômico (rRNA) e RNA de
transferência ou transportador (tRNA). Durante a tradução, códigos de três
bases, denominados códons, são usados para produzir uma proteína
adicionando sequencialmente aminoácidos na extremidade de uma cadeia
polipeptídica crescente.
Existem 64 códons, no entanto, apenas 61 códons codificam um aminoácido,

enquanto os três códons restantes sinalizam que o processo de tradução
deve parar e, consequentemente, terminar a síntese proteica.
Aproximadamente 25.000 genes foram identificados no genoma humano. A

região do genoma que contém genes, chamada de região codificadora, ocupa
apenas cerca de 1–2% de todo o genoma humano. Milhões de variações
genéticas (polimorfismos e/ou mutações) foram identificadas principalmente
polimorfismos de nucleotídeo único e pequenas inserções ou deleções
(InDels) de um ou mais nucleotídeos.
Cada indivíduo contém cerca de 2–3 milhões desses polimorfismos, sendo

que uma pequena fração destes são variações "de novo" que não são
herdadas de nenhum dos pais, surgem durante o desenvolvimento
embrionário.
❖ Definição de sequenciamento de DNA

O DNA consiste em uma sequência única de nucleotídeos. O sequenciamento
é o processo de determinação da sequência de nucleotídeos dentro de uma
molécula de DNA. Dessa forma, é possível saber a ordem em que as quatro
bases nitrogenadas (adenina, guanina, citosina e timina) ocorrem dentro
daquela molécula de ácido nucleico e suas ordens nas cadeias
polinucleotídicas contém as informações sobre as propriedades hereditárias e
bioquímicas dos organismos vivos, uma vez que em amostras biológicas
possui uma ampla variedade de aplicações na pesquisa, na medicina e na
identificação forense.
No princípio, era possível sequenciar apenas trechos curtos de

oligonucleotídeos e o primeiro sequenciamento do genoma humano custou
cerca de 3 bilhões de dólares. Atualmente é possível sequenciar milhões de
bases e até genomas completos de forma rápida e com um custo
relativamente baixo (aproximadamente US$ 1.000 por genoma).
O projeto genoma humano dividiu-se em duas frentes: uma pública, que
utilizou uma abordagem mais meticulosa, e outra de interesse privado, que se
propôs a realizar tal análise de maneira rápida, empregando intensamente a
computação.
❖ Metodologias de sequenciamento de DNA
Um dos métodos mais antigos e clássicos é o método de terminação em
cadeia ou método Sanger, usado para sequenciar o primeiro genoma
humano. Os métodos mais recentes, capazes de processar um grande
número de moléculas de DNA rapidamente são chamados coletivamente de
métodos de sequenciamento de alto rendimento (High Throughput
Sequencing - HTS) ou métodos de sequenciamento de nova geração (Next
Generation Sequencing - NGS).
❖ Sequenciamento de primeira geração
Envolviam a separação de polinucleotídeos por comprimento via eletroforese

em géis de poliacrilamida, usada em dois protocolos complexos em meados
da década de 1970: o sistema "plus and minus" (mais e menos) de Alan
Coulson e Sanger em 1975 e a técnica de clivagem química de Allan Maxam
e Walter Gilbert.
Técnica de plus and minus: usava DNA polimerase para sintetizar novos
nucleotídeos a partir de um primer, incorporando nucleotídeos marcados
radioativamente, antes de realizar duas segundas reações de polimerização:
uma reação "mais", em que apenas um único tipo de nucleotídeo estava
presente, de forma que todas as extensões terminavam com essa base, e
uma reação "menos", na qual três nucleotídeos eram usados, o que produzia
sequências até a posição antes do próximo nucleotídeo faltante. Ao correr os
produtos em um gel de poliacrilamida e comparar entre as oito canaletas, era
possível inferir a posição dos nucleotídeos na sequência em análise. Foi
usando essa técnica que Sanger e colaboradores sequenciaram o primeiro
genoma de DNA, pertencente a um bacteriófago.
Técnica de Maxam e Gilbert: Em vez de usar uma DNA polimerase para

gerar fragmentos, o DNA radiomarcado era tratado com produtos químicos
que clivam as fitas em bases específicas. Após correr em um gel de
poliacrilamida, o comprimento dos fragmentos clivados (e, portanto, a posição
dos nucleotídeos específicos) podia ser determinado e com base nesses
dados era possível inferir a sequência. Esta foi a primeira técnica a ser
amplamente adotada e é considerada o marco inicial do sequenciamento de
DNA de primeira geração.
Técnica de terminação em cadeia de Sanger ou método didesoxi: teve

maior impacto na tecnologia de sequenciamento de DNA surgiu em 1977, é a
base da primeira geração de sequenciadores. Ele se baseia no uso de
uma enzima DNA polimerase para sintetizar cadeias de DNA de
comprimentos variados. Nesse método, uma fita de DNA servirá
como molde para a fita da qual deseja-se descobrir a sequência.
Assim, os componentes necessários para uma reação de sequenciamento de

Sanger:
1. A molécula de DNA que se deseja conhecer a sequência (DNA molde);
2. Todos os quatro tipos de nucleotídeos, chamados de dNTPs
(desoxinucleotídeos), sendo cada um, separado em um tubo distinto de
reação, ou seja, um tubo para Adenina (dATP), outro para Timina
(dTTP), outro para Citosina (dCTP) e por fim, outro para Guanina
(dGTP);
3. Didesoxinucleotídeos, tipo especial de nucleotídeos chamados de
ddNTPs (sendo respectivamente denominados ddATP, ddCTP, ddGTP
e ddTTP, são similares aos nucleotídeos comuns, mas com uma
diferença chave: falta um grupo hidroxila na posição 3′ do carbono do
anel de sacarose que atua como um “gancho”, permitindo que um novo
nucleotídeo seja adicionado à cadeia existente. Uma vez que um
didesoxinucleotídeo é adicionado à cadeia, não há hidroxila disponível
e nenhum outro nucleotídeo pode ser adicionado, ou seja, interrompe a
ação da polimerase e assim termina a cadeia que está sendo
sintetizada;
4. Sequência iniciadora (primer);
5. Enzima polimerase.
Para que o sequenciamento ocorra, uma sequência iniciadora com

algumas dezenas de pares de base de nucleotídeos, denominada
primer, é projetada para ser o ponto de partida e liga-se a uma região
complementar na sequência do DNA alvo, servindo como ponto de
partida para a síntese de uma nova fita. A enzima DNA polimerase é
responsável por adicionar novos nucleotídeos à fita de DNA em
crescimento, partindo da sequência primer
Uma grande quantidade de cada um dos quatro nucleotídeos normais
são adicionados separadamente ao DNA a ser sequenciado, que é
então dividido em quatro tubos de reação que recebe uma pequena
quantidade de didesoxinucleotídeos trifosfatos (ddNTPs): ddATP,
ddGTP, ddCTP ou ddTTP.
Como esses didesoxinucleotídeos serão incorporadas apenas

ocasionalmente, cada reação produz um conjunto de cópias de DNA
que terminam em diferentes pontos da sequência. Após a síntese, os
produtos das reações A, G, C e T são carregados individualmente em
quatro faixas de um único gel e separados por eletroforese em gel, um
método que separa os fragmentos de DNA por seus tamanhos. A
sequência de DNA da fita recém-sintetizada pode ser determinada
lendo as bandas em ordem, começando no fundo do gel. Uma vez que
cada cópia tem uma letra a mais que a última, pode-se classificar as
cadeias de DNA por tamanho e usar as sequências das bandas para a
leitura da fita
Uma série de melhorias foram feitas no sequenciamento de Sanger

nos anos seguintes, principalmente a substituição da radiomarcação
por detecção baseada em fluorometria (o que permitiu que a reação
ocorresse em um único tubo em vez de quatro) e o aprimoramento da
detecção por eletroforese capilar.
Contribuíram para o desenvolvimento de máquinas de sequenciamento

de DNA cada vez mais automatizadas, usadas para sequenciar os
genomas de espécies cada vez mais complexas. Eram capazes de
realizar leituras com comprimentos ligeiramente inferiores a um
quilobase (kb). Para analisar fragmentos mais longos, os
pesquisadores usavam técnicas como o sequenciamento shotgun, em
que fragmentos de DNA sobrepostos eram clonados e sequenciados
separadamente e, em seguida, montados em uma longa sequência
contígua (contig) in silico.
O desenvolvimento de técnicas como a reação em cadeia da

polimerase (PCR) e tecnologias de DNA recombinante representou um
grande auxílio para a revolução genômica, pois forneciam meios de
gerar altas concentrações de amostras de DNA puras para o
sequenciamento. O surgimento de sequenciadores didesoxi mais
novos (como a linha ABI PRISM produzida pela Applied Biosystems)
permitiu o sequenciamento simultâneo de centenas de amostras.
Esses sequenciadores passaram a ser usados no Projeto Genoma
Humano.
❖ Análise de Sequenciamento Sanger por Eletroforese Capilar
Usa eletroforese capilar (uma pequena fibra de vidro oca preenchida

com uma resina) para separar os fragmentos de DNA. Os terminadores
ddNTPs são marcados com quatro corantes fluorescentes, que emitem
luz em um comprimento de onda específico quando iluminados com
um laser, conforme os fragmentos de DNA passam por um capilar de
vidro, o que permite que os 4 tipos sejam empregados em uma única
reação e os fragmentos sejam analisados juntos.
As sequências de fragmentos de DNA variando de 50–100 bp até 1000

bp podem ser analisadas em um único capilar. À medida que os
detectores de luz coletam as informações de cor dos fragmentos de
DNA que passam pelo capilar, elas são traduzidas em um
cromatograma que pode ser visualizado usando um software de
análise de DNA e são interpretadas com as letras A, C, G e T. O
gráfico que representa o resultado do sequenciamento de DNA é
denominado eletroferograma.
Por ser um método de separação, é esperado que na eletroforese

capilar as diferenças entre as mobilidades efetivas dos solutos sejam
maximizadas e as causas de alargamento das zonas sejam
minimizadas, o que promoverá um resultado com melhor resolução.
❖ Sequenciamento de nova geração
São tecnologias mais recentes, amplamente empregados quando genomas

inteiros precisam ser sequenciados. Capazes de executar milhões de reações
de sequenciamento em paralelo, o que representou um grande avanço em
relação aos métodos de primeira geração. O desenvolvimento do NGS
permitiu a diminuição do custo e do tempo das reações de sequenciamento,
podem ser divididos em duas categorias: sequenciamentos de segunda
geração e sequenciamentos de terceira geração.
❖ Sequenciamento de segunda geração
Ao mesmo tempo que o sequenciamento Sanger era aprimorado, surgiu uma

nova metodologia de sequenciamento que não utilizava dNTPs ou primers
marcados com radiação ou fluorescência para inferir a sequência dos
nucleotídeos. Era utilizado um método luminescente para medir a síntese de
pirofosfato, processo que envolvia duas enzimas, no qual a ATP sulfurilase é
usada para converter o pirofosfato em ATP, que é então usado como
substrato para a luciferase, produzindo luz proporcional à quantidade de
pirofosfato.
Esta abordagem foi usada para inferir a sequência medindo a produção de

pirofosfato à medida que cada nucleotídeo é adicionado ao sistema sobre o
DNA molde afixado a uma fase sólida. Tanto o método de Sanger quanto
esse método de pirossequenciamento são técnicas de sequenciamento por
síntese (SBS), pois ambos requerem a ação direta da DNA polimerase para
produzir um resultado passível de ser analisado, o que não ocorre na técnica
de Maxam-Gilbert.
Características positivas: poderia ser realizado usando nucleotídeos naturais

(em vez dos dNTPs modificados usados no método de terminação de cadeia)
e o resultado podia ser observado em tempo real (dispensando as
eletroforeses demoradas). Outras melhorias posteriores foram: anexar o DNA
a esferas paramagnéticas e degradar enzimaticamente dNTPs não
incorporados para remover a necessidade de etapas de lavagem. A principal
desvantagem apresentada por esta técnica é determinar quantos do mesmo
nucleotídeo existem em sequência em uma determinada posição, a
intensidade da luz liberada não é linear acima de quatro ou cinco nucleotídeos
idênticos.
Várias técnicas de sequenciamento massivo paralelo surgiram, com destaque

para o método de sequenciamento Solexa, que mais tarde foi adquirido pela
Illumina. Em vez de usar esferas, esta técnica emprega moléculas de DNA
anexadas a adaptadores que servem para fixar essas moléculas a uma placa
de vidro. Em seguida, uma PCR em fase sólida produz aglomerados clonais
de cada uma das fitas de DNA ligadas à placa de vidro. A etapa de
sequenciamento é realizada por SBS (sequenciamento por síntese) usando
dNTPs fluorescentes terminadores reversíveis, que não conseguem se ligar a
outros nucleotídeos, pois o fluoróforo ocupa a posição hidroxila 3'. Este
fluoróforo é clivado antes que a polimerização continue, o que permite que o
sequenciamento ocorra de maneira síncrona. Em cada ciclo, a identidade do
nucleotídeo incorporado pode ser monitorada por um sensor que detecta a
excitação dos fluoróforos com lasers, antes da remoção enzimática das
porções fluorescentes.
Uma terceira opção de sequenciamento de segunda geração foi o

sequenciamento por ligação e detecção de oligonucleotídeo (sequencing by
oligonucleotide ligation and detection - SOLiD) do sistema da Applied
Biosystems (que se tornou Life Technologies após uma fusão com a
Invitrogen). O sequenciamento SOLiD não é realizado por síntese (não é
catalisado com uma polimerase), mas por ligação, usando uma DNA ligase.
Técnica de sequenciamento por nanoesfera de DNA da Complete Genomic. A

geração da população de DNA clonal é promovida por uma amplificação
circular que é usada para gerar longas cadeias de DNA que consistem em
unidades repetidas da sequência molde ligada a adaptadores, que se
automontam em nanoesferas e posteriormente são fixadas em uma lâmina
para serem sequenciadas.
Ion Torrent, que foi a primeira tecnologia chamada de sequenciamento pós-

luz, pois não usa fluorescência nem luminescência. Esferas contendo
populações clonais de fragmentos de DNA (produzidas por meio de uma PCR
em emulsão) são adicionadas a uma placa contendo picopoços (poços muito
pequenos), em seguida são adicionados os nucleotídeos. Porém, a
incorporação dos nucleotídeos não é medida pela liberação de pirofosfato,
mas pela diferença de pH causada pela liberação de prótons (íons H+ )
durante a polimerização, o que é possível devido à tecnologia de
semicondutor de óxido metálico (metal-oxide-semiconductor - CMOS) usada
na fabricação de chips microprocessadores.
❖ Sequenciamento de terceira geração
A primeira tecnologia de sequenciamento de molécula única (SMS) foi

comercializada pela Helicos BioSciences, os moldes de DNA são anexados a
uma superfície plana e, em seguida, dNTPs fluorescentes terminadores
reversíveis são adicionados uma base por vez e imagens são capturadas
antes da clivagem e do ciclo da próxima base. Esta foi a primeira tecnologia a
permitir o sequenciamento de DNA não amplificado.
Outra tecnologia é a plataforma em tempo real de molécula única (SMRT) da
Pacific Biosciences, disponível na linha de máquinas PacBio. Durante a
execução a polimerização do DNA ocorre em matrizes de nanoestruturas
microfabricadas, chamadas guias de onda de modo zero (ZMWs), que são
pequenos orifícios em um filme metálico recobrindo um chip. Esses ZMWs
exploram as propriedades da luz que passa por aberturas de diâmetro menor
que seu comprimento de onda, o que faz com que ela decaia
exponencialmente, iluminando exclusivamente o fundo dos poços. Isso
permite a visualização de moléculas únicas de fluoróforo perto da parte
inferior do ZMW, devido à zona de excitação do laser ser tão pequena,
mesmo com a presença de moléculas próximas em solução. A deposição de
moléculas únicas de DNA polimerase dentro dos ZMWs as coloca dentro da
região iluminada. Com a adição da biblioteca de DNA de interesse e de
dNTPs fluorescentes, a extensão das cadeias de DNA por nucleotídeos
únicos pode ser monitorada em tempo real, uma vez que o nucleotídeo
fluorescente é incorporado e emite fluorescência detectável, após a qual o
corante é clivado, cessando o sinal. Este processo pode sequenciar
moléculas únicas em um período de tempo muito curto.
Características vantajosas: o sequenciamento ocorre na velocidade da

atuação da polimerase, ele produz dados cinéticos, permitindo a detecção de
bases alteradas. Capazes de produzir leituras extremamente longas, podendo
exceder 10 kb de comprimento, sendo uma ferramenta útil para montagem de
genomas de novo (novos genomas).
Merece destaque a tecnologia de sequenciamento em nanoporo (NanoPore)

da Oxford, que usa nanoporos para a detecção e quantificação de vários tipos
de moléculas biológicas e químicas. A passagem das moléculas através de
canais iônicos bloqueia o fluxo de íons, diminuindo a corrente por um período
de tempo proporcional ao comprimento do ácido nucleico. Os equipamentos
de sequenciamento em nanoporo apresentam um tamanho compacto e um
baixo custo em relação às outras plataformas NGS.
❖ Aplicações do sequenciamento de DNA
Diagnóstico: pode ser muito útil para investigar doenças de etiologia

genética. A análise do exoma, que compreende todos os genes expressos de
um organismo, mostrou-se promissora na identificação dos alelos causais
para muitas doenças hereditárias. Além disso, o NGS tem desempenhado um
papel importante na evolução da compreensão de neoplasias. Compreender
as bases genéticas de um câncer faz com que os médicos tenham um
direcionamento melhor para tomar decisões sobre o manejo do paciente, o
que inclui opções de tratamento ideais para cada indivíduo e para cada tipo
de câncer. Um exemplo conhecido envolve os genes BRCA1 e BRCA2, cujas
variantes patogênicas têm um enorme impacto na probabilidade de
desenvolver câncer de mama. Mulheres portadoras de alguns alelos
patogênicos podem até optar por cirurgias preventivas, como mastectomias
duplas.
Pesquisa: se tornou parte integrante da maioria dos laboratórios de pesquisa,

sendo usado para verificar os resultados de experimentos de clonagem e para
entender o efeito de genes específicos. As tecnologias NGS são usadas para
estudar variações nas composições genéticas de plasmídeos, bactérias,
leveduras, nematoides e até mesmo mamíferos usados em experimentos
científicos.
O sequenciamento de DNA fornece informações sobre os elementos

regulatórios do genoma de cada célula e as variações em sua atividade em
diferentes tipos de células e indivíduos. Como exemplo, um determinado gene
pode estar permanentemente desativado em alguns tecidos, enquanto é
expresso constitutivamente em outros. Da maneira semelhante, indivíduos
com suscetibilidade para desenvolver uma determinada doença podem
apresentar genes regulados de maneira diferente em comparação com
indivíduos que são imunes para a mesma doença. Essas diferenças nas
regiões regulatórias do DNA podem ser demonstradas por meio de
sequenciamento e podem fornecer informações que ajudam a elucidar
determinados fenótipos.
Forense: A capacidade de usar pequenas quantidades de DNA para obter

resultados de sequenciamento confiáveis tem sido extremamente útil para o
campo da ciência forense. De particular importância é a possibilidade de
sequenciar diferentes DNAs em uma amostra com vários doadores, pois
cenas de crime frequentemente contêm material genético de várias pessoas.
Avanços recentes permitem o sequenciamento post mortem do exoma de um

indivíduo, o que pode ser útil para ajudar a esclarecer a causa da morte. Por
exemplo, uma morte causada por envenenamento pode estar associada a
alterações no exoma dos órgãos afetados. Além disso, o sequenciamento do
DNA também pode determinar se o indivíduo tinha uma doença ou uma
predisposição genética preexistente.
Teste de Paternidade: é um teste extremamente confiável, atingindo 99,9%

de acurácia nos seus resultados, e que permite excluir ou confirmar com alta
precisão a paternidade biológica de alguém pela análise comparativa do DNA
do filho com o do suposto pai.
No genoma humano existem regiões do DNA que são compostas por
sequências repetitivas altamente polimórficas, ou seja, sequências que são
muito variáveis entre indivíduos diferentes. Sendo assim, é altamente
improvável que duas pessoas que não possuam parentesco apresentem o
mesmo genótipo nessas regiões.
Sabendo-se que todos os indivíduos herdam 50% do DNA da mãe e 50% do

DNA do pai, os alelos que não forem maternos são necessariamente
paternos, quando os alelos não são compatíveis, pode-se excluir a
paternidade com o mesmo nível de certeza.
O método de biologia molecular utilizado para os testes de paternidade é a

PCR, que permite amplificar os fragmentos a serem analisados, as amostras
são aplicadas em um gel para eletroforese e a análise é realizada através da
comparação das bandas.
A figura abaixo mostra um resultado no gel de eletroforese. A posição das

bandas é correspondente ao tamanho da sequência de DNA analisada. Como
são repetitivas, a variabilidade está no tamanho das repetições. Assim, os
alelos são compatíveis se estiverem na mesma “altura” no gel, ou seja, se
apresentarem o mesmo tamanho.
A banda superior do filho (o primeiro alelo) é compatível com a banda superior

da mãe, ou seja, estão na mesma altura no gel, ou em outras palavras, os
fragmentos de DNA apresentam o mesmo tamanho. Assim, se sabemos que
a primeira banda do filho veio da mãe, a segunda banda, a mais inferior tem
que ser igual a um dos alelos do pai.
Além da análise em gel, atualmente a PCR em tempo real permite a análise

com marcadores de fluorescência, a intensidade do sinal corresponde à
quantidade de material amplificado. Os testes de paternidade podem ser
realizados ainda no pré-natal, através da coleta de materiais que tenham DNA
do feto, como líquido amniótico a partir da 14ª semana de gravidez.ou vilo
corial a partir da 10ª semana de gestação através de uma aspiração de
células da placenta.
Pode ser utilizada em outros tipos de análise de parentesco, também é

possível utilizar para identificação de indivíduos, como por exemplo, a partir
da comparação de uma amostra desconhecida obtida em uma cena de crime
com uma amostra de um indivíduo suspeito de ter cometido tal crime.
❖ Biossegurança e protocolos preconizados para acidentes

profissionais
De acordo com a Resolução-RDC nº 50, de 21 de fevereiro de 2002, a
biossegurança é o "conjunto de práticas, equipamentos e instalações voltadas
para a prevenção, minimização ou eliminação de riscos inerentes às
atividades de prestação de serviços, pesquisas, produção e ensino, visando à
saúde dos homens, à preservação do ambiente e à qualidade dos resultados".
Vários assuntos estão incluídos dentro do estudo de biossegurança:

❖ Equipamentos de proteção individual e coletiva;
❖ NR 32, que trata da segurança e saúde no trabalho em serviços de
saúde;
❖ Classificação dos principais riscos ocupacionais;
❖ Classificação de risco de agentes biológicos e os níveis de
biossegurança dos laboratórios;
❖ Protocolos para acidentes profissionais;
❖ Boas práticas de gerenciamento dos resíduos de serviços de saúde.
❖ A biossegurança no laboratório clínico
A Resolução - RDC n° 11, de 16 de fevereiro de 2012, que dispõe sobre o

funcionamento de laboratórios analíticos que realizam análises em produtos
sujeitos à Vigilância Sanitária, traz um capítulo dedicado a biossegurança.
São apenas 6 artigos, vejamos:
CAPÍTULO V - DA BIOSSEGURANÇA
Art. 57. O laboratório deve dispor de local, instalações, equipamentos e

procedimentos de segurança e de proteção apropriados ao manuseio de
agentes físicos, biológicos e químicos que impliquem em riscos ao meio
ambiente, à segurança e à saúde do trabalhador.
Art. 58. O laboratório deve dispor de um sistema atualizado de gerenciamento

de riscos em biossegurança para todas as atividades com agentes de risco à
saúde humana, animal e ao ambiente, incluindo o gerenciamento de resíduos,
acessível ao pessoal que possa estar exposto a esses agentes.
Art. 59. O laboratório deve avaliar, definir, documentar e sinalizar o nível de

biossegurança dos ambientes e áreas, baseado nas atividades realizadas,
equipamentos, instrumentos e agentes de risco envolvidos.
Art. 60. O laboratório deve implantar procedimentos de biossegurança

adequados aos níveis definidos.
Art. 61. O laboratório deve prover, a todos os técnicos envolvidos, treinamento

periódico nos procedimentos de biossegurança exigidos para o escopo
analítico e instruções escritas e atualizadas desses procedimentos.
Art. 62. O laboratório deve exigir e manter disponíveis os comprovantes

atualizados de exames de saúde obrigatórios pela legislação trabalhista e os
comprovantes de imunização necessários para o pessoal exposto a agentes
de risco.
Ainda dentro da RDC n° 11/ 2012, o artigo 53 diz que "o laboratório deve
implantar um programa para a execução, monitoramento, controle e
verificação das operações de limpeza, desinfecção e esterilização de
superfícies, instalações, equipamentos, instrumentos e materiais, conforme
requerido no escopo analítico e nos procedimentos de biossegurança".
Descontaminação: processo pelo qual agentes de risco são removidos ou

eliminados ou os seus efeitos adversos são neutralizados (RDC n° 11/ 2012).
Pode ser aplicada através de uma limpeza, desinfecção ou esterilização:
Limpeza: Processo sistemático e contínuo para a manutenção do asseio ou,

quando necessário, para a retirada de sujidade de uma superfície .
Desinfecção: Processo físico ou químico que destrói ou inativa a maioria dos

microrganismos patogênicos de objetos inanimados e superfícies, com
exceção de esporos bacterianos.
Esterilização: Processo físico ou químico que destrói todas as formas de vida

microbiana, ou seja, bactérias nas formas vegetativas e esporuladas, fungos e
vírus.
A esterilização pode ser realizada por processos físicos, químicos ou físico-

químicos. Os processos físicos incluem calor úmido (autoclave), calor seco
(estufa) e radiação gama (cobalto). A esterilização por processos químicos
pode ser realizada por produtos como o glutaraldeído, o formaldeído e o ácido
peracético. Os processos físico-químicos, menos utilizados devido ao seu alto
custo, são realizados através do emprego de óxido de etileno, plasma de
peróxido de hidrogênio ou vapor de formaldeído.
E a desinfestação? Esta pode ser conceituada como:

❖ Destruição de metazoários, especialmente artrópodes e roedores, com
finalidades profiláticas.
❖ Extermínio de insetos, roedores ou outros animais danosos às
atividades humanas e transmissores de doenças.
Outros dois conceitos importantes (e muitas vezes confundidos) são:
Antissepsia é o conjunto de medidas empregadas para impedir a proliferação

microbiana. Trata-se de um procedimento que visa o controle de infecção a
partir do uso de substâncias microbicidas ou microbiostáticas de uso na pele
ou mucosa.
Assepsia é o conjunto de medidas utilizadas para impedir a penetração de

microrganismos (contaminação) em local que não os contenha. É um
processo que permite afastar os germes patogênicos de um local ou objeto.
❖ Soluções Desinfetantes
Um item importante são os produtos utilizados na limpeza do espaço físico do
laboratório, são conhecidos de modo geral como saneantes. Esses produtos
correspondem a sabões e detergentes, que na diluição apropriada são
fundamentais para manter a limpeza adequada do laboratório.
Os desinfetantes são uma classe de saneantes que devem ser aplicados em

áreas onde há a presença de matéria orgânica para garantir a desinfecção da
superfície. A aplicação do desinfetante deve ser precedida de uma limpeza,
segundo as recomendações adequadas para que o procedimento de
desinfecção seja efetivo.
Os produtos saneantes utilizados em serviços de saúde são selecionados, e

adquiridos sob a responsabilidade do SCHI (Serviço de Controle e Infecção
Hospitalar) em associação com o Serviço de Limpeza e Desinfecção de
Superfícies em Serviços de Saúde e com o funcionário responsável pelo setor
de compras da instituição.
A ANVISA orienta que esses produtos devem seguir um sistema que garanta
a qualidade dos saneantes, para que os mesmos atendam às exigências
feitas pela legislação em vigor. Recomenda ainda que o rótulo dos saneantes
contenha os seguintes itens:
• Nome comercial do produto;
• Categoria a qual pertence;
• Número do registro na ANVISA (para produtos registrados);
• Modo de utilização (deve-se destacar o tempo de contato);
• Precauções de uso (determinação de EPIs e de risco de toxicidade);
• Restrições do uso;
• Composição do produto;
• Teor do princípio ativo (em porcentagem %);
• Frases relacionadas ao risco do produto;
• Prazo de validade e data de fabricação;
• Lote e volume;
• Dados da empresa fabricante (CNPJ, nome e endereço).
Devem ter validade de até 5 anos, podendo ser renovada. É fundamental que
esses produtos destinados à limpeza sejam formulados com substâncias que
comprovadamente não sejam: mutagênicas, teratogênicas ou carcinogênicas
para mamíferos. Os saneantes são classificados quanto ao risco da seguinte
forma:
❖ Risco 1: produtos que em sua forma pura têm pH entre 2 e 11,5.
Esses produtos requerem notificação junto à ANVISA. Incluem-se os
produtos de limpeza em geral e afins.
❖ Risco 2: produtos que em sua forma pura tem pH menor que 2 ou
maior que 11,5. Correspondem a produtos que apresentam potencial
corrosivo, ação antimicrobiana, ação desinfetante. Podem ser à base
de microrganismos ou que apresentem em sua formulação ácidos
inorgânicos como: ácido fluorídrico (HF), ácido nítrico (HNO3) ou ácido
sulfúrico (H2SO4). Esses produtos devem ser registrados junto à
ANVISA.
As principais soluções desinfetantes utilizadas na limpeza de superfícies em
serviços de saúde são: álcool, compostos fenólicos (estão em desuso devido
à toxicidade), compostos liberadores de cloro ativo (podem ser inorgânicos ou
orgânicos), compostos quaternários de amônio, monopersulfetos de potássio,
biguanida polimérica, glucoprotamina e agentes oxidantes.
❖ Manuseio e esterilização de material contaminado e técnicas de

lavagem de material
Funcionários lidam constantemente com materiais contaminados, é

importante que regras sejam seguidas para evitar acidentes e contaminação
dos envolvidos. Os resíduos contaminados podem ser: sangue e secreções
de pacientes com doenças transmissíveis, hemoderivados, resíduos
perfurocortantes, resíduos radioativos, resíduos químicos e outros.
Ao manusear materiais contaminados, é importante que os funcionários

tenham completa atenção e estejam sempre fazendo uso dos EPIs
necessários, como luvas e óculos de proteção. No caso do descarte, as
recomendações devem seguir a legislação vigente (RDC nº 222/2018). Muitos
materiais que entram em contato com contaminantes são reutilizados na
rotina laboratorial, como por exemplo: vidrarias, lâminas e lamínulas, câmaras
de Neubauer, pinças, tesouras, pipetas e etc.
Outros materiais, ainda que sejam descartáveis, acabam sendo manipulados

até o descarte, como por exemplo as agulhas descartáveis. Esses materiais,
após utilizados, devem passar por um processo de desinfecção ou
esterilização, para que assim possam ser reutilizados ou descartados com
segurança.
❖ Vidrarias: as vidrarias usadas em laboratórios devem ser autoclavadas
a uma temperatura de 120º C por 20 minutos e colocadas para secar
em estufa. Tubos de ensaio, frascos e pipetas que estejam sujos de
material proteico devem ser imergidos em solução de hipoclorito a 1%
por, no mínimo, 12 horas.
❖ Lâminas e lamínulas: devem ser colocadas em solução de hipoclorito
a 1% em frasco apropriado e rotulado. As lamínulas devem ser lavadas
no laboratório e postas em vasilhames com álcool na mesa de apoio do
fluxo.
❖ Câmaras de Neubauer e homogeneizadores de vidro: após a
utilização, devem ser colocados em vasilha apropriada com solução de
hipoclorito a 1% por 1 hora. Após esse período, devem ser lavados em
água corrente, secos e guardados.
❖ Frascos, tubos, ponteiras, seringas e tampas (plásticos): esses
materiais, quando contaminados, devem ser imersos em solução de
hipoclorito de sódio a 1%.
❖ Pipetas: as pipetas devem ser colocadas com chumaço de algodão,
embaladas em papel pardo e levadas para esterilização em forno a 170
- 180ºC por 1 hora.
❖ Agulhas descartáveis contaminadas: após a utilização, elas devem
ser colocadas em vasilhame de paredes rígidas com formol a 10% por
24 horas. Devem ser descartadas sem usar o protetor, para evitar o
risco de acidentes (perfuração acidental do dedo).
❖ Instrumentos: críticos, semicríticos e não-críticos:
Os instrumentos utilizados na área médica podem ser classificados de acordo

com o tipo de contato que eles têm com o paciente (contato direto ou
indireto), e isso determina o processo de descontaminação ao qual eles
devem ser submetidos (limpeza, desinfecção ou esterilização). Dessa forma,
os instrumentos ou artigos podem ser classificados como:
❖ Críticos: Aqueles utilizados em procedimentos de alto risco, que

penetram tecidos ou órgãos, expondo os materiais ao contato direto
com sangue ou outros fluidos contaminantes. Requerem esterilização
para uso. Ex: Instrumental cirúrgico, seringas e agulhas, espéculos
ginecológicos, etc.
❖ Semicríticos: São os que têm contato com pele ou mucosa íntegras.
Requerem desinfecção de alto nível ou esterilização para uso. Ex:
Ponteiras de otoscópios, ambus, nebulizadores, etc.
❖ Não-críticos: São de uso externo ao paciente, entrando em contato
apenas com pele íntegra. Devem ter um processamento específico na
forma de limpeza ou desinfecção de baixo nível (se foi exposto a
material biológico). Ex:Termômetro, botões de equipamentos
acionados pelo profissional, mesas auxiliares para procedimentos,
comadres, cubas, etc
❖ Equipamento de Proteção Individual (EPI) e Equipamento de
Proteção Coletiva (EPC)
A realização de atividades em ambiente laboratorial exige o uso de

equipamentos de proteção para preservar a saúde e segurança dos
trabalhadores.
Equipamento de Proteção Individual (EPI) é "todo o equipamento ou

produto de uso individual, utilizado pelo trabalhador, destinado a proteger a
sua saúde dos riscos inerentes às atividades laboratoriais" (Consulta Pública
nº 1, de 10 de outubro de 2008). Ex: luvas, máscaras, óculos de proteção,
escudos faciais e protetores respiratórios (respiradores).
Equipamento de Proteção Coletiva (EPC) é "todo o equipamento de uso

coletivo destinado a proteger a saúde do trabalhador, a comunidade e o meio
ambiente, dos riscos inerentes às atividades laboratoriais" (Consulta Pública
nº 1, de 10 de outubro de 2008). Ex: cabines de segurança biológica (CSB),
capela de segurança química, chuveiro de emergência e lava-olhos
❖ NR 32 - Segurança e saúde no trabalho em serviços de saúde
A Norma Regulamentadora (NR) 32 "Tem por finalidade estabelecer as

diretrizes básicas para a implementação de medidas de proteção à segurança
e à saúde dos trabalhadores dos serviços de saúde, bem como daqueles que
exercem atividades de promoção e assistência à saúde em geral". Esta norma
abrange as situações de exposição a riscos para a saúde do profissional, a
saber: riscos biológicos; riscos químicos; e radiações ionizantes.
A NR 32 estabelece o Programa de Prevenção de Riscos Ambientais (PPRA):

32.2.2.1 O PPRA, além do previsto na NR-09, na fase de reconhecimento,
deve conter:
1. Identificação dos riscos biológicos mais prováveis, em função da
localização geográfica e da característica do serviço de saúde e seus
setores. [...]
2. Avaliação do local de trabalho e do trabalhador. [...]
32.2.2.2 O PPRA deve ser reavaliado 01 (uma) vez ao ano e:

a) sempre que se produza uma mudança nas condições de trabalho, que
possa alterar a exposição aos agentes biológicos;
b) quando a análise dos acidentes e incidentes assim o determinar.
32.2.2.1 O PPRA, além do previsto na NR-09, na fase de reconhecimento,

deve conter:
I. Identificação dos riscos biológicos mais prováveis, em função da localização
geográfica e da característica do serviço de saúde e seus setores. [...]
II. Avaliação do local de trabalho e do trabalhador. [...]
32.2.2.3 Os documentos que compõem o PPRA deverão estar disponíveis

aos trabalhadores.
A NR 32 também estabelece o Programa de Controle Médico de Saúde
Ocupacional (PCMSO):
32.2.3 Do Programa de Controle Médico de Saúde Ocupacional - PCMSO

32.2.3.1 O PCMSO, além do previsto na NR-07, e observando o disposto no
inciso I do item 32.2.2.1, deve contemplar:
a) o reconhecimento e a avaliação dos riscos biológicos;
b) a localização das áreas de risco segundo os parâmetros do item 32.2.2;
c) a relação contendo a identificação nominal dos trabalhadores, sua função,
o local em que desempenham suas atividades e o risco a que estão expostos;
d) a vigilância médica dos trabalhadores potencialmente expostos;
e) o programa de vacinação.
32.2.3.2 Sempre que houver transferência permanente ou ocasional de um

trabalhador para um outro posto de trabalho, que implique em mudança de
risco, esta deve ser comunicada de imediato ao médico coordenador ou
responsável pelo PCMSO.
32.2.3.3 Com relação à possibilidade de exposição acidental aos agentes

biológicos, deve constar do PCMSO:
a) os procedimentos a serem adotados para diagnóstico, acompanhamento e
prevenção da soroconversão e das doenças;
b) as medidas para descontaminação do local de trabalho;
c) o tratamento médico de emergência para os trabalhadores;
d) a identificação dos responsáveis pela aplicação das medidas pertinentes;
e) a relação dos estabelecimentos de saúde que podem prestar assistência
aos trabalhadores;
f) as formas de remoção para atendimento dos trabalhadores;
g) a relação dos estabelecimentos de assistência à saúde depositários de
imunoglobulinas, vacinas, medicamentos necessários, materiais e insumos
especiais.
32.2.3.4 O PCMSO deve estar à disposição dos trabalhadores, bem como da

inspeção do trabalho
❖ Medidas de proteção também são estabelecidas pela NR 32:
32.2.4.1 As medidas de proteção devem ser adotadas a partir do resultado da

avaliação, previstas no PPRA, observando o disposto no item 32.2.2.
32.2.4.1.1 Em caso de exposição acidental ou incidental, medidas de

proteção devem ser adotadas imediatamente, mesmo que não previstas no
PPRA.
32.2.4.2 A manipulação em ambiente laboratorial deve seguir as orientações

contidas na publicação do Ministério da Saúde – Diretrizes Gerais para o
Trabalho em Contenção com Material Biológico, correspondentes aos
respectivos microrganismos.
32.2.4.3 Todo local onde exista possibilidade de exposição ao agente
biológico deve ter lavatório exclusivo para higiene das mãos provido de água
corrente, sabonete líquido, toalha descartável e lixeira provida de sistema de
abertura sem contato manual.
32.2.4.3.1 Os quartos ou enfermarias destinados ao isolamento de pacientes

portadores de doenças infectocontagiosas devem conter lavatório em seu
interior.
32.2.4.3.2 O uso de luvas não substitui o processo de lavagem das mãos, o

que deve ocorrer, no mínimo, antes e depois do uso das mesmas.
32.2.4.4 Os trabalhadores com feridas ou lesões nos membros superiores só

podem iniciar suas atividades após avaliação médica obrigatória com emissão
de documento de liberação para o trabalho.
32.2.4.5 O empregador deve vedar:

a) a utilização de pias de trabalho para fins diversos dos previstos;
b) o ato de fumar, o uso de adornos e o manuseio de lentes de contato nos
postos de trabalho;
c) o consumo de alimentos e bebidas nos postos de trabalho;
d) a guarda de alimentos em locais não destinados para este fim;
e) o uso de calçados abertos.
32.2.4.6 Todos trabalhadores com possibilidade de exposição a agentes

biológicos devem utilizar vestimenta de trabalho adequada e em condições de
conforto.
32.2.4.6.1 A vestimenta deve ser fornecida sem ônus para o empregado.
32.2.4.6.2 Os trabalhadores não devem deixar o local de trabalho com os

equipamentos de proteção individual e as vestimentas utilizadas em suas
atividades laborais.
32.2.4.6.3 O empregador deve providenciar locais apropriados para

fornecimento de vestimentas limpas e para deposição das usadas.
32.2.4.6.4 A higienização das vestimentas utilizadas nos centros cirúrgicos e

obstétricos, serviços de tratamento intensivo, unidades de pacientes com
doenças infectocontagiosa e quando houver contato direto da vestimenta com
material orgânico, deve ser de responsabilidade do empregador.
32.2.4.7 Os Equipamentos de Proteção Individual - EPI, descartáveis ou não,

deverão estar à disposição em número suficiente nos postos de trabalho, de
forma que seja garantido o imediato fornecimento ou reposição.
32.2.4.8 O empregador deve: a) garantir a conservação e a higienização dos

materiais e instrumentos de trabalho; b) providenciar recipientes e meios de
transporte adequados para materiais infectantes, fluidos e tecidos orgânicos.
32.2.4.9 O empregador deve assegurar capacitação aos trabalhadores, antes
do início das atividades e de forma continuada, devendo ser ministrada:
a) sempre que ocorra uma mudança das condições de exposição dos
trabalhadores aos agentes biológicos;
b) durante a jornada de trabalho;
c) por profissionais de saúde familiarizados com os riscos inerentes aos
agentes biológicos.
32.2.4.9.1 A capacitação deve ser adaptada à evolução do conhecimento e à

identificação de novos riscos biológicos e deve incluir:
a) os dados disponíveis sobre riscos potenciais para a saúde;
b) medidas de controle que minimizem a exposição aos agentes;
c) normas e procedimentos de higiene;
d) utilização de equipamentos de proteção coletiva, individual e vestimentas
de trabalho;
e) medidas para a prevenção de acidentes e incidentes;
f) medidas a serem adotadas pelos trabalhadores no caso de ocorrência de
incidentes e acidentes.
32.2.4.9.2 O empregador deve comprovar para a inspeção do trabalho a

realização da capacitação através de documentos que informem a data, o
horário, a carga horária, o conteúdo ministrado, o nome e a formação ou
capacitação profissional do instrutor e dos trabalhadores envolvidos.
32.2.4.10 Em todo local onde exista a possibilidade de exposição a agentes

biológicos, devem ser fornecidas aos trabalhadores instruções escritas, em
linguagem acessível, das rotinas realizadas no local de trabalho e medidas de
prevenção de acidentes e de doenças relacionadas ao trabalho.
32.2.4.10.1 As instruções devem ser entregues ao trabalhador, mediante

recibo, devendo este ficar à disposição da inspeção do trabalho.
]
32.2.4.11 Os trabalhadores devem comunicar imediatamente todo acidente ou
incidente, com possível exposição a agentes biológicos, ao responsável pelo
local de trabalho e, quando houver, ao serviço de segurança e saúde do
trabalho e à CIPA.
32.2.4.12 O empregador deve informar, imediatamente, aos trabalhadores e

aos seus representantes qualquer acidente ou incidente grave que possa
provocar a disseminação de um agente biológico suscetível de causar
doenças graves nos seres humanos, as suas causas e as medidas adotadas
ou a serem adotadas para corrigir a situação.
32.2.4.13 Os colchões, colchonetes e demais almofadados devem ser

revestidos de material lavável e impermeável, permitindo desinfecção e fácil
higienização.
32.2.4.13.1 O revestimento não pode apresentar furos, rasgos, sulcos ou

reentrâncias.
32.2.4.14 Os trabalhadores que utilizarem objetos perfurocortantes devem ser
os responsáveis pelo seu descarte.
32.2.4.15 São vedados o reencape e a desconexão manual de agulhas.
32.2.4.16 O empregador deve elaborar e implementar Plano de Prevenção de

Riscos de Acidentes com Materiais Perfurocortantes, conforme as diretrizes
estabelecidas no Anexo III desta Norma Regulamentadora.
32.2.4.16.1 As empresas que produzem ou comercializam materiais

perfurocortantes devem disponibilizar, para os trabalhadores dos serviços de
saúde, capacitação sobre a correta utilização do dispositivo de segurança.
32.2.4.16.2 O empregador deve assegurar, aos trabalhadores dos serviços de

saúde, a capacitação prevista no subitem 32.2.4.16.1.
32.2.4.17 Da Vacinação dos Trabalhadores

32.2.4.17.1 A todo trabalhador dos serviços de saúde deve ser fornecido,
gratuitamente, programa de imunização ativa contra tétano, difteria, hepatite B
e os estabelecidos no PCMSO.
32.2.4.17.2 Sempre que houver vacinas eficazes contra outros agentes

biológicos a que os trabalhadores estão, ou poderão estar, expostos, o
empregador deve fornecê-las gratuitamente.
32.2.4.17.3 O empregador deve fazer o controle da eficácia da vacinação

sempre que for recomendado pelo Ministério da Saúde e seus órgãos, e
providenciar, se necessário, seu reforço.
32.2.4.17.4 A vacinação deve obedecer às recomendações do Ministério da

Saúde.
32.2.4.17.5 O empregador deve assegurar que os trabalhadores sejam

informados das vantagens e dos efeitos colaterais, assim como dos riscos a
que estarão expostos por falta ou recusa de vacinação, devendo, nestes
casos, guardar documento comprobatório e mantê-lo disponível à inspeção do
trabalho.
32.2.4.17.6 A vacinação deve ser registrada no prontuário clínico individual do

trabalhador, previsto na NR-07.
32.2.4.17.7 Deve ser fornecido ao trabalhador comprovante das vacinas

recebidas
❖ O anexo 3 da NR 32 estabelece um plano de prevenção de riscos

de acidentes com materiais perfurocortantes.
Objetivo "estabelecer diretrizes para a elaboração e implementação de um

plano de prevenção de riscos de acidentes com materiais perfurocortantes
com probabilidade de exposição a agentes biológicos, visando a proteção,
segurança e saúde dos trabalhadores dos serviços de saúde, bem como
daqueles que exercem atividades de promoção e assistência à saúde em
geral". Para implementação deste plano deve ser estabelecida uma Comissão
Gestora Multidisciplinar, regulamentada da seguinte forma:
2. Comissão gestora multidisciplinar:
2.1 O empregador deve constituir uma comissão gestora multidisciplinar, que

tem como objetivo reduzir os riscos de acidentes com materiais
perfurocortantes, com probabilidade de exposição a agentes biológicos, por
meio da elaboração, implementação e atualização de plano de prevenção de
riscos de acidentes com materiais perfurocortantes.
2.2 A comissão deve ser constituída, sempre que aplicável, pelos seguintes
membros:
a) o empregador, seu representante legal ou representante da direção do
serviço de saúde;
b) representante do Serviço Especializado em Engenharia de Segurança e
em Medicina do Trabalho - SESMT, conforme a Norma Regulamentadora n.º
4;
c) vice-presidente da Comissão Interna de Prevenção de Acidentes - CIPA ou
o designado responsável pelo cumprimento dos objetivos da Norma
Regulamentadora n.º 5, nos casos em que não é obrigatória a constituição de
CIPA;
d) representante da Comissão de Controle de Infecção Hospitalar;
e) direção de enfermagem
f) direção clínica;
g) responsável pela elaboração e implementação do PGRSS - Plano de
Gerenciamento de Resíduos de Serviço de Saúde;
h) representante da Central de Material e Esterilização;
i) representante do setor de compras; e
j) representante do setor de padronização de material.
3. Análise dos acidentes de trabalho ocorridos e das situações de risco com

materiais perfurocortantes:
3.1 A Comissão Gestora deve analisar as informações existentes no PPRA e

no PCMSO, além das referentes aos acidentes do trabalho ocorridos com
materiais perfurocortantes.
3.2 A Comissão Gestora não deve se restringir às informações previamente

existentes no serviço de saúde, devendo proceder às suas próprias análises
dos acidentes do trabalho ocorridos e situações de risco com materiais
perfurocortantes.
3.3 A Comissão Gestora deve elaborar e implantar procedimentos de registro

e investigação de acidentes e situações de risco envolvendo materiais
perfurocortantes.
4. Estabelecimento de prioridades:
4.1 A partir da análise das situações de risco e dos acidentes de trabalho
ocorridos com materiais perfurocortantes, a Comissão Gestora deve
estabelecer as prioridades, considerando obrigatoriamente os seguintes
aspectos:
a) situações de risco e acidentes com materiais perfurocortantes que
possuem maior probabilidade de transmissão de agentes biológicos
veiculados pelo sangue;
b) frequência de ocorrência de acidentes em procedimentos com utilização de
um material perfurocortante específico;
c) procedimentos de limpeza, descontaminação ou descarte que contribuem
para uma elevada ocorrência de acidentes; e
d) número de trabalhadores expostos às situações de risco de acidentes com
materiais perfurocortantes.
5. Medidas de controle para a prevenção de acidentes com materiais

perfurocortantes:
5.1 A adoção das medidas de controle deve obedecer à seguinte hierarquia:

a) substituir o uso de agulhas e outros perfurocortantes quando for
tecnicamente possível;
b) adotar controles de engenharia no ambiente (por exemplo, coletores de
descarte);
c) adotar o uso de material perfurocortante com dispositivo de segurança,
quando existente, disponível e tecnicamente possível; e
d) mudanças na organização e nas práticas de trabalho.
❖ Classificação de risco dos agentes biológicos
De acordo com a NR 32, consideram-se agentes biológicos os

microrganismos, geneticamente modificados ou não; as culturas de células;
os parasitas; as toxinas e os príons.
A NR 32 faz as seguintes considerações sobre a classificação dos agentes

biológicos: Para a classificação correta dos agentes utilizando-se esta tabela,
deve-se considerar que:
a) a não identificação de um determinado agente na tabela não implica em
sua inclusão automática na classe de risco 1, devendo-se conduzir, para isso,
uma avaliação de risco, baseada nas propriedades conhecidas ou potenciais
desses agentes e de outros representantes do mesmo gênero ou família.
b) os organismos geneticamente modificados não estão incluídos na tabela.
c) no caso dos agentes em que estão indicados apenas o gênero, devem-se
considerar excluídas as espécies e cepas não patogênicas para o homem.
d) todos os vírus isolados em seres humanos, porém não incluídos na tabela,
devem ser classificados na classe de risco 2, até que estudos para sua
classificação estejam concluídos.
Classe de risco 1: Baixo risco individual para o trabalhador e para a

coletividade, com baixa probabilidade de causar doença ao ser humano. Ex:
Bacillus subtilis, Bacillus polimyxa, Lactobacillus sp., Lactococcus spp.,
Saccharomyces e cepas não patogênicas de E. coli.
Classe de risco 2: Risco individual moderado para o trabalhador e com baixa

probabilidade de disseminação para a coletividade. Podem causar doenças
ao ser humano, para as quais existem meios eficazes de profilaxia ou
tratamento. Ex: Bactérias: Clostridium tetani; Helicobacter pylori; Klebsiella
pneumoniae; Leptospira interrogans; Mycobacterium leprae; Neisseria
gonorrhoeae; Neisseria meningitidis; Salmonella spp; Staphylococcus aureus;
Streptococcus spp; Treponema pallidum; Vibrio cholerae; Vírus: hepatite virais
(A a E); Dengue tipos 1-4; Chikungunya; Zika; Herpes simplex (vírus tipos 1 e
2); Epstein-Barr; Influenza tipos A, B e C; Papiloma humano; Sarampo;
Rubéola; Caxumba; Citomegalovírus; Rotavírus; Parasitas: Ascaris
lumbricoides, Entamoeba histolytica, Giardia spp, Leishmania spp,
Plasmodium spp, Schistosoma mansoni, Taenia saginata, Taenia solium,
Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi, etc.; Quase todos os fungos.
Classe de risco 3: Risco individual elevado para o trabalhador e com

probabilidade de disseminação para a coletividade. Podem causar doenças e
infecções graves ao ser humano, para as quais nem sempre existem meios
eficazes de profilaxia ou tratamento. Ex: Bacillus anthracis; Clostridium
botulinum; Mycobacterium tuberculosis; Yersinia pestis; HIV - Vírus da
Imunodeficiência Humana; Vírus Linfotrópicos das células T humana (HTLV-1
e HTLV-2); Vírus da Raiva, Vírus da Febre Amarela.
Classe de risco 4: Risco individual elevado para o trabalhador e com

probabilidade elevada de disseminação para a coletividade. Apresentam
grande poder de transmissibilidade de um indivíduo a outro. Podem causar
doenças graves ao ser humano, para as quais não existem meios eficazes de
profilaxia ou tratamento. Ex: Vírus Ebola; Vírus da Febre Hemorrágica; Vírus
da Aftosa com seus diversos tipos e variantes; Vírus da Varíola.
Classe de risco: 1, 2, 3, 4
Risco individual para o trabalhador: Baixo, moderado, elevado, elevado
Risco de disseminação para a coletividade: Baixo, limitado, moderado,
elevado.
Meios eficazes de profilaxia ou tratamento: -, existem, nem sempre
existem, não existem
Classificação de risco de Escherichia coli:

❖ Classe de risco 1: cepas não patogênicas de E. coli;
❖ Classe de risco 2: todas as cepas enteropatogênicas,
enterotoxigênicas, enteroinvasivas e detentoras do antígeno K 1 de E.
coli;
❖ Classe de risco 3: cepas verocitotóxicas de E. coli (por exemplo
O157:H7 ou O103).
❖ Níveis de biossegurança
De acordo com a Consulta Pública nº 1, de 10 de outubro de 2008 "consiste
na combinação de práticas e técnicas de laboratório, equipamentos de
proteção de segurança e instalações laboratoriais. Define a contenção
necessária ao trabalho com agentes biológicos, de forma segura para os
seres humanos, os animais e o ambiente. Aplica-se também ao manejo de
animais".
Envolvem um conjunto de precauções de contenção necessárias para isolar
agentes biológicos nocivos em uma instalação laboratorial fechada. De
acordo com a RDC nº 50/2002, os laboratórios podem ser classificados em
quatro níveis de biossegurança: NB-1, NB-2, NB-3 e NB-4, "crescentes no
maior grau de contenção e complexidade do nível de proteção, que consistem
de combinações de práticas e técnicas de laboratório e barreiras primárias e
secundárias de um laboratório".
O nível de biossegurança de um laboratório é definido a partir de uma

avaliação dos riscos em função dos agentes que são manipulados e das
atividades que são realizadas."O responsável técnico pelo laboratório é o
responsável pela avaliação dos riscos e pela aplicação adequada dos níveis
de biossegurança aqui descritos, em função dos tipos de agentes e das
atividades a serem realizadas. Poderão ser adotadas práticas mais ou menos
rígidas quando existir informação específica disponível que possa sugerir a
virulência, a patogenicidade, os padrões de resistência a antibióticos, a vacina
e a disponibilidade de tratamento, ou outros fatores significadamente
alterados" (RDC nº 50/2002).
No nível mais baixo de biossegurança, adotam-se precauções mais simples,

como a lavagem regular das mãos e uso de equipamentos de proteção mais
básicos. Em níveis mais altos de biossegurança, as precauções adotadas se
tornam progressivamente mais complexas, podendo incluir sistemas de fluxo
de ar, várias salas de contenção, roupas protetoras com pressão positiva,
protocolos mais rígidos estabelecidos para todos os procedimentos,
treinamento extensivo de pessoal e acesso altamente restrito à instalação.
Vejamos a seguir como a ANVISA define cada nível de biossegurança:
NB-1 - Nível de Biossegurança 1:

❖ Representa um nível básico de contenção que se baseia nas práticas
padrões de microbiologia sem uma indicação de barreiras primárias ou
secundárias, com exceção de uma pia para a higienização das mãos.
❖ As práticas, o equipamento de segurança e o projeto das instalações
são apropriados para o treinamento educacional secundário ou para o
treinamento de técnicos, e de professores de técnicas laboratoriais. Este
conjunto também é utilizado em outros laboratórios onde o trabalho com
cepas definidas e caracterizadas de microrganismos viáveis e
conhecidos por não causarem doenças em homens adultos e sadios é
realizado. O Bacillus subtilis, o Naegleria gruberi, o vírus da hepatite
canina infecciosa e organismos livres sob as Diretrizes do NIH de DNA
Recombinantes são exemplos de microrganismos que preenchem todos
estes requisitos descritos acima.
❖ Muitos agentes que geralmente não estão associados a processos
patológicos em homens são, entretanto, patógenos oportunos e que
podem causar uma infecção em jovens, idosos e indivíduos
imunossupressivos ou imunodeprimidos. As cepas de vacina que
tenham passado por múltiplas passagens in vivo não deverão ser
consideradas não virulentas simplesmente por serem cepas de vacinas.

❖ As práticas, os equipamentos, o projeto e a construção são aplicáveis
aos laboratórios clínicos, de diagnóstico, laboratórios-escolas e outros
laboratórios onde o trabalho é realizado com um maior espectro de
agentes nativos de risco moderado presentes na comunidade e que
estejam associados a uma patologia humana de gravidade variável.
Com boas técnicas de microbiologia, esses agentes podem ser usados
de maneira segura em atividades conduzidas sobre uma bancada
aberta, uma vez que o potencial para a produção de borrifos e aerossóis
é baixo. O vírus da hepatite B, o HIV, a Salmonella spp. e Toxoplasma
spp. são exemplos de microrganismos designados para este nível de
contenção. O nível de Biossegurança 2 é adequado para qualquer
trabalho que envolva sangue humano, líquidos corporais, tecidos ou
linhas de células humanas primárias onde a presença de um agente
infeccioso pode ser desconhecida.
❖ Embora os organismos rotineiramente manipulados em um NB2 não
sejam transmitidos através de aerossóis, os procedimentos envolvendo
um alto potencial para a produção de salpicos ou aerossóis que possam
aumentar o risco de exposição destes funcionários devem ser
conduzidos com um equipamento de contenção primária ou com
dispositivos como a Cabine de Segurança Biológica (CSB) ou os copos
de segurança da centrífuga. Outras barreiras primárias, como os
escudos para borrifos, proteção facial, aventais e luvas, devem ser
utilizadas.
❖ As barreiras secundárias, como pias para higienização das mãos e
instalações para descontaminação de lixo, devem existir com o objetivo
de reduzir a contaminação potencial do meio ambiente.

❖ As práticas, o equipamento de segurança, o planejamento e construção
das dependências são aplicáveis para laboratórios clínicos, de
diagnóstico, laboratório-escola, de pesquisa ou de produções. Nesses
locais realiza-se o trabalho com agentes nativos ou exóticos que
possuam um potencial de transmissão via respiratória e que possam
causar infecções sérias e potencialmente fatais. O Mycobacterium
tuberculosis, o vírus da encefalite de St. Louis e a Coxiella burnetii são
exemplos de microrganismos determinados para este nível. Os riscos
primários causados aos trabalhadores que lidam com estes agentes
incluem a autoinoculação, a ingestão e a exposição aos aerossóis
infecciosos.
❖ No NB3, enfatizam-se mais as barreiras primárias e secundárias para
protegerem os funcionários de áreas contíguas, a comunidade e o meio
ambiente contra a exposição aos aerossóis potencialmente infecciosos.
Por exemplo, todas as manipulações laboratoriais deverão ser
realizadas em uma cabine de segurança biológica (CSB) ou em outro
equipamento de contenção, como uma câmara hermética de geração de
aerossóis. As barreiras secundárias para este nível incluem o acesso
controlado ao laboratório e sistemas de ventilação que minimizam a
liberação de aerossóis infecciosos do laboratório.

❖ As práticas, o equipamento de segurança, o planejamento e construção
das dependências são aplicáveis para trabalhos que envolvam agentes
exóticos perigosos que representam um alto risco por provocarem
doenças fatais em indivíduos. Estes agentes podem ser transmitidos via
aerossóis, e até o momento não há nenhuma vacina ou terapia
disponível. Os agentes que possuem uma relação antigênica próxima ou
idêntica a dos agentes do NB4 também deverão ser manuseados neste
nível. Quando possuímos dados suficientes, o trabalho com esses
agentes deve continuar neste nível ou em um nível inferior. Os vírus
como Marburg ou vírus da febre hemorrágica Criméia – Congo são
manipulados no Nível de Biossegurança 4.
❖ Os riscos primários aos trabalhadores que manuseiam agentes do NB4
incluem a exposição respiratória aos aerossóis infecciosos, exposição da
membrana mucosa e/ou da pele lesionada às gotículas infecciosas e a
autoinoculação. Todas as manipulações de materiais de diagnóstico
potencialmente infeccioso, substâncias isoladas e animais naturalmente
ou experimentalmente infectados apresentam um alto risco de exposição
e infecção aos funcionários de laboratório, à comunidade e ao meio
ambiente.
❖ O completo isolamento dos trabalhadores de laboratórios em relação
aos materiais infecciosos aerossolizados é realizado primariamente em
cabines de segurança biológica Classe III ou com um macacão individual
suprido com pressão de ar positivo. A instalação do NB4 é geralmente
construída em um prédio separado ou em uma zona completamente
isolada, com uma complexa e especializada ventilação e sistemas de
gerenciamento de lixo que evitem uma liberação de agentes viáveis no
meio ambiente.
Apesar de o vírus HIV pertencer à classe de risco 3, os laboratórios que

trabalham com DSTs, AIDS e hepatites virais são normalmente NB2, podendo
ter áreas de NB3, dependendo dos fatores de avaliação de risco e das
técnicas que são utilizadas.
❖ Classificação dos Principais Riscos Ocupacionais
A Consulta Pública nº 1/2008 define risco como a "probabilidade de

ocorrência de efeitos adversos à saúde humana, animal e ao ambiente".
Neste contexto, os riscos ocupacionais podem ser classificados em cinco
grandes grupos:
❖ Riscos físicos: diversas formas de energia a que possam estar
expostos os trabalhadores, tais como: ruído, calor, frio, pressão,
umidade, radiações ionizantes e não-ionizantes, vibração, etc.
❖ Riscos químicos: as substâncias, compostos ou produtos que possam
penetrar no organismo do trabalhador pela via respiratória, nas formas
de poeiras, fumos gases, neblinas, névoas ou vapores, ou que seja, pela
natureza da atividade, de exposição, possam ter contato ou ser
absorvidos pelo organismo através da pele ou por ingestão.
❖ Riscos biológicos: as bactérias, vírus, fungos, parasitos, entre outros.
❖ Riscos ergonômicos: Qualquer fator que possa interferir nas
características psicofisiológicas do trabalhador, causando desconforto ou
afetando sua saúde. São exemplos de risco ergonômico: o levantamento
de peso, ritmo excessivo de trabalho, monotonia, repetitividade, postura
inadequada de trabalho, etc.
❖ Riscos de acidentes: Qualquer fator que coloque o trabalhador em
situação vulnerável e possa afetar sua integridade, e seu bem-estar
físico e psíquico. São exemplos de risco de acidente: as máquinas e
equipamentos sem proteção, probabilidade de incêndio e explosão,
arranjo físico inadequado, armazenamento inadequado, etc.
Esta classificação estava presente na antiga versão da NR5 da Portaria nº

3.214 de 08 de junho de 1978. A nova versão da norma não contempla mais
essa classificação, porém ela se tornou consagrada e sempre é cobrada em
provas de concurso.
NR-9 (Programa De Prevenção de Riscos Ambientais) traz o conceito de risco

ambiental, seguindo a seguinte classificação:
9.1.5 Para efeito desta NR, consideram-se riscos ambientais os agentes

físicos, químicos e biológicos existentes nos ambientes de trabalho que, em
função de sua natureza, concentração ou intensidade e tempo de exposição,
são capazes de causar danos à saúde do trabalhador.
9.1.5.1 Consideram-se agentes físicos as diversas formas de energia a que

possam estar expostos os trabalhadores, tais como: ruído, vibrações,
pressões anormais, temperaturas extremas, radiações ionizantes, radiações
não ionizantes, bem como o infrassom e o ultrassom.
9.1.5.2 Consideram-se agentes químicos as substâncias, compostos ou

produtos que possam penetrar no organismo pela via respiratória, nas formas
de poeiras, fumos, névoas, neblinas, gases ou vapores, ou que, pela natureza
da atividade de exposição, possam ter contato ou ser absorvidos pelo
organismo através da pele ou por ingestão.
9.1.5.3 Consideram-se agentes biológicos as bactérias, fungos, bacilos,

parasitas, protozoários, vírus, entre outros. Note que as definições de riscos
físicos, químicos e biológicos são as mesmas, porém não há menção aos
riscos ergonômicos e de acidentes nesta norma..
❖ Protocolos preconizados para acidentes profissionais

Os profissionais que trabalham em laboratórios estão sob constante risco de
acidentes, seja por contato com materiais biológicos contaminados, produtos
químicos, equipamentos, vidrarias ou materiais perfurocortantes. Por este
motivo, é importante que existam protocolos padronizados tanto para a
prevenção de acidentes, quanto para aplicação em caso de ocorrência de
algum acidente profissional. Em relação à contaminação biológica, as
principais vias de contaminação são:
❖ Cutânea ou percutânea: pode acontecer através de lesões ou até
mesmo na ausência delas. Ex: acidentes com perfurocortantes,
derramamento ou respingos de amostras biológicas, arranhões e
mordidas de animais de experimentação, etc.
❖ Respiratória: através de aerossóis, • conjuntiva: contato de
contaminantes com os olhos,
❖ Oral: contato de contaminantes com a mucosa oral.
Visando à segurança individual e coletiva no ambiente laboratorial, é

necessária a adoção de diversas condutas preventivas, ou regras básicas
neste ambiente. Dentre estas regras, podemos citar:
❖ Usar vestimentas adequadas: calças compridas, sapatos fechados e
jaleco; Usar EPIs quando realizar alguma tarefa que os exija;
❖ Cabelos longos devem estar sempre presos;
❖ Não usar adornos e piercings;
❖ Evitar o uso de maquiagem e outros cosméticos;
❖ Evitar o uso de lentes de contato;
❖ Não colocar objetos na boca;
❖ NUNCA pipetar com a boca, sempre usar pipetadores;
❖ Manter as unhas curtas;Lavar as mãos ao chegar e sair do laboratório,
antes e depois de manipular qualquer amostra ou produto químico ou
realizar qualquer procedimento;
❖ Após a lavagem das mãos, aplicar antisséptico (preferencialmente álcool
a 70%);
❖ O uso de luvas não dispensa a necessidade de lavar as mãos;
❖ Não comer, beber ou fumar dentro do laboratório;
❖ Não armazenar ou aquecer alimentos utilizando os equipamentos do
laboratório;
❖ Não manipular aparelhos celulares enquanto estiver realizando algum
procedimento;
❖ Limpar e descontaminar as superfícies das bancadas antes e após a
realização de qualquer procedimento e imediatamente após a ocorrência
de respingos ou derramamentos;
❖ Todo material potencialmente contaminado por agentes biológicos deve
ser descontaminado por autoclavação ou por processos químicos;
❖ Vidrarias quebradas e outros instrumentos perfurocortantes devem ser
descartados em embalagem própria, com paredes rígidas e devidamente
identificada;
❖ Não tocar em maçanetas, telefones e outros objetos de uso comum
enquanto estiver utilizando luvas.
❖ Não utilizar luvas e jaleco fora do ambiente laboratorial;
❖ Luvas descartáveis devem ser descartadas de forma segura e jamais
devem ser reutilizadas;
❖ Verificar a voltagem correta dos equipamentos (110 ou 220V) antes de
ligá-los.
❖ Exposição a material biológico
Deve-se imediatamente lavar a região exposta com água e sabão (pele) ou

com água ou soro fisiológico (mucosas). Não se deve utilizar antissépticos e
soluções irritantes (hipoclorito de sódio, glutaraldeído, éter) no local do
ferimento.
O indivíduo acidentado deve ser encaminhado para um serviço de saúde

especializado, onde será verificado (e atualizado, se necessário) o status de
imunização contra tétano. Também serão iniciadas medidas de
quimioprofilaxia contra HIV e hepatite B e será realizado um
acompanhamento sorológico para estes agentes. No caso de indicação de
uso de antirretrovirais, esta terapia deverá se iniciar dentro de 1 a 2 horas
após o acidente.
❖ Derramamento de material biológico
As outras pessoas devem deixar o ambiente imediatamente. A pessoa que for

realizar a limpeza deve usar EPIs e cobrir o material derramado com papel
toalha ou outro material absorvente. Derramar hipoclorito de sódio sobre o
papel toalha, iniciando pelas extremidades e avançando para o centro e
deixar agir por 30 minutos. Descartar todos os materiais e desinfetar a área
com álcool etílico a 70%.
❖ Quebra de tubos no interior da centrífuga
Deve-se desligar o equipamento e mantê-lo fechado por 30 minutos, para

reduzir a dispersão de aerossóis ao abrir a tampa. A seguir, deve-se descartar
os fragmentos de tubos quebrados com muito cuidado e usar substância
desinfetante para descontaminar a centrífuga, incluindo o rotor e as caçapas.
❖ Quebra de tubos no interior de estufas bacteriológicas
Todas as pessoas devem deixar a sala onde ocorreu o acidente e ninguém

deve entrar por pelo menos 1 hora. Após este período, a pessoa que irá
realizar os procedimentos deve retornar, equipada com os EPIs apropriados e
realizar a descontaminação com descontaminantes químicos (álcool etílico a
70%, hipoclorito de sódio, produtos fenólicos) que não danifiquem o
equipamento.
Deve-se autoclavar as partes removíveis (bandejas e estantes) e os materiais

devem ser transferidos para outra estufa, após desinfecção. Proceder com o
descarte dos materiais cortantes em recipientes apropriados. Limpar toda a
estufa com detergente neutro, seguindo as recomendações do fabricante, e
proceder com desinfecção com álcool a 70% ou outro desinfetante.
❖ Derramamento de produtos químicos
O primeiro passo é consultar a ficha de informação de segurança do produto

químico (FISPQ) e seguir as orientações contidas no documento. Deve-se
proceder com a absorção do material derramado, seguindo as orientações da
FISPQ, e depois realizar uma limpeza do local, sempre utilizando EPIs.
No caso de derramamento de ácidos ou produtos corrosivos, o líquido deve

ser imediatamente absorvido com substâncias como mantas ou vermiculita.
Se o derramamento do produto ocorrer sobre o trabalhador, ele deve se

encaminhar imediatamente para o chuveiro de emergência, remover as
roupas atingidas e lavar as áreas afetadas por 15 minutos ou enquanto ainda
sentir alguma dor ou ardência.
❖ Resíduos de serviços de saúde - RDC Nº 222/2018
Regulamenta as Boas Práticas de Gerenciamento dos Resíduos de Serviços

de Saúde, foi publicada pela ANVISA em substituição à RDC nº 306, de 7 de
dezembro de 2004. Esta Resolução se aplica aos geradores de resíduos de
serviços de saúde (RSS) cujas atividades envolvam qualquer etapa do
gerenciamento dos RSS, sejam eles públicos e privados, filantrópicos, civis ou
militares, incluindo aqueles que exercem ações de ensino e pesquisa.
São considerados como geradores de RSS "todos os serviços cujas

atividades estejam relacionadas com a atenção à saúde humana ou animal,
inclusive os serviços de assistência domiciliar; laboratórios analíticos de
produtos para saúde; necrotérios, funerárias e serviços onde se realizem
atividades de embalsamamento (tanatopraxia e somatoconservação);
serviços de medicina legal; drogarias e farmácias, inclusive as de
manipulação; estabelecimentos de ensino e pesquisa na área de saúde;
centros de controle de zoonoses; distribuidores de produtos farmacêuticos,
importadores, distribuidores de materiais e controles para diagnóstico in vitro;
unidades móveis de atendimento à saúde; serviços de acupuntura; serviços
de piercing e tatuagem, salões de beleza e estética, dentre outros afins".
Contudo, a RDC nº 222/2018 "não se aplica a fontes radioativas seladas, que

devem seguir as determinações da Comissão Nacional de Energia Nuclear -
CNEN, e às indústrias de produtos sob vigilância sanitária, que devem
observar as condições específicas do seu licenciamento ambiental".
Em relação ao conceito de Resíduos de Serviços de Saúde, a Consulta

Pública nº 1/2008 os define como "todos aqueles resultantes de atividades
exercidas nos serviços de saúde, que por suas características, necessitam de
processos diferenciados em seu manejo, exigindo ou não tratamento prévio à
sua disposição final".
Em seu capítulo II, a RDC nº 222/2018 estabelece o Plano De Gerenciamento
dos Resíduos de Serviços de Saúde (PGRSS), que é um "documento que
aponta e descreve todas as ações relativas ao gerenciamento dos resíduos
de serviços de saúde, observadas suas características e riscos,
contemplando os aspectos referentes à geração, identificação, segregação,
acondicionamento, coleta, armazenamento, transporte, destinação e
disposição final ambientalmente adequada, bem como as ações de proteção
à saúde pública, do trabalhador e do meio ambiente".
Em relação ao PGRSS, a RDC nº 222/2018 diz que

Art. 4º O gerenciamento dos RSS deve abranger todas as etapas de
planejamento dos recursos físicos, dos recursos materiais e da capacitação
dos recursos humanos envolvidos.
Art. 5º Todo serviço gerador deve dispor de um Plano de Gerenciamento de

RSS (PGRSS), observando as regulamentações federais, estaduais,
municipais ou do Distrito Federal. [...]
Art. 10 O serviço gerador de RSS é responsável pela elaboração,

implantação, implementação e monitoramento do PGRSS. Parágrafo único. A
elaboração, a implantação e o monitoramento do PGRSS pode ser
terceirizada.
No capítulo III, a RDC nº 222/2018 trata das etapas de manejo, que incluem:
segregação, acondicionamento e identificação; coleta e transporte interno;
armazenamento interno, temporário e externo; coleta e transporte externos; e
destinação.
O artigo 13 da RDC nº 222/2018 diz que:

Art. 13 Os RSS no estado sólido, quando não houver orientação específica,
devem ser acondicionados em saco constituído de material resistente a
ruptura, vazamento e impermeável.
§ 1º Devem ser respeitados os limites de peso de cada saco, assim como o
limite de 2/3 (dois terços) de sua capacidade, garantindo-se sua integridade e
fechamento.
§ 2º É proibido o esvaziamento ou reaproveitamento dos sacos.
O artigo 15 da RDC nº 222/2018 diz que: "Os RSS do Grupo A que não
precisam ser obrigatoriamente tratados e os RSS após o tratamento são
considerados rejeitos e devem ser acondicionados em saco branco leitoso".
Porém, os meios de cultura, que pertencem ao grupo A, subgrupo A1,
precisam ser tratados antes de ser descartados.
De acordo com o parágrafo único do artigo 89 da RDC nº 222/2018: "É

permitida a separação do conjunto seringa agulha com auxílio de dispositivos
de segurança, sendo vedada a desconexão e o reencape manual de
agulhas".
Por fim, a parte que é mais cobrada da RDC nº 222/2018 é a classificação

dos resíduos de serviços de saúde, que está descrita no anexo I da
resolução. Os RSS são divididos em grupos A, B, C, D e E, sendo que o
grupo A é subdividido em subgrupos A1, A2, A3, A4 e A5.
❖ O grupo A abrange "resíduos com a possível presença de agentes

biológicos que, por suas características, podem apresentar risco de
infecção".
❖ O grupo B compreende "resíduos contendo produtos químicos que
apresentam periculosidade à saúde pública ou ao meio ambiente,
dependendo de suas características de inflamabilidade, corrosividade,
reatividade, toxicidade, carcinogenicidade, teratogenicidade,
mutagenicidade e quantidade".
❖ O grupo C os rejeitos radioativos, ou seja, "qualquer material que
contenha radionuclídeo em quantidade superior aos níveis de dispensa
especificados em norma da CNEN e para os quais a reutilização é
imprópria ou não prevista".
❖ O grupo D inclui os resíduos comuns, ou seja, "resíduos que não
apresentam risco biológico, químico ou radiológico à saúde ou ao meio
ambiente, podendo ser equiparados aos resíduos domiciliares".
❖ O grupo E estão os "materiais perfurocortantes ou escarificantes, tais
como: lâminas de barbear, agulhas, escalpes, ampolas de vidro,
brocas, limas endodônticas, pontas diamantadas, lâminas de bisturi,
lancetas; tubos capilares; ponteiras de micropipetas; lâminas e
lamínulas; espátulas; e todos os utensílios de vidro quebrados no
laboratório (pipetas, tubos de coleta sanguínea e placas de Petri) e
outros similares".
❖ Guia de Procedimentos Gerais de Experimentação Biotério

O manejo adequado de animais de laboratório implica na interação de
diversos fatores físicos, químicos, biológicos e da responsabilidade e
profissionalismo do bioterista.
Biotérios são as instalações capazes de produzir e manter espécies animais
destinadas a servir como reagentes biológicos em diversos tipos de ensaios
controlados, para atender as necessidades dos programas de pesquisa,
ensino, produção e controle de qualidade nas áreas biomédicas,
farmacológicas e biotecnológicas segundo a finalidade de cada Instituição.
É necessário que os biotérios sejam construídos amparados em rígidos

critérios de biossegurança e em também quanto à sua organização funcional,
espacial, permitindo assim a criação ou a experimentação animal, dentro dos
padrões preconizados de higiene, assepsia e segurança, necessários à
obtenção ou a utilização de diferentes espécies animais.
A escrita de pesquisas deve ser fundamentada em dados in vitro ou em

literatura prévia, de acordo com a linha de pesquisa desenvolvida pelo usuário
do biotério. O número de animais bem como o delineamento experimental
deve ser descrito detalhadamente tanto no projeto quanto no formulário a ser
enviado para a CEUA (Comissão de Ética na Utilização de Animais).
❖ Documentos necessários para utilização do biotério

A leitura desse documento deve ser realizada na íntegra antes da escrita do
projeto a ser realizado no biotério em questão. A utilização do biotério é
realizada mediante a programação da chegada de animais e entrega de
documentos por parte dos usuários.
O pesquisador deverá enviar uma solicitação de animais conforme

especificado no site. Contudo, para o recebimento dos animais solicitados, o
pesquisador deverá ter a autorização do projeto emitida pela Comissão de
Ética no Uso de Animais Experimentais (CEUA), sendo que a confirmação do
pedido dos animais ao Biotério Central só será realizada mediante este
número de aprovação. Uma cópia desta aprovação deverá ser encaminhada
também ao médico veterinário responsável-técnico (MV-RT) deste biotério,
indicando que o projeto poderá ser realizado, juntamente com outros
documentos citados a seguir.
Os pesquisadores podem solicitar ao CEUA até 10% do número total de

animais que serão utilizados no experimento para piloto ou reposição de
animais em caso de óbito. Todos os usuários do biotério deverão ter
concluído o treinamento on-line para uso de animais experimentais,
independentemente de ter experiência prévia com animais de laboratório.
Uma cópia do certificado desse treinamento também deverá ser entregue ao
MV-RT do biotério (verificar o tipo de certificado necessário).
Todos os membros da equipe necessitam preencher a ficha de usuário,

anexando nela uma foto 3x4. Além desses documentos individuais, é preciso
preencher o formulário de procedimentos com uso de animais experimentais,
sendo um formulário por experimento, a ser entregue juntamente aos
documentos já citados. De forma resumida, deverão ser entregues ao MV-RT
do biotério, 15 dias antes da chegada dos animais:
1) Cópia do certificado do treinamento on-line de cada usuário (docentes,
discentes e pesquisadores responsáveis)
2) Cópia da declaração da Comissão de Ética (CEUA);
3) Ficha dos usuários envolvidos no projeto com foto;
4) Formulário sobre os procedimentos.
❖ As Barreiras Sanitárias
São imprescindíveis nos biotérios de Criação e Manutenção/Experimentação.

São definidas como mecanismos físicos, químicos e biológicos que dificultam
ou minimizam os efeitos da interação entre agentes biológicos de risco com o
homem e o animal e que são necessárias de acordo com o grau de risco do
agente envolvido.
São exemplos de barreiras sanitárias: materiais utilizados na construção dos

Biotérios (isolantes térmicos, impermeabilizantes), equipamentos para a
filtração de ar, autoclaves, higiene pessoal da equipe de funcionários do setor
e dos usuários de animais, pressão diferencial entre ambientes, compostos
químicos utilizados em desinfecção e esterilização, etc.
O ambiente do biotério requer cuidados rigorosos, pois os animais vivem em
ambientes artificiais, recebem dieta padronizada e, na maioria dos
experimentos, as doenças são artificialmente induzidas. Estes animais
dependem totalmente do técnico responsável pelo biotério para suprir suas
necessidades nutricionais e pelo seu bem estar.
Deve-se também obter apenas animais com padrão sanitário definido,

adotando-se barreiras sanitárias eficientes no biotério, para diminuir as
chances de contaminação, pois isto poderia ocasionar doença ou morte
destes animais propiciando falhas nos resultados das pesquisas.
É necessário o monitoramento cuidadoso da saúde dos animais e dos
técnicos a fim de se evitar doenças que podem ser transmitidas do homem
para os animais e vice-versa.
Quanto mais eficientes são as barreiras sanitárias dos biotérios, sejam estes
de Criação ou Manutenção/Experimentação, menores as chances de
contaminação dos animais e do homem.
❖ Equipamentos de Proteção Individual (EPI) necessários para a

utilização do biotério
O uso do biotério deve ser feito pensando em manter os experimentos

sempre dentro dos padrões estabelecidos no projeto, evitando-se
contaminações e possíveis desvios de resultado. Com base nisso, deve-se
utilizar equipamentos de proteção individual (EPI) para evitar a transmissão
de patógenos entre os animais e destes para o manipulador e pesquisador.
Antes de entrar no biotério, o usuário deverá verificar se sua vestimenta está

compatível com o ambiente de pesquisa: sapatos fechados, calça comprida
ou saia comprida e deve-se evitar o uso de perfumes. Os EPIs são de
responsabilidade dos usuários, que deverão adquiri-los previamente a ida ao
Biotério.
Na área destinada à paramentação, o usuário deverá: colocar o jaleco (limpo

ou descartável e exclusivo para o biotério), máscara (limpa e descartável, de
uso exclusivo para o biotério), gorro descartável, propés descartáveis e luvas
descartáveis. Deve-se salientar que os materiais descartáveis deverão ser
jogados no lixo infectante após a saída do biotério, não sendo possível sua
reutilização. No caso de jaleco de tecido reutilizável, este deverá ser lavado
separadamente das demais peças de roupas do usuário.
O uso correto de EPI colabora para o bom andamento dos experimentos e

evita a saída de microrganismos próprios dos animais manipulados para o
exterior do biotério, uma vez que em imunossuprimidos ou em casos de
patógenos específicos é possível a transmissão do microrganismo ao ser
humano, doença conhecida como zoonose.
❖ Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA)

Grupo de pessoas: pesquisadores, veterinários, não pesquisadores e
atuantes na proteção animal, que tem como propósito zelar pelo cumprimento
das leis referentes ao uso de animais em pesquisa e avaliam a utilização sob
justificativa adequada para a proposta do projeto.
A CEUA deve garantir a adesão do princípio dos 3Rs por todos os envolvidos
nesses estudos envolvendo animais do inglês: replacement, reduction and
refinement, foi criado por Russel and Burch em 1959 e tem como premissa
uma pesquisa humanitária para os animais.
❖ Espécies mais utilizadas em pesquisa
● Cães (Canis familiaris);

● Camundongos (Mus musculus domesticus);
● Cobaia ou porquinho-da-Índia (Cavia porcellus);
● Coelho (Oryctolagus cunicullus);
● Hamster chinês (Cricetelus griseus);
● Hamster sírio (Mesocricetus auratus);
● Macaco Rhesus (Macaca mulatta);
● Rato (Rattus norvegicus).
❖ Bem-estar animal
Associado à percepção do animal sobre o ambiente em que ele vive. Como

os animais utilizados em experimentação são mantidos em cativeiro, é
necessário oferecer um ambiente mais próximo às suas necessidades a fim
de propiciar um bem-estar para eles. O conceito de bem-estar está associado
às liberdades animais, sendo elas:
- livre de fome e sede;
- livre de dor, ferimentos e doenças;
- livre de desconforto; - livre de expressar seu comportamento natural;
- livre de medo e angústia.
A ausência dessas observações pode gerar problemas para o

desenvolvimento do experimento, tanto no que diz respeito ao manejo dos
animais quanto nos resultados obtidos, além da prática ser considerada maus
tratos. A inobservância do bem-estar animal é considerada crime e
respondem por ele todos os envolvidos: pesquisadores, técnicos, médico
veterinário, responsáveis pelo biotério e instituição de pesquisa envolvida.
Visando manter os animais com adequado grau de bem-estar podem ser

realizados procedimentos como enriquecimento ambiental, observação diária
dos animais e adequação de técnicas e medicações ao longo do experimento.
❖ Classificação dos Animais quanto ao Status Sanitário
O manejo na criação e manutenção de animais de laboratório pode ser

através de técnicas que resultarão em animais livres de qualquer forma de
vida associada (vírus, bactérias, fungos, protozoários, helmintos, etc).
De acordo com o status sanitário que apresentam os animais de laboratório

estes podem ser classificados como:
❖ Gnotobióticos → Possuem uma microbiota associada conhecida.
❖ Germ Free → Animais totalmente isentos de germes.
❖ Specific Patogen Free (SPF) → Animais isentos de Agentes Patogênicos
Específicos.
❖ Animais Convencionais → Animais que possuem microbiota indefinida.
Fatores como temperatura, umidade, ventilação e qualidade do ar, luz e ruído

devem ser controlados o máximo possível.
❖ Fatores ambientais em um biotério
Temperatura: A temperatura ideal para quase todas as espécies de animais

em biotérios é de 21° C (±3). Para evitar situações de estresse térmico que
levariam à queda da resposta imune dos animais e consequentemente
alterações nos dados dos experimentos, esses animais devem ser mantidos
constantemente em sua zona de conforto térmico, o que implica no controle
rigoroso da temperatura.
Umidade: Umidade relativa do ar recomendada para a maioria dos animais

de laboratório é de 55%(± 15). A maioria dos animais de laboratório apresenta
sudorese insignificante e usa a taquipnéia como mecanismo de adaptação
frente ao calor. Assim, o excesso de umidade interfere na dissipação de calor
destes animais.
Ventilação e renovação do ar: Os animais estão constantemente perdendo

calor e umidade e eliminando CO2 , além de outros produtos resultantes de
reações metabólicas. Os biotérios devem ter um mecanismo de renovação de
ar, a fim de evitar o acúmulo de substâncias tóxicas nas salas. O uso de
exaustores e condicionadores de ar é, portanto, indispensável.
Em relação ao ambiente de trabalho, alguns odores animais são agressivos

para seres humanos. Grande parte destes odores é produzida pela
decomposição bacteriana dos excrementos, porém não se devem usar
produtos que os mascarem, pois, podem ser extremamente nocivos aos
animais. Esses odores devem ser controlados por procedimentos rotineiros de
limpeza e ventilação adequados. As pessoas que trabalham nestes ambientes
obrigatoriamente devem usar máscaras.
O mais comum e mais sério dos contaminantes ambientais dos biotérios é o

amoníaco (NH3 ), que se forma pela ação das bactérias (urease positiva)
sobre os excrementos. A concentração do amoníaco é influenciada por muitos
fatores, como: ventilação, umidade relativa, número de animais por gaiola,
alimentação, etc. Atualmente existem sistemas de estantes que comportam
certo número de animais e gaiolas em um ambiente ventilado e climatizado.
Luz e fotoperíodo: A intensidade luminosa e o fotoperíodo influenciam o

metabolismo e o ciclo estral dos animais, alterando suas respostas biológicas.
O fotoperíodo consiste na quantidade de luz que estes animais receberam
durante o dia (10h, 12h, etc.). Recomenda-se o isolamento total do biotério
em relação à luz natural, permitindo o controle da intensidade luminosa e do
fotoperíodo.
Deve-se preferir o uso de luzes fluorescentes brancas, em virtude de menor

emissão de calor. A intensidade luminosa não deve ultrapassar a 300 Lux, na
sala, a um metro do chão, e, no interior das gaiolas, não deve exceder a 60
Lux. Outras variáveis devem ser consideradas, como a luminosidade dentro
das gaiolas, uma vez que, como estas estão dispostas em prateleiras, gaiolas
das prateleiras superiores tendem a receber mais luz do que as situadas nas
prateleiras inferiores.
Ruído: fator de grande influência sobre o bem estar dos animais de biotério,
principalmente considerando-se que os ouvidos dos roedores possuem a
capacidade de escutar frequências mais altas (ultrassons), inaudíveis pelos
ouvidos humanos.
Frente a sinais de estresse dos animais, deve-se verificar se há alguma fonte

de ruído (por exemplo, um equipamento que possa estar emitindo ultrassons)
que esteja perturbando os animais, mas que não seja perceptível pelo
tratador. Notar também que ruídos contínuos são menos estressantes do que
um ruído repentino. Alguns autores recomendam o uso de música para
minimizar o estresse por ruído. É recomendado ruído com até cerca de 45 Db
(decibéis).
Caixas e gaiolas: Existem vários modelos de dimensões variadas e de

gaiolas e caixas que são utilizadas para a manutenção de animais em
biotérios, sendo mais indicadas as de policarbonato ou polipropileno, por
serem autoclaváveis. As gaiolas devem ser periodicamente higienizadas e
autoclavadas.
Número de animais por caixa, para as principais espécies de laboratório.
espécie: cobaias; coelhos; ratos e hamsters; camundongos

peso(gr): 250-300 / 4000 / 150-200 / 20
dimensões (cm):
● largura: 20-35 / 45 / 20-35 / 20-30
● profundidade: 30-50 / 60 / 30-50 / 30-45
● altura: 20-20 / 40 / 20-20 / 12-12
nº de animais: 1-4 / 1 / 3-10 / 10-20
Cama das gaiolas: Os materiais que podem ser utilizados são: vermiculita e
a palha de arroz, contudo, o mais adequado é a maravalha (serragem grossa)
de Pinus. A serragem esterilizada por autoclavagem é a mais indicada, e
deve ser trocada regularmente. Seu descarte deve ocorrer em sacos plásticos
fechados, com o status de lixo contaminado, recolhido por serviço especial de
coleta.
❖ Enriquecimento ambiental para os animais
O bem-estar animal e a qualidade de vida dos animais confinados também

devem ser levados em consideração. Existem numerosas maneiras para
melhorarmos o ambiente de permanência dos animais utilizados em
experimentação, como, inserir objetos que possam trazer-lhes a sensação de
prazer, interação, diversão ou familiaridade com seus hábitos naturais. Os
ratos e camundongos, por exemplo, são animais curiosos e podem se
beneficiar de atividades que diminuam o estresse durante esse período de
pesquisa.
As caixas utilizadas para abrigo dos animais podem ser incrementadas com a
finalidade de proporcionar os sentimentos descritos acima. Algumas maneiras
para isso são: disponibilizar tubos de acrílico ou iglus para os animais se
esconderem quando eles sentirem vontade, adicionar folhas de papel em
branco nas caixas para que eles possam picá-los, colocar rolo de papel cartão
(rolos de papel higiênico ou de papéis utilizados na cozinha, como alumínio,
guardanapo; sempre limpos), colocar vegetais frescos para coelhos (folhas de
coloração verde escura, buscar informações junto ao médico veterinário).
Existem muitas outras técnicas que podem ser utilizadas, essas descritas são
as mais simples e acessíveis.
Deve-se observar constantemente os dentes dos roedores e de lagomorfos,

pois esses animais são elodontes, ou seja, seus dentes crescem durante toda
a vida e precisam ser desgastados para evitar a oclusão dentária. Esse
problema pode ocasionar outros problemas bucais e também desnutrição,
desidratação ou até caquexia e morte. Assim, caso seja necessário, poderá
ser utilizado materiais para que os animais gastem os dentes evitando tal
agravo, sempre avaliando os objetivos do projeto e as recomendações
veterinárias (do MV-RT).
❖ Alimentação dos animais de experimentação
Os animais de pesquisa devem receber alimentação adequada durante todo o

experimento, a menos que existam momentos de jejum ou privação de
alimento em decorrência do experimento, avaliado pela CEUA durante o
momento de submissão da solicitação de animais.
A dieta deve atender os requisitos nutricionais de cada espécie, tanto

quantitativa quanto qualitativamente. Geralmente as rações comerciais de
animais de laboratório são apresentadas em “pellets” não esterilizada, pois a
maioria dos animais necessita estar roendo diariamente para desgastar os
dentes. Ratos e camundongos se alimentam da mesma ração. Dietas são
normalmente superestimadas (Proteína: 140-227 g/kg).
É de responsabilidade do pesquisador oferecer qualquer outro tipo de

alimento sólido para o bem-estar dos animais ou ração especial dependendo
do seu delineamento experimental. A qualidade desses alimentos deve ser
atestada pelo fabricante e pelos responsáveis pelos animais, tanto o técnico
do biotério quanto os pesquisadores.
De acordo com os objetivos do estudo desenvolvido, os pesquisadores

necessitarão oferecer alimento específico, como, por exemplo: ração triturada,
ração pastosa, ração estéril, ficando a cargo dele realizar os ajustes
necessários para atender aos seus requisitos de alimentação. Os detalhes
deverão ser informados ao técnico e ao MV-RT e deve-se colocar a
informação por escrito na ficha fixada na caixa dos animais.
Ter cuidado na estocagem da ração para não haver contaminação por fungos,
bactéria, insetos etc. Ela deve estar armazenada em local limpo, seco e
ventilado.
A água é oferecida em bebedouros ou através de sistema automático usando

válvulas. Os bebedouros devem ser lavados e autoclavados. A água é filtrada
e tratada, podendo ser esterilizada com a adição de 01 mL/ litro de ácido
clorídrico.
A privação de água não deve ultrapassar 6 horas e o jejum alimentar deve ser
de no máximo 6 - 8 horas;
❖ Manejo e comportamento
É necessário submeter os animais à climatização padronizada para que eles

se habituem ao ambiente que serão criados e mantenham sua homeostase.
Os técnicos que trabalham em biotério devem estar treinados para que se
habituem a observar os animais e anotarem qualquer alteração
comportamental.
Os animais de laboratório conhecem o seu tratador pelo odor e se estressam
menos quando manipulados por tratadores com quem já tenham tido contato
anterior. Não é recomendado trocar o pesquisador/ técnico durante o
experimento, pois isto pode alterar o metabolismo devido ao estresse dos
animais. Também é comprovado que pessoas estranhas na sala de
experimentação podem resultar em um aumento de temperatura corpórea do
animal por estresse. Esse cuidado é de especial importância quando um
experimento está sendo realizado.
❖ Graus de invasividade e de estresse durante o experimento
Todos os experimentos devem ser classificados quanto ao grau de

invasividade e de estresse causado aos animais durante todo o procedimento.
A classificação da invasividade leva em consideração o estresse e
desconforto causado pelo procedimento e o uso ou não de medicamentos
para o alívio da dor. Segundo o CONCEA, eles são classificados em:
❖ GI 1 (grau de invasividade 1) = experimentos que causam pouco ou

nenhum desconforto ou estresse. Exemplos: observação e exame físico;
administração via oral, intravenosa, subcutânea ou intramuscular de
substâncias que não causem reações adversas perceptíveis; eutanásia
por métodos aprovados após anestesia ou sedação; deprivação
alimentar ou hídrica por períodos equivalentes à deprivação na natureza.
❖ GI 2 (grau de invasividade 2) = experimentos que causam estresse,
desconforto ou dor, de leve intensidade. Exemplos: procedimentos
cirúrgicos menores, como biópsias, sob anestesia; períodos breves de
contenção e imobilidade em animais conscientes; exposição a níveis não
letais de compostos químicos que não causem reações adversas
graves.
❖ GI 3 (grau de invasividade 3) = experimentos que causam estresse,
desconforto ou dor, de intensidade intermediária. Exemplos:
procedimento cirúrgico invasivo conduzido em animais anestesiados;
imobilidade física por várias horas; indução de estresse por separação
materna ou exposição a agressor; exposição a estímulos aversivos
inescapáveis; exposição a choques localizados de intensidade leve;
exposição a níveis de radiação e compostos químicos que provoquem
prejuízo duradouro na função sensorial e motora; administração de
agentes químicos por vias como a intracardíaca e intracerebral.
❖ GI 4 (grau de invasividade 4) = experimentos que causam dor de alta
intensidade. Exemplo: indução de trauma em animais não sedados.
Na normativa 39 do CONCEA (Conselho Nacional de Controle de
Experimentação Animal), que entrou em vigor em maio de 2021, determinou-
se que os projetos de pesquisa que envolvem procedimentos com grau de
invasividade 3 e 4 somente poderão ser realizados por usuários (professores
responsáveis e alunos) após obtenção do certificado do curso de capacitação
no manejo ético de animais vertebrados, com carga horária mínima de 21
horas. Este deverá ser entregue junto com a documentação. Outro fator
relacionado aos graus de invasividade 3 e 4 relaciona-se ao número de
animais utilizados nesses experimentos, o qual deve ter uma tendência a ser
menor devido ao estresse e à dor causada nos animais.
❖ Contenção dos animais
Alguns procedimentos são realizados mediante a sedação do animal, outros

são realizados com o animal contido manualmente ou com o auxílio de
equipamentos específicos. Tem como objetivo manter o animal em posição
adequada para o fim que se deseja e também para evitar acidentes com o
animal e com o próprio manipulador, além de diminuir o estresse do animal.
A contenção pode ser utilizada para: coleta de sangue, inoculação de

substâncias nas diferentes vias de administração e outros procedimentos
necessários durante a experimentação animal. Também pode ser realizado
em alguns procedimentos cirúrgicos, nos quais é preciso que o animal se
mantenha em determinada posição durante todo o procedimento. Contudo,
neste caso, somente será realizada após a anestesia para evitar estresse
desnecessário ao animal.
A utilização de objetos específicos para a contenção deve ser considerada,

uma vez que os equipamentos possuem tamanho e padrão específico para a
espécie a ser contida, evitando danos ao animal. Os equipamentos mais
comumente utilizados na contenção de animais de experimentação são: o
manual e o contensor artificial.
❖ Transporte de Animais
Os pesquisadores que precisarem locomover os animais durante o

experimento deverão seguir os procedimentos para o bem-estar dos animais,
bem como se adequar às exigências da legislação. Os animais deverão ser
acomodados em gaiolas sem água e sem alimento para deslocamentos
próximos (dentro da própria cidade), sendo verificado o número de animais
compatível com o tamanho da caixa de transporte. Deve-se atentar para que
a capacidade de animais por caixa, durante o transporte, seja no máximo
duas vezes maior do que a capacidade por caixa que é utilizada no biotério.
Esses aspectos são importantes para evitar a movimentação desses animais

durante a viagem e a ocorrência de lesões nos animais transportados. Em
caso de viagens longas, deverá ser realizado um estudo com o MV-RT para
avaliar a necessidade de paradas a fim de alimentar os animais e descansá-
los.
O transporte precisa ser o mais calmo e fresco possível, garantindo que não
haja: odores intensos durante o transporte (não fumar, não usar odorizador de
ambientes, etc.), ruídos (evite buzinas, ouvir músicas, etc.); e em temperatura
adequada para cada espécie. Antes da retirada dos animais do biotério, eles
deverão ser avaliados pelo MV-RT que emitirá um atestado sanitário. Esse
atestado será utilizado juntamente com os documentos descritos a seguir
para a emissão da Guia de Trânsito Animal (GTA) pela Coordenadoria de
Defesa Agropecuária de São Paulo. É importante frisar que a emissão de
GTA requer o pagamento de uma taxa (DARE) para cada deslocamento a ser
realizado.
Animal/Temperatura
Camundongo 22 ± 2°C
Rato 22 ± 2°C
Coelho 19 ± 1°C
O local de destino dos animais deverá ser cadastrado junto à Coordenadoria

de Defesa Agropecuária de São Paulo para que possa receber os animais.
Assim serão necessários os seguintes documentos para a emissão da GTA:
- CNPJ e nome do estabelecimento de origem,
- CNPJ e nome do estabelecimento de destino,
- atestado sanitário e nota do estabelecimento de origem discriminando a
espécie e o número de animais a serem deslocados.
Com tais documentos em mãos, o pesquisador deverá entrar em contato com
a Coordenadoria de Defesa Agropecuária de São Paulo. Após a emissão da
GTA, que provavelmente deve demorar alguns dias, deverá ser realizado o
pagamento da DARE sob a pena de não ter autorização futura para
movimentação de animais em caso de não pagamento da taxa.
Cada trajeto deverá ser acompanhado por uma GTA, ou seja, a saída dos
animais do biotério deverá ter uma GTA com o destino cadastrado e
informado na GTA, e o retorno do estabelecimento para o biotério deverá ter
outra GTA, cujo destino será o biotério. Assim, para cada movimentação,
serão necessárias duas GTA, uma de ida e outra de retorno dos animais ao
biotério.
A documentação necessária para a emissão de GTA deverá ser

providenciada o quanto antes para não atrasar a programação do
experimento, uma vez que ela é imprescindível para a retirada dos animais do
biotério.
❖ Higiene e limpeza
A eficiência de qualquer procedimento de limpeza depende do zelo do

executor. A higiene pessoal constitui uma importante barreira contra
infecções. O hábito de lavar as mãos antes e após manipular qualquer animal,
reduz o risco de disseminar doenças, bem como o de auto-infecção.
É obrigatório o uso de luvas para qualquer procedimento nos biotérios

(criação e experimentação). Ao manipular agentes patogênicos, em biotérios
experimentais, utilizar luva dupla. Uniforme completo (Jaleco de mangas
compridas e longo, calça exclusiva para uso no biotério, máscara, gorro,
pantufas, etc). Aventais, jalecos e uniformes são vestimentas de proteção
usadas nas áreas de animais, devendo ser retiradas antes de sair do
ambiente.
As roupas de laboratório usadas em áreas de risco devem ser autoclavadas

antes de serem lavadas. O material descartado (proveniente de necrópsia,
carcaças de animais infectados, etc) deve ser identificado e autoclavado. Se
possível incinerado.
Equipamentos e superfícies de trabalho devem ser descontaminadas com

desinfetante apropriado, em uma rotina básica, após o término do trabalho
com materiais infecciosos e especialmente após derrame, gotejamento ou
outra forma de contaminação com material infeccioso. É importante conhecer
as características das substâncias empregadas na higienização para que seja
eficaz e segura. Ler com atenção o modo de utilização de cada desinfetante.
Utilizar a dose recomendada pelo fabricante.
1- Limpeza Diária
a) Limpar e desinfetar a superfície da bancada de trabalho (álcool 70%) após
as atividades realizadas.
b) Verificar se os sacos de lixo estão nas lixeiras.
c) Retirar o lixo infectante produzido no dia.
d) Encaminhar ao depósito específico de lixo, fora do biotério.
2 - Limpeza Bimestral do freezer:

a) Separar as peças do interior do freezer e descartar conforme POP 6
b) Secar e desinfetar com álcool 70%, caso seja necessário.
DESCARTE DE MATERIAIS BIOLÓGICOS NÃO CONTAMINADOS:

a) Recolher os materiais sujos gerados nas salas de manutenção e
experimentação animal;
b) Depositar os resíduos em sacos brancos identificados com o símbolo de
risco biológico;
c) Lacrar ou amarrar os sacos;
d) Identificar os sacos com as informações pertinentes;
e) Encaminhar os sacos com os resíduos biológicos até a lixeira no exterior
do prédio diariamente;
f) A empresa terceirizada fará a coleta.
DESCARTE DE CARCAÇAS DE ANIMAIS:

a) Depositar as carcaças de animais em sacos brancos identificados com o
símbolo de risco biológico;
b) Lacrar os sacos;
c) Identificar os sacos com as seguintes informações: gerador, data,
quantidade de animais e número de protocolo de aprovação da CEUA e
observações pertinentes;
d) Acondicionar os sacos no freezer disponível dentro do Biotério;
e) Os responsáveis pela retirada dos sacos do freezer entrarão em contato
com a empresa de coleta contratada para descarte.
❖ Responsabilidade pelos animais
Cada pesquisador/aluno será responsável pelo acompanhamento dos animais

envolvidos na sua pesquisa, desde o momento da chegada até a eutanásia.
Será responsabilidade de cada pesquisador/aluno a visita regular aos animais
para verificar o estado destes, no mínimo uma vez por semana. Em caso de
alguma alteração nos animais, comunicar o MV-RT do biotério.
A medicação dos animais deverá ser realizada obrigatória e exclusivamente

pelo pesquisador/aluno envolvido no projeto de pesquisa. Em caso de
inoculação de microrganismos nos animais, os animais deverão ser cuidados
(troca de caixa, maravalha, alimentação e água) pelos próprios alunos
pesquisadores.
Nos demais casos, existindo técnicos no biotério, os animais serão cuidados

por estes servidores, que manterão as caixas limpas e oferecerão
alimentação e água aos animais.
❖ Aquisição de medicamentos
Alguns dos medicamentos utilizados nos animais podem ser encontrados na

farmácia humana, porém outros são apenas de uso veterinário. Sendo assim,
é importante buscar orientação do MV-RT para avaliar os protocolos
adequados a cada animal e pesquisa e também solicitar as receitas para a
compra dos medicamentos. Ao adquirir os medicamentos, conferir a
concentração dos medicamentos e a indicação descrita na receita, bem como
a via de administração a ser realizada.
Deve-se salientar que a compra do medicamento pode demandar tempo, pois

além de alguns medicamentos necessitarem de receituário especial, pode
haver falta do produto no fornecedor, por isso é tão importante o
planejamento para a compra dos medicamentos.
❖ Vias de Administração
As vias de administração dos medicamentos podem ser via oral (VO) e via
gavage, subcutânea (SC), intramuscular (IM), intraperitoneal (IP), intravenosa
(IV). Para a administração dos medicamentos relacionados na seção anterior,
deve-se seguir o recomendado, observando figuras a seguir:
❖ Tipos de agulha a utilizar para realizar as medicações
As medicações injetáveis devem ser feitas utilizando as agulhas adequadas

para cada espécie. Recomenda-se o uso das seguintes agulhas para os
animais mantidos no biotério:
● Ratos e camundongos: insulina (marrom);
● Coelhos: 24G (roxa).
Para fazer o procedimento de anestesia, o preparo da mistura dos

medicamentos pode ser realizado na própria seringa que será utilizada para a
aplicação da mistura. É indicado utilizar uma agulha para o preparo da
medicação e outra para a aplicação no animal, pois a primeira utilizada pode
perder o corte e a aplicação se torna mais dolorida.
❖ Dosagens das medicações indicadas para ratos, camundongo e

coelhos
❖ Anestésicos para procedimentos de curta duração:
Ratos e camundongos: Cetamina 10% (Dopalen) 100mg/Kg e xilazina 2%

(Anasedan) 10mg/Kg. Via de administração preferencial: intraperitoneal (IP).
Coelhos: Cetamina 10% (Dopalen) 35mg/Kg e xilazina 2% (Anasedan)

5mg/Kg. Via de administração: IM.
Obs.: Anestésicos inalatórios serão calculados pelo M.V. responsável pelo

procedimento.
❖ Analgésicos e anti-inflamatórios: Quando o procedimento realizado

resultar em DOR LEVE:
Ratos: Paracetamol 1-2mg/mL de água de bebida durante 3 dias. ◦

Carprofeno 1,5mg/Kg a cada 12h. Vias de administração: via oral (VO),
durante 3 dias.
Camundongos: Paracetamol 1-2mg/mL de água de bebida durante 3 dias. ◦

Carprofeno 5mg/Kg a cada 24h. Vias de administração: via subcutânea (SC),
durante 3 dias.
Coelhos: Paracetamol 1-2mg/mL de água de bebida durante 3 dias. ◦

Dipirona 12mg/Kg a cada 12h. Vias de administração: VO durante 3 dias.
Os procedimentos mais comuns que geram dor leve são: lesões superficiais
em pele ou nos dentes, como uma ligadura.
resultar em DOR MODERADA:
Ratos/Camundongos: Tramal 5-7mg/Kg a cada 24h. Vias de administração:

IM, SC, IP ou VO, durante 3 a 5 dias. ◦ Meloxicam 0,2% na dose de 1mg/Kg a
cada 24h. Via de administração: SC por 3 dias.
Coelhos: Tramal 5-7mg/Kg a cada 24h. Vias de administração: IM, SC, IP ou

VO, durante 3 a 5 dias. ◦ Meloxicam 0,2% na dose de 0,2mg/Kg a cada 24h.
Via de administração: SC, por 3 dias.
Os procedimentos mais comuns que geram dor moderada são: incisões de

maior extensão na pele ou procedimentos mais invasivos em cavidade oral
como, por exemplo, implantação de placas para testes de biocompatibilidade
no subcutâneo dos animais.

resultar em DOR SEVERA:
Ratos/Camundongos: Tramal 8-10mg/Kg a cada 12h. Vias de

administração: IM, SC, IP ou VO por 5 dias. ◦ Meloxicam 0,2% na dose de
2mg/Kg a cada 24h. Via de administração: SC por 3 dias.
Coelhos: Tramal 8-10mg/Kg a cada 12h. Vias de administração: IM, SC, IP

ou VO por 5 dias. ◦ Meloxicam 0,2% na dose de 0,3 mg/Kg a cada 24h. Via de
administração: SC por 3 dias.
Os procedimentos mais comuns que geram dor severa são aqueles mais
cruentos, que envolvem maior incisão de pele e tecido muscular, aqueles
envolvendo tecido ósseo, ou procedimentos mais invasivos em cavidade oral,
tais como defeitos ou fraturas ósseas e cirurgia de implante.
Atenção: é importante verificar o protocolo estabelecido para cada

experimento, segundo a literatura, para que não haja interferência dos
medicamentos sobre os resultados esperados no seu estudo.
❖ Antimicrobianos (antibióticos)
Há procedimentos em que não existe necessidade do uso de antimicrobianos,

que são aqueles menos invasivos, como por exemplo, feridas superficiais.
Contudo, procedimentos invasivos como os cirúrgicos, há sempre
necessidade do uso de antibióticos conforme descrito abaixo:
Ratos/Camundongos: Pentabiótico 0,01mL a cada 100g de peso vivo. Via

de administração: IM, em duas doses separadas por 5 dias cada.
Enrofloxacino 2,5% 5-10mg/Kg. Vias de administração: VO, SC ou IM, duas
vezes ao dia, durante 7 ou 10 dias. Também pode ser realizado na dose de
100mg/L de água de bebida.
Coelhos: Pentabiótico 0,1mL/Kg. Via de administração: IM, em duas doses
separadas por 5 dias cada.
Enrofloxacino 2,5% 5-10mg/Kg. Vias de administração: VO, SC ou IM, duas
vezes ao dia, durante 7 ou 10 dias. Também pode ser realizado na dose de
100mg/L de água de bebida.
❖ Cálculo das doses das medicações
O cálculo da dose das medicações sempre se baseia na fórmula:

Peso do animal (Kg) x Dose (mg/Kg) = volume a ser administrado (mL)
concentração (mg/mL)
Exemplo: um rato pesando 400g será submetido a um procedimento no qual

será necessário administrar cetamina e xilazina. Sendo assim, o cálculo será:
Para cetamina 10%:
concentração (mg/mL)
então: 0,4 kg x 100 mg/kg = 0,4 mL
100mg/mL
Para xilazina 2%:

concentração (mg/ mL)
então: 0,4 kg x 10 mg/kg = 0,2 mL
20mg/mL
Atenção:
● Unidades de medida: o peso deve estar SEMPRE em Kg, a dose em
mg/Kg e a concentração em mg/mL. Se os valores estiverem em outras
unidades, deverá ser realizada a conversão das unidades previamente à
utilização da fórmula.
● Os animais devem ser pesados antes da anestesia e caso não seja
observada muita diferença de peso entre eles, pode ser estimado um
peso médio e realizado o cálculo de medicações com esse peso. Há
uma balança no biotério que fica na sala de quarentena, que pode ser
utilizada nesta etapa, mas ela NÃO DEVE ser trocada de lugar.
● As doses são aquelas indicadas para as diferentes espécies segundo as
últimas edições do “Formulário de Animais Exóticos” e do “Guia
Terapêutico Veterinário”. Por favor, em caso de dúvidas consulte o MV-
RT do biotério.
● A concentração do medicamento está na bula do medicamento. Muitas
vezes, ela não está em mg/mL e por isso deve ser realizada a conversão
de unidades. Exemplo: um medicamento na concentração de 5g a cada
10mL corresponde a 500 mg/mL, que é o valor a ser colocado na
fórmula.
Obs.: No caso da anestesia injetável com o uso desses medicamentos,
devemos fazer a associação da cetamina com a xilazina. Para isso, realiza-se
a mistura desses fármacos em um recipiente estéril ou na própria seringa, na
quantidade necessária de cada medicamento, obtida após a realização do
cálculo acima. A mistura deve ser preparada exclusivamente para um animal,
e a seguir realiza-se a aplicação dela. NUNCA faça o preparo para dois ou
mais animais porque podem ser administrados volumes errados de cada
medicamento.
❖ Reserva de centro cirúrgico
A reserva dos centros cirúrgicos, I e II, é realizada por meio virtual, pelo site
da faculdade, o usuário deve clicar na aba SISTEMAS e depois deve clicar
em Reserva de Equipamentos. Ao entrar nessa seção, clicar em área de
Biociências e Diagnóstico Bucal e a seguir clicar em agendar equipamentos.
Nesse momento deverá ser adicionado o CPF e a senha do usuário (aluno) e
deve ser inserido o nome do orientador como responsável.
A seguir, deve ser inserida a data com a hora inicial e a hora final do
procedimento e posteriormente no campo laboratório, o usuário deve
selecionar Biotério, e por fim deve selecionar a sala a ser reservada (sala 1 ou
sala 2).. Caso haja alguma mudança na data agendada, é importante que o
usuário desmarque para que outro possa ter acesso, caso seja necessário.
❖ Pré-operatório
Inclui o preparo do animal para o procedimento a ser realizado, desde o

jejum, quando necessário, até o momento da aplicação da medicação
anestésica. Além disso, é necessário que haja um planejamento cirúrgico, por
escrito, que deverá estar contido na documentação enviada ao CEUA e que
deverá ser seguido rigorosamente (em caso de alteração, a documentação
deve ser substituída). O planejamento cirúrgico deve incluir, pelo menos, as
seguintes informações detalhadas:
● identificação da equipe cirúrgica e suas funções;
● descrição da anestesia;
● equipamentos, medicamentos e outros suprimentos necessários.
Verifique o tipo de procedimento a ser realizado com antecedência,

consultando o MV-RT quanto à necessidade de ajustes nas medicações
anestésicas, com base em literatura relevante para o experimento em
questão. Alguns medicamentos podem precisar de receituário especial e não
são comprados com facilidade.
Deve-se salientar que a medicação injetável (“anestesia” com cetamina e

xilazina) tem duração do efeito, em média, de apenas 30 minutos, podendo
variar entre os indivíduos. Esse tipo de “anestesia” pode ocasionar
complicações no trans e pósoperatório, como o óbito do animal. Caso isso
ocorra em mais de 10% da quantidade total de animais solicitados ao CEUA,
será necessária uma nova submissão de documentos ao CEUA para solicitar
a reposição dos animais que vieram a óbito. Em caso de dúvidas, procure o
MV-RT para conversar sobre o protocolo anestésico.
❖ Anestesia
Geralmente, o protocolo anestésico é realizado com cetamina e xilazina,

sendo esperado que o animal fique inconsciente (“caia”) após um tempo de
10 a 15 minutos da administração, com duração média de 30 minutos. Em
alguns casos, pode ser feito jejum prévio à anestesia, com duração de cerca
de 6 horas, mas nesse caso será necessário verificar a dose da medicação a
ser administrada.
Caso o animal permaneça com reflexos após esse período de tempo, pode
ser administrado mais 25% do volume total dos fármacos utilizados para a
anestesia, o repique. Por exemplo: se o volume inicial administrado foi de
0,4mL de cetamina e 0,2mL de xilazina, como descrito acima no exemplo do
cálculo de medicamentos, podemos administrar o volume de 0,1mL de
cetamina e 0,05mL de xilazina para induzir o animal à anestesia. É necessário
aguardar cerca de 10 minutos novamente e verificar os reflexos do animal. Se
o animal ainda mantiver os reflexos, pode-se repetir o procedimento mais uma
vez. Caso o animal ainda assim não “caia” não é indicado repetir o
procedimento de repique pela terceira vez, devido ao risco de morte por
overdose anestésica. O operador deve devolver o animal à gaiola e tentar
novo procedimento após, no mínimo, 24 horas.
Durante o procedimento cirúrgico, o animal pode começar a tomar

consciência e voltar da anestesia. Nestes casos, indica-se administrar
também 25% da dose (“repique”), observando-se também se este animal já
recebeu uma dose de “repique” como explicado no parágrafo anterior.
❖ Aspectos sistêmicos relevantes para o procedimento anestésico
● A anestesia causa queda brusca de temperatura;

● É preciso evitar a hipotermia do animal;
● Durante o procedimento e após sua finalização, o animal deve ser
mantido com aquecedores, bolsa ou luva de procedimento com água
quente. Há um aquecedor no biotério e deve ser utilizado para manter
a temperatura do seu animal experimental. Se a temperatura ambiente
estiver muito alta, não será necessário o uso do aquecedor. Em um dia
de temperatura amena ou fria, o animal deverá ficar no aquecedor até
o seu retorno do anestésico, o que geralmente leva um tempo de 3 a 4
horas.
Temperatura corporal (ºC): CA: 35,8 - 37,7 / R: 37,5 – 38,1 / CO: 38,3 – 39,5
Frequência respiratória (mov/min): CA: 80 – 200 / RA: 70 – 115 / CO: 35 -
65
Frequência cardíaca (bat/min): CA: 350 – 600/ RA: 250 - 350 / CO: 120 -
300
❖ Cuidado para não queimar os animais. O responsável pelo procedimento

também é o responsável por desligar o aquecedor e devolver os animais
nas gaiolas onde permanecerão até a eutanásia.
❖ Cuidado para não causar queimadura nos animais quando utilizar bolsa
ou luva com água quente; utilizar um tecido entre a bolsa/luva e o corpo
do animal. O aquecedor nunca deve permanecer ligado no período da
noite com risco de ocasionar curto circuito na rede elétrica.
❖ Cuidado com a temperatura do ar condicionado da sala cirúrgica,
mantenha próximo à temperatura ideal para a espécie estudada.
❖ Mantenha o ambiente o mais silencioso e calmo durante todo o
procedimento, sem odores fortes. Durante o procedimento cirúrgico evite
grande número de pessoas e conversas com falas e risadas exaltadas, o
ambiente deve ser silencioso e sem odores fortes.
❖ Cirurgia
Antes de começar, o responsável pelo procedimento deve fazer o teste de

sensibilidade à dor no animal, realizando uma pressão nos dígitos do animal
com uma pinça ou com os próprios dedos. O animal não deve apresentar
movimento em resposta ao estímulo, significando que está em plano
anestésico adequado e pronto para o procedimento cirúrgico.
Após iniciado o procedimento, deve-se interromper a cirurgia imediatamente

caso o animal se movimente. O responsável deve realizar o “repique” da
anestesia e esperar cerca de 10 minutos. Em seguida, deve ser realizado
novamente o teste de sensibilidade no animal e quando não houver
sensibilidade deve-se dar continuidade à cirurgia. Entretanto, quando houver
sensibilidade, é necessário realizar outro repique para se obter resultado
negativo ao teste de sensibilidade. Ressalta-se que há risco do animal vir a
óbito devido ao excesso de anestésico. Nos casos em que o animal já
recebeu um repique de anestésicos e ainda não está insensível, é indicado
fazer a sutura e finalizar o procedimento cirúrgico em outro dia.
Devem-se aplicar os princípios da técnica cirúrgica que foram aprendidos no
curso online e/ou orientados pelo MV-RT, quando solicitado. As incisões
devem ser realizadas causando mínima lesão tecidual e hemostasia. É
importante lembrar que mesmo que você considere que o animal tenha
perdido pouco sangue, este volume pode ser significativo para ele, devido ao
seu pequeno porte. É importante verificar o local onde a anestesia foi aplicada
para verificar a presença de reações dérmicas no pós-operatório. Caso o
animal apresente lesão, o responsável deve imediatamente comunicar o MV-
RT para que seja realizada a avaliação da mesma.
❖ Pós-operatório
Varia de acordo com o tipo de cirurgia, portanto é necessário pedir auxílio ao
MV-RT para a escolha de um protocolo efetivo de analgésico, antibiótico e/ou
anti-inflamatório. Este protocolo deve ser estabelecido com GRANDE
antecedência ao procedimento, uma vez que algumas medicações são mais
difíceis de serem encontradas e necessitam de receituário especial.
❖ Eutanásia
Define-se como eutanásia a morte serena, sem dor ou sofrimento. Após a
realização dos experimentos os animais envolvidos devem ser submetidos á
eutanásia, no entanto, eles não optaram por morrer e não tem consciência
que vão morrer. A eutanásia é um procedimento emocional e ético que deve
ser executado por um médico veterinário segundo resolução do Conselho
Federal de Medicina Veterinária nº 714, de 20 de junho de 2002.
Para a realização da eutanásia, deve ser utilizado o dobro ou o triplo da dose
anestésica (mistura da cetamina e xilazina – mesma concentração usada para
anestesia) para o peso do animal, seguida da decapitação. Antes da
decapitação, deve ser realizado o teste de sensibilidade à dor. Caso o animal
apresente sensibilidade não poderá passar pelo procedimento, devendo ser
realizado repique do anestésico até que ele esteja anestesiado ou tenha vindo
a óbito.
Os responsáveis pelo procedimento devem descartar as carcaças e órgãos
não utilizados na pesquisa em saco branco leitoso (risco biológico) e levá-los
ao local de armazenamento de resíduos biológicos. Esse saco branco é bem
frágil, sendo assim, é RECOMENDÁVEL utilizar também uma embalagem de
ração vazia juntamente ao saco branco, a fim de evitar o extravasamento de
sangue e secreções/excreções provenientes das carcaças.
EXCEPCIONALMENTE, também poderá ser feito o uso de dois sacos
brancos caso não haja disponibilidade da embalagem de ração.
CAPÍTULO I DAS NORMAS GERAIS
Art. 2º A eutanásia deve ser indicada quando o bem-estar do animal estiver
ameaçado, sendo um meio de eliminar a dor, o estresse ou o sofrimento dos
animais, os quais não podem ser aliviados por meio de analgésicos, de
sedativos ou de outros tratamentos, ou, ainda, quando o animal constituir
ameaça à saúde pública ou animal, ou for objeto de ensino ou pesquisa.
Parágrafo único. É obrigatória a participação do Médico Veterinário como
responsável pela eutanásia em todas as pesquisas que envolvam animais.
CAPÍTULO II DOS PROCEDIMENTOS
Art. 8º A escolha do método dependerá da espécie animal envolvida, dos
meios disponíveis para a contenção dos animais, da habilidade técnica do
executor, do número de animais e, no caso de experimentação animal, do
protocolo de estudo, devendo ainda o método ser:
I - compatível com os fins desejados;
II - seguro para quem o executa, causando o mínimo de estresse no ope-
rador, no observador e noanimal;
III - realizado com o maior grau de confiabilidade possível, comprovando- -se
sempre a morte do animal, com a declaração do óbito pelo Médico
Veterinário.
Art. 10. Os procedimentos de eutanásia são de exclusiva responsabilidade do
médico veterinário.
Art. 11. Nas situações em que o objeto da eutanásia for o ovo embriona- do, a
morte do embrião deverá ser comprovada antes da manipulação ou
eliminação do mesmo.
CAPÍTULO III DOS MÉTODOS RECOMENDADOS
Art. 12. Os agentes e métodos de eutanásia, recomendados e aceitos sob
restrição encontram-se listados, por espécie, no anexo
I. § 1º Métodos recomendados são aqueles que produzem consistentemente
uma morte humanitária, quando usados como métodos únicos de eutanásia.
§ 2º Métodos aceitos sob restrição são aqueles que, por sua natureza técnica
ou por possuírem um maior potencial de erro por parte do executor ou por
apresentarem problemas de segurança, podem não produzir
consistentemente uma morte humanitária, ou ainda por se constituírem em
métodos não bem documentados na literatura científica. Tais métodos devem
ser empregados somente diante da total impossibilidade do uso dos métodos
recomendados constantes da Resolução.
Art. 13. Outros métodos de eutanásia não contemplados poderão ser
permitidos, desde que realizados sob autorização do CRMV ou CFMV.
Art. 14. São considerados métodos inaceitáveis:
I - Embolia Gasosa;
II - Traumatismo Craniano;
III - Incineração in vivo;
IV - Hidrato de Cloral (para pequenos animais);
V - Clorofórmio;
VI - Gás Cianídrico e Cianuretos;
VII - Descompressão; VIII - Afogamento;
IX - Exsanguinação (sem sedação prévia);
X - Imersão em Formol;
XI - Bloqueadores Neuromusculares (uso isolado de nicotina, sulfato de
magnésio, cloreto de potássio e todos os curarizantes);
XII - Estricnina.
Parágrafo único. A utilização dos métodos deste artigo constitui-se em

infração ética.
Art. 15. Esta Resolução entra em vigor na data de sua publicação, revogadas
as disposições em contrário.
❖ Normas de biossegurança
Todos os bioteristas ou estudantes/pesquisadores que trabalham com
animais infectados ou não devem ter treinamentos específicos e serem
informados sobre todos os riscos a que estão sujeitos, bem como as maneiras
de se proteger e evitá-los.
Fumar, comer ou beber não é permitido dentro dos biotérios ou em qualquer
outra área em que existam microorganismos patogênicos.
Gabinetes de fluxo laminar, contenções físicas e/ou equipamentos de
proteção individual (respiradouros, máscaras faciais) devem ser usados
sempre que procedimentos com alto potencial de formação de aerossóis são
realizados.
Qualquer ferimento na pele do técnico, ou estudante, ou pessoal de apoio,
deve ser devidamente protegido antes de se iniciar a manipulação de animais
e agentes patogênicos.
Se agentes altamente infecciosos ou nocivos são usados, o animal deve ser
isolado em unidade de fluxo laminar ou mesmo em isoladores, nos quais o ar
que entra e sai é convenientemente filtrado, através de filtros absolutos.
Necrópsias de animais infectados com organismos altamente contagiosos
devem ser feitas em gabinetes ventilados, que permitam a filtragem do ar.
Avaliação sorológica periódica do pessoal, considerando o agente de risco. O
acesso para estudantes, pesquisadores, visitantes deverá ser limitado ao
horário em que os bioteristas estiverem presentes.
Os biotérios devem ter um programa de segurança que inclui equipamentos
de combate a incêndio, instruções para o uso correto de equipamentos e
treinamento de primeiros socorros.
❖ Procedimentos Básicos para Pesquisas com Animais
1. É expressamente PROIBIDO ao usuário entrar na sala dos animais em
manutenção e experimentação sem autorização;
2. É OBRIGATÓRIO o uso dos equipamentos de proteção individual (EPI):
Óculos de proteção, luvas de látex, e jaleco de manga longa, e outros,
conforme o tipo de pesquisa a ser realizada;
3. O Pesquisador Responsável pelo protocolo de pesquisa ou de aula prática
deve comunicar ao responsável técnico do Biotério o início e o término da
pesquisa, bem como toda e qualquer intercorrência no curso dessa, além do
número do protocolo aprovado pela CEUA correspondente ao protocolo em
andamento;
4. O Protocolo de pesquisa ou de aula prática SOMENTE poderá ser iniciado
após a apresentação do respectivo Parecer de Aprovação da CEUA, com
cópia para o devido arquivamento nos controles internos do Responsável
Técnico;
5. Antes de alocar animais para experimentação, o Pesquisador Responsável
pelo protocolo de pesquisa ou de aula prática deverá ASSINAR e
ENTREGAR o Termo de Responsabilidade e o termo de concordância com as
Normas de Uso do Biotério (assinado por todos os membros participantes da
pesquisa). Os documentos devem ser entregues à bioterista responsável pelo
biotério antes do início da entrada dos animais no biotério.
6. Anotar no livro ata disponível na sala de higienização: data de limpeza das
caixas, responsável pela limpeza, número de caixas higienizadas assinatura
da pessoa que realizou a limpeza;
7. Nas etiquetas de identificação das caixas dos animais em experimentação
devem constar as seguintes informações: espécie animal, sexo, quantidade
de animais, nome e telefone do responsável pelos animais, início da pesquisa
e data prevista para término da pesquisa, número do protocolo de aprovação
pela CEUA; no site do BEA está disponível modelo de etiqueta
(http://bea.jatai.ufg.br/).
8. A coordenação do Biotério deve ser avisada quando os animais forem
mantidos em regime de restrição alimentar ou hídrico;
9. Para as pesquisas com animais, que estiverem em andamento, serão
mantidos no arquivo do biotério o parecer consubstanciado do projeto de
pesquisa enviado pela CEUA e parecer de aprovação fornecido pela CEUA
(Comissão de ética no uso de animais) correspondente a cada pesquisa, para
eventuais consultas;
10. Os pesquisadores e alunos que iniciarem seus experimentos deverão
possuir treinamento de manuseio animal, que poderá ser provido pelo (a)
bioterista ou responsável técnico (a) do Biotério, que atestará tal condição;
11. Toda a entrada e saída de alunos no biotério deverá ser registrada com o
preenchimento e assinatura do formulário de controle de acesso, localizado
na entrada do biotério.

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❖ O que são Vidrarias e Instrumentos de Laboratório?

Os laboratórios possuem vidrarias e instrumentos utilizados para diversas

❖ O que são vidrarias de precisão?

Algumas das vidrarias que apresentam marcação são denominadas vidrarias

O termo precisão está relacionado à ideia de reprodutibilidade: quando é

É a curvatura que um líquido apresenta em sua parte superior quando

Quando a solução é incolor, devemos ajustar a parte inferior do menisco à

❖ Exemplos de vidrarias de laboratório -

Béquer: é uma das mais conhecidas vidrarias do laboratório e é usado para

Balão de fundo chato: utilizado para conter líquidos e é muito usado em

Balão de fundo redondo: é principalmente utilizado em sistemas de refluxo e

Balão volumétrico: é uma vidraria de precisão (possui marcação em um

Proveta: utilizada para medir e transferir volumes variáveis de líquidos. Ela é

Tubo de ensaio: utilizado para realizar reações de pequena escala com

Pipeta: utilizada para medição e transferência de volumes precisos de

Pipetas graduadas: usadas na medição de volumes variados dentro de um

✔ Não pode ser aquecida

Bureta: vidraria calibrada para transferir volumes de líquidos de forma

✔ Geralmente possui uma torneira, para controlar o escoamento do

Kitassato/balão de Buchner ou balão de vácuo: vidraria usada juntamente

Funil de vidro simples: pode ser de haste curta ou de haste longa.

Funil de Buchner: utilizado em procedimentos de filtração a vácuo

Condensador: usado em procedimentos de destilação e tem a função de

Placa de Petri: pode ser feita de vidro ou de plástico e é utilizada para a

Bastão de vidro: utilizado para misturar ou transferir líquidos de um

Conta gotas: utilizado para adicionar pequenos volumes (algumas gotas) de

Vidro de relógio: peça de vidro de forma côncava utilizada para pesagem de

Termômetro: utilizado para medir a temperatura do ambiente ou de

Picnômetro: vidraria utilizada na determinação da densidade de líquidos.

❖ Exemplos de instrumentos de laboratório

Trompa de vácuo: instrumento de metal ou de vidro que se acopla à torneira

Alonga: usada nos processos de destilação para conectar o condensador ao

Tubo falcon: usado no processo de centrifugação, no qual são separados os

Cálice de sedimentação: utilizado em exames parasitológicos para

Almofariz e pistilo: (também chamado de gral ou morteiro) é um recipiente

Cadinho: recipiente geralmente de porcelana (também pode ser de ferro,

Cápsula de porcelana: usada na evaporação de líquidos e na secagem de

Triângulo de Porcelana: utilizado como suporte para cadinhos de porcelana

Tela metálica com amianto: utilizada geralmente em cima do bico de

Suporte Universal: estrutura utilizada como sustentação para outros

Anel ou Argola: se prende à haste do suporte universal e é usado para

Garra de Condensador: braçadeira que serve para afixar vidrarias, como o

Mufa: tipo de adaptador ao suporte universal e forma um sistema de

Manta Aquecedora: fonte de calor utilizada em conjunto com o balão de

Espátula e colheres: instrumentos em aço inox, porcelana ou níquel

Papel Filtro: utilizado juntamente com o funil para a separação de sólidos e

Pinça Metálica: (também chamada de tenaz) é utilizada na manipulação de

Pinça de madeira: usada para segurar vidrarias em aquecimento e evitando

Estante para tubos de ensaio: utilizado para manter os tubos de ensaio de

Pipetador tipo pera: instrumento de borracha utilizado em conjunto com a

❖ Preparo de Soluções - Massa/Volume

Quando vamos resolver uma questão de concentração ou diluição e os dados

✔ DO MENOR PARA MAIOR UNIDADE = /1000

Os cálculos para conversão de unidades de volume funcionam da mesma

✔ DO MENOR PARA MAIOR UNIDADE = /1000

❖ O que são Misturas?

Compostas por substância pura: amostra de matéria que possui composição

Mistura heterogênea: os componentes não são uniformes ou possuem

❖ O que é Solução e seus tipos?

Uma solução é um tipo especial de mistura homogênea: proporção de soluto

Relação entre a quantidade de soluto e a quantidade de solvente, podem ser

✔ Ex: Desinfecção das bancadas do laboratório pode ser feita utilizando-

❖ O que são Diluições Seriadas?

❖ Introdução a Microbiologia: O que são Microrganismos?