Universidade Estadual de Campinas Faculdade de Engenharia Qumica rea de Concentrao: Engenharia de Processos

Extrao de pilocarpina e epiisopiloturina de jaborandi utilizando processos envolvendo solventes supercrticos

lida de Castilho Barnab

Orientador: Prof. Dr. Theo Guenter Kieckbusch Co-orientadores: Dr. lvaro Bandeira Antunes de Azevedo (Petrobrs, RJ) Prof. Dr. Paulo Mazzafera (IB/UNICAMP)

Dissertao de mestrado apresentada Faculdade de Engenharia Qumica da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos para a obteno de ttulo de Mestre em Engenharia Qumica.

Campinas So Paulo Outubro de 2008

FICHA CATALOGRFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA DA REA DE ENGENHARIA E ARQUITETURA - BAE UNICAMP

B252e

Barnab, lida de Castilho Extrao de pilocarpina e epiisopiloturina de jaborandi utilizando processos envolvendo solventes supercrticos / lida de Castilho Barnab. --Campinas, SP: [s.n.], 2008. Orientadores: Theo Guenter Kieckbusch, Paulo Mazzafera, lvaro Bandeira Antunes de Azevedo. Dissertao de Mestrado - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Qumica. 1. Pilocarpina. 2. Alcalides. 3. Extrao com fluido supercritico. 4. Adsoro. I. Kieckbusch, Theo Guenter. II. Mazzafera, Paulo. III. Azevedo, lvaro Bandeira Antunes de. IV. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia Qumica. V. Ttulo.

Titulo em Ingls: Extraction of pilocarpine and epiisopiloturine from jaborandi (Pilocarpus Microphyllus) using processes involving supercritical solvents Palavras-chave em Ingls: Jaborandi, Pilocarpine, Supercritical fluid extraction, Adsorption rea de concentrao: Engenharia de Processos Titulao: Mestre em Engenharia Qumica Banca examinadora: Marco Vinicius Chaud, Martin Aznar Data da defesa: 09/10/2008 Programa de Ps Graduao: Engenharia Qumica

DEDICATRIA

A meus pais Rosemeiri e Valdemar, que sempre estiveram do meu lado, no medindo esforos para ajudar. Aos meus irmos Eberson e Endija, que sempre contriburam para meu crescimento pessoal. Aos meus sobrinhos Joo Pedro e Sofia, que sempre trazem em seus sorrisos a alegria da vida. Ao meu namorado Adriano, pelo companheirismo e pelo amor que serviram de estmulo para a finalizao deste trabalho.

AGRADECIMENTOS

A Deus pelas bnos recebidas. A FAPESP pela bolsa de mestrado. Ao CPQBA pela doao de folhas de jaborandi. Ao Professor Theo Guenter Kieckbusch pela excelente orientao e pacincia. Aos co-orientadores Prof. Paulo Mazzafera e lvaro Azevedo pela contribuio para a execuo deste trabalho. Aos meus colegas de laboratrio que sempre estiveram dispostos a ajudar e ensinar. A todos meus amigos pelos momentos agradveis que passamos no decorrer do curso. A todos aqueles que de forma direta ou indireta contriburam para a realizao deste trabalho.

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RESUMO Pilocarpina um alcalide encontrado somente nas folhas de jaborandi (Pilocarpus microphyllus), uma espcie vegetal nativa da flora brasileira e empregada principalmente no tratamento de glaucoma e de xerostomia (boca seca). A epiisopiloturina, alcalide tambm encontrado no extrato de jaborandi, tem atividade biolgica semelhante pilocarpina, embora atue por mecanismos diferentes. Esta pesquisa teve como objetivo o estudo da aplicabilidade da tecnologia que utiliza fluidos supercrticos na recuperao e purificao destes dois princpios ativos de folhas de jaborandi e de um resduo industrial semi-slido gerado na extrao de pilocarpina de jaborandi com solventes orgnicos. Os ensaios de extrao contemplaram presses de 200 a 300 bar e temperaturas de 40, 50 e 60C, utilizando CO2 puro e CO2 + 10% (em massa) de etanol. Em um estudo complementar investigou-se a influncia do acoplamento de uma coluna de adsoro (slica-gel) em ambiente supercrtico visando purificar os extratos. Os ensaios com CO2 puro indicaram que aumentos de presso melhoram a capacidade de extrao em todas as situaes estudadas, sendo esse efeito mais intenso nas extraes de pilocarpina das folhas e de epiisopiloturina da pasta. Aumentos de temperatura favorecem as extraes, exceto nos ensaios realizados a 200 bar, com pilocarpina contida nas folhas, que apresentaram uma tendncia inversa, indicativa da proximidade de uma presso de cruzamento. O CO2 puro mostrou-se pouco eficiente em extrair pilocarpina das folhas. Nas condies avaliadas, a melhor recuperao de pilocarpina ocorreu a 60C e na presso de 300 bar (14,5% das folhas; 84,5% da pasta). O uso de co-solvente (10% etanol) melhorou esse nvel de recuperao de pilocarpina e mostrou-se muito mais eficiente na recuperao de epiisopiloturina. Uma contaminao do extrato com clorofila foi observada no processamento das folhas de jaborandi com CO2 puro e que se intensifica com o uso de etanol, prejudicando a pureza dos mesmos. A slica-gel mostrou ter maior afinidade pela clorofila do que com os alcalides. No processo extrao/adsoro, a clorofila completamente adsorvida na slica, deslocando as molculas de pilocarpina e de epiisopiloturina, indicativo de que esta pode ser uma alternativa promissora para a produo de um extrato de alta qualidade. Os ensaios de extrao/adsoro com a pasta residual indicaram que a slica-gel no capaz de separar a pilocarpina da epiisopiloturina. Palavras-chaves: jaborandi, pilocarpina, fluido supercrtico, extrao, adsoro, clorofila. iii

ABSTRACT Pilocarpine is an alkaloid found only in jaborandi leaves (Pilocarpus microphyllus), a native tree of Brazil, and is widely used in the treatment of glaucoma and xerostomia (dry mouth). Epiisopiloturine, another alkaloid also found in jaborandi has a similar biological activity, acting by different mechanisms. This research evaluated the applicability of the technology that uses supercritical fluid (SCF) in the recovery of these two active compounds from jaborandi leaves and from an industrial pastelike residue produced during extraction of pilocarpine with organic solvents. The SCF extractions runs used pure CO2 and CO2 + 10% (m/m) ethanol at pressures of 200 and 300 bar and temperatures of 40, 50 and 60C. In an additional study, a silica gel adsorption stage was coupled to the system in an attempt to purify the extracts. Results using pure CO2 indicate that increases in pressure increase the extraction capacity in all situations studied, more intensively the pilocarpine extraction from the leaves and epiisopiloturine from the paste. Higher temperatures improved the extraction rates, except for pilocarpine extractions from the leaves, at 200 bar, when a reverse trend was found, signalizing the proximity of a crossing pressure. Pure CO2 showed poor effectiveness in extracting pilocarpine from the leaves. At the conditions evaluated, the highest recovery found for pilocarpine was at 60C and 300 bar (14.5% from the leaves; 64.5% from the paste). The addition of a co-solvent (10% ethanol) boosted the pilocarpine recovery level, and was even more effective in the recovery of epiisopiloturine. The pure CO2 leaves extracts were contaminated with chlorophyll, a condition aggravated when CO2 with ethanol was used. Silica showed higher affinity for chlorophyll than for the alkaloids. In the extraction/adsorption coupled process, all chlorophyll was adsorbed on silica, displacing the pilocarpine and epiisopiloturine molecules, and suggesting a suitable alternative for the production of high quality extracts. The extraction/adsorption runs using the paste indicated that silica was unable to separate pilocarpine from epiisopiloturine. Key-words: jaborandi, pilocarpine, epiisopiloturine, supercritical fluid, extraction, adsorption chlorophyll.

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SUMRIO CAPTULO I. INTRODUO........................................................................................... 1 CAPTULO II. REVISO BIBLIOGRFICA................................................................. 4 II.1. Jaborandi ..................................................................................................................... 4 II.1.1. Pilocarpina ........................................................................................................... 5 II.1.2. Epiisopiloturina.................................................................................................... 8 II.2. Extrao convencional ................................................................................................ 9 II.3. Fluido supercrtico .................................................................................................... 11 II.3.1. Utilizao de co-solventes (CSOL) ................................................................... 14 II.3.2. Acoplamento de outras operaes unitrias....................................................... 18 II.4. Influncia da matriz slida........................................................................................ 20 CAPTULO III. MATERIAIS E MTODOS ................................................................. 24 III.1. Materiais .................................................................................................................. 24 III.1.1. Matria-prima ................................................................................................... 24 III.1.2. Padres de pilocarpina e epiisopiloturina......................................................... 25 III.1.3. Solventes HPLC ............................................................................................... 25 III.1.4. CO2 e co-solvente ............................................................................................. 25 III.1.5. Adsorvente........................................................................................................ 26 III.2. Equipamento de extrao supercrtica..................................................................... 26 III.3. Determinao de pilocarpina e epiisopiloturina por HPLC..................................... 28 III.4. Determinao de clorofila por espectrofotmetro ................................................... 29 III.5. Extrao de pilocarpina e epiisopiloturina .............................................................. 30 III.5.1. Mtodo convencional ....................................................................................... 30 III.5.2. Ensaios de extrao supercrtica....................................................................... 31 CAPTULO IV. RESULTADOS E DISCUSSO ........................................................... 33 IV.1. Contedo de princpios ativos ................................................................................. 33 IV.1.1. Folhas de jaborandi .......................................................................................... 33 IV.1.2. Pasta residual.................................................................................................... 34 IV.2. Solubilidade de pilocarpina e de epiisopiloturina em CO2 supercrtico.................. 35 IV.3. Ensaios preliminares de extrao supercrtica......................................................... 36 IV.4. Extrao supercrtica com CO2 puro: folhas de jaborandi ...................................... 37 IV.4.1. Influncia da temperatura na extrao de pilocarpina...................................... 38 v

IV.4.2. Influncia da presso na extrao de pilocarpina............................................. 40 IV.4.3. Recuperao de pilocarpina.............................................................................. 41 IV.4.4. Extraes de epiisopiloturina ........................................................................... 43 IV.5.1. Influncia da temperatura na extrao de pilocarpina...................................... 44 IV.5.2. Influncia da presso na extrao de pilocarpina............................................. 45 IV.5.3. Recuperao de pilocarpina.............................................................................. 46 IV.5.4. Extrao da epiisopiloturina............................................................................. 47 IV.5.5. Correlao com a densidade do CO2-SC.......................................................... 50 IV.6. Ensaios de extrao supercrtica com CO2 puro + etanol ....................................... 51 IV.6.1. Folhas de jaborandi .......................................................................................... 51 IV.6.2. Pasta residual.................................................................................................... 54 IV.7. Extrao acoplada adsoro em slica-gel ............................................................ 57 IV.7.1. Folhas de jaborandi .......................................................................................... 57 IV.7.2. Pasta residual.................................................................................................... 61 CAPTULO V. CONCLUSES E RECOMENDAES ............................................. 64 V.1. Concluses................................................................................................................ 64 V.2. Recomendaes para trabalhos futuros .................................................................... 65 CAPTULO VI. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS................................................. 67 APNDICE A. CROMATOGRAMAS ............................................................................ 76 APNDICE B. EQUIPAMENTO DE EXTRAO SUPERCRTICA ....................... 82 APNDICE C. CURVAS DE ABSORBNCIA DA CLOROFILA A.......................... 83 APNDICE D. SOLUBILIDADE EFETIVA .................................................................. 84

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NDICE DE FIGURAS Figura II.1. Pilocarpus microphyllus Figura II.2. Estrutura molecular da pilocarpina. Figura II.3. Degradao da pilocarpina (Chung et al., 1970). Figura II.4. Estrutura dos ismeros que compem a pilosina (Scheerer, 2001). Figura II.5. Extrao convencional de alcalides do jaborandi (adaptado de Saldaa, 2002). Figura II.6. Variao da densidade em funo da temperatura e presso do dixido de carbono (adaptado de Angus e Dereuck, 1976). Figura II.7. Solubilidade da cafena no CO2 (Saldaa et al., 1999). T= 333,1 K e 5,25 mol % de co-solvente (Ting et al., 1993). Figura II.9. Variao da temperatura crtica com a porcentagem molar de co-solvente (adaptado de Ting et al., 1993). Figura II.10. Adsoro em ambiente supercrtico da mistura cido benzico e cido saliclico. Influncia do a) tempo (P= 20MPa e T= 318K); b) presso (T= 318K e t= 120 min); c) temperatura (P=20 e t= 120 min), U a razo entre massa de soluto adsorvido e massa de solvente (Domingo et al., 2001). Figura II.11. Curvas de extrao da cafena do ch-mate modo (comercial) e in natura (Saldaa, 2002). Figura IV.1. Curvas de extrao supercrtica de pilocarpina de folhas de jaborandi a 200 bar. Figura IV.2. Curvas de extrao supercrtica de pilocarpina de folhas de jaborandi a 300 bar. Figura IV.3. Fotografia das amostras obtidas em cada ponto da extrao realizada com folhas de jaborandi utilizando CO2 puro. Figura IV.4. Curvas de extrao de pilocarpina de folhas de jaborandi a 40C. Figura IV.5. Curvas de extrao de pilocarpina de folhas de jaborandi a 50C. Figura IV.6. Curvas de extrao de pilocarpina de folhas de jaborandi a 60C. do CO2. 39 40 41 41 42 21 38 38 38 38 19 16 12 13 15 10 4 5 6 8

Figura II.8. Efeito do co-solvente na solubilidade do naproxeno em funo da presso. 15

Figura IV.7. Recuperao de pilocarpina das folhas de jaborandi em funo da densidade

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Figura IV.8. Curvas de extrao da epiisopiloturina de folhas de jaborandi, a uma presso de 300 bar. Figura IV.9. Curvas de extrao da pilocarpina da pasta residual a presso de 200 bar. Figura IV.11. Curvas de extrao de pilocarpina da pasta residual a 40C. Figura IV.12. Curvas de extrao de pilocarpina da pasta residual a 50C. Figura IV.13. Curvas de extrao de pilocarpina da pasta residual a 60C. Figura IV.14. Recuperao de pilocarpina da pasta residual em funo da densidade do CO2. Figura IV.15. Curvas de extrao da epiisopiloturina da pasta residual a presso de 200 bar. Figura IV.16. Curvas de extrao da epiisopiloturina da pasta residual a presso de 300 bar. Figura IV.17. Curvas de extrao de epiisopiloturina da pasta residual a 40C. Figura IV.18. Curvas de extrao de epiisopiloturina da pasta residual a 50C. Figura IV.19. Curvas de extrao de epiisopiloturina da pasta residual a 60C. Figura IV.20. Massa extrada de epiisopiloturina (em termos de rea do pico) em funo da densidade do CO2. Figura IV.21. Curvas de extrao de pilocarpina de folhas de jaborandi com CO2 puro e com CO2 + 10% de etanol a presso de 300 bar. e com CO2 + 10% de etanol a presso de 300 bar. Figura IV.23. Curvas de extrao da clorofila (em unidades de absorbncia) de folhas de jaborandi com CO2 puro e CO2 + 10% de etanol a presso de 300 bar. Figura IV.25. Curvas de extrao de epiisopiloturina da pasta residual a presso de 300 bar. de jaborandi a 60C e 300 bar. Figura IV.27. Curvas de extrao/adsoro e curva de dessoro de epiisopiloturina de folhas de jaborandi a 60C e 300 bar. jaborandi a 60C e 300 bar. 58 59 viii Figura IV.28. Curvas de extrao/adsoro e curva de dessoro de clorofila de folhas de 56 58 Figura IV.26. Curvas de extrao/adsoro e curva de dessoro de pilocarpina de folhas 54 Figura IV.24. Curvas de extrao de pilocarpina da pasta residual a presso de 300 bar. 55 51 53 Figura IV.22. Curvas de extrao de epiisopiloturina de folhas de jaborandi com CO2 puro 50 48 49 49 50 48 47 43 44 45 46 46

Figura IV.10. Curvas de extrao da pilocarpina da pasta residual a presso de 300 bar. 45

Figura IV.29. Fotografia das amostras obtidas na etapa de extrao/adsoro realizadas com folhas de jaborandi utilizando CO2 puro. Figura IV.30. Fotografia das amostras obtidas na etapa de dessoro com CO2 + 10% etanol. bar. 300 bar. Figura A.1. Cromatograma do padro de pilocarpina diluda em gua. Figura A.2. Cromatograma do padro de epiisopiloturina diluda em gua. Figura A.3. Cromatograma do padro de pilocarpina diluda em etanol. Figura A.4. Cromatograma do padro de epiisopiloturina diluda em etanol. Figura A.5. Cromatograma da mistura dos padres de pilocarpina e de epiisopiloturina diluda em gua. Figura A.6. Cromatograma da mistura dos padres de pilocarpina e de epiisopiloturina diluda em etanol. Figura C.1. Espectrofotmetro da absorbncia da clorofila das extraes supercrticas da folha de jaborandi a 300 bar. Figura D.1. Solubilidade efetiva da pilocarpina em funo da densidade do CO2. Figura D.2. Variao relativa da solubilidade efetiva da epiisopiloturina em funo da densidade do CO2. 85 83 84 81 Figura B.1. Equipamento de extrao supercrtica da EXTRAE/FEA (mtodo esttico). 82 80 61 62 62 76 77 78 79 Figura IV.31. Curvas de adsoro/dessoro de pilocarpina da pasta residual a 60C e 300 Figura IV.32. Curvas de adsoro/dessoro de epiisopiloturina da pasta residual a 60C e 60

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NDICE DE TABELAS Tabela IV.1. Contedo de pilocarpina nas folhas de jaborandi determinados por extrao com alternncia de pH. ......................................................................................................... 33 Tabela IV.2. Recuperao de pilocarpina na extrao de folhas de jaborandi, a 300 bar. ... 52 Tabela IV.3. rea acumulada de epiisopiloturina extrao de folhas de jaborandi, a 300 bar, quando passados 1500g de CO2. .......................................................................................... 53 Tabela IV.4. Recuperao de pilocarpina na extrao da pasta residual a presso de 300 bar. .............................................................................................................................................. 55 Tabela IV.5. rea acumulada de epiisopiloturina na extrao da pasta residual, a 300 bar, quando passados 1500g de CO2. .......................................................................................... 56

CAPTULO I. INTRODUO

O uso de plantas medicinais para combater enfermidades milenar, j tendo sido utilizado por gregos, romanos e egpcios. A histria da civilizao mostra que, alm de servirem como fonte de alimentos, os vegetais tambm foram usados na obteno de remdios, cosmticos, perfumes e venenos (Agra et al., 1994). Planta medicinal aquela que exerce uma ao farmacolgica quando administrada de alguma forma ao homem ou a animais, devido presena de princpios ativos. Muitas destas plantas medicinais devem sua ao farmacolgica a princpios ativos conhecidos vindo mesmo, em vrios casos, a fornecer matria-prima para a indstria farmacutica (Rizzini e Mors, 1995). Os principais tipos de compostos utilizados como princpios ativos em medicamentos e cosmticos so alcalides, flavonides, glicosdeos, mucilagens, leos essenciais e taninos. Estas substncias qumicas so encontradas em folhas, sementes, razes e cascas de plantas (Bentley, 1965). Os alcalides pertencem a um grupo qumico com amplo emprego farmacolgico, tornando muito importante as proposies e novas metodologias que envolvam sua obteno e purificao. A biodiversidade brasileira, representando 20% das espcies do planeta, constitui um mercado economicamente atraente, possibilita a descoberta de medicamentos para a cura de molstias como cncer e AIDS. Os fitofrmacos, medicamentos produzidos a partir dos princpios ativos das plantas, foram responsveis por 30% do mercado de medicamentos em 1999, e neste mesmo ano, a indstria farmacutica brasileira ocupou o dcimo maior mercado do mundo movimentando 9 bilhes de dlares e sua exportao gerou ao pas uma receita de 22 milhes de dlares (Petrovick et al., 1999). Nos ltimos anos, a produo de fitofrmacos tem sido o objetivo de instituies de pesquisas nacionais e internacionais, pois movimenta US$ 20 bilhes/ano no mercado mundial (INPA, 2006). Para o desenvolvimento de um produto farmacutico, cosmtico ou alimentcio a partir de produtos naturais so necessrios processos de extrao, concentrao e/ou purificao do princpio ativo. Quando a matria-prima constituda por folhas, a dificuldade aumenta por possurem baixas concentraes do princpio ativo, sendo 1

Captulo I. Introduo necessrio grande volume deste material. Para obter elevado rendimento com alta seletividade, os processos tradicionais de extrao e purificao que utilizam solventes qumico,s e que tem sido utilizados por muitas dcadas, tendem a ser demorados, fazem uso de substncias txicas, usam severas condies de processo que favorecem a degradao dos produtos e oferecem grandes riscos de acidentes nocivos ao meio ambiente porque requerem volumes relativamente grandes de solventes, alm da gerao de resduos txicos (Luque de Castro e Garcia-Ayuso, 1998). Devido s preocupaes ambientais com a utilizao de solventes orgnicos em extraes, a tecnologia de fluido supercrtico surge como uma alternativa atraente como mtodo de extrao. O uso de fluido supercrtico (FSC) se destaca por ser uma tecnologia limpa, que permite a possibilidade de trabalhar a moderadas temperaturas e uma simples descompresso consegue separar o soluto do solvente. Nos ltimos vinte anos, a indstria farmacutica demonstrou maior interesse por processos envolvendo fluido supercrtico devido ao seu potencial em produzir partculas com propriedades desejadas, nveis reduzidos de solventes e maior pureza dos princpios ativos, pois a presena de impurezas pode contribuir para mudana das propriedades qumicas e fsicas levando a instabilidades (Daintree, 2008). O dixido de carbono o solvente mais utilizado em extraes supercrticas. Apesar de ser um timo solvente de compostos no-polares, tais como hidrocarbonetos, princpios ativos como fenis, alcalides e glicosdeos so pouco solveis em CO2 fato que dificulta a extrao (Vilegas et al., 1997). Esta limitao pode ser superada modificando as condies termodinmicas de presso e temperatura, e/ou com a adio de pequenas quantidades de co-solventes polares ao CO2 supercrtico. A utilizao de co-solventes polares faz aumentar significativamente a solubilidade de compostos polares. Um dos co-solventes mais utilizados o etanol que pode ser uma boa escolha para a extrao supercrtica de princpios ativos por causa da sua baixa toxicidade (Hamburger et al., 2004; Lang e Wai, 2001).

Captulo I. Introduo O jaborandi (Pilocarpus Microphyllus) um arbusto nativo da flora brasileira e nas ltimas trs dcadas foi uma das espcies mais importantes e mais exploradas comercialmente, devido ao alcalide pilocarpina presente em suas folhas (Pinheiro, 2002). A importncia da pilocarpina como um fitoterpico no tratamento do glaucoma e xerostomia pode ser avaliada atravs dos dados disponibilizados pela ABIQUIF (2008), os quais mostram que em 2007, o cloridrato e o nitrato de pilocarpina ocuparam o segundo lugar entre os produtos brasileiros farmacuticos mais exportados, atingindo 8,6 milhes de dlares. O processo convencional para a extrao de pilocarpina utilizado pelas indstrias usa solventes como clorofrmio e solues de hidrxido de amnia e cido sulfrico atravs da tcnica de alternncia de extremos de pH. Isto pode favorecer a degradao da pilocarpina por epimerizao ou hidrlise, transformando-se em isopilocarpina e cido isopilocrpico (Sternitzke et al., 1992). O nico trabalho encontrado na literatura sobre a utilizao de FSC para a recuperao da pilocarpina foi realizado na Faculdade de Engenharia Qumica, UNICAMP, mas os limitados resultados apresentados so inconclusivos (Saldaa, 2002). O objetivo deste trabalho a explorao da promissora tecnologia que utiliza FSC para a extrao e purificao de pilocarpina e epiisopiloturina a partir de folhas do jaborandi e de uma pasta residual industrial gerada atravs da extrao de pilocarpina das folhas de jaborandi por mtodos convencionais. Ensaios experimentais visam levantar subsdios tcnico/cientficos para o desenvolvimento adequado do processo, assim como a obteno destes produtos de alto valor agregado com uma qualidade superior a dos mtodos convencionais. Este projeto de pesquisa se insere na programao de equipe multidisciplinar coordenada pelo Prof. Dr. Paulo Mazzafera (IB, UNICAMP), que vem, com o apoio da FAPESP, estudando sistematicamente estes dois importantes princpios ativos para elucidar as aes farmacolgicas da epiisopiloturina, as rotas metablicas de produo destes alcalides e o domnio dos mtodos de extrao e recuperao. Esta pesquisa conta tambm com a colaborao do Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Qumicas, Biolgicas e Agrcolas (CPQBA/UNICAMP) no fornecimento das folhas de jaborandi. 3

CAPTULO II. REVISO BIBLIOGRFICA

II.1. Jaborandi Jaborandi a designao de um grupo de espcies pertencentes famlia Rutaceae, do gnero Pilocarpus sendo que as principais espcies so microphyllus, jaborandi e pennatifolius. O jaborandi pode ser classificado como um arbusto ou arvoreta com aproximadamente 3 a 7,5 m de altura, com folhas de 2 a 6 cm de comprimento apresentando bordas variando de lanceolado a oval, como mostrado na Figura II.1 (Oliveira et al., 1991; Pinheiro, 2002). O jaborandi conhecido pelos ndios tupi-guaranis h vrios sculos, que o denominaram de ia-mbor-endi, que significa que faz babar, pois induz a salivao (Corra, 1984).

Figura II.1. Pilocarpus microphyllus

Dentre as espcies conhecidas, a Pilocarpus microphyllus e a Pilocarpus jaborandi, foram as mais estudadas devido aos maiores percentuais de pilocarpina contidos em suas folhas e pela sua vasta distribuio geogrfica, que engloba praticamente todo o territrio nacional, desde o Par at o Rio Grande do Sul (Avancini et al., 2003; Pinheiro, 2002). O jaborandi uma espcie nativa da flora brasileira muito explorada nas ltimas trs dcadas, sendo o Maranho o estado que participa com 95% da produo nacional 4

Captulo II. Reviso bibliogrfica (Pinheiro, 2002). Desde 1992, porm, a planta faz parte da Lista Oficial de Espcies da Flora Brasileira Ameaadas de Extino, publicada pelo Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renovveis, devido sua explorao descontrolada (IBAMA, 1992). II.1.1. Pilocarpina A pilocarpina um alcalide encontrado somente nas folhas de jaborandi, na faixa de concentrao de 0,5 a 1%. Esta variao de concentrao influenciada por fatores climticos e pelo tipo de solo. As folhas mais jovens apresentam 70% mais pilocarpina do que as folhas velhas; isto porque a fase jovem dependente da formao de enzimas para o desenvolvimento dos processos de diferenciao dos respectivos tecidos (Scheerer, 2001). Alcalides so bases orgnicas nitrogenadas presentes em plantas, microrganismos e animais. Um ou mais tomos de nitrognio esto presentes, e estes so responsveis pela basicidade dos alcalides (Dewick, 1997). A pilocarpina um alcalide derivado, provavelmente, do aminocido histidina (Dewick, 1997). Ela apresenta um ncleo imidazlico e outro pentagonal lactnico. Este alcalide foi isolado por Hardy em 1875, sendo que sua constituio qumica foi determinada por Pinner e sua sntese foi realizada pelo qumico polons Preobrashenski em 1933 (Mingoia, 1967). Este alcalide pode ser obtido na forma de cristais. Sua estrutura molecular apresentada na Figura II.2. Sua frmula qumica C11H16N2O2, e sua massa molecular 208,26 g/gmol. Seu ponto de fuso 34C e o de ebulio 260C, sendo que nesta temperatura ocorre uma parcial converso isopilocarpina. A pilocarpina solvel em gua, lcool e clorofrmio (MERCK, 1983).

Figura II.2. Estrutura molecular da pilocarpina. 5

Captulo II. Reviso bibliogrfica A pilocarpina uma substncia sensvel temperatura e ao pH e a degradao dela em soluo aquosa ocorre por hidrlise ou por epimerizao. A competio das duas rotas de degradao dependente deste dois fatores, como pode ser observado na Figura II.3. A estabilidade da pilocarpina decresce com o incremento de pH e sobretudo com elevadas temperaturas (Bundgaard et al., 1986; Neville et al.,1975; Fan et al.,1996). O aumento de temperatura faz com que a epimerizao ocorra em maiores propores do que a hidrlise (Neville et al.,1975).

Figura II.3. Degradao da pilocarpina (Chung et al., 1970).

Um estudo realizado por Saldaa (2002) investigou uma possvel degradao da pilocarpina, avaliando a estabilidade de uma soluo de pilocarpina hidroclorada em etanol e mantida por trs semanas, a temperatura de 21C. O monitoramento foi realizado por CLAE e no se constatou degradao. As aes muscarnicas da pilocarpina se manifestam em seres humanos atravs de uma potente excitao das secrees glandulares o que causam um aumento do suor e da saliva (Mingoia, 1967; Swan, 1967). A aplicao farmacutica mais importante da 6

Captulo II. Reviso bibliogrfica pilocarpina est baseada na sua capacidade em reduzir a presso intra-ocular no tratamento do glaucoma e em cirurgias do olho, por causar a constrio da pupila (Migdal, 2000; Webster et al., 1993). O glaucoma uma doena comum manifestada pela lenta e progressiva perda de viso, sendo a segunda causa de cegueira nos EUA (Di Stasi, 1996). A pilocarpina tem sido tambm recomendada para o tratamento da xerostomia, que a reduo da produo da saliva, muito comum nos pacientes que foram submetidos radioterapia e em pacientes com sndrome de Sjgren (Davies et al., 2001 e Wynn, 1996), pois ativa as glndulas salivares. Algumas pesquisas apontaram que a pilocarpina estimula o crescimento de cabelo e que tambm possui ao renal, removendo metablicos txicos (Swan, 1967). Dentre os efeitos adversos associados ao uso da pilocarpina, merecem destaque, o rubor facial, a sudorese excessiva, nuseas, vmitos, distrbios gastrintestinais, cefalia, aumento da freqncia urinria, alteraes cardacas, vasculares e da musculatura lisa (Taylor e Al-Hashimi, 1996; Bernardi et al., 2002). De acordo com Nusair e Rubinow (1999), a posologia do medicamento que promove aumento do fluxo salivar ou conforto subjetivo ao paciente de 5 mg de pilocarpina via oral tomada entre 3 a 4 vezes por dia, no podendo exceder 20 mg/dia. Doses superiores a esse limite no proporcionam um aumento dos benefcios esperados e os malefcios tendem a se exacerbar. A pilocarpina um frmaco parassimpatomimtico que estimula de forma direta os receptores colinrgicos. Alguns dos produtos contendo sais de pilocarpina (cloridrato e nitrato) disponveis no mercado so encontrados com os nomes de Adsorbocarpine, Akarpine, Almocarpine, I-pilocarpine, Isopto carpine, Minims Pilocarpine, Miocarpine, Ocu-carpine, Ocusert-Pilo, Pilocar, Pilokair, Pilopine HS, Piloptic, Pilostat, P.V. Carpine, P.V. Carpine Liquifilm, Spectro-pilo, Spersacarpine (Cosentino, 1998). Um estudo realizado por Souza Filho et al. (2003) mostrou que os medicamentos base de pilocarpina tiveram um considervel aumento no preo entre os anos de 1972 e 2002 e que apesar da introduo de outros medicamentos para o tratamento de glaucoma, a pilocarpina continua atual.

Captulo II. Reviso bibliogrfica II.1.2. Epiisopiloturina Nas folhas do jaborandi, alm da pilocarpina, so encontrados outros alcalides como a pilocarpidina, pilosina, isopilocarpina, jaborina e jaboridina, alm de 0,24% a 0,38% de leo essencial (Merck, 1983). Comercialmente, pilosina o nome dado a um conjunto de quatro ismeros: pilosina, isopilosina, epiisopilosina e epiisopiloturina, cujas estruturas esto apresentadas na Figura II.4. Estes ismeros so de difcil isolamento, mas em um trabalho feito recentemente por Abreu et al. (2007) foi possvel sua separao e identificao analtica.

OH
H H H

OH
H H H

Pilosina

Isopilosina

H
OH H H

H
OH H H

N O
O N

Epiisopilosina = benzeno

Epiisopiloturina

Figura II.4. Estrutura dos ismeros que compem a pilosina (Scheerer, 2001).

O processo industrial de extrao de pilocarpina das folhas do jaborandi gera um resduo semi-slido rico em epiisopiloturina, mas que contm tambm os outros ismeros. 8

Captulo II. Reviso bibliogrfica O interesse pela separao destes ismeros justamente descobrir frmacos para o tratamento de enfermidades. O alcalide epiisopiloturina foi isolado e identificado por Voigtlander et al. (1978). Sua frmula C15H18N2O3 e sua massa molecular 274,32. Um estudo que vem sendo realizado no Laboratrio de Fisiologia Vegetal, IB/UNICAMP com a colaborao do Laboratrio de Farmacologia, FCM/UNICAMP, coordenado pelo Prof. Dr. Paulo Mazzafera, tem como finalidade demonstrar qual a ao da epiisopiloturina em receptores colinrgicos e canais inicos. Os resultados preliminares indicaram ao semelhante da pilocarpina, apesar de ocorrer por mecanismos diferentes. Este mesmo grupo vem conduzindo diversos trabalhos visando confirmar a possvel ao farmacolgica da epiisopiloturina. Nas folhas do jaborandi tambm so encontrados leos essenciais, que so constitudos por 2-tridecanona, -cariofileno, 2-pentadecanona, xido de cariofileno, Dgermacreno, entre outros (Taveira et al., 2003).

II.2. Extrao convencional A Figura II.5 apresenta o fluxograma de uma extrao convencional de alcalides de jaborandi, a qual consiste nas etapas de preparo da matria-prima, seguida de extrao e purificao dos princpios ativos atravs da alternncia de pH. Este tipo de extrao caracterizado por ser demorado e pouco seletivo, alm de utilizar grande quantidade de solventes orgnicos, o que dificulta a fabricao de um produto de alta qualidade, ou seja, sem resduos txicos (Saldaa, 2002).

Captulo II. Reviso bibliogrfica Folhas de jaborandi secas e moidas

NH4OH 10%

Agitao HCl diludo Agitao

Centrifugao

Fase orgnica

Decantao

Resduo slido

Fase aquosa Clorofrmio em meio alcalino (NH4OH) Fase orgnica Evaporao/cristalizao Fase aquosa (descartar) Cristais: sais de pilocarpina Decantao

Figura II.5. Extrao convencional de alcalides do jaborandi (adaptado de Saldaa, 2002).

Um trabalho realizado por Avancini et al. (2003) avaliou mtodos de extrao convencional de pilocarpina das folhas de jaborandi. Para efeito de comparao com a extrao supercrtica, o melhor mtodo de extrao convencional de pilocarpina das folhas de jaborandi foi o escolhido para a quantificao de pilocarpina neste trabalho. 10

Captulo II. Reviso bibliogrfica II.3. Fluido supercrtico O estado supercrtico atingido quando a temperatura e a presso de uma substncia esto acima dos seus parmetros crticos, ou seja, T>Tc e P>Pc. A tecnologia que faz uso desse estado da matria tem desenvolvido mtodos de extrao que se destacam por serem rpidos e eficientes para recuperar produtos qumicos de matrizes de planta (Marr e Gamse, 2000; Lang e Wai, 2001). uma tecnologia limpa que permite trabalhar com moderadas temperaturas e/ou presses e a separao do soluto e solvente relativamente fcil. Alm disso, o tempo de extrao extremamente reduzido, obtm-se produtos de alta qualidade e pureza e com tamanhos de partculas que podem ser controlados (Mohamed et al., 1989). O interesse pelos fluidos supercrticos cresceu muito nos ltimos anos, bem como seu leque de aplicaes, gerando uma gama maior de produtos para usos alimentcio, cosmtico e farmacuticos. O fluido supercrtico adquire uma densidade similar de um lquido, o que lhe confere um maior poder de solvatao do que o dos gases. A compressibilidade desses fluidos, entretanto, prxima a de um gs (Skoog e Leary, 1992; Stuart et al., 1996). Outra caracterstica desses fluidos ter um coeficiente de difuso de massa maior e viscosidade e tenso superficial menores do que um solvente lquido, o que lhe permite penetrar nos pequenos espaos e poros em materiais slidos dos quais se deseja extrair o soluto, como tecidos de plantas, favorecendo a extrao quando controlada pela difuso molecular (Wang e Weller, 2006; McHugh e Krukonis, 1994). A escolha do fluido supercrtico muito importante no desenvolvimento do processo de extrao supercrtica. As limitaes do uso de produtos orgnicos e a reduo do preo do dixido de carbono fizeram com que este se tornasse a substncia mais empregada neste tipo de processo (Wang e Weller, 2006). Dentre as caractersticas que o tornaram o mais utilizado, as mais importantes so o fato de ser atxico, no-inflamvel, ter baixa reatividade e ser de grande acessibilidade, a possibilidade de sua obteno com alto grau de pureza a baixo custo e, sobretudo, por apresentar baixos parmetros crticos (Taylor, 1996). A baixa temperatura crtica do CO2 permite sua utilizao no estado 11

Captulo II. Reviso bibliogrfica supercrtico, sem prejudicar as propriedades funcionais de protenas e outros constituintes de alimentos e por isso adequado para a extrao de princpio ativo de produtos naturais complexos uma vez que a maioria destes compostos hidrolisvel e termolbil (McHugh e Krukonis, 1994). A solubilidade depende de um complexo equilbrio entre a densidade do fluido supercrtico e a presso de vapor do soluto, os quais so controlados pela temperatura e presso. O CO2 supercrtico capaz de solubilizar componentes no polares ou de baixa polaridade e incapaz de solubilizar protenas, polissacardeos e sais minerais; tem um alto poder de solvatao para componentes com baixa massa molecular que decresce com o aumento da massa, tem alta afinidade por componentes orgnicos oxigenados de mdia massa molecular, tem baixa solubilidade em gua a temperaturas abaixo de 100 C e capaz de separar componentes que tem baixa volatilidade e alta massa molecular e/ou que so mais polares com o incremento de presso (Brunner, 2005). O diagrama de estado do CO2 apresentado na Figura II.6 permite observar as considerveis variaes da densidade do dixido de carbono na regio supercrtica, quando se aplicam pequenas alteraes na temperatura ou na presso.

Figura II.6. Variao da densidade em funo da temperatura e presso do dixido de carbono (adaptado de Angus e Dereuck, 1976). 12

Captulo II. Reviso bibliogrfica Nota-se, atravs das isotermas, que aps o ponto crtico, a densidade muito influenciada pela temperatura. Ela aproximadamente 5 vezes maior a 310 K do que a 380 K, e como conseqncia, baixas temperaturas favorecem o poder de solvatao do fluido supercrtico. Nessa regio, a medida que se afasta da presso crtica, esse efeito fica menos pronunciado. Por outro lado, aumentos de temperatura aumentam a energia livre do sistema e com isso seu potencial de solubilizao Este comportamento delimitado pela presso de cruzamento, onde a solubilidade a mesma para qualquer temperatura (Chimowitz e Pennisi, 1986). Em situaes nas quais a presso est abaixo da presso de cruzamento um aumento de temperatura diminui a solubilidade do soluto no fluido supercrtico. Acima da presso de cruzamento, aumentos de temperatura aumentam a solubilidade. Essa situao acontece devido aos dois efeitos opostos do aumento da temperatura sobre a solubilidade, mencionados acima. Esse fenmeno muito conhecido em extraes supercrtica e denominado de comportamento retrgrado. Um exemplo de comportamento retrgrado est apresentado na Figura II.7, que apresenta a solubilidade de cafena em CO2 supercrtico (Saldaa et al., 1999). Observa-se na figura que abaixo da presso de cruzamento (cerca de 19 MPa), aumentos de temperatura diminuem a solubilidade da cafena (devido diminuio da densidade), enquanto que acima dessa presso, temperaturas mais altas solubilizam maior quantidade de material.

Figura II.7. Solubilidade da cafena no CO2 (Saldaa et al., 1999). 13

Captulo II. Reviso bibliogrfica A presso desempenha um papel importante na extrao supercrtica de substncias presentes em vegetais. O aumento da presso provoca um aumento da densidade do fluido supercrtico, resultando em dois efeitos opostos: o aumento do poder de solvatao pode ser compensado pela maior dificuldade de penetrao do fluido supercrtico na matriz vegetal, o que reduz a quantidade de substncia extrada (Bahramifar et al., 2005). Parmetros como presso, temperatura, estrutura qumica do co-solvente, concentrao do co-solvente, vazo, mtodo de operao (esttica ou dinmica), dimetro de partculas e tempo de extrao devem ser considerados na otimizao das condies de extrao. II.3.1. Utilizao de co-solventes (CSOL) O dixido de carbono apresenta uma baixa afinidade por molculas polares devido ao alto valor de seu quadrupolo. O CO2 apesar de ser caracterizado como uma molcula apolar apresenta um carter intermedirio entre um solvente totalmente no-polar e fracamente polar (Clifford, 1998). Esta desvantagem pode ser contornada pela adio de modificadores, tambm conhecidos como co-solventes ou entrainers, que apresentam caracterstica polar. A adio de pequenas quantidades de co-solvente polar ao CO2-SC forma uma mistura supercrtica polar (Dobbs et al., 1986; Gurdial et al., 1993). A adio de um co-solvente faz aumentar a solubilidade de um determinado soluto por um determinado componente, devido s associaes qumicas e interaes entre eles e/ou o aumento de densidade (Brunner, 1983). A presena de modificadores rompe a interao entre a molcula de interesse e a matriz, aumentando a eficincia de extrao de componentes orgnicos polares (Lang e Wai, 2001). As vantagens so o favorecimento da dessoro do soluto e a diminuio da quantidade de solvente utilizado. O fator predominante depende da natureza qumica dos componentes e das condies experimentais de temperatura, presso e concentraes (Zhong et al., 1997). O efeito do CSOL, segundo Ting et al. (1993), explicado pelas interaes entre as molculas de soluto e as molculas de CSOL, aumentando a densidade local em volta da molcula do soluto em relao densidade do meio, por causa da formao de um cluster 14

Captulo II. Reviso bibliogrfica ao redor dessa molcula (Debenedetti et al., 1989; Brennecke et al., 1990). O termo cluster se refere ao aumento de densidade local em decorrncia da maior quantidade de solvente no entorno da molcula. Este aumento de densidade se deve atrao entre soluto e solvente e compressibilidade do sistema prximo ao ponto crtico, formando assim aglomerados de molculas de solvente. Ting et al. (1993) afirmam que, dependendo do soluto e do CSOL, haver a possibilidade da formao de pontes de hidrognio entre as molculas de soluto e as molculas de CSOL. Esta concluso foi baseada no estudo da solubilidade de naproxeno em misturas com CO2-SC e co-solventes e os resultados so apresentados na Figura II.8. Foram realizados estudos com os seguintes CSOLs: metanol, etanol, 1-propanol e isopropanol. Os resultados demonstram que o efeito do CSOL (quantificado como sendo a razo entre a solubilidade do soluto na mistura do solvente com o CSOL e a solubilidade do soluto no solvente puro) aumenta com o aumento da cadeia do lcool, sendo que o propanol o CSOL que maximiza este efeito. Os resultados mostram que o efeito do CSOL, para as condies e substncias utilizadas, diminui com o aumento da presso. O isopropanol tem um efeito de CSOL menor do que o propanol, devido ao impedimento estrico para a formao do cluster de solvatao, pois o posicionamento da hidroxila no meio da cadeia dificulta a aproximao para a formao da ponte de hidrognio com os oxignios presentes na molcula do soluto.

Figura II.8. Efeito do co-solvente na solubilidade do naproxeno em funo da presso. T= 333,1 K e 5,25 mol % de co-solvente (Ting et al., 1993).

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Captulo II. Reviso bibliogrfica Outro efeito discutido pelos autores o maior distanciamento das condies crticas. A mistura de CO2/isopropanol possui temperatura crtica menor do que a mistura CO2/propanol. A adio de co-solvente modifica a polaridade do CO2 e as propriedades do solvente supercrtico. No caso da adio de lcoois, a presso crtica e a temperatura crtica aumentaram de acordo com o aumento da concentrao deste na mistura (Ting et al., 1993). Este efeito pode ser observado na Figura II.9. Portanto, para a condio experimental utilizada, a mistura utilizando isopropanol como co-solvente est mais distante do seu ponto crtico e, quanto mais distante, menor o efeito de compressibilidade no sistema e a diferena de densidade local do cluster de solvatao em relao ao meio menor, quando comparada com a mistura utilizando propanol como CSOL.

Figura II.9. Variao da temperatura crtica com a porcentagem molar de co-solvente (adaptado de Ting et al., 1993).

Vrios estudos confirmam os efeitos do co-solvente na extrao de molculas complexas. Schaeffer et al. (1988), estudaram a variao da solubilidade do alcalide monocrotalina com a adio de etanol ao CO2-SC. Os resultados encontrados pelos autores revelaram que com as adies de 5 e 10 mol % de etanol, a solubilidade aumentou 6 e 12 vezes, respectivamente, quando comparada com a solubilidade no CO2-SC puro. Os autores tambm constataram um deslocamento da presso de cruzamento com o aumento da quantidade de etanol.

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Captulo II. Reviso bibliogrfica Zhong et al. (1997), estudaram o efeito da adio de etanol como co-solvente, na solubilidade de cido esterico em CO2-SC. Os resultados indicaram um aumento de solubilidade do cido esterico com o aumento da percentagem de etanol mantendo a mesma presso. Segundo os autores, este resultado em razo da formao de pontes de hidrognio entre a hidroxila do etanol e o oxignio do cido carboxlico, juntamente com um aumento da densidade do fluido supercrtico com a adio do co-solvente, melhorando o poder de solvatao do FSC. A solubilidade de resveratrol em mistura de CO2 e etanol foi estudada por Berna et al., (2001). Este estudo foi motivado pela baixa solubilidade deste soluto em CO2-SC. Os autores estudaram misturas com 5; 7,5; 12,5 e 15 mol % de etanol. Os resultados apontam que as misturas contendo 7,5 % de etanol apresentavam o maior incremento da solubilidade. Choi et al. (1999a, 1999b, 2000) estudaram a extrao dos alcalides hiosciamina e escopolamina de Scopolia Japonica, metil efedrina, norefedrina, efedrina e pseudoefedrina de Ephedra Sinica e de cefalotaxina das folhas de Cephalotaxus Wilsoniana utilizando CO2-SC e CSOL. Estes autores apontam para o fato de que, apesar de alguns destes alcalides apresentarem altas solubilidades em CO2-SC puro, os rendimentos de extrao a partir da matriz vegetal so muito baixos. Isto se deve ao fato de que os alcalides se encontram presentes nos tecidos vegetais na forma de sais conjugados com cidos orgnicos. Os autores verificaram ainda que a adio de um CSOL com caractersticas bsicas (ex: solues de dietilamina em gua ou metanol) aumentou drasticamente a solubilidade dos alcalides. A extrao supercrtica com co-solventes se torna menos seletiva, aumentando a extrao de substncias indesejveis, como pigmentos e graxas de alto peso molecular. Um estudo realizado por Yang et al. (2002) mostrou que o processo de extrao supercrtica de frmacos presentes em folhas de Ginkgo biloba com CO2 puro e com a adio de etanol como co-solvente, forneceu extratos esverdeados ou amarelados, sendo necessrias etapas de purificao para obter um produto livre de impurezas. Processos de extrao supercrtica realizados com folhas tem como contaminante principal a clorofila. Esta extrada com CO2 puro, e em maiores propores, quando utilizado o etanol como co-solvente. Esta

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Captulo II. Reviso bibliogrfica uma impureza difcil de ser retirada em uma nica etapa de extrao supercrtica, exigindo procedimentos de purificao para fabricar um produto de alta qualidade. II.3.2. Acoplamento de outras operaes unitrias A separao de uma mistura por meio de extrao com fluidos supercrticos pode ser obtida por extrao seletiva, separao seletiva ou combinao das duas tcnicas. Para que ocorra uma extrao seletiva necessrio que exista um comportamento de solubilidade diferente de cada composto em relao ao solvente puro ou com co-solventes e em funo da temperatura e presso de trabalho. A separao seletiva pode ser obtida atravs do controle da descompresso, ou pelo acoplamento de outras operaes unitrias. A combinao das estratgias acima descritas, devido grande versatilidade dos processos que utilizam FSC, tambm deve ser considerada como uma alternativa para a recuperao e purificao de princpios ativos. Quando a extrao seletiva dos solutos de interesse no for possvel, pode-se ainda acoplar outras operaes unitrias ao sistema, como, por exemplo, adsoro, separao por membranas, etc., a fim de promover a separao desejada (Afrane e Chimowitz, 1995; Mohamed et al., 2000; Corzo et al., 2000). Na coluna de adsoro, a separao ocorre devido s diferenas de interao dos solutos de interesse com o adsorvente e o FSC, muito se assemelhando tcnica de cromatografia. Azevedo (2005) utilizou a combinao destas tcnicas para a recuperao e separao de cafena, cidos clorognicos e leo dos gros de caf verde. Este autor observou que parte da cafena foi extrada junto com o leo de caf verde e que apenas traos de cidos clorognicos eram detectados nos extratos quando CO2 puro foi utilizado como solvente. Para separar a cafena e refinar o leo foi utilizada uma coluna de adsoro. Observou-se ainda que, aps o desengorduramento dos gros modos, os cidos clorognicos foram extrados de forma mais efetiva atravs da modificao da polaridade do solvente utilizando lcoois alifticos. Estes mesmos lcoois alifticos foram utilizados para dessorver a cafena da coluna de slica. Para o refino dos cidos clorognicos do extrato obtido foi utilizada uma coluna empacotada com resina aninica.

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Captulo II. Reviso bibliogrfica Domingo et al. (2001) estudaram o processo de adsoro do cido benzico e do cido saliclico em alumina, slica gel e amberlite, utilizando CO2-SC como solvente. Foram avaliados sistemas binrios e ternrios, nos quais se procurou identificar os efeitos da presso, temperatura e tempo de extrao e natureza do material adsorvente em funo da quantidade de soluto adsorvido (mol) por grama de adsorvente. Verificou-se que a temperatura e a natureza do adsorvente so as variveis de processo que exercem maior influncia como pode ser observado na Figura II.10.

Figura II.10. Adsoro em ambiente supercrtico da mistura cido benzico e cido saliclico. Influncia do a) tempo (P= 20MPa e T= 318K); b) presso (T= 318K e t= 120 min); c) temperatura (P=20 e t= 120 min), U a razo entre massa de soluto adsorvido e massa de solvente (Domingo et al., 2001).

Solutos polares tm maior afinidade por adsorventes hidroflicos do que hidrofbicos. Desse resultado pode-se estimar a maior ou menor afinidade de um determinado soluto por um dado adsorvente com base nas suas solubilidades em solventes polares e apolares. Entretanto, a anlise no to simples, pois a capacidade das molculas se auto-associarem influencia na cintica de adsoro. Aquelas que formam dmeros passam a ter um volume molecular maior e, conseqentemente, um menor coeficiente de difuso. A polaridade das molculas e, por conseguinte, a sua afinidade por adsorventes hidroflicos tambm alterada, como foi verificado pelos autores. Os autores no 19

Captulo II. Reviso bibliogrfica explicitam a razo pela qual a adsoro dos solutos em alumina baixa, apesar da alumina ter a mesma caracterstica da slica gel (ons OH na superfcie). Ao que parece, a rea superficial da alumina (aproximadamente 3 vezes menor que a da slica-gel) um fator importante a ser considerado. Em sistemas ternrios formados de FSC e dois solutos, verificou-se tambm a possibilidade de adsoro seletiva de um dos solutos mostrando a potencialidade de utilizao do processo de adsoro como tcnica de separao de misturas (Domingo et al., 2001). Lim e Rizvi (1996) estudaram a remoo de colesterol da gordura de leite utilizando CO2SC como solvente e acoplando uma coluna de adsoro contendo silicato de magnsio ao processo de extrao. Estes autores verificaram que alm da remoo do colesterol e da recuperao eficiente da gordura de leite, o adsorvente manteve a sua capacidade de adsoro aps a etapa de dessoro. Em trabalho posterior, Mohamed et al. (2000) estudaram o mesmo processo utilizando etano supercrtico como solvente. Alcanou-se a remoo completa do colesterol utilizando uma massa de etano cerca de 10 vezes menor do que a massa de CO2 necessria para promover a mesma separao. Este resultado se deve ao fato da solubilidade do leo de manteiga e do colesterol serem cerca de duas ordens de grandeza superiores em etano supercrtico em comparao aos valores de solubilidade em CO2-SC nas mesmas condies. Como variante do processo de adsoro, Schaeffer et al. (1989) utilizaram uma resina de troca-catinica para purificar a monocrotalina da Crotolria Spectabilis. Neste processo, a adsoro realizada atravs das interaes qumicas entre as molculas de monocrotalina e a resina. Estes autores conseguiram excelentes resultados, isolando a monocrotalina com pureza superior a 95 %.

II.4. Influncia da matriz slida Um parmetro que merece relevncia na extrao supercrtica o tamanho de partcula da matriz. A Figura II.11 mostra o estudo feito por Saldaa (2002) comparando as

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Captulo II. Reviso bibliogrfica curvas de extrao da cafena do ch-mate modo e in natura a 343C, presso de 25,5 MPa e vazo de 0,9-1,8 g CO2 min-1.

Figura II.11. Curvas de extrao da cafena do ch-mate modo (comercial) e in natura (Saldaa, 2002).

Observa-se que a inclinao da curva de extrao da cafena do ch-mate modo muito mais acentuada do que a do ch-mate in natura. Dessa forma, pode-se concluir que a partcula com um menor dimetro favorece a extrao por ter uma maior rea superficial. Alm disso, a moagem rompe as clulas e expe os solutos a um contato direto com o solvente. O processo de extrao ocorre de trs maneiras diferentes, sendo que a primeira etapa controlada apenas pela solubilizao do soluto pelo fluido, devido grande quantidade de soluto na superfcie do produto. A segunda etapa a de transio, pois a quantidade de soluto na superfcie diminuiu e comea a difuso do soluto de dentro das partculas para a superfcie, ocorrendo uma reduo das taxas de extrao. A ltima etapa

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Captulo II. Reviso bibliogrfica controlada pela difuso interna, ou seja, o soluto contido no interior da partcula se difunde para o meio e devido alta resistncia, a transferncia de massa baixa. Dessa forma, pode-se concluir que o processo de extrao supercrtica a partir de matrizes slidas depende de trs fatores: a solubilidade do soluto no fluido supercrtico, a difuso do fluido na matriz slida e o efeito das interaes soluto-solvente-matriz (Daintree, 2008).

II.5. Extrao supercrtica da pilocarpina O nico trabalho sobre a recuperao de pilocarpina envolvendo fluidos supercrticos encontrado na literatura foi realizado por Saldaa (2002), que estudou a solubilidade da pilocarpina hidroclorada em sistemas binrios utilizando CO2 ou FCH3 (fluoreto de metila) como solventes na faixa de temperatura de 343 a 353 K e presses de 6,9 a 8,6 MPa. Os resultados demonstraram que a quantidade de pilocarpina hidroclorada solubilizada pela fase supercrtica foi extremamente baixa, apesar da grande diferena de polaridade entre os solventes. Existem algumas suposies que podem explicar esse efeito: - As presses utilizadas nos ensaios foram baixas. Maiores presses poderiam resultar em um aumento de solubilidade. - A afinidade entre o fluido e a molcula de pilocarpina hidroclorada baixa. A molcula de CO2 apresenta uma baixa polaridade, resultando em uma pequena afinidade com a molcula de pilocarpina hidroclorada, e a presena do grupo HCl pode induzir uma maior polarizao da molcula de pilocarpina. Com o fluorofrmio, apesar deste ser um solvente polar, no existe a formao de interaes especficas (i.e. pontes de hidrognio) com a molcula da pilocarpina, o que pode ter sido a principal causa da baixa solubilidade. - Na literatura tem sido reportado que alcalides na forma salina no so solveis em CO2 supercrtico, enquanto que na forma de base livre podem ser muito solveis. A solubilidade da pilocarpina hidroclorada foi estudada por Saldaa (2002) em uma srie de solventes de diferentes graus de polaridade na seguinte ordem: ter de petrleo < diclorometano < ter etlico < acetato de etila < acetona < etanol < gua. Nesse estudo, 22

Captulo II. Reviso bibliogrfica verificou-se que a pilocarpina foi solvel em etanol e gua, mas insolvel nos outros solventes. Analisando-se a estrutura molecular dos solventes, observa-se que apenas a gua e o etanol podem formar pontes de hidrognio com a molcula de pilocarpina e dissociar o sal. Esta pesquisadora tambm iniciou o estudo da extrao da pilocarpina das folhas de jaborandi usando CO2 supercrtico saturado com gua. Os resultados preliminares obtidos indicaram a incapacidade do CO2 em extrair a pilocarpina, embora pequena quantidade desse soluto tenha sido encontrada na gua coletada do fundo do vaso de extrao, ao final do experimento.

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CAPTULO III. MATERIAIS E MTODOS

III.1. Materiais III.1.1. Matria-prima a) Folhas de jaborandi As folhas de jaborandi utilizadas nesta pesquisa foram obtidas de trs fontes. a.1) Folhas do Instituto de Biologia, UNICAMP Folhas de jaborandi foram colhidas de rvores cultivadas no herbrio do IB/UNICAMP e separadas de possveis impurezas. Elas foram secas em estufa com recirculao de ar a 45C, por 48 horas e modas em um micro moinho de facas (marca Tecnal, modelo TE 648). Essas folhas foram utilizadas em pesquisas exploratrias. a.2) Folhas de produto comercial Folhas de jaborandi secas foram adquiridas no comrcio local, e modas no moinho de facas Tecnal. a.3) Folhas do CPQBA/UNICAMP Folhas de jaborandi da espcie Pilocarpus Microphyllus foram doadas pelo Centro Pluridisciplinar de Pesquisa Qumicas, Biolgicas e Agrcolas (CPQBA), de rvores plantadas em Campinas, com mais de 20 anos de idade. Estas folhas foram colhidas em maro de 2007. Dois lotes de folhas foram secos em estufa com recirculao de ar at atingir umidade de 7%. Um dos lotes foi seco a 40C por 5 dias e o outro a 70C por 3 dias. Essas duas condies foram escolhidas para poder avaliar a influncia da temperatura do ar de secagem na quantidade de princpios ativos encontrado nas folhas, uma vez que estes compostos so termolbeis. As folhas inteiras foram armazenadas em sacos plsticos, fechados e mantidos em locais secos e sem luminosidade.

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Captulo III. Materiais e mtodos Antes de cada ensaio de extrao, estas folhas eram modas no moinho de facas Tecnal e submetidas anlise granulomtrica. Amostras com dimetro mdio de 0,030 cm foram usadas em todos os ensaios. As folhas modas eram deixadas por 12 horas na estufa a 40C antes de cada ensaio de extrao. b) Pasta residual industrial Alm de folhas de jaborandi, foi utilizada uma pasta que resultante do processo industrial de extrao de pilocarpina das folhas de jaborandi, e cedida ao instituto de Biologia/UNICAMP pela Vegetex (Merck). A consistncia desta pasta semi-slida, tem uma colorao acinzentada e, segundo os fornecedores, muito rica em epiisopiloturina. Segundo informaes de pesquisadores do IB/UNICAMP, o lote desse material estava estocado a mais de 5 anos, sob refrigerao. No LEPPbio a pasta foi armazenada em local resfriado e em embalagens plsticas hermeticamente fechadas. III.1.2. Padres de pilocarpina e epiisopiloturina Foram utilizados padres de pilocarpina da marca Sigma, com 99% de pureza, e de epiisopiloturina (Vegeflora, Botucatu-SP), com 97,7% de pureza. III.1.3. Solventes HPLC Foram utilizados trietilamina PA (Riedelde Han - Alemanha, com 99% de pureza), cido fosfrico PA (Merck - Alemanha, com 99% de pureza) e metanol (J. T. Baker - EUA, com 99,9% de pureza). III.1.4. CO2 e co-solvente O dixido de carbono foi adquirido junto a White Martins (Campinas), em cilindros contendo tubo pescador. O co-solvente utilizado o etanol da marca Synth com grau de pureza de 99,8%.

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Captulo III. Materiais e mtodos III.1.5. Adsorvente Na coluna de adsoro foi utilizada slica-gel (Merck) com tamanho de partcula de 0,063 a 0,200 mm de dimetro.

III.2. Equipamento de extrao supercrtica O equipamento de extrao supercrtica utilizado foi projetado e desenvolvido pela equipe do Laboratrio de Engenharia de Produtos e Processos em Biorrecursos da FEQ/UNICAMP em parceria com a AUTIC (Automao e Instrumentao Industrial Ltda. - Campinas) (Azevedo, 2005). O desenvolvimento deste equipamento foi financiado com recursos FAPESP (Proc. 02/07753-0) e encontra-se em processo de patenteamento. A Figura III.1 mostra uma fotografia frontal do equipamento, que constitudo por cinco mdulos, descritos a seguir: Mdulo 1 Mdulo de Alimentao do solvente e co-solvente. Neste mdulo est localizado o quadro geral de fora do equipamento. Ele constitudo por uma bancada em dois nveis. No nvel inferior esto localizados os sistemas de alimentao de solvente e do co-solvente. Eles so constitudos por bombas para HPLC marca Gilson (EUA) modelos 305 (solvente) e 306 (co-solvente), um mdulo manomtrico marca Gilson modelo 805 para controle da presso na descarga das bombas, um transdutor de presso e display digital para indicao de presso, um sistema de pr-aquecimento de solvente localizado jusante do misturador esttico. No nvel superior esto localizadas as vlvulas que permitem a alimentao dos solventes ao processo. A bancada superior constitui o apoio para os demais mdulos. Mdulo 2 Mdulo Principal de Extrao. constitudo por uma coluna de 500 mL, uma vlvula reguladora de fluxo para coleta de material do fundo da coluna, um manmetro para monitorao da presso dentro da coluna, um controlador de temperatura PID para a camisa de aquecimento da coluna, um controlador para temperatura na camisa de aquecimento da vlvula e indicadores de temperatura.

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Captulo III. Materiais e mtodos Este mdulo foi projetado visando proporcionar versatilidade de configuraes de operao. A coluna deste mdulo possui um conjunto de tampas e bocais que permite a realizao de processos concorrentes e contracorrrente e uma vlvula de amostragem no fundo (que pode ser ligada facilmente conexo de sada do mdulo). Este mdulo foi projetado para servir a diferentes propsitos como em operaes de extrao, absoro, adsoro, e mesmo na formao de partculas por processos atravs de mudanas de configurao nas tampas. O solvente pode ser alimentado coluna de 3 diferentes maneiras. No presente trabalho, o solvente foi alimentado pelo fundo da coluna, e quando necessrio, j misturado com o co-solvente.

Figura III.1. Equipamento de extrao supercrtica.

Mdulo 3 Mdulo de Separao. composto por uma coluna de 300 mL, duas vlvulas reguladoras de fluxo, sendo uma para controle de presso na coluna e outra para retirada de amostra do fundo da coluna, um manmetro para monitorao da presso dentro da coluna, um controlador de temperatura PID para a camisa de aquecimento da coluna, um controlador P para a camisa de aquecimento da vlvula e indicadores de temperatura. Devido a versatilidade do sistema, este mdulo pode ser utilizado como mdulo de separao por adsoro, por absoro, por controle da condensao retrgrada e ainda utilizado como um segundo mdulo de extrao. 27

Captulo III. Materiais e mtodos Mdulo 4 Mdulo de Separao. Este mdulo igual ao Mdulo 3. Este segundo mdulo de separao confere ao equipamento uma versatilidade ainda maior, permitindo que separaes seqenciadas, ou extraes e separaes em paralelo sejam realizadas. Mdulo 5 Mdulo de Medio e Coleta. Este mdulo constitudo por vlvulas de bloqueio, uma vlvula reguladora de fluxo na qual a presso da corrente de sada do mdulo de extrao (ou separao, a depender do processo) reduzida para a presso atmosfrica, dois filtros de linha que tem por finalidade proteger o medidor totalizador de vazo, um manmetro pra monitorar a perda de carga nos filtros, um medidor totalizador de vazo tipo mssico (Dwyer, EUA). Ele contm ainda um controlador de temperatura PID para a camisa da vlvula reguladora de fluxo, uma camisa de aquecimento para a vlvula reguladora de fluxo e frascos separadores (kitassatos, tubos em U, etc.). A funo deste mdulo reduzir a presso da corrente de sada de um dos mdulos acima descritos e localizados a montante. Aps a reduo da presso pela vlvula reguladora de fluxo, o gs expandido passa pelos frascos separadores e segue para o medidor totalizador de vazo. Neste instrumento medida a vazo do solvente aps a expanso e quantificada a massa de solvente que passou pelo sistema (Azevedo, 2005).

III.3. Determinao de pilocarpina e epiisopiloturina por HPLC As quantificaes de pilocarpina e epiisopiloturina nos extratos foram realizadas usando o mtodo isocrtico proposto por Avancini et al. (2003). A coluna utilizada foi uma Supelcosil LC18 (SUPELCO) e o eluente foi preparado com a seguinte composio: 13,5 mL de H3PO4 em 1000 mL de gua MiliQ, seguido da adio de 3,0 mL de trietilamina (pH 3,0) e 111,2 mL de metanol (Fan et al. 1996). A vazo de solvente foi de 1 mL/min. A separao foi monitorada com detector de UV a 212 nm. A identificao dos picos foi realizada atravs da comparao dos tempos de reteno dos padres de pilocarpina e epiisopiloturina. O Apndice A apresenta os cromatogramas obtidos com os dois padres separados e juntos, dissolvidos em gua e em etanol. As Figuras A.1 e A.2 mostram cromatogramas 28

Captulo III. Materiais e mtodos dos dois padres dissolvidos em gua. Os picos esto bem definidos e tem um tempo de reteno de 4,5 e 5,6 minutos, respectivamente para a pilocarpina e epiisopiloturina. A mistura dos dois padres, em gua, apresentou os mesmos picos (Figura A.5). Como o material das extraes supercrtica era coletado em etanol, tambm foi feita uma anlise dos padres dissolvidos em etanol e constatou-se uma aproximao dos picos de pilocarpina e epiisopiloturina, assim como uma pior definio dos mesmos, dificultando a quantificao desses princpios ativos (Figuras A.3, 4 e 6 no Apndice A). Para melhor resoluo na cromatografia, os extratos obtidos nos ensaios foram secos em speed vac e depois dissolvidos em gua. A quantificao dos picos foi realizada atravs de comparao com as reas do padro de composio conhecida. A quantidade existente de padro de epiisopiloturina no foi suficiente para realizar todas as anlises. No monitoramento dos ensaios de extrao, os picos cromatogrficos eram identificados e as reas correspondentes eram relacionadas entre si. Desta maneira foi possvel determinar a variao da quantidade de epiisopiloturina recuperada ao longo do processo em funo das condies de extrao.

III.4. Determinao de clorofila por espectrofotmetro A determinao da clorofila foi realizada por leitura direta no espectrofotmetro (HP, modelo 8453, EUA). Da mesma forma, como com a epiisopiloturina, no foi determinada a concentrao absoluta de clorofila devido ausncia do padro. Os picos correspondentes clorofila A foram identificados entre os comprimentos de onda 400 a 700 nm, e lido no comprimento de onda 666, como apresentado na Figura III.2 em um estudo realizado com clorofila extrada de folhas de espinafre em etanol (Soares, 2006). Dessa forma, as absorbncias eram relacionadas entre si, o que possibilitou acompanhar o processo de extrao da clorofila em alguns diferentes ensaios. Alguns espectrogramas obtidos da clorofila so apresentados no Apndice C. Para a leitura no espectrofotmetro, todas as amostras tinham seu volume completado at 200 mL com etanol. 29

Captulo III. Materiais e mtodos

Figura III.2. Sobreposio de espectros da clorofila a (5 x 10-6) em etanol, obtidos a intervalos de 5 min em amostra iluminada. As setas indicam a diminuio das bandas com a exposio continua luz vermelha LED (Soares, 2006),

III.5. Extrao de pilocarpina e epiisopiloturina III.5.1. Mtodo convencional A extrao de pilocarpina e epiisopiloturina foi feita pelo mtodo convencional e o valor encontrado foi assumido como o contedo desses componentes na matria-prima para possibilitar uma comparao com a extrao supercrtica. Foi utilizada a metodologia otimizada por Avancini (2003) mas adaptada para maiores quantidades de material. Para cada 1g de folhas so adicionados 10 mL de NH4OH (10%) e a mistura agitada. Aps 15 minutos, adiciona-se 10 mL de clorofrmio, e agita-se. O sistema deixado decantar e a fase clorofrmica coletada. O procedimento repetido trs vezes. As fraes 30

Captulo III. Materiais e mtodos clorofrmicas so reunidas e extradas duas vezes com 10 mL de cido sulfrico, 2%. Agita-se os tubos com as amostras. As fraes cidas so reunidas e alcalinizadas pH 12 com NH4OH. Uma nova extrao em clorofrmio realizada duas vezes, e as fraes orgnicas obtidas so reunidas e secas em speed-vac. III.5.2. Ensaios de extrao supercrtica A parte central da coluna de extrao do Mdulo 3 (Figura III.1) alimentada com cerca de 10 g de folhas de jaborandi (modas e secas) ou da pasta industrial. O fundo e o topo da coluna recebiam uma camada de esferas de vidro para direcionar o escoamento do solvente e junto a tampa foi colocado uma camada de l de vidro para evitar arraste mecnico. O extrator do Mdulo 2 estava vazio, e foi utilizado como pulmo. III.5.2.1. Ensaios de extrao supercrtica com CO2 puro. O CO2 era alimentado lentamente, mantendo a vlvula de sada fechada, at que a presso no interior do extrator se igualasse presso do cilindro e o sistema de aquecimento do extrator era ento ligado. Aps atingir a temperatura de processo, as bombas so ligadas e espera-se o sistema alcanar a condio de presso de processo. Atingidas as condies pr-definidas de presso e temperatura, abria-se cuidadosamente a vlvula micromtrica (pela qual se d a despressurizao do sistema) localizada na sada do mdulo de medio e coleta, at estabelecer a vazo de processo desejada. O material que escoava atravs da vlvula micromtrica era coletado nos frascos separadores para posterior quantificao e o CO2 seguia para o medidor totalizador de vazo sendo medido em CNTP. O material extrado foi coletado em intervalos de tempo pr-estabelecidos. Havendo necessidade, a vazo das bombas era corrigida para que o sistema operasse a presso constante, monitorada atravs de manmetro. III.5.2.2. Ensaios de extrao supercrtica com CO2 + 10% de etanol. Os procedimentos nos ensaios de extrao que usam CO2 + etanol so os mesmos descritos no Item III.5.2.1 exceto pela necessidade de programar a segunda bomba para adicionar a quantidade de etanol desejada.

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Captulo III. Materiais e mtodos Nos ensaios de extrao com co-solvente, usou-se uma percentagem de 10% em massa em relao a vazo de CO2. III.5.2.3. Ensaios de extrao supercrtica com coluna de adsoro Uma coluna de adsoro com slica-gel foi acoplada ao sistema aps a coluna de extrao, ou seja, o extrator do Mdulo 2 do equipamento foi empacotado com a matriaprima e o extrator do Mdulo 3 (mdulo de separao) recebeu a slica-gel. A coluna de adsoro foi empacotada da seguinte forma: uma camada inferior de esferas de vidro, seguida de 20g de slica, e o volume do extrator foi completado com esferas de vidro. Junto tampa foi colocada uma camada de l de vidro. O procedimento para a extrao conforme descrito no Item III.5.2.1, foi adotado na primeira etapa do processo (extrao e adsoro). Foi utilizado CO2 puro para essa etapa e a extrao e adsoro ocorreram seqencialmente. Depois de uma quantidade pr-fixada de CO2 puro ter passado, o ensaio de extrao e adsoro interrompido e o Mdulo 2 (mdulo de extrao) isolado e limpo. Na etapa de dessoro o solvente usado foi CO2 + 10% etanol. Ele admitido no Mdulo 2 (vazio) e escoa pelo Mdulo 3, que contem a slica-gel com o material adsorvido. A metodologia de controle da operao e coleta das amostras utilizada na etapa de dessoro igual ao descrito no Item III.5.2.2, onde foi utilizado CO2 adicionado de 10% de etanol em massa. A programao do uso da coluna de adsoro contemplava dois objetivos: - Avaliar a possibilidade de separar pilocarpina e epiisopiloturina. Neste caso usou-se a pasta residual. - Separar a clorofila nos extratos com os princpios ativos de interesse. A matriaprima nesse ensaio foram folhas de jaborandi.

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CAPTULO IV. RESULTADOS E DISCUSSO

IV.1. Contedo de princpios ativos O mtodo de extrao convencional com alternncia de pH foi utilizado para definir a composio de pilocarpina e epiisopiloturina nas amostras, conforme indicado no Item III.5.1. IV.1.1. Folhas de jaborandi Foram utilizadas folhas de jaborandi secas a duas temperaturas, 40C e 70C, a fim de avaliar se a temperatura do ar de secagem das folhas afetava a estabilidade da pilocarpina. Essas determinaes foram repetidas aps 13 meses de armazenamento para avaliar uma possvel degradao da pilocarpina com o tempo de estocagem. Os resultados obtidos esto apresentados na Tabela IV.1 e correspondem a mdias de determinaes em duplicatas. Observa-se que as amostras secas a 40C apresentam um contedo de pilocarpina cerca de 10% maior do que as folhas secas a 70C, nos dois perodos de tempo em que foi feita a determinao. Como conseqncia desse resultado, os ensaios de extrao supercrtica foram realizados com folhas secas a 40C. Tabela IV.1. Contedo de pilocarpina nas folhas de jaborandi determinados por extrao com alternncia de pH. Temperatura de secagem 40C 70C Maio/2007 0,45% 0,41% Junho/2008 0,35% 0,32%

A variao na porcentagem de pilocarpina encontrada nas folhas de jaborandi, secas nas duas condies, indica que o tempo de armazenagem de 13 meses causou uma perda em torno de 22% de pilocarpina. 33

Captulo IV. Resultados e discusso As anlises tambm confirmaram a presena do princpio ativo epiisopiloturina, porm em quantidades muito menores ao da pilocarpina. Uma determinao exata do contedo de epiisopiloturina no foi possvel devido a escassez do padro cromatogrfico. O contedo de pilocarpina encontrado nas folhas de jaborandi pelo mtodo de alternncia de pH se enquadra entre os valores encontrados na literatura para esta espcie de pilocarpus microphyllus. IV.1.2. Pasta residual Para a determinao da umidade da pasta foi utilizada uma estufa a vcuo, a 105C por 48 horas. A mdia do teor de umidade de 5 amostras foi de 4,8%. O laudo apresentado pela indstria Vegetex (Merck) indica que a composio deste produto : - Epiisopiloturina 55% - Pilocarpina 4,7% - Isopilocarpina 2,1% - matriz vegetal 38,2% A porcentagem de pilocarpina encontrada na pasta residual foi de 1,41%. Este valor uma mdia de triplicatas de extraes realizadas pelo mtodo convencional. A quantidade de pilocarpina medida muito menor do que o valor informado no laudo da indstria, o que pode ser um indicativo de que a pilocarpina tenha se degradado com o tempo. Anlises realizadas no espectrmetro de massas (Applied Biosystems Q-trap mass spectrometer - Foster City, CA, USA) indicaram a presena de vrias outras substncias, como cido pilocrpico, isopilocarpina, pilosina, epiisopiloturina (Sawaya et al., 2008).

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Captulo IV. Resultados e discusso IV.2. Solubilidade de pilocarpina e de epiisopiloturina em CO2 supercrtico A determinao da solubilidade de equilbrio de um componente em um fluido supercrtico deve ser realizada pelo contato desse fluido com o produto puro por um tempo suficiente para atingir a saturao. Vrias tentativas de determinao da solubilidade de pilocarpina em CO2 supercrtico foram realizadas no equipamento do Laboratrio EXTRAE da Faculdade de Engenharia de Alimentos/UNICAMP. Os resultados obtidos, entretanto, no puderam ser validados devido solidificao da pilocarpina no interior da vlvula de despressurizao do sistema, impedindo assim sua recuperao completa. Os resultados apresentaram quantidades de recuperao de pilocarpina muito distintos e no sero considerados aqui. Um esquema do equipamento usado est apresentado no Apndice B. A determinao da solubilidade pelo mtodo dinmico, usando vazes baixas de CO2 no extrator supercrtico alimentado com pilocarpina pura tambm no pode ser realizada devido a necessidade de um volume considervel desse material, que tem um custo elevado. A determinao do comportamento da solubilidade da epiisopiloturina em fluido supercrtico tambm no foi possvel devido ausncia desse produto no mercado com um grau de pureza adequado. Como conseqncia, o comportamento de solubilidade dos princpios ativos s pode ser avaliado atravs das curvas de extrao dos mesmos. Considerando sua baixa concentrao nas folhas e a grande resistncia transferncia de massa que a estrutura celular das folhas de jaborandi poderia oferecer, preferiu-se trabalhar com a pasta residual. O valor determinado, mesmo quando obtido na primeira fase da extrao, no absoluto, e deve ser considerado como uma solubilidade efetiva em comparaes em situaes idnticas pois esses princpios ativos esto dissolvidos na matriz e os outros componentes afetam sua fugacidade. Por ser um resultado que pode apresentar incertezas, a solubilidade destes princpios ativos esto apresentados no Apndice D e podem servir como base para a determinao da solubilidade destes compostos puros.

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Captulo IV. Resultados e discusso IV.3. Ensaios preliminares de extrao supercrtica Inicialmente foram realizados ensaios preliminares exploratrios, visando, sobretudo uma familiarizao com a operao do equipamento. Os ensaios definitivos de extrao foram realizados com as folhas de jaborandi da espcie Pilocarpus Microphyllus doadas pelo CPQBA. Alm de folhas de jaborandi, foi utilizada a pasta residual industrial doada pela Vegetex (Merck). Alguns ensaios foram realizados com folhas de jaborandi, colhidas em rvores cultivadas no IB/UNICAMP. Na extrao foram utilizadas 20g de folhas secas e modas. Este ensaio foi feito nas mesmas condies utilizadas por Saldaa (2002), ou seja, presso de 255 bar e temperatura de 77C, usando CO2 puro como solvente. Um total de 613g de CO2 (CNTP) foram escoados pelo leito. O extrato foi coletado em etanol e depois da extrao uma parte da tubulao foi limpa com este mesmo solvente. O resultado indicou a extrao de 0,002 g de pilocarpina, mas nenhuma epiisopiloturina. Embora a quantidade de pilocarpina extrada tenha sido baixa, o resultado foi promissor pois confirmou a possibilidade de extrair esses princpios ativos com CO2 supercrtico, fato que no fora conseguido por Saldaa (2002). Esse resultado especialmente importante porque o CO2 uma molcula apolar e a pilocarpina polar e, portanto, com pouca afinidade mtua. Para avaliar esse efeito de polaridade na solubilizao, as folhas processadas com CO2 foram mantidas no extrator e aps o primeiro ensaio foi feito uma extrao complementar utilizando CO2 com 10% de etanol (em massa). Neste segundo ensaio, a presso e a temperatura utilizadas foram as mesmas do primeiro ensaio, e bombeou-se um total de 589g CO2. Como resultado obteve-se 0,003 g de pilocarpina mas ainda nenhuma epiisopiloturina. Um terceiro ensaio foi realizado com 34 g de folhas secas e modas adquiridas no comrcio. As mesmas temperatura e presso dos testes anteriores foram utilizadas em uma extrao utilizando CO2 com 10% de etanol, em um total de 505g CO2. A quantidade de pilocarpina extrada foi de 0,143g e, como nos ensaios anteriores ainda no se conseguiu 36

Captulo IV. Resultados e discusso identificar epiisopiloturina. Estes ensaios preliminares confirmaram a excelente afinidade do etanol pela pilocarpina, alm da possibilidade de extrair a pilocarpina apenas com CO2 puro.

IV.4. Extrao supercrtica com CO2 puro: folhas de jaborandi As extraes supercrticas com folhas de jaborandi foram realizadas com aproximadamente 10g de matria-prima utilizando CO2 puro como solvente. A vazo de 1,0 L/min de CO2 (CNTP) foi pr-definida, obedecendo a restries do prprio equipamento de extrao supercrtica, e tambm para obter uma condio prxima ao equilbrio de saturao (Azevedo, 2005). As temperaturas usadas nos ensaios de extrao supercrtica foram 40, 50 e 60C, tendo em vista que a pilocarpina pode se degradar a elevadas temperaturas. As presses de trabalho escolhidas foram de 300 e 200 bar pois abaixo deste valor a densidade do dixido de carbono pequena, tornando difcil a extrao de molculas polares. A coleta dos extratos foi realizada a cada 50g, 150 g a 350g, de CO2, ao longo do tempo de operao. Curvas da massa acumulada de pilocarpina extrada em funo da massa acumulada de CO2 que escoou a diferentes temperaturas esto traadas nas Figuras IV.1 (presso de 200 bar) e IV.2 (presso de 300 bar). No foi constatada recuperao de epiisopiloturina nas extraes a 200 bar, constatando dessa forma que nestas condies de temperatura e presso a extrao mais seletiva para a pilocarpina. As curvas correspondentes para a epiisopiloturina, so apresentadas em termos de rea dos picos no cromatogramas e esto na Figura IV.8 (300 bar). Uma anlise destes resultados ser feita a seguir.

37

Captulo IV. Resultados e discusso

massa acumulada de pilocarpina (mg) 3
40C 50C 60C

0 0 500 1000 1500 2000 2500

massa acumulada de CO2 (g)

Figura IV.1. Curvas de extrao supercrtica de pilocarpina de folhas de jaborandi a 200 bar.
8 massa acumulada de pilocarpina (mg)

40C 50C 60C

0 0 500 1000 1500 2000 massa acumulada de CO2 (g)

Figura IV.2. Curvas de extrao supercrtica de pilocarpina de folhas de jaborandi a 300 bar.

IV.4.1. Influncia da temperatura na extrao de pilocarpina A influncia da temperatura presso constante de 200 bar na extrao de

pilocarpina pode ser observada diretamente na Figura IV.1. O posicionamento das curvas indica claramente que o aumento de temperatura diminui a quantidade de pilocarpina 38

Captulo IV. Resultados e discusso extrada, uma confirmao de que, a essa presso, a extrao controlada pelo poder de solubilidade do dixido de carbono. Esses extratos apresentaram uma colorao levemente esverdeada, devido contaminao com clorofila. Essa colorao era mais intensa nas primeiras amostras, conforme pode ser observado na fotografia das amostras, apresentada na Figura IV.3. O monitoramento da extrao de clorofila por meio de espectrofotmetro, foi feito em um ensaio complementar e apresentado na Figura IV.23.

Figura IV.3. Fotografia das amostras obtidas em cada ponto da extrao realizada com folhas de jaborandi utilizando CO2 puro.

As curvas de extrao de pilocarpina a 300 bar (Figura IV.2) indicam uma maior capacidade de extrao do que a 200 bar, e um comportamento diferenciado em relao temperatura. A extrao a 40C, que se mostrara a mais eficiente a 200 bar, tem o pior desempenho a 300 bar. O posicionamento das curvas de extrao indica que o aumento de temperatura favoreceu a extrao de pilocarpina, ao contrrio do que aconteceu nas extraes realizadas a presso de 200 bar (Figura IV.1). Esta inverso ocorre devido ao fenmeno conhecido como comportamento retrgrado, que limitado pela presso de cruzamento, na qual a solubilidade a mesma, independentemente da temperatura. Abaixo da presso de cruzamento, a predominncia do efeito da densidade e o aumento de temperatura favorece a extrao de pilocarpina. Aps a presso de cruzamento, o efeito 39

Captulo IV. Resultados e discusso predominante da presso de vapor do soluto, que se eleva e desta forma aumenta a solubilidade da pilocarpina no fluido supercrtico. IV.4.2. Influncia da presso na extrao de pilocarpina As curvas de extrao j apresentadas (Figura IV.1 e 2) foram relocadas conforme a temperatura para melhor demonstrar o efeito da presso de CO2, e dispostas nas Figuras IV.4, 5 e 6, a temperaturas de 40, 50 e 60C, respectivamente. Uma anlise comparativa das curvas de extrao nessas trs figuras indica um comportamento diferenciado entre as extraes a 40C e a 50 ou 60C. Na Figura IV.4 (extraes a 40C) as curvas esto prximas entre si indicando que o aumento de presso no aumenta de forma significativa a quantidade de pilocarpina extrada. Nestas condies de baixo poder de extrao, um aumento de densidade do CO2 no aumenta a solubilidade.

4 massa acumulada de pilocarpina (mg)

200 bar

3 2 1 0 0

300 bar

500

1000

1500

2000

massa acumulada de CO2 (g)

Figura IV.4. Curvas de extrao de pilocarpina de folhas de jaborandi a 40C.

40

Captulo IV. Resultados e discusso

6
200 bar

massa acumulada de pilocarpina (mg)

300 bar

0 0 500 1000 1500 2000 2500

massa acumulada de CO2 (g)

Figura IV.5. Curvas de extrao de pilocarpina de folhas de jaborandi a 50C.

8
200 bar

massa acumulada de pilocarpina (mg)

300 bar

0 0 500 1000 1500 2000 massa acumulada de CO2 (g)

Figura IV.6. Curvas de extrao de pilocarpina de folhas de jaborandi a 60C.

Nas extraes a 50C (Figura IV.5) e 60C (Figura IV.6) houve um considervel aumento de massa de pilocarpina extrada com o incremento da presso. A 50C esse aumento de cerca de 3,3 vezes e a 60C ele sobe para 10 vezes. IV.4.3. Recuperao de pilocarpina A Figura IV.7 apresenta os dados de recuperao de pilocarpina (massa de pilocarpina extrada (mg)/ massa de pilocarpina inicial (mg)) das folhas de jaborandi em funo da densidade do CO2, calculada quando 1500g de CO2 escoaram pelo sistema, isto , 41

Captulo IV. Resultados e discusso no comeo da terceira fase da extrao. Para este clculo foi considerado que as folhas de jaborandi contm 0,40% de pilocarpina, como encontrado pela extrao convencional. Os dados experimentais lanados na Figura IV.7 indicam que no existe uma correlao global entre densidade do CO2 e recuperao da pilocarpina. Os valores obtidos, entretanto, podem ser correlacionados conforme a presso. Isso pode ser devido ao fato da extrao, em alguns casos, no ter alcanado o patamar da terceira etapa, como por exemplo, o ensaio a 40C e 200 bar. Essa situao corresponde ao controle do processo de extrao pela solubilidade da pilocarpina no CO2 supercrtico. Nesses casos, curvas com descontinuidade sinalizam o efeito do comportamento retrgrado, como encontrado em Azevedo (2005) na extrao de cafena com fluido supercrtico.

16 % Recuperao de pilocarpina
200 bar 300 bar

12

0 0,6 0,7 0,8 Densidade (g/cm 3) 0,9 1

Figura IV.7. Recuperao de pilocarpina das folhas de jaborandi em funo da densidade do CO2.

O outro aspecto importante que se pode observar pelos valores na Figura IV.7 so os baixos rendimentos obtidos. Para as curvas de extrao apresentadas na Figura IV.1, a recuperao de pilocarpina foi de 5,6%, 3,2% e 1,4% nas temperaturas de 40, 50 e 60C, respectivamente. Conforme j mencionado, nesse caso a diminuio de temperatura teve um efeito positivo na extrao de pilocarpina, pois de 60C para 50C ocorreu um aumento de cerca de 2,3 vezes e de 50C para 40C um acrscimo de 1,8 vezes. Para as extraes realizadas a 300 bar (Figura IV.2) o aumento de temperatura favoreceu a extrao de 42

Captulo IV. Resultados e discusso pilocarpina. Em relao extrao a 40C, o aumento na recuperao de pilocarpina foi de aproximadamente 2 e de 2,8 em relao s extraes a 50C e 60C, respectivamente na presso de 200 bar. Vrios estudos mostram que substncias na forma de base livre so mais solveis em CO2 do que quando esto na forma de sais (Choi, 1999a). A extrao dos princpios ativos das folhas de jaborandi obteve um baixo rendimento devido ao fato destes estar em forma de sais na plantas como j foi reportado na literatura. A adio de co-solventes basificados pode extrair estes compostos na forma de bases livres, que passam ento a ser solveis em solvente no polar, como mostra o estudo realizado por Choi et al. (1999a). No presente trabalho no se fez uso de solvente basificado, pois estes so solventes txicos. Neste contexto, optou-se por utilizar um solvente com baixa toxidade, o etanol, j que o princpio ativo tem emprego farmacolgico. IV.4.4. Extraes de epiisopiloturina Conforme j mencionado, apenas nas extraes a 300 bar foi detectada a presena de epiisopiloturina. Os resultados encontrados esto traados na Figura IV.8, que apresenta a massa de epiisopiloturina como proporcional rea do pico (unidades arbitrrias) correspondente, nos cromatogramas. Da mesma forma como ocorreu com a extrao da pilocarpina, a 300 bar a ordem das curvas indica que o aumento da temperatura favoreceu a extrao supercrtica e pode-se concluir, portanto, que nestas condies de extrao o efeito da presso de vapor do princpio ativo prevalece sobre o efeito da densidade.
40 epiisopiloturina (rea acumulada do pico) 30 20
40C

10 0 0 500 1000 1500

50C 60C

2000

massa acumulada de CO2 (g)

Figura IV.8. Curvas de extrao da epiisopiloturina de folhas de jaborandi, a uma presso de 300 bar. 43

Captulo IV. Resultados e discusso IV.5. Extrao supercrtica com CO2 puro: pasta residual Curvas da massa acumulada de pilocarpina extrada em funo da massa acumulada de CO2 a diferentes temperaturas esto traadas nas Figuras IV.9 (presso de 200 bar) e IV.10 (presso de 300 bar). As curvas correspondentes para a epiisopiloturina so apresentadas em termos de rea dos picos no cromatogramas e esto nas Figuras IV.15 e 16. Uma anlise destes resultados ser feita a seguir. IV.5.1. Influncia da temperatura na extrao de pilocarpina As Figuras IV.9 e 10 apresentam a variao da massa de pilocarpina extrada da pasta residual a diferentes temperaturas, usando CO2 supercrtico a presso de 200 e de 300 bar, respectivamente. Observa-se que o efeito do aumento da temperatura tende a ser o mesmo nas duas presses, isto , um incremento na temperatura aumenta a massa de pilocarpina extrada. Esses resultados indicam que nas extraes usando a pasta, o efeito da presso de vapor do soluto mais importante que o poder de solvncia (densidade) do CO2. Uma comparao entre o comportamento de extrao da pilocarpina da pasta com as curvas de extrao das folhas (Figuras IV.1 e 2) indica que o efeito da temperatura o mesmo presso de 300 bar, mas inverso presso de 200 bar.
500 massa acumulada de pilocarpina (mg) 400 300 200 100 0 0 500 1000 1500 2000 2500 3000
40C 50C 60C

massa acumulada de CO2 (g)

Figura IV.9. Curvas de extrao da pilocarpina da pasta residual a presso de 200 bar.

44

Captulo IV. Resultados e discusso

500 massa acumulada de pilocarpina (mg) 400 300 200 100 0 0 500 1000 1500 2000 2500 3000
40C 50C 60C

massa acumulada de CO2 (g)

Figura IV.10. Curvas de extrao da pilocarpina da pasta residual a presso de 300 bar.

Esses resultados revelam a influncia da matriz sobre a capacidade de extrao mas uma indicao mais precisa, entretanto, s pode ser obtida em ensaios de solubilidade usando produtos puros. O fato das extraes realizadas com pasta obter um melhor rendimento pode ser atribudo presena residual de solventes utilizados na extrao convencional de pilocarpina de folhas de jaborandi. O conjunto desses resultados so fortes indcios de que a presso de cruzamento da pilocarpina deve se situar prxima a 200 bar. IV.5.2. Influncia da presso na extrao de pilocarpina As curvas de extrao de pilocarpina da pasta residual j apresentadas nas Figuras IV.9 e 10 foram reagrupadas conforme a temperatura de 40, 50 e 60C e traadas nas Figuras IV.11, 12 e 13, respectivamente.
500 massa acumulada de pilocarpina (mg) 400 300 200 100 0 0 500 1000 1500 2000 2500 3000
200 bar 300 bar

massa acumulada de CO2 (g)

Figura IV.11. Curvas de extrao de pilocarpina da pasta residual a 40C. 45

Captulo IV. Resultados e discusso

500 massa acumulada de pilocarpina (mg) 400 300 200 100 0 0 500 1000 1500 2000 2500 3000
200 bar 300 bar

massa acumulada de CO2 (g)

Figura IV.12. Curvas de extrao de pilocarpina da pasta residual a 50C.

500 massa acumulada de pilocarpina (mg) 400 300 200 100 0 0 500 1000 1500 2000 2500 3000
200 bar 300 bar

massa acumulada de CO2 (g)

Figura IV.13. Curvas de extrao de pilocarpina da pasta residual a 60C.

Observa-se que o aumento da presso de 200 para 300 bar aumentou a massa de pilocarpina extrada da pasta, mas em uma proporo bem menor do que a observada com as folhas de jaborandi. Aps a passagem de 1500g de CO2 pelo sistema, o aumento de presso provocou um aumento de 15, 5,8 e 13% para as temperaturas de 40, 50 e 60C, respectivamente, na quantidade de pilocarpina extrada. IV.5.3. Recuperao de pilocarpina A Figura IV.14 mostra a recuperao de pilocarpina (massa de pilocarpina extrada/ massa de pilocarpina inicial) na situao em que 1500g de CO2 escoaram pelo 46

Captulo IV. Resultados e discusso sistema, em funo da densidade do dixido de carbono calculada atravs da equao de Peng-Robinson. O clculo foi feito assumindo uma concentrao inicial de 4,7% de pilocarpina na pasta. Os valores da Figura IV.14 revelam que a recuperao da pilocarpina da pasta foi acima de 60%, e portanto muito mais eficiente do que das folhas. O formato das curvas da Figura IV.9 indica que com 1500g de CO2, ainda no se atingiu o patamar de extrao, e portanto as recuperaes de pilocarpina a 200 bar poderiam ser ainda maiores. Os pontos experimentais da Figura IV.14 no apresentam uma correlao definida em relao densidade do CO2, embora em cada nvel de presso ocorra uma tendncia de diminuio da recuperao com o aumento da densidade. Esse fato, conforme j se concluiu antes, reflete uma situao na qual o aumento de temperatura mais importante do que o aumento da presso.
100 80 60 40 20 0 0,6 0,7 0,8 0,9 1 200 bar 300 bar

% Recuperao de pilocarpina

Densidade do CO2 (g/cm 3)

Figura IV.14. Recuperao de pilocarpina da pasta residual em funo da densidade do CO2.

IV.5.4. Extrao da epiisopiloturina As curvas de extrao da epiisopiloturina em termos da rea do pico correspondente nos cromatogramas das amostras so apresentadas nas Figuras IV.15 e 16. Apesar de no se ter conseguido quantificar de forma absoluta a massa de epiisopiloturina 47

Captulo IV. Resultados e discusso extrada, uma comparao relativa dos resultados deixa claro que nas duas presses de trabalho, o aumento de temperatura favorece a extrao. Essa mesma tendncia foi encontrada na extrao da pilocarpina da pasta (ver Figuras IV.9 e 10).
1000 800 600 400 200 0 0 500 1000 1500 2000 2500 massa acumulada de CO2 (g)
40C 50C 60C

Figura IV.15. Curvas de extrao da epiisopiloturina da pasta residual a presso de 200 bar.
5000 Epiisopiloturina (rea acumulada do pico)
40C

Epiisopiloturina (rea acumulada do pico)

4000 3000 2000 1000 0 0

50C 60C

500

1000

1500

2000

massa acumulada de CO2 (g)

Figura IV.16. Curvas de extrao da epiisopiloturina da pasta residual a presso de 300 bar.

As Figuras IV.17, 18 e 19 apresentam as curvas de extrao da epiisopiloturina (medida pela rea do pico correspondente) da pasta residual a 40, 50 e 60C nas presses de 300 e 200 bar, respectivamente. Para todas as temperaturas, estudadas o aumento de presso teve um efeito positivo bem definido sobre a massa de epiisopiloturina extrada e a temperaturas mais altas esse efeito se intensifica. Essas mesmas tendncias foram 48

Captulo IV. Resultados e discusso encontradas na extrao de pilocarpina da pasta, o que dificulta a otimizao das condies de operao, visando recuperar seletivamente apenas um dos componentes.
1500 E p iiso p ilo tu rin a (rea acu m u lad a d o p ico )
200 bar 300 bar

1000

500

0 0 500 1000 1500 2000 massa acumulada de CO2 (g)

Figura IV.17. Curvas de extrao de epiisopiloturina da pasta residual a 40C.

1500 Epiisopiloturina (rea acumulada do pico)

1000

500
200 bar 300 bar

0 0 500 1000 1500 2000 massa acumulada de CO2 (g)

Figura IV.18. Curvas de extrao de epiisopiloturina da pasta residual a 50C.

49

Captulo IV. Resultados e discusso

4000 Epiisopiloturina (rea acumulada do pico) 200 bar 3000 2000 1000 0 0 500 1000 1500 2000 2500 massa acumulada de CO2 (g) 300 bar

Figura IV.19. Curvas de extrao de epiisopiloturina da pasta residual a 60C.

IV.5.5. Correlao com a densidade do CO2-SC A recuperao da epiisopiloturina no pode ser avaliada, pois o contedo total inicial desse princpio na pasta no foi determinvel. A fim de correlacionar tendncias em funo da densidade do CO2, como foi feito com a pilocarpina na Figura IV.14, optou-se por utilizar a massa extrada (em termos de rea do pico) com 1500g de CO2 em funo da densidade do CO2. A Figura IV.20 apresenta as curvas encontradas, para 200 e 300 bar.
4000 epiisopiloturina (rea acumulada do pico) 200 bar 3000 300 bar

2000

1000

0 0,6 0,7 0,8 Densidade do CO2 (g/cm 3) 0,9 1

Figura IV.20. Massa extrada de epiisopiloturina (em termos de rea do pico) em funo da densidade do CO2.

50

Captulo IV. Resultados e discusso IV.6. Ensaios de extrao supercrtica com CO2 puro + etanol As condies de operao que resultaram em alta recuperao de pilocarpina com CO2 puro foram escolhidas para se avaliar o efeito da adio de etanol como co-solvente, isto , presso de 300 bar e temperaturas de 50 e 60C. IV.6.1. Folhas de jaborandi Os extratos obtidos na extrao de folhas de jaborandi utilizando CO2 adicionado de 10% de etanol (em massa) apresentaram colorao mais esverdeada do que a extrao com CO2 puro, devido extrao de clorofila. Uma avaliao deste efeito ser apresentada no Item IV.6.1.C. A. Pilocarpina A Figura IV.21 compara as curvas de extrao de pilocarpina das folhas de jaborandi a presso de 300 bar e temperaturas de 50 e 60C utilizando CO2 com 10% etanol com os valores obtidos sem o etanol, e j apresentados na Figura IV.2. Observa-se que, para as condies de temperatura usadas, a adio de 10% de etanol no CO2 supercrtico favoreceu de uma forma notvel a extrao de pilocarpina das folhas de jaborandi em relao a extrao apenas com CO2.

massa acumulada de pilocarpina (mg)

20
50C, CO2 + 10% etanol 60C, CO2 + 10% etanol

15

50C, CO2 puro 60C, CO2 puro

10

0 0 500 1000 1500 2000

massa acumulada de CO2 (g)

Figura IV.21. Curvas de extrao de pilocarpina de folhas de jaborandi com CO2 puro e com CO2 + 10% de etanol a presso de 300 bar. 51

Captulo IV. Resultados e discusso A Tabela IV.2 apresenta os rendimentos de extrao, calculados com a massa extrada com 1500g de CO2. Em relao extrao com dixido de carbono supercrtico puro a adio de 10% etanol aumentou em cerca de 2,7 vezes a quantidade de pilocarpina extrada na temperatura de 50C e em 2,3 na temperatura de 60C. Comparando os dados obtidos nas duas temperaturas na extrao com co-solvente, observa-se que o aumento de temperatura favoreceu a recuperao de pilocarpina. Tabela IV.2. Recuperao de pilocarpina na extrao de folhas de jaborandi, a 300 bar. T 50C 60C CO2 10,6% 14,6% CO2 + 10%etanol 28,4% 33,1%

Esses resultados confirmam o maior poder de solubilizao do etanol em relao a componentes polares e o ganho obtido na extrao equivalente aos valores encontrados na literatura. Infelizmente, entretanto, a contaminao com clorofila muito mais intensa e visvel do que nas extraes com CO2 puro. B. Epiisopiloturina A Figura IV.22 apresenta as curvas de extrao da epiisopiloturina das folhas de jaborandi na presso de 300 bar, temperatura de 50 e 60C, com CO2 puro e com CO2 modificado com 10% de etanol. Observa-se que a adio de 10% de etanol no CO2 supercrtico tambm promoveu uma maior extrao, sobretudo temperatura de 60C.

52

Captulo IV. Resultados e discusso

1200 epiisopiloturina (rea acumulada do pico) 900
50C, CO2 + 10% etanol

600 300 0 0 500 1000

60C, CO2 + 10% etanol 50C, CO2 puro 60C, CO2 puro

1500

2000

massa acumulada de CO2 (g)

Figura IV.22. Curvas de extrao de epiisopiloturina de folhas de jaborandi com CO2 puro e com CO2 + 10% de etanol a presso de 300 bar.

A Tabela IV.3 apresenta os valores da rea acumulada de epiisopiloturina aps a passagem de 1500g de CO2. Observa-se pela comparao entre esses valores que o efeito da adio de etanol propiciou um aumento de aproximadamente 5 vezes a 50C, e de 27 vezes a 60C. Na temperatura mais alta estudada (60C), ocorreu a melhor solubilizao da epiisopiloturina nas folhas de jaborandi, assim como a pilocarpina. Tabela IV.3. rea acumulada de epiisopiloturina extrao de folhas de jaborandi, a 300 bar, quando passados 1500g de CO2. T 50C 60C B. Clorofila A Clorofila A extrada em conjunto com os princpios ativos foi quantificada por espectrometria e os resultados, em termo de absorbncia, esto apresentados na Figura IV.23. CO2 30,3 35,5 CO2 + 10%etanol 139,3 951,9

53

Captulo IV. Resultados e discusso

Absorbncia acumulada (clorofila) 4 3 2 1 0 0 500 1000 1500 2000 massa acumulada de CO2 (g)
50C, CO2 + 10% etanol 60C, CO2 + 10% etanol 60C, CO2 puro

Figura IV.23. Curvas de extrao da clorofila (em unidades de absorbncia) de folhas de jaborandi com CO2 puro e CO2 + 10% de etanol a presso de 300 bar.

Observa-se que a mudana de temperatura nas extraes realizadas com cosolvente no alterou de modo significativo a quantidade de clorofila extrada. As amostras da extrao com CO2 puro apresentaram menores quantidades de clorofila do que o processo com CO2 adicionado de 10% etanol, mas os valores de absorbncia lidos, entretanto, so considerveis, e muito mais significativos do que uma avaliao inicial subjetiva indicou. A presena de etanol, portanto, favorece a extrao dos princpios ativos de interesse mas produz um extrato contaminado por clorofila. Conseqentemente, para se obter um produto com alto grau de pureza so necessrias etapas de purificao posterior. As curvas de absorbncia de alguns extratos obtidos na extrao supercrtica de folhas de jaborandi em etanol so apresentadas no Apndice C. IV.6.2. Pasta residual A Figura IV.24 apresenta valores da extrao de pilocarpina da pasta residual obtido em ensaios a 50 e 60C utilizando CO2 com 10% de etanol, presso de 300 bar. Na mesma figura esto traadas as curvas j apresentadas de extrao com CO2 puro. Da mesma forma que nos ensaios com as folhas de jaborandi, a adio de etanol garantiu uma maior extrao dos princpios ativos nas duas temperaturas. 54

Captulo IV. Resultados e discusso

600 massa acumulada de pilocarpina (mg)

400

200

50C, CO2 + 10% etanol 60C, CO2 + 10% etanol 50C, CO2 puro 60C, CO2 puro

0 0 500 1000

1500

2000

massa acumulada de CO2 (g)

Figura IV.24. Curvas de extrao de pilocarpina da pasta residual a presso de 300 bar.

A Tabela IV.4 apresenta a recuperao da extrao de pilocarpina (massa de pilocarpina extrada/ massa de pilocarpina na pasta) da pasta residual depois de escoado 1500g de CO2. O maior rendimento foi obtido na extrao a 60C e 300 bar, com 10% de etanol. Tabela IV.4. Recuperao de pilocarpina na extrao da pasta residual a presso de 300 bar. Temperatura 50C 60C CO2 72,6% 84,5% CO2 + 10%etanol 89,8% 106,9%

As curvas de extrao da epiisopiloturina da pasta residual a 50 e 60C utilizando CO2 com 10% de etanol, a presso de 300 bar esto apresentadas na Figura IV.25 Juntamente com as curvas obtidas com CO2 puro. Como em todos os ensaios anteriores, a adio de co-solvente favoreceu a extrao de epiisopiloturina para todas as condies estudadas. O formato das curvas deixa claro que o etanol favoreceu a solubilidade da epiisopiloturina no fluido supercrtico, pois as curvas se diferenciam desde o comeo da extrao. 55

Captulo IV. Resultados e discusso

100000
50C, CO2 + 10% etanol 60C, CO2 + 10% etanol 50C, CO2 puro 60C, CO2 puro

Epiisopiloturina (rea acumulada do pico)

80000

60000

40000

20000

0 0 500 1000 1500 2000 massa acumulada de CO2 (g)

Figura IV.25. Curvas de extrao de epiisopiloturina da pasta residual a presso de 300 bar.

Os valores da rea acumulada de epiisopiloturina aps a passagem de 1500g de CO2 apresentada na Tabela IV.5. Nas duas temperaturas estudadas o aumento de massa extrada com etanol em relao a extrao sem etanol foi de aproximadamente 30 vezes para a epiisopiloturina e de 1,3 vezes para a pilocarpina. A adio de etanol nas extraes realizadas com a pasta residual mostrou ter um efeito positivo mais intenso com relao a epiisopiloturina do que a pilocarpina.

Tabela IV.5. rea acumulada de epiisopiloturina na extrao da pasta residual, a 300 bar, quando passados 1500g de CO2. T 50C 60C CO2 1352 2932 CO2 + 10%etanol 45375 89803

56

Captulo IV. Resultados e discusso IV.7. Extrao acoplada adsoro em slica-gel O acoplamento de uma etapa de adsoro ao processo de extrao teve como objetivo conseguir um extrato de alta qualidade sem a presena de clorofila e, se possvel, separar a pilocarpina da epiisopiloturina. A escolha pela slica-gel est baseada no fato dela ser um adsorvente hidroflico, ou seja, tem bastante afinidade com solutos polares e ter maior rea superficial do que a alumina (Domingo et al., 2001). IV.7.1. Folhas de jaborandi Folhas de jaborandi foram inicialmente submetidas ao processo contnuo e combinado de extrao (no Mdulo 2) e adsoro (no Mdulo 3) com CO2 puro, a 60C e 300 bar. As amostras para anlise eram recolhidas aps a passagem do fluido pela adsoro. Para a etapa de extrao e adsoro foi utilizado como solvente CO2 puro e para a etapa de dessoro (lavagem) foi utilizado CO2 com 10% etanol em massa, aps a retirada da carga do Mdulo 2. Um total de 1250g de CO2 escoram pelo sistema na etapa de extrao e adsoro. Para a etapa de dessoro, ativou-se a bomba do co-solvente, e outras 1250 g de CO2 contendo 10% de etanol passaram pelo sistema completando a operao. As Figuras IV.26, 27 e 28 apresentam as curvas de extrao obtidas, correspondentes a pilocarpina, epiisopiloturina e clorofila, respectivamente. Para facilitar comparaes, nas mesmas figuras esto traadas as curvas de extrao obtidas sem a coluna de adsoro, utilizando CO2 puro.

57

Captulo IV. Resultados e discusso

massa acumulada de pilocarpina (g) 8,0

6,0
Extrao, CO2 puro Extrao/Adsoro, CO2 puro Dessoro, CO2 + 10% etanol

4,0

2,0

0,0 0 500 1000 1500 2000 2500 3000

massa acumulada de CO2 (g)

Figura IV.26. Curvas de extrao/adsoro e curva de dessoro de pilocarpina de folhas de jaborandi a 60C e 300 bar.

60
Extrao, CO2 puro

Epiisopiloturina (rea do pico acumulada)

50 40 30 20 10 0 0

Extrao/Adsoro, CO2 puro Dessoro, CO2 + 10% etanol

500

1000

1500

2000

2500

3000

massa acumulada de CO2 (g)

Figura IV.27. Curvas de extrao/adsoro e curva de dessoro de epiisopiloturina de folhas de jaborandi a 60C e 300 bar.

58

Captulo IV. Resultados e discusso

Absorbncia acumulada (clorofila)
3,00
Extrao, CO2 puro Extrao/Adsoro, CO2 puro Dessoro, CO2 + 10% etanol

2,00

1,00

0,00 0 500 1000 1500 2000 2500 3000

massa acumulada de CO2 (g)

Figura IV.28. Curvas de extrao/adsoro e curva de dessoro de clorofila de folhas de jaborandi a 60C e 300 bar.

Uma anlise desses resultados experimentais deve ser feita comparando as curvas obtidas com e sem adsoro, assim como as curvas obtidas com os trs componentes entre si. O comportamento da clorofila (Figura IV.28) o classifica como um soluto com intensa interao com o adsorvente. Durante todo o perodo em que o sistema recebeu CO2 puro, toda a clorofila extrada ficou adsorvida na slica. Isto pode ser constatado pela limpidez das amostras coletadas e apresentadas na Figura IV.29 e confirmado pela absorbncia zerada, na leitura com o espectrofotmetro. A Figura IV.28 destaca a forte interao soluto/adsorvente pela comparao com a curva sem o uso da slica, traada com os dados da Figura IV.23. Na etapa de extrao e adsoro em que apenas CO2 puro foi usado como solvente, o comportamento da pilocarpina (Figura IV.26) foi semelhante ao da epiisopiloturina (Figura IV.27) e bem diferenciado do da clorofila. As curvas obtidas indicam que a slica-gel adsorve apenas parte da massa de pilocarpina e de epiisopiloturina extrada das folhas. Uma comparao entre as curvas obtidas com adsoro e sem o adsorvente sugere que a reteno de pilocarpina no adsorvente superior da epiisopiloturina, indicando uma interao mais forte entre a slica e a pilocarpina. Esses mecanismos de adsoro, entretanto, podem estar sendo influenciados pela adsoro 59

Captulo IV. Resultados e discusso preferencial da clorofila, e ensaios de equilbrio de adsoro dos componentes puros so necessrios.

Figura IV.29. Fotografia das amostras obtidas na etapa de extrao/adsoro realizadas com folhas de jaborandi utilizando CO2 puro.

A forte interao da clorofila com a slica se mantem mesmo na etapa de dessoro, no qual se utiliza CO2 + 10% etanol. Isso pode ser constatado pela limpidez das duas primeiras amostras recolhidas (ver Figura IV.30) e pelo valor da absorbncia, conforme Figura IV.28. A curva indica que apenas aps a passagem de 250g de CO2 possvel detectar clorofila no extrato. As curvas de dessoro da pilocarpina e da epiisopiloturina tambm apresentam um perodo inicial sem a presena destes componentes. Esse perodo, entretanto, menor do que o da clorofila e pode ser atribudo a um volume morto dentro do sistema. Cessado o processo de extrao de dessoro, observou-se, durante a retirada da slica-gel de dentro do extrator, que ela no apresentava nenhum vestgio de colorao esverdeada, decorrente da adsoro de clorofila. Pode-se assumir, portanto, que a clorofila foi completamente removida da slica. Uma avaliao dos valores de absorbncia acumulada da Figura IV.28, entretanto, lana dvidas sobre o monitoramento de toda a operao. Observa-se que a massa total de 60

Captulo IV. Resultados e discusso clorofila extrada (em termos de somatrio de absorbncia) no processo com adsoro inferior ao da extrao simples, com CO2 puro. Essa constatao est baseada em apenas um ensaio, com cargas diferentes de folhas de jaborandi. Um planejamento experimental com vrias repeties do ponto central daria maior confiabilidade estatstica a essas concluses. O mesmo dever ser feito em relao a pilocarpina e epiisopiloturina.

Figura IV.30. Fotografia das amostras obtidas na etapa de dessoro com CO2 + 10% etanol.

IV.7.2. Pasta residual A fim de avaliar uma possvel separao de pilocarpina da epiisopiloturina sem a interferncia da clorofila, programou-se um ensaio com a pasta residual. Uma nova carga de slica-gel foi utilizada, pr-tratada em estufa a 105C por 24 horas antes do experimento. A operao extrao/adsoro foi mantida at que um total de 1250g de CO2 puro escoram pelo sistema. Nesse instante ativou-se a bomba do co-solvente, e outras 800g de CO2 contendo 10% de etanol completaram a operao. Os resultados deste estudo esto apresentados nas Figuras IV.31 e 32 respectivamente para a pilocarpina e epiisopiloturina. Para facilitar uma comparao, nas figuras tambm esto locados os pontos experimentais obtidos nas extraes correspondentes sem o estgio de adsoro, usando CO2 puro. 61

Captulo IV. Resultados e discusso

600
Extrao, CO2 puro

500 massa acumulada de Pilocarpina (mg) 400 300 200 100 0 0

Extrao/Adsoro, CO2 puro Dessoro, CO2 + 10% etanol

500

1000

1500

2000

2500

massa acumulada de CO2 (g)

Figura IV.31. Curvas de adsoro/dessoro de pilocarpina da pasta residual a 60C e 300 bar.

4000
Extrao, CO2 puro

epiisopiloturina (rea acumulada do pico)

Extrao/Adsoro, CO2 puro

3000

Dessoro, CO2 + 10% etanol

2000

1000

0 0 500 1000 1500 2000 2500 massa acumulada de CO2 (g)

Figura IV.32. Curvas de adsoro/dessoro de epiisopiloturina da pasta residual a 60C e 300 bar.

As curvas da massa coletada, tanto da pilocarpina como da epiisopiloturina, no primeiro estgio do processo, indicam que ambas tm muita afinidade com a slica pois 62

Captulo IV. Resultados e discusso ficaram completamente adsorvidas na mesma, quando CO2 puro o solvente. Esse comportamento contrasta com o que foi encontrado no ensaio com as folhas de jaborandi. Uma comparao entre os resultados do processo que usa adsoro aplicada s folhas e aplicada pasta residual indica que existe uma competio pelos stios de adsoro entre a clorofila e os alcalides. A forte interao entre clorofila e slica tende a prevalecer e destacar a adsoro da pilocarpina e epiisopiloturina. Essa situao abre perspectivas para uma otimizao do processo e maximizar a extrao desses dois componentes em um extrato livre de clorofila. As curvas de dessoro tm um formato inicial ligeiramente diferente da dessoro constatada no processo com clorofila. Observa-se que o perodo sem a presena destes componentes maior, o que pode ser consequncia de vrios fatores, como por exemplo, uma baixa capacidade de dessoro do CO2 + 10% etanol, ou uma quantidade excessiva de adsorvente. Uma comparao entre as figuras indica que a slica-gel utilizada no se revelou um bom agente de separao entre a pilocarpina e a epiisopiloturina, pois elas apresentaram um comportamento semelhante de adsoro/dessoro. Ser necessrio um estudo exaustivo, procurando outros adsorventes e outras condies de operao (adsoro e dessoro) para poder separar esses dois princpios ativos. Os resultados preliminares aqui obtidos, entretanto, lanam dvidas sobre essa possibilidade, pois fez-se uso de condies tpicas de extrao/adsoro e a slica-gel o adsorvente dotado de uma polaridade padro adequada para esse objetivo.

63

CAPTULO V. CONCLUSES E RECOMENDAES

V.1. Concluses Essa pesquisa demonstrou ser possvel extrair pilocarpina e epiisopiloturina de matrizes vegetais ou de resduos industriais. As principais concluses e tendncias encontradas so listadas abaixo, e podero servir para auxiliar na otimizao do processo. Elas so vlidas dentro dos limites de condies operacionais avaliadas, isto , presso de 200 e 300 bar e temperaturas de 40 a 60C. A. Com relao a extraes usando CO2 puro: 1. Aumentos de presso e de temperatura favorecem a extrao de pilocarpina e

epiisopiloturina. 2. A matriz que contem o princpio ativo tem grande influncia no processo de extrao:

as folhas de jaborandi ofereceram maior resistncia do que a pasta residual, e a 200 bar, aumentos de temperatura diminuem a extratibilidade da pilocarpina. 3. A recuperao de pilocarpina obtida na extrao com folhas de jaborandi a 60C e

300 bar, foi de apenas 15%, mas para a pasta alcanou 84,5%. 4. O extrato contaminado por clorofila.

B. Com relao a extraes usando CO2 + 10% etanol: 1. 2. Aumentos de temperatura favorecem a extrao a 300 bar. A adio de 10% de etanol em massa ao CO2 supercrtico favorece a extrao da

pilocarpina, epiisopiloturina e da clorofila das folhas de jaborandi e da pasta residual. 3. A recuperao de pilocarpina das folhas de jaborandi foi de 33%, e foi superior a

90%, da pasta. 4. A contaminao com clorofila foi cerca de 40% superior em relao a extrao sem o

co-solvente.

64

Captulo V. Concluses e recomendaes C. Com relao ao acoplamento de uma coluna de adsoro: 1. A slica-gel tem grande capacidade de adsoro de pilocarpina, epiisopiloturina e

clorofila em ambiente supercrtico com CO2 puro. 2. A afinidade da clorofila pela slica-gel muito alta, deslocando o equilbrio de

adsoro da pilocarpina e epiisopiloturina em ambiente supercrtico com CO2 puro. 3. A adio de 10% de etanol ao CO2-SC desloca o equilbrio de adsoro da clorofila,

assim como da pilocarpina e epiisopiloturina, dessorvendo esses solutos da slica-gel.

V.2. Recomendaes para trabalhos futuros 1. Dar continuidade aos ensaios de extrao com folhas de jaborandi com presses e

temperaturas mais altas e utilizando outros co-solventes de baixa toxidade, lembrando que o emprego destes princpios ativos farmacolgico. 2. Investigar o fracionamento dos componentes de interesse pelo controle da

descompresso. 3. Avaliar a influncia de pr-tratamento das folhas (grau de moagem, condio de

secagem, contedo de umidade, macerao parcial em etanol, etc). 4. Avaliar o efeito de altas temperaturas na desnaturao de pilocarpina em ambiente

supercrtico. 5. Determinar isotermas de equilbrio de adsoro em ambiente supercrtico para a

pilocarpina e epiisopiloturina e seus contaminantes principais. 6. Avaliar outras combinaes de extrao/adsoro/dessoro (tipo de adsorventes,

solventes e condies de lavagem) visando sobretudo separar a clorofila. 7. Estudar o acoplamento de outras etapas de purificao, para uma possvel separao

de pilocarpina e epiisopiloturina. 8. 9. Fazer a modelagem do processo. Determinar a solubilidade de pilocarpina e epiisopiloturina em fluido supercrtico, e

encontrar a presso de cruzamento. 65

Captulo V. Concluses e recomendaes 10. Avaliar a viabilidade econmica da extrao dos princpios ativos de folhas de

jaborandi por fluido supercrtico.

66

CAPTULO VI. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

ABREU, I. N., MASSAFERA, P., EBERLIN, M. N., ZULLO, M. A. T., SAWAYA, A. C. H. F., Characterization of the variation in the imidazole alkaloid profile of Pilocarpus microphyllus in different seasons and parts of the plant by electrospray ionization mass spectrometry fingerprinting and identification of novel alkaloids by tandem mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom, 21: 1205 - 1213, 2007. ABIQUIF, Associao Brasileira da Indstria Farmacoqumica. Disponvel em: http://www.abiquif.org.br/PDFs/mercado.pdf. Acessado em 04/08/2008. AFRANE, G., CHIMOWITZ, E. H., Adsorption in near critical binary solvents mixtures: Thermodynamic analysis and data. Fluid Phase Equilibria, 3: 213 - 238, 1995. AGRA, M. de F., ROCHA, E.A., FORMIGA, S.C., LOCATELLI, E. Plantas Medicinais dos Cariris Velhos, Paraba. Parte I Subclasse Asteridea. Revista Brasileira de Farmcia, 75: 61 64, 1994. ANGUS, S. B. A., DEREUCK, K. M., International Thermodynamic Tables of the Fluid State: Carbon dioxide. Pergamon Press. Oxford, Inglaterra, 1976. AVANCINI, G., ABREU, I. N., SALDAA, M. D. A., MOHAMED, R. S., MAZZAFERA, P., Induction of pilocarpine formation in jaborandi leaves by salicylic acid and methyljasmonate. Phytochemistry, 63: 171 - 175, 2003. AZEVEDO, A. B. A., Extrao e recuperao dos princpios ativos do caf utilizando solventes supercrticos. Campinas: Faculdade de Engenharia Qumica, Universidade Estadual de Campinas, 2005. Tese (Doutorado). BAHRAMIFAR, N., YAMINI, Y., SHAMSIPUR, M., Investigation on the supercritical carbon dioxide extraction of some polar drugs from spiked matrices and tablets. Journal of Supercritical Fluids, 35, 205 - 211, 2005.

67

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13

C nuclear magnetic resonace

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75

APNDICE A. CROMATOGRAMAS

Pk # 1
1: 210 nm, 8 nm pilocarp_agua.dat

Retention Time 4.5

1

Area 8411876

Pk #
800

600

mAU

400

200

6
Minutes

10

12

14

Figura A.1. Cromatograma do padro de pilocarpina diluda em gua.

76

Apndice A Pk # 1 2 Retention Time 5.5 7.1 Area 12596653 113699

1: 210 nm, 8 nm pilotur_agua.dat

Pk #
1000

750

mAU

500

250

6
Minutes

2
8

10

12

14

Figura A.2. Cromatograma do padro de epiisopiloturina diluda em gua.

77

Apndice A Pk # 1 2
1: 210 nm, 8 nm pilocarp_alcool.dat

Retention Time 3.5 3.6

Area 6281609 5055338

800

Pk #

600

mAU

400

200

2
4

6
Minutes

10

12

14

Figura A.3. Cromatograma do padro de pilocarpina diluda em etanol.

78

Apndice A Pk # 1 2 3 4
1: 210 nm, 8 nm pilotur_alcool.dat

Retention Time 2.9 3.8 4.8 5.6

Area 416564 5590646 629868 1133002

Pk #
600

400
mAU

200

4
6
Minutes

10

12

14

Figura A.4. Cromatograma do padro de epiisopiloturina diluda em etanol.

79

Apndice A Pk # 1 2 3 4 Retention Time 4.5 5.5 7.1 12.5 Area 4786002 7980712 1001950 1753428

Pk #

600

mAU

400

200

800

1: 210 nm, 8 nm mixagua.dat

6
Minutes

10

12

14

Figura A.5. Cromatograma da mistura dos padres de pilocarpina e de epiisopiloturina diluda em gua.

80

Apndice A Pk # 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
80 0
1: 210 n m , 8 n m m ixalco o l.d at

Retention Time 3.5 3.7 4.0 4.6 5.0 5.6 7.9 9.0 12.1 13.7

Area 4696117 839299 847374 38421 284069 538454 48105 140340 165571 303485

Pk #

60 0

mAU

40 0

2
20 0

1 3 4 5

6
M inutes

10

12

10
14

Figura A.6. Cromatograma da mistura dos padres de pilocarpina e de epiisopiloturina diluda em etanol.

81

APNDICE B. EQUIPAMENTO DE EXTRAO SUPERCRTICA

equipamento

de

extrao

supercrtica

do

Laboratrio

EXTRAE/FEA/UNICAMP apresentado na Figura B.1. No extrator deste equipamento de extrao supercrtica foi colocado 2 g de padro de pilocarpina misturado com esferas de vidro. Este ensaio no permitiu encontrar a solubilidade da pilocarpina, pois a vlvula de bloqueio pela qual ocorria a despressurizao que levaria o material ao coletor, era mantida submersa em gua aquecida e as condies de temperatura utilizadas no foram capazes de impedir a solidificao da pilocarpina na vlvula, bloqueando a passagem do fluido. Maiores informaes sobre o equipamento e o procedimento de extrao podem ser encontradas em Papa (2007).

Figura B.1. Equipamento de extrao supercrtica da EXTRAE/FEA (mtodo esttico).

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APNDICE C. CURVAS DE ABSORBNCIA DA CLOROFILA A

A Figura C.1, apresenta as curvas de absorbncia na regio visvel do espectro obtidas com extratos de diferentes curvas de extrao para determinao de clorofila. A absorbncia foi monitorada no comprimento de onda de 666 nm.

Extrao a 60C e 300 bar, CO2 + 10% etanol Extrao a 50C e 300 bar, CO2 + 10% etanol Extrao a 60C e 300 bar, CO2 puro Extrao a 50C e 300 bar, CO2 puro

Figura C.1. Espectrofotmetro da absorbncia da clorofila das extraes supercrticas da folha de jaborandi a 300 bar.

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APNDICE D. SOLUBILIDADE EFETIVA

A solubilidade da pilocarpina e da epiisopiloturina foi calculada atravs da inclinao na parte inicial das curvas de extrao dos princpios ativos da pasta residual. importante salientar que esta solubilidade deve ser considerada efetiva pelo fato de no ter sido determinada usando os princpios ativos puro, e, no caso da pasta, incluir o efeito de outros componentes na presso de vapor. a. Pilocarpina A Figura D.1 apresenta a solubilidade efetiva da pilocarpina (mg de pilocarpina/ g CO2). As curvas so bem definidas para cada presso e mostram que a uma presso constante o aumento de densidade (que conseqncia da diminuio da temperatura) desfavorece a extrao de pilocarpina. A variao da solubilidade com a densidade mais intensa a 300 bar do que a 200 bar.
1,00 Solubilidade (mg pilocarpina/g CO 2)
200 bar

0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 0,6

300 bar

0,7

0,8 Densidade do CO2 (g/cm 3)

0,9

Figura D.1. Solubilidade efetiva da pilocarpina em funo da densidade do CO2.

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Apndice D b. Epiisopiloturina A variao da solubilidade efetiva da epiisopiloturina em termos de rea do pico/ g CO2 em funo da densidade do CO2 apresentada pela Figura D.2. Da mesma forma que com a pilocarpina, os valores de solubilidade da epiisopiloturina na presso de 200 bar foram inferiores aos encontrados para a presso de 300. O formato das duas curvas semelhante s da pilocarpina (Figura D.1). Em cada nvel de presso, os dois princpios ativos tm o mesmo comportamento em relao densidade do CO2, dificultando dessa forma sua separao.
3
200 bar 300 bar

Solubilidade (rea do pico da epiisopiloturina/ g CO2)

0 0,6 0,7 0,8 0,9 1

Densidade do CO2 (g/cm 3)

Figura D.2. Variao relativa da solubilidade efetiva da epiisopiloturina em funo da densidade do CO2.

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