UNIVERSIDADE FEDERAL UBERLNDIA CAMPUS DE PATOS DE MINAS BIOTECNOLOGIA QUMICA ANALTICA

Prof. Dra. DJENAINE DE SOUZA

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2 SEPARAES CROMATOGRFICAS
A cromatografia surgiu em 1906 quando um botnico russo (Mikhael Semenovih Tswet) separou pigmentos de plantas em uma coluna de vidro contendo CaCO3.
ter de petrleo

mistura de pigmentos pigmentos separados

CaCO3

Cromatografia = kroma [cor] + graph [escrever]

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A cromatografia baseada na diferena de mobilidade de solutos passando por uma fase slida.

A + B

FASE MVEL

A separao e isolamento das espcies feita passando-se uma quantidade suficiente de solvente atravs da coluna para provocar o aparecimento de bandas ou zonas de separao individuais que devem sair pela extremidade oposta da coluna, onde podem ser detectadas.

Sinal Tempo de reteno

3 CLASSIFICAO DOS MTODOS CROMATOGRFICOS

1 Pela forma fsica do sistema cromatogrfico: PLANAR e COLUNA

CROMATOGRAFIA EM PAPEL CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA

CROMATOGRAFIA LQUIDA CROMATOGRAFIA GASOSA CROMATOGRAFIA FLUDO SUPERCRTICO

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2 De acordo com a fase mvel empregada: LQUIDA, GASOSA e FLUDO SUPERCRTICO

3 De acordo com a fase estacionria: SLIDAS, LQUIDAS E QUIMICAMENTE LIGADAS

4 De acordo com o modo de separao: ADSORO, PARTIO, TROCA INICA, EXCLUSO ou MISTURAS DE MECANISMOS.

4 MECANISMOS DE SEPARAO
Para que uma separao ocorra necessrio que os componentes da amostra apresentem mobilidades diferentes e interaes diferentes com a fase mvel e estacionria. Existem diferentes mecanismos para que a separao ocorra, proporcionando diferentes tcnicas cromatogrficas diferentes.

1 Cromatografia de adsoro: o soluto adsorvido na superfcie de uma fase estacionria.

2 Cromatografia de partio: o soluto dissolvido em um lquido recobre a superfcie de um suporte slido.

3 Cromatografia de troca inica: nions so mantidos ligados a ctions que esto covalentemente ligados fase estacionria. Resinas de troca inica podem ser empregadas na fase estacionria para a atrao e troca de nions de interesse.

4 Cromatografia de excluso molecular: pequenas molculas penetram os poros da fase estacionria e molculas grandes so excludas.

5 Cromatografia de afinidade: um tipo de molcula em uma mistura complexa ligada covalentemente fase estacionria e todas as outras molculas so excludas.
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5 TEORIA BSICA
Velocidades de migrao Constante de distribuio Tempo ou volume de reteno Fator de reteno Fator de separao Eficincia de separao Fatores que afetam a eficincia

a) Tempo ou volume de reteno

tR tR = tR - tM

SINAL

tM
TEMPO
tR = TEMPO DE RETENO (tempo, aps a injeo da amostra, que o analito demora para atingir o detector cromatogrfico). tM = TEMPO MORTO (tempo que a espcie no retida leva para atingir o detector). tR = TEMPO DE RETENO AJUSTADO (tempo mdio que o analito fica retido na fase estacionria).
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b) Velocidades de migrao
Perfis de concentrao em diferentes tempos de migrao. B mais retido pela coluna que A B migra mais rapidamente. O movimento atravs da coluna aumenta a distncia entre A e B. Alargamento dos picos e diminuio na eficincia de separao Diferenas nas velocidades de migrao melhoram a eficincia da separao. Velocidade de migrao do analito e o alargamento dos picos so os principais fatores em separaes cromatogrficas.
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Concentrao X distncia migrada

c) Constante de distribuio (Kc)

A velocidade de eluio depende das constantes de distribuio do analito entre as fases mvel e estacionria. Numa coluna cromatogrfica ocorre uma srie de estgios independentes, nos quais acontece o equilbrio entre o analito dissolvido na fase estacionria e na fase mvel

Afinidade pela fase estacionria

[A]estacionria [A]mvel
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Afinidade pela fase mvel

MENOR RETENO !!!

d) Fator de reteno (k)

Descreve as velocidades de migrao do soluto nas colunas

constante de equilbrio em termos da MASSA do analito em cada fase. FATOR DE RETENO, k: razo entre as massas de analito contidas na fase estacionria (Ws) e na fase mvel (WM) RAZO DE FASES, : razo entre volumes de estacionria (Vs) e na fase mvel (VM)

WS W M

VM VS

O fator de reteno k depende da constante termodinmica de distribuio KC e da razo de fases da coluna.

k =

tr tm tm

Fator de reteno avaliado em funo do tempo de reteno.

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e) Fator de separao

Razo entre o tempo de reteno de 2 componentes (A e B)

SINAL

tB tm t A tm

t0

A
Tempo de reteno

Define a seletividade da separao

A reteno proporcional razo dos coeficientes de partio.

K K

B A

Quanto maior a relao dos coeficientes de partio entre as fases mvel e estacionria maior ser a separao.
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f) Eficincia de separao
Considerando-se que a coluna cromatogrfica composta por uma srie de estgios separados onde ocorre o equilbrio entre o analito e as fases mvel e estacionria.

Cada estgio de equilbrio chamado de PRATO TERICO

O nmero de pratos tericos de uma coluna (N) pode ser calculado por:

tR wb

Coluna mais eficiente

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A eficincia da coluna cromatogrfica aumenta medida que o nmero de pratos tericos aumenta e a altura do prato terico diminu. ALTURA EQUIVALENTE A UM PRATO TERICO (H) = Tamanho de cada estgio de equilbrio

H =

L N

Perfil de concentrao

Nmero de molculas

Distncia migrada
= varincia do pico. Pico tem perfil gausiano, pode-se considerar o formato do pico pela varincia do pico.

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1 Cada prato terico tem um equilbrio do soluto entre a fase mvel e a estacionria;

2 Movimento do soluto coluna abaixo transferncia de equilbrio de um prato para outro;

3 prato terico explica a forma gausiana do pico cromatogrfico e suas velocidade de movimentao na coluna.

Diferenas no nmero de pratos tericos varia de centenas a milhares de coluna para coluna.

Empacotadas, L = 2 m Capilares, L = 30 m

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g) Fatores que afetam a eficincia

1 Velocidade do fluxo da fase mvel; 2 Coeficientes de difuso do soluto na fase mvel; 3 Coeficiente de difuso do soluto na fase estacionria; 4 Fator de reteno (k); 5 Dimetro da partcula na fase estacionria; 6 - Espessura da camada de lquido que recobre a fase estacionria.

(A, B, C = constantes)

A altura equivalente a um prato torico (H) funo da velocidade linear mdia da fase mvel (u).
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A = TERMO RELACIONADO AOS MLTIPLOS CAMINHOS. As molculas do soluto podem percorrer diferentes caminhos na fase estacionria, promovendo alargamento do pico cromatogrfico. Depende do dimetro das partculas da fase estacionria.

B = TERMO LONGITUDINAL. As molculas do soluto difundem na direo perpendicular ao fluxo. Depende do coeficiente de difuso da fase mvel e inversamente proporcional ao fluxo. Vazes altas fazem com que o analito permanea pouco tempo em contado com fase estacionria, minimizando a difuso longitudinal.

C = EFEITO DOS COEFICIENTES DE TRANSFERNCAIA DE MASSA (Cm e Cs). Uma coluna cromatogrfica no opera no equilbrio, pois h um fluxo. Quanto mais rpido o fluxo, menor o tempo para se ter o equilbrio do soluto com a fase mvel e estacionria. Aumentando o fluxo aumenta-se o efeito proporcional de C.
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