Você está na página 1de 10

211

Estudo quantitativo e morfolgico das regies organizadoras de nuclolo coradas pela prata (AgNORs) em neoplasias benignas e malignas da glndula mamria da espcie canina
Alexander Proazzi VAZCURADO Jos Luiz GUERRA Ricardo Augusto DIAS
Correspondncia para: Alexander Proazzi Vaz-Curado, Embravet. Av. Conselheiro Alves, 194 CEP:11015-200 Santos SP aproazzi@usp.br Recebido para publicao: 02/02/2007 Aprovado para publicao: 31/01/2008

1 Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia da Universidade de So Paulo, So Paulo-SP 2 Departamento de Medicina Veterinria Preventiva e Sade Animal da Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia da Universidade de So Paulo, So Paulo-SP

Resumo
O alvo deste estudo foi apresentar um novo mtodo de avaliao das regies organizadoras de nuclolos (NORs), objetivando verificar a correlao entre malignidade das clulas tumorais com proliferao celular. Vinte e nove tumores foram analisados quanto aos aspectos morfolgicos e quantitativos de regies organizadoras de nuclolos coradas pela prata (AgNORs) e comparados quatro glndulas mamrias normais utilizadas como controle. Os dados obtidos foram tratados pelos testes no-paramtrico de Kruskal-Wallis e U de Mann-Whitney. Os nmeros mdios de NORs dos grupos neoplsicos malignos incluindo carcinomas tubulares (2,14 0,54), carcinomas papilferos (1,79 0,24) e carcinomas slidos (1,95 0,30) mostraram diferena significativa quando comparados ao grupo controle (1,16 0,08). A anlise morfolgica das AgNORs mostrou que o padro de apresentao da NORs do tipo I prevaleceu nos grupos neoplsicos benignos (75% dos casos de adenoma tubular e 50% dos casos de carcinoma tubular), enquanto o tipo II prevaleceu nos grupos neoplsicos de comportamento maligno (54,5 % dos carcinomas papilferos e 100% dos carcinomas slidos). O grupo controle mostrou na sua totalidade (100% dos casos) predominncia de NORs do tipo IV. O padro do Tipo III no predominou em nenhum dos grupos envolvidos neste estudo. A anlise da morfologia das AgNORs uma ferramenta til na determinao do prognstica de alteraes neoplsicas da glndula mamria canina.

Palavras-chave: AgNORs. Neoplasia mamria. Prognstico. Anlise morfolgica. Ces.

Introduo Os tumores derivados do tecido glandular mamrio na espcie canina so de grande relevncia na clnica veterinria, visto ocuparem a segunda posio em ocorrncia entre as leses tumorais desta espcie, compreendendo mais de 52% de todos os tumores caninos. 1,2 Tradicionalmente, a determinao do grau de malignidade tem sido confiada ao grau de anaplasia das clulas, representado por: pleomorfismo nuclear, perda de polaridade, figuras atpicas de

mitose e, invasividade das clulas tumorais em tecidos adjacentes. 3 Estudos morfolgicos de clulas cancerosas tm revelado variaes na organizao estrutural do ncleo celular. Contudo, at ento, nenhuma dessas caractersticas pode ser considerada representativa como sinal de malignidade. Ateno particular tem sido dada morfologia nucleolar, onde mudanas morfolgicas na organizao de protenas ribonucleares nucleolar esto sendo repetidamente obser vadas em clulas neoplsicas.4,5,6,7

Braz. J. vet. Res. anim. Sci., So Paulo, v. 45, n. 3, p. 206-210, 2008

212

A capacidade de proliferao das clulas tumorais mostra-se um grande objeto de interesse na pesquisa com cnceres, especialmente quando considerada a relao entre atividade proliferativa e curso clnico.8 Regies organizadoras de nuclolos (NORs) so segmentos de cromossomos na metfase onde genes ribossomais esto localizados e que corresponde s constries secundrias.9 Durante a interfase, as NORs esto localizadas nos centros fibrilares e esto intimamente associadas ao componente fibrilar denso do nuclolo. 10,11,12 Estas estruturas contm todos os componentes necessrios para a sntese de rRNA e, portanto, a transcrio dos genes ribossomais.13 As NORs em interfase podem ser visualizadas microscopia de luz, em amostras processadas rotineiramente utilizando mtodos de colorao pela prata, devido a argirofilia que um grupo de protenas associadas ela apresenta.14 As NORs coradas pela prata so chamadas de AgNORs.15 Numerosos autores sugerem que o procedimento de colorao pela prata para obser var as NORs de ncleos adequado para avaliao prognstica do curso das neoplasias.16 Uma grande variedade de mtodos esto sendo introduzidos na avaliao da cintica celular na oncologia moderna, porm, poucos so aplicveis em tecidos fixados em formol e embebidos em parafina.17 Uma srie de trabalhos tem sido publicados relacionando marcadores de proliferao associados antgenos nucleares, como MIB-1 e/ou PCNA, AgNORs. Pich, Margaria e Chiusa 18 , estudando, em humanos, a atividade proliferativa em carcinomas mamrios masculinos mostraram que a contagem de AgNORs uma importante ferramenta prognstica, pois, correlaciona-se fortemente com o tempo de sobrevida, o que foi corroborado pela demonstrao da forte associao da positividade dos marcadores de proliferao imuno-histoqumicos PCNA e MIB-1 com a mdia de vida dos pacientes que sofriam desta afeco. Em animais, Castagnaro et al.19 conseguiram mostrar que a contagem

mdia de AgNORs por clula um ndice de proliferao significativamente correlacionado com o tempo de sobrevida ps-operatrio. O objetivo deste trabalho comparar a quantidade de NORs encontrada no ncleo das clulas componentes do tecido mamrio normal de cadelas ovario-histerectomizadas, com o nmero de NORs presente nas clulas dos tumores benignos e malignos ocorridos nesta glndula, usando o mtodo de colorao argiroflica (AgNOR), assim como, apresentar um novo mtodo de avaliao das NORs relacionando sua morfologia e distribuio, objetivando verificar a correlao entre malignidade de clulas tumorais com proliferao celular. Material e Mtodo O material utilizado neste trabalho consta de quatro casos de tecido mamrio normal de cadelas ovario-histerectomizadas h pelo menos um ano e de 29 casos de tumores benignos e malignos da mesma glndula selecionados e classificados segundo a OMS, incluindo nove ces sem raa definida, seis ces de raa Poodle, quatro Pastores Alemes, dois Dobermann, dois Cocker Spaniel Ingls, dois Terrier Brasileiro e um de cada das seguintes raas: Dachshund, Akita, Boxer, Pinscher. As idades variavam de quatro a 15 anos (mdia: 9,13 anos). Para a classificao das lminas foi utilizado o mtodo de classificao histolgica das neoplasias mamrias caninas propostas por Misdorp et al20. Infiltrado inflamatrio ou macrofgico evidente, mais tumores com dois ou mais padres histolgicos de classificao diferentes foram utilizados como parmetros de excluso do trabalho. Histoqumica das NORs Dos casos selecionados, cortes de 5 mm de espessura em branco colocados em lminas sem silano, foram submetidos colorao argiroflica segundo a tcnica adaptada do mtodo proposto por Ploton et al. 21. Os cortes estendidos em lminas de vidro so submetidos a desparafinizao e

Braz. J. vet. Res. anim. Sci., So Paulo, v. 45, n. 3, p. 206-210, 2008

213

hidratao atravs de passagens sucessivas em xilol e lcool. As lminas sofriam banho de 5 minutos em soluo de lcool e cido actico (3:1) e depois em gua deionizada corrente por 5 minutos. Aps receber soluo de prata 50% misturada soluo de gelatina 1% na proporo de 2:1, as lminas eram incubadas em cmara mida por 30 minutos em estufa 45C. Finalmente, as lminas eram lavadas vigorosamente com gua deionizada aquecida, desidratadas em solues crescentes de lcool, clareadas em xilol e montadas com Permount sem nenhuma contracolorao. Anlise Quantitativa e Morfomtrica As anlises quantitativa e morfomtrica das NORs de cada caso foram realizadas atravs da anlise por imagem utilizando o software ImageLab verso 2.4, programa do Laboratrio de Informtica Dedicado Odontologia (L.I.D.O.) da Faculdade de Odontologia da Universidade de So Paulo (F.O.U.S.P.). Para anlise morfomtrica foram selecionadas imagens de 5 a 10 campos histolgicos aleatoriamente, com o uso de objetiva de 100X em imerso, em microcpio de luz Leitz, modelo LaborluxS (Ernest Leitz Gmbtl, Deutschland), com finalidade de se estudar 200 ncleos. As imagens, adquiridas por cmara de vdeo CCD acoplada ao microscpio, foram digitalizadas atravs de placa grfica ris-16 (extenso.I16) em um microcomputador IBM-PC-PS/1 (International Business Machines Corporation, USA). Atravs de um programa de captura (Microsoft (R) VidCap - Video Capture Tool), o campo a ser analisado era colado para anlise e processamento de imagem atravs de outro software ImagemLab. Depois de inserida e maximizada a imagem, acionava-se o cone contador manual localizado na barra lateral de ferramentas. Com o cursor, cada NOR era localizada e simultaneamente o programa contava a quantidade positiva de pontos marcados na tela. A contagem

dos ncleos foi feita com um contador manual de clulas Veeder-Root. Durante o procedimento de contagem, era feita a anlise qualitativa das NORs, sendo avaliadas quanto s suas caractersticas morfolgicas, confor me descrito posterior mente, e classificadas de acordo com o tipo mais freqente. Aps o trmino das anlises morfomtricas e quantitativas, todos os dados foram tabulados e transformados em arquivo texto, para posterior tratamento estatstico. Tipo de Apresentao das NORs A anlise do tipo de apresentao das NORs foi realizado segundo o mtodo proposto por Sredni et al.22 no estudo de neoplasias do crtex adrenal em adultos e crianas, de acordo com a experincia desenvolvida durante a observao dos tumores e glndulas adjacentes, onde definiuse quatro padres de apresentao das AgNORs baseados no nmero, forma e posio em relao membrana nuclear, sendo cada caso classificado de acordo com o padro predominante. O mtodo de avaliao se deu como descrito anterior mente ocorrendo concomitantemente anlise morfomtrica. Anlise estatstica Utilizaram-se testes de anlise estatsticas no-paramtricas dadas as caractersticas dos dados obtidos, uma vez que os dados no apresentam uma distribuio normal por grupo. O teste utilizado foi o de Anderson-Darling. Para triagem da avaliao estatstica dos grupos, o teste de deteco das diferenas entre os cinco grupos estudados (quatro grupos neoplsicos e o grupo controle) foi o de Kruskall-Wallis. Em seguida, como mtodo para comparao dos grupos dois a dois, utilizamos o teste U de Mann-Whitney. Para proceder a anlise estatstica no programa de computador, os grupos controle, adenoma, carcinoma tubular, carcinoma papilfero e carcinoma slido, receberam, respectivamente, a numerao 1, 2, 3, 4 e 5. Do mesmo modo, os tipos I, II, III e IV de

Braz. J. vet. Res. anim. Sci., So Paulo, v. 45, n. 3, p. 206-210, 2008

214

apresentao das NORs receberam, respectivamente, a numerao 1, 2, 3 e 4. Resultados Classificao histolgica do tecido mamrio normal e neoplsico Glndulas mamrias em repouso de cadelas ovario-histerectomizadas, que foram utilizadas como controle, revelaram, ao exame histolgico, parnquima constitudo de glndulas tbulo-alveolares compostas por uma monocamada de epitlio cbico, cujos ncleos apresentaram-se ovalados, com cromatina densa, basoflicos, e com citoplasma acidoflico, cujos limites eram pouco definidos, envolvidos por uma camada de clulas mioepiteliais. Os adenomas tubulares caracterizavam-se por apresentar proliferao de clulas pequenas, hipercromticas, cuboidais ou colunares que ocupavam, por vezes, o lmen dos alvolos e tbulos. O citoplasma exibia, ocasionalmente, vacuolizaes. O lmen de alguns alvolos e tbulos, freqentemente, eram dilatados e preenchidos por matriz proteincea acidoflica. Os carcinomas tubulares apresentaram proliferaes compostas por clulas hipercromticas, muitas vezes pequenas, pouco diferenciadas, cujo crescimento exibiam um padro tubular ou acinar. Os carcinomas papilferos exibiram padro de crescimento em forma de papilas irregulares com delicadas traves de tecido conjuntivo, as quais eram cobertas por estratificaes irregulares de clulas com moderada a acentuada perda de polaridade. Em muitos casos, as estruturas cresciam dentro de cistos. Os carcinomas slidos caracterizavam-se por proliferao de

cordes slidos de clulas anaplsicas, livres de qualquer estroma, dentro de tbulos ou cinos que, no raro, invadiam o tecido conjuntivo adjacente. Anlise Quantitativa e Morfomtrica das NORs Em todos os tumores estudados as regies organizadoras de nuclolo coradas pela prata foram visualizadas como pontos enegrecidos, por vezes acastanhados, localizados no interior dos ncleos. A tabela 1 mostra a anlise quantitativa das NORs das clulas analisadas. Os dados representam o nmero total de casos analisados e o nmero total de clulas por caso, sendo que, de cada caso 200 clulas (ou prximo de 200 clulas) foram analisadas. O nmero mnimo e mximo de NORs, assim como as mdias do nmero de NORs das clulas analisadas esto presentes na tabela 1. Em relao ao nmero mdio do total de NORs por clulas analisadas, atravs do teste de Kr uskal-Wallis, obser va-se diferena significativa comparando-se o grupo controle (Figura 1) (243,75 21,79) com as clulas dos adenomas tubulares (Figura 2) (377,75 133,42), com as clulas dos carcinomas tubulares (Figura 3) (421,50 116,99), dos carcinomas papilferos (378,00 51,71) e com as clulas dos carcinomas slidos (Figura 4) (454,50 93,48) (Tabela 1). As anlises pareadas feitas atravs do teste de Mann-Whitney mostraram diferena significativa quando comparados os grupos neoplsicos ao grupo controle (p < 0,05). A tabela 2 mostra a freqncia do nmero mdio de NORs por ncleo

Tabela 1 Dados quantitativos das clulas e das regies organizadoras nucleolares dos 29 tumores da glndula mamria canina

Braz. J. vet. Res. anim. Sci., So Paulo, v. 45, n. 3, p. 206-210, 2008

215

Tabela 2 Freqncia do nmero mdio de NORs por ncleo das clulas componentes do grupo controle e dos tumores da glndula mamria canina

Figura 1 Padro de distribuio das AgNORs do Tipo IV Tecido mamrio de co. Glndula Mamria Normal. Poucas (uma a quatro) AgNORs puntiformes (pequenas, redondas e uniformes) localizadas no centro ou na periferia do ncleo. Objetiva 100x

Figura 2 Padro de distribuio das AgNORs do Tipo I. Tecido mamrio de co. Adenoma Tubular. Poucas (uma a quatro) AgNORs de tamanho mdio (correspondente ao nuclolo), redondas e uniformes localizadas no centro ou na periferia do ncleo. Objetiva 100x

Figura 3 Padro de distribuio das AgNORs do Tipo II. Tecido mamrio de co. Carcinoma Tubular. Uma ou duas AgNORs grandes, redondas e uniformes, com tendncia a localizar-se no centro do ncleo, acompanhadas por vrias outras menores. Objetiva 100x

Figura 4 Padro de distribuio das AgNORs do Tipo III. Tecido mamrio de co. Carcinoma Slido. AgNORs pleomrficas, de formas e tamanhos variados, distribudas difusamente no ncleo. Objetiva 100x

das clulas analisadas do grupo controle e dos tumores da glndula mamria. As anlises pareadas feitas atravs do teste de Mann-Whitney mostraram que no houve diferena significativa em relao ao nmero de NOR por clulas do grupo controle (1,16 0,08) comparado com adenoma tubular (1,74 0,69), (p = 0,14). Entre o grupo controle e os carcinomas tubulares (2,14 0,54), os carcinomas

papilferos (1,79 0,24) e os carcinomas slidos (1,95 0,30) houve diferena estatisticamente significativa (p = 0,011, p = 0,004, p = 0,006, respectivamente). No houve, entretanto, diferena significativa entre os grupos neoplsicos quando comparados entre si. O teste de KruskalWallis mostrou diferena significativa entre os cinco grupos envolvidos neste estudo (p = 0,016).

Braz. J. vet. Res. anim. Sci., So Paulo, v. 45, n. 3, p. 206-210, 2008

216

Tipos de NORs nas Neoplasias Mamrias A anlise microscpica com objetiva de imerso revelou que os tumores benignos e malignos apresentaram predominncia dos tipos morfolgicos I e II (Figura 5.a e b, respectivamente) de NORs, segundo a

classificao adotada. A distribuio percentual de apresentao das NORs est expressa na tabela 3. O padro de apresentao de NORs do tipo III (Figura 5.c) no predominou nenhum dos grupos histolgicos envolvidos neste estudo. Em relao freqncia dos tipos

Figura 5 Tipo de apresentao das NORs segundo o mtodo proposto por SREDNI (2003). a) Tipo I: Poucas (uma a quatro) AgNORs de tamanho mdio (correspondente ao nuclolo), redondas e uniformes localizadas no centro ou na periferia do ncleo; b) Tipo II: Uma ou duas AgNORs grandes, redondas e uniformes, com tendncia a localizar-se no centro do ncleo, acompanhadas por vrias outras menores; c) Tipo III: AgNORs pleomrficas, de formas e tamanhos variados, distribudas difusamente no ncleo; d) Tipo IV: Poucas (uma a quatro) AgNORs puntiformes (pequenas, redondas e uniformes) localizadas no centro ou na periferia do ncleo Tabela 3 Freqncia dos tipos morfolgicos de apresentao de NORs nas clulas componentes do grupo controle e dos tumores da glndula mamria canina

Braz. J. vet. Res. anim. Sci., So Paulo, v. 45, n. 3, p. 206-210, 2008

217

morfolgicos de apresentao de NORs nas clulas analisadas, as clulas do grupo controle, quando comparadas ao grupos tumorais, atravs do teste de duas propores, mostraram diferena significativa (p < 0,05). O grupo controle mostrou na sua totalidade (100% dos casos) predominncia de NORs do tipo IV (Figura 5.d) (padro predominante somente neste grupo). Setenta e cinco por cento dos casos de adenoma tubular apresentaram padro morfolgico de apresentao das NORs do tipo I e 25% dos casos do tipo II. Os carcinomas tubulares mostraram freqncia similar para os tipos I e II (50% para cada padro). Dos casos de carcinoma papilfero, 45,45% apresentaram padro de apresentao do tipo I, e 54,54% apresentaram o tipo II. Finalmente, em todos os espcimes analisados de carcinoma slido, o padro predominante foi do tipo II. Pelo teste de Mann-Whitney no houve diferena significativa dos padres de apresentao das NORs quando pareados adenomas tubulares, carcinomas tubulares, e carcinomas papilferos (p > 0,05). Houve diferena significativa entre os grupos adenoma tubular e carcinoma slido (p = 0,007). Discusso A proposta deste trabalho foi estudar se a avaliao da atividade celular poderia representar uma ferramenta prognstica nos tumores de glndula mamria canina, atravs de um marcador de proliferao celular argiroflico (AgNOR), pragmtico, de custo baixo, rpida confeco, passvel de ser aplicado na rotina de laboratrios. Sabe-se que h muitos mtodos com valor prognstico tendo como alvo a proliferao celular que podem ser aplicados em tecidos fixados e includos em parafina e que esto sendo introduzidos patologia cirrgica, permitindo inclusive a realizao de estudos retrospectivos. Ateno particular tem sido dada morfologia nucleolar, onde mudanas morfolgicas na organizao de protenas ribonucleares esto sendo repetidamente

observadas em clulas neoplsicas.4,5,6,7 A expresso aumentada de AgNORs tem sido detectada em clulas cancerosas quando comparadas clulas normais ou benignas em alguns rgos. Isto tem sugerido que AgNORs refletem o potencial maligno.3,23,24,25,26 Ristimki et al. 8 e Parrett et al 27 , demonstraram em estudo com carcinoma de clon e mama, respectivamente, que estes tumores expressam altos nveis de protena cicloxigenase-2, quando comparados ao tecido normal adjacente. Muitos autores vem relacionando processos neoplsicos com agentes inflamatrios, e concluem pesquisas acerca deste assunto. O fato de que substncias liberadas por clulas componentes de processo inflamatrio ativo atuam diretamente sobre o tecido neoplsico adjacente, incentivou-nos a excluso de espcimes contaminados, a fim de se reduzir a ao de agentes externos sobre o comportamento celular. O processo de seleo tambm ocorreu para o grupo controle, do qual fizeram parte somente fmeas ovrio-histerectomizadas h pelo menos um ano, para que no houvesse interferncia de agentes hormonais ativos. Crocker28 encontraram que o nmero total de AgNOR em leses malignas de mama excedem significativamente aqueles encontrados no tecido mamrio normal ou mesmo em leses benignas de mama. Fato corroborado em nosso estudo, j que houve diferenas significativas em relao ao nmero mdio do total de NORs por clulas analisadas comparando-se o grupo controle com carcinoma tubular, carcinoma papilfero e carcinoma slido. Porm, quando comparado adenoma tubular com grupos neoplsicos malignos, no houve diferenas significativas. Os tecidos neoplsicos estudados neste trabalho apresentaram, em relao ao nmero mdio de NORs por ncleo, diferena significativa entre o grupo controle e os grupos neoplsicos de carcinoma tubular, carcinoma papilfero e carcinoma slido. J quando comparados os grupos controle e adenoma tubular, e quando pareadas leses malignas entre si, no

Braz. J. vet. Res. anim. Sci., So Paulo, v. 45, n. 3, p. 206-210, 2008

218

houve diferena significativa. Na literatura atual, outros trabalhos envolvendo o estudo das NORs tentam incrementar a informao prognstica acrescentado a avaliao de diferentes marcadores de proliferao ao estadiamento histolgico. Assim, no s o nmero, mas tambm a rea que as NORs ocupam no ncleo, tem um importante papel como fator prognstico no tempo livre de doena. 15,29 Porm, existe uma notvel dificuldade, entre os trabalhos analisados, de se determinar uma adequada linha de corte no que tange anlise morfomtrica, tornando, ainda, impossvel determinar o real comportamento biolgico do cncer. No sentido de se aprimorar o estudo das AgNORs, Kida, Takano e Okudaira 30 observaram diferena nos padres de apresentao das AgNORs em 10 adenomas e cinco carcinomas adrenocorticais, e concluram que a observao cuidadosa das AgNORs pode facilitar a distino entre tumores adrenocorticais benignos e malignos. Durante a observao cuidadosa e repetida dos tumores adrenocorticais de adultos e crianas para quantificao das NORs, Sredni et al. 22 definiram quatro padres bsicos de apresentao de AgNORs, classificando cada tumor com o padro predominante. A metodologia utilizada foi extrapolada para esse estudo. Em nossa avaliao observamos que o tipo IV limitou-se s glndulas mamrias em repouso, utilizadas aqui como controle. Este achado corrobora com Sredni el al. 22 que observaram predominncia do tipo IV nas glndulas adrenais contralaterais normais (tecido controle) s glndulas adrenais neoplasias. O padro tipo III, o qual foi obser vado somente nos tumores adrenocorticais peditricos, no prevaleceu em nenhum espcime envolvido neste trabalho. Vale lembrar que as clulas das glndulas adrenais e mamria, inicialmente, so provenientes de camadas embriolgicas distintas. A composio e organizao de suas estruturas, assim como, o produto de suas atividades sintticas tambm difere. Portanto, no se pode descartar a hiptese

de que o modo de apresentao das alteraes proveniente de mutaes carcinognicas seja diferente entre estes tecidos no que tange anlise das AgNORs. O padro morfolgico do tipo I e II predominaram nos grupos neoplsicos deste estudo. O padro de apresentao de NOR do tipo I predominou em adenomas tubulares (75%). Em carcinomas tubulares, a incidncia dos padres de apresentao das NORs do tipo I e II apareceu em igual proporo (50%). Os carcinomas papilferos exibiram ligeira predominncia do padro de apresentao do tipo II (54,54%). Os carcinomas slidos apresentaram exclusivamente o padro do tipo II (100%). Estes achados vo ao encontro daqueles encontrados por Sredni et al. 22, pois, os tumores adrenais de adultos apresentaram predominncia do tipo histolgico I (56%) e II (aproximadamente 30%). Em humanos, observa-se influncia dos padres de AgNOR sobre a sobrevida livre de doena, sendo o tipo I caracterstico dos tumores clinicamente benignos, e o tipo II caracterstico dos tumores clinicamente malignos. Segundo Bostock1, dentro do grupo de carcinomas simples, uma ordem de aumento de malignidade foi encontrada: carcinomas no-infiltrativos, carcinomas tubulo-papilares, carcinomas slidos e carcinomas anaplsicos. Como observado em nosso trabalho, houve diferena significativa entre os grupos adenoma tubular, com predominncia do padro morfolgico do tipo I, e carcinoma slido onde predominou o tipo II. Com estes dados podemos considerar que os tumores de glndula mamria com o padro morfolgico do tipo I podem ser relacionados com prognstico favorvel, enquanto que o padro morfolgico do tipo II, aqui observado nas neoplasias de carter mais agressivo, pode se correlacionar com prognstico desfavorvel. Estas consideraes nos do margem a concluir que mais estudos devam ser feitos em relao ao padro de apresentao das AgNORs, e que neoplasias de outros tecidos sejam avaliadas de modo a aperfeioar a

Braz. J. vet. Res. anim. Sci., So Paulo, v. 45, n. 3, p. 206-210, 2008

219

metodologia aqui aplicada, visto que a anlise da morfologia das AgNORs tm-se mostrado uma promissora ferramenta prognstica de alteraes neoplsicas. Concluso A anlise da morfologia das AgNORs uma ferramenta til na determinao do prognstica de alteraes

neoplsicas da glndula mamria canina. Agradecimentos Ao Doutores Moacyr D. Novelli e Ricardo Alves de Mesquita do Departamento de Patologia Geral da Faculdade de Odontologia da USP e Dra. Simone Treiger Sredni do Departamento de Patologia do Hospital do Cncer.

Quantitative and morphological study of silver staining nucleolar organizer regions (AgNORs) in benign and malignant neoplasms of the canine mammary gland Abstracts
The aim of this study was try to present a new method of evaluation of the nucleolar organizer regions (NORs) being related its morphology and distribution, objectifying to verify the correlation between malignancy of tumoral cells with cellular proliferation. Twenty-nine tumors were analyzed with regard to quantitative and morphological aspects of the silver staining nucleolar organizer regions (AgNORs) and compared to four normal mammary glands used as control. The data obtained were submitted to non-parametric KruskalWallis and Mann-Whitney U tests. The mean NORs counts of the malignant neoplastic groups tubular carcinomas (2.14 0.54), papillary carcinomas (1.79 0.24) and solid carcinomas (1.95 0.30) showed significant difference when compared with the control group (1.16 0.08). Morphological analysis of AgNORs revealed that the expression pattern of type I NORs predominate in the benign histological groups (75% of the tubular adenoma cases and 50% of the tubular carcinoma cases), whereas type II NORs pattern prevailed in the malignant behavior neoplastic groups (54,5% of the papillary carcinoma and 100% of the solid carcinoma cases). Control group showed total predominance (100% of the cases) of type IV NORs. Expression pattern of the type III NORs did not prevail in neither histological group encompassed by this study. Evaluation of AgNORs morphology reveals an useful tool for prognosis assessment of neoplastic alterations of the canine mammary gland.
Key-words: AgNORs. Mammary neoplasms. Prognostic. Morphological analysis. Dogs.

Referncias
1 BOSTOCK, D. E. Neoplasia of the skin and mammary glands in dogs and cats. In: BOSTOCK, D. E. Current veterinary therapy. Philadelphia: Kirk RW, 1977. p. 493-496. 2 BOSTOCK, D. E. Veterinary professional development series: Canine and feline mammary neoplasms. Br. Vet. J., v. 142, p. 506-515, 1986. 3 CROCKER, J. Nucleolar organiser regions. Curr. Top.

Pathol., v. 82, p. 91-149, 1990. 4 BOLOGNARI, A.; CONTINI, A. The role of the nucleolus in carcinogenesis. Riv. Biol. Norm. Patol., v. 7, p. 43-68, 1981. 5 BSCH, H.; SMETANA, K. Nucleoli of tumour cells. In: BUSCH, H.; SMETANA, K. The nucleolus. New York-London: Academic Press, 1970. p. 448-471. 6 KOLLER, P. C. The nucleus of the cancer cell. A histological review. Exp. Cell Res., v. 9, p. 3-14, 1963. Supplement.

Braz. J. vet. Res. anim. Sci., So Paulo, v. 45, n. 3, p. 206-210, 2008

220

7 WISCHNITZER, S. The submicroscopic morphology of the interphase nucleus. Int. Rev. Cytol., v. 34, p. 148, 1973. 8 RISTIMKI, A. et al. Expression of cyclooxygenase-2 in human gastric carcinoma. Cancer Res. v. 57, p. 127680, 1997. 9 HOWELL, W. M. Selective staining of nucleolus organizer regions (NORs). In: BUSCH H.; ROTHBLUM, L. The cell nucleus. New York: Academic Press, 1982. p. 89-143. 10 BOURGEOIS, C. A. et al. Silver stainig of NORs in electron microscopy. Exp. Cell Res., v. 123, p. 449452, 1979. 11 HERNANDEZ-VERDUN, D. et al. Ultrastructural localization of AgNOR stained proteins in the nucleolus during the cell cycle and in other nucleolar structures. Chromosoma, v. 79, p. 349-362, 1980. 12 HERNANDEZ-VERDUN, D. Structural organization of the nucleolus in mammalian cells. Methods Achiev. Exp. Pathol., v. 12, p. 26-62, 1986. 13 DERENZINI, M.; THIRY, M.; GOESSENS, G. Ultrastructural cytochemistry of the mammalian cell nucleolus. J. Histochem. Cytochem., v. 38, p. 12371256, 1990. 14 THER, D. et al. Nucleolar size and activity are related to pRb and p53 status in human breast cancer. J. Histochem. Cytochem., v. 52, n. 12, p. 1601-1607, 2004. 15 DERENZINI, M. et al. The prognostic value of the AgNOR parameter in human breast cancer depends on the pRb and p53 status. J. Clin. Pathol., v. 57, p. 755761, 2004. 16 VAJDOVICH, P. et al. Use of the argyrophilic nucleolar region method for cytologic and histologic examination of the lymph nodes in dogs. Vet. Pathol., v. 41, p. 338-345, 2004. 17 CROCKER, J. Molecular and immunohistological aspects of cell proliferation. In: CROCKER, J. Molecular biology in histopathology. New York: J Wiley, 1994. p. 93-120. 18 PICH, A.; MARGARIA, E.; CHIUSA, L.; Proliferative activity is a significant prognostic factor in male breast carcinoma. Am. J. Pathol., v. 145, v. 2, p. 481-489, 1994. 19 CASTAGNARO, M.; CASANOLEC C.; RU, G.

Argyrophilic nucleolar organiser regions (AgNORs) count as indicator of post-surgical prognosis in felin mammary carcinomas. Res. Vet. Sci., v. 64, p.97-100, 1998. 20 MISDORP, W. et al. Histological classification of the mammary tumours of the dog and the cat. Washington, D.C: Armed Forces Institute of Pathology, 1999. 59 p. (WHO international histological classification of tumours of domestic animals; 2nd series, v. 7). 21 PLOTON, D. et al. Improvement in the staining and the visualization of the argyrophilic proteins of the nucleolar organizer region at the optical level. Histochem. J., v. 18, p. 5-14, 1986. 22 SREDNI, S. T. et al. Adrenocortical tumours in children and adults: a study of pathological and proliferation features. Pathology, v. 35, p. 130-135, 2003. 23 DERENZINI, M.; PESSION, A; THER, D. Quantity of nucleolar silver-stained proteins is related to proliferating activity in cancer cells. Lab. Invest., v. 63, p. 137-140, 1990. 24 OFNER, D. et al. Silver stained nucleolar organizer regions proteins (AgNORs) as a predictor of prognosis in colonic cancer. J. Pathol., v. 162, p. 43-49, 1990. 25 SCHMITD, K. W. Silver stained nucleolar organizer regions proteins (AgNORs) as a predictor of prognosis in colonic cancer. J. Pathol., v. 162, p. 43-49, 1990. 26 YANG, P.; HUANG, G. S.; ZHU, X. S. Role of nucleolar organizer regions in the differentiating malignant from benign tumours of the colon. J. Clin. Pathol., v. 43, p. 235-238, 1990. 27 PARRETT, M. L. et al. Cyclooxygenase-2 gene expression in human breast cancer. Int. J. Oncol., v. 10, p. 503-507. 1997. 28 CROCKER, J. Evaluation of nucleolar organiser region-associated proteins in breast malignancy. R. Smith & J. Crocker. Histopathology, v. 12, p. 113-125, 1998. 29 GIUSEPPE, S. et al. Prognostic value of histologic stage and proliferative activity in canine malignant mammary tomours. J. Vet. Diagn. Invest., v. 14, p. 2534, 2002. 30 KIDA, Y.; TAKANO, Y.; OKUDAIRA, M.; Argirophilic nucleolar organiser regions in human adrenocortical neoplasms. J. Cancer Res. Clin. Oncol., v. 119, p. 49-54, 1992.

Braz. J. vet. Res. anim. Sci., So Paulo, v. 45, n. 3, p. 206-210, 2008