AULA 3

Replicao do DNA

Paolo De Marco CF 10_11

Experincia de Meselson & Stahl (1958)

Cultivo em meio
15NH 4Cl

Cultivo em meio
14NH 4Cl

Purificao do DNA seguida de centrifugao em gradiente de CsCl

A replicao do DNA semi-conservativa

Apenas a hiptese semiconservativa condiz com os resultados da experincia de Meselson & Stahl.

Modelo de replicao semi-conservativa

Cadeias originais

Cadeias neosintetizadas

forquilha de replicao
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Modelo de replicao semi-conservativa

As origens de replicao
Observaes de cromossomas bacterianos em replicao: duplicao a partir de um nico ponto e avanando nas duas direces

Observaes de cromossomas eucariticos em replicao: duplicao a partir de vrios pontos avanando nas duas direces Esse ponto de partida da replicao dum cromossoma chamada origem de replicao.
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As origens de replicao

O cromossoma bacteriano tem uma nica origem de replicao constitui um nico replicon

As origens de replicao
O cromossoma eucaritico tem muitas origens de replicao constitudo por muitos replicons.

Todos so activados uma nica vez no ciclo celular ainda que no simultaneamente.

Definio de replicon: segmento de cromossoma replicado a partir de uma nica origem de replicao

A replicao do DNA bidireccional

Em cada origem formam-se duas forquilhas que procedem nas duas direces at encontrarem a forquilha de um replicon adjacente

O olho ou bolha de replicao

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Replicons num cromossoma eucaritico

Cada forquilha avana a uma velocidade de ca. 3000 bp/min. Cada replicon tem um tamanho de 30-300 kbp. A fase S dura ca. 6 hrs. Regies diferentes do genoma so replicadas em momentos diferentes da fase S. Zonas de cromatina mais condensada so replicadas mais tarde.

tempo

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Incio da replicao num cromossoma bacteriano

A origem de replicao apresenta sequncias especficas ricas em AT reconhecidas pelas protenas iniciadoras. A seguir forma-se um complexo DNA-protenas chamado primossoma.

A origem de replicao funciona apenas se estiver devidamente metilada (nas As das sequncias GATC, em E. coli). Nos 10 min a seguir replicao uma origem fica num estado refractrio (no funciona) devido a falta de metilao da cadeia nova.
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A sntese semidescontnua do novo DNA

cadeia contnua (lder)
5 3

cadeia descontnua (atrasada) 13

A sntese de novo DNA

As DNA polimerases no conseguem comear a copiar a cadeia molde do zero, precisam sempre da extremidade 3 de um cido nucleico onde se agarrarem. Isto fornecido por outro enzima, a primase, que de facto d incio replicao sintetizando curtos primers (iniciadores) de RNA. Estes primers so depois degradados ao avanar da nova cadeia de DNA. No fim as duas cadeias contguas tm de ser unidas numa s: isto feito pela DNA ligase.
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Protenas envolvidas na replicao

As cadeias de DNA tm de ser separadas para a polimerase poder actuar: a helicase um enzima que gasta energia (ATP) para fundir (abrir) o DNA. Logo a seguir intervm umas protenas que estabilizam o ssDNA, as SSBPs. Elas impedem que as duas cadeias voltem a fechar, mas tambm que se formem estruturas internas que poderiam impedir ou dificultar a aco da polimerase. Contudo, no podem cobrir as bases, que tm de ficar livres.

(SSBP)

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Protenas envolvidas na replicao

Helicase

Single strandDNA Binding Protein SSBP

Ao desenrolar das cadeias, produzida toro na regio a jusante. A tenso resultante na molcula eliminada pela aco da topoisomerase I que produz uma interrupo temporria numa das cadeias (nick) deixando esta cadeia livre de rodar volta da ligao fosfo-ster da outra. Existem modelos de forquilha com dmeros de polimerase a sintetizar as duas cadeias ao mesmo tempo (filme). Nos eucariotas a maquinaria envolvida mais complexa, mas o esquema o mesmo com funes anlogas.
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Protenas envolvidas na replicao

O complexo de protenas envolvidas na forquilha de replicao pode ser chamado replissoma.

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Fidelidade na replicao
A replicao um processo vital porque produz as novas cpias do genoma para as novas geraes de clulas. de fundamental importncia que a sntese de novo DNA seja o mais correcta possvel.

Os sistemas in vivo atingem nveis de erro to baixos como 1 erro em cada 109 nucleotdeos inseridos (10-9). Esta fidelidade to elevada conseguida por mecanismos de correco de erros que aumentam a fidelidade de base da polimerase.
Passo 5 3 polimerizao taxa de erro 10-5

contribuio para diminuio da taxa de erro 3 5 exonucleolytic proofreading mismatch repair Final 10-2 10-2 10-9

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Fidelidade na replicao
proofreading
As prprias DNA polimerases tm uma regio do complexo enzimtico com funo de correco de erros (proofreading): se o segmento de DNA que funciona como primer acaba com uma base que no emparelha correctamente, a polimerase retira um n suficiente de nucleotdeos para trs at obter uma extremidade 3-OH funcional. Esta funo aumenta a fidelidade de base da polimerase de duas ordens de grandeza. Alm disso existem outros mecanismos para manter baixa a taxa de erro. Um mecanismo encontrado em E. coli, e sucessivamente descoberto em eucariotas, o chamado mismatch repair system.

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Fidelidade na replicao
mismatch repair
Existem vrios sistemas de reparao de erros no DNA. O sistema mismatch repair serve para corrigir os eventuais raros erros que ainda escapam ao proofreading. Existem protenas especficas (MutS) que reconhecem locais com uma base no emparelhada (mismatch) e outras (MutL) removem o segmento de DNA flanqueante e promovem a sua re-sntese. Mas fundamental que seja removida a cadeia nova e no a cadeia molde. Em E. coli a cadeia molde est metilada enquanto a cadeia nova demora algum tempo para ficar metilada: MutH reconhece um stio GATC onde uma das duas adeninas no esteja ainda metilada e nicka essa cadeia o que leva sua remoo por MutL seguida por re-sntese.
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mismatch repair

Em outras bactrias e em eucariotas o reconhecimento da cadeia nova no se baseia na falta de metilao, mas possivelmente na presena ainda de descontinuidades (nicks) devidas ao facto que acabou de ser sintetizada.

MutL ou suas homlogas procuram uma interrupo e removem essa cadeia e no a outra.

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Protenas envolvidas na replicao

smbolo
DnaA DnaB DnaC helicase helicase loader

Escherichia coli

nome

funo
Reconhece a origem de replicao e abre a dupla hlice num stio especfico Desenrola o DNA Auxilia a ligao da helicase origem

DnaG
SSBP RpoABC TopA HsdM

primase
single stranded DNA binding protein RNA polimerase Topoisomerase I Dam metilase

Sintetiza primers de RNA

Liga e estabiliza ssDNA Auxilia a aco da DnaA Alivia a tenso torcional gerada pelo desenrolamento da dupla hlice Metila as adeninas nas sequncias GATC da nova cadeia Sntese de novo DNA

DnaENQX DNA polimerase III HolABCDE

vrios genes

DNA polimerase I
DNA ligase

Excisa os primers de RNA e preenche as lacunas

Junta fragmentos de Okazaki adjacentes
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LigAB

Tipos de replicao alternativos

rolling circle (crculo rolante)

Tpica de genomas circulares de alguns vrus (bacterifagos) e de alguns plasmdeos.

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Tipos de replicao alternativos

D-loop (displacement loop)

Parece ser a modalidade de replicao do genoma mitocondrial humano (circular). As duas novas cadeias so iniciadas em locais diferentes.

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O problema dos replicons lineares

Vrias solues: alguns vrus ou plasmdeos lineares circularizam antes da replicao (ex. fagos T4)

outros organismos (adenovrus, poliovrus) produzem uma protena que fornece um OH que a DNA polimerase pode usar como primer para produzir a partir da a cadeia cpia (no precisam de primase) noutros organismos ainda (vertebrados) existem os telmeros e a telomerase: equilbrio entre eroso das extremidades e nova sntese.

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