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N 631. Conferencia

Observao de Algumas Alteraes Celulares Inflamatrias, Limtrofes, Pr-malignas e Malignas atravs dos Mtodos de Citologia Convencional e Citologia de Base Lquida.
Maria Eugnia Furtado dos Santos Dos Santos[1] , Leonardo Gomes Caldas Caldas [2], Arthur Silva Loureno Godinho Godinho[2] , Lacy Cardoso de Brito Junior Brito Junior[3] (1) Departamento de Patologia Centro de Cincias Biolgicas Universidade Federal do Par BRASIL (2) CESUPA - CENTRO UNIVERSITRIO DO PAR BRASIL (3) Departamento de Patologia Centro de Cincias Biolgicas Universidade Federal do Par. BRASIL

Resumo
OBJETIVOS. Os critrios citolgicos inflamatrios, limtrofes, de pr-malignidade e malignidade originalmente descritos por Papanicolau e demais pesquisadores, nos ltimos anos, vm passando por intensas revises graas ao surgimento de novas metodologias de diagnstico citolgico como a citologia de base lquida. Assim, o objetivo deste trabalho foi de apresentar (educao continuada), e divulgar, as diferenas citolgicas relativas s alteraes celulares inflamatrias, limtrofes, pr -malignas e malignas observadas em esfregaos de citologia convencional e citologia de base lquida. MATERIAL E MTODOS. Foram analisados, atravs de citologia convencional e citologia de base lquida (Sistema DNA-CITOLIQ - Digene), exames de Papanucolau, corado e montados de forma convencional, para observao, e demonstrao (educao continuada) das diferenas que podem ser encontradas em relao s alteraes celulares inflamatrias, limtrofes, pr-malignas e malignas. RESULTADOS. Mostraram que o uso do mtodo de citologia de base lquida reduziu a incidncia de amostras limitadas por baixa celularidade; material ressecado ou mal corado; excesso de muco, polimorfonucleares, hemcias, ou mesmo processo inflamatrio exuberante; em comparao com os observados na citologia convencional. Em relao identificao das alteraes celulares inflamatrias, limtrofes, pr-malignas e malignas pelos mtodos supracitados, no houve diferenas significativas entre os mtodos, exceto pela maior facilidade, e reduo do tempo, para a observao das clulas alteradas. CONCLUSES. Estudo confirma dados da literatura que evidenciam que as maiores vantagens do mtodo de citologia de base lquida, em comparao com a citologia convencional, so a melhor visualizao das alteraes celulares limtrofes, pr-malignas e malignas, o fundo da lmina limpo e o tamanho da amostra a ser analisada na citologia de base lquida. Porm, mostrou tambm que as dimenses da escova ginecolgica utilizada neste mtodo pode oferecer alguma alterao nos resultados; e que o mesmo necessita que o seu operador seja previamente treinado antes de pratic -lo, tanto em relao confeco dos imprints como da anlise dos resultados citolgicos.

Introduo
O exame citolgico proposto por Papanicolaou na dcada de quarenta (1941), e conhecido como citologia convencional, ou citologia onctica, baseia-se em uma metodologia de diagnstico presuntivo e preventivo para a deteco primria de leses precursoras, ou mesmo de leses cancergenas, de material crvico-vaginal, que apresenta boa sensibilidade e especificidade. Porm, embora de grande importncia para o fim que se propem, esta metodologia tem como premissa, para o seu sucesso diagnstico, a necessidade de que a coleta, fixao e colorao da amostra sejam bem feitas, garantindo material com celularidade adequada, boa preservao das caractersticas celulares, e a representao da zona de transformao (Juno Escamo Colunar JEC); bem como a obteno de dados clnicos da paciente: como idade, data da ltima menstruao ou menopausa, a existncia de alteraes citolgicas em exames anteriores, ou teraputicas em curso, so fatores indispensveis para a interpretao correta da amostra (Koss, L G, 1997; HALBE, HW, 1993). Com o passar dos anos, todavia, e os avanos tecnolgicos nesta rea, esta metodologia passou a sofrer contnuas crticas em relao sensibilidade, e a sua capacidade de correlao com os achados histopatolgicos para leses pr -malignas e malignas. Principalmente em decorrncia da quantidade significativa, e indesejvel, de casos falso -negativos e falso-positivos associados a esta metodologia. A maioria dos quais atribudos a erros de coleta e interpretao dos resultados (KOSS et. al, 1997) gerados por: (1) baixa celularidade da amostra em decorrncia de mucosa ressecada aps o uso de duchas ginecolgicas; (2) presena de artefatos e ressecamente por de m fixao da amostra; e/ou (3) amostra muito espessa, em funo da sobreposio celular por excesso de muco, cremes vaginais, hemorragia, citlise (restos celulares) ou infiltrado inflamatrio (excesso de leuccitos ou material necrosado); que podem levar a uma interpretao errada da amostra ou mesmo obscurecer a presena de clulas pr malignas e malignas. Contudo, outro fator relacionado a erros nesta metodologia que a natureza altamente repetitiva do trabalho de rastreamento de muitos esfregaos de citologia convencional diariamente por uma mesma pessoa (Koss et. al, 1997; Brasil, Ministrio da Sade, 2002). Neste sentido, vrios estudos foram ento realizados, na tentativa de reduzir estes interferentes no diagnstico preventivo e presuntivo do cncer de colo de tero, e assim na dcada de noventa surgiu uma metodologia que se intitulava revolucionria neste sentido, era a citologia de base liquida, citologia de monocamada ou de camada fina. Mais especfica que a citologia convencional com a finalidade de permitir a anlise das amostras cervico-vaginais por mtodos de automao (anlise computadorizada), com menor quantidade de artefatos e sobreposies celulares (Pereira, SMM et al 2003; ACS Guideline, 2002).

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Sendo conhecidas hoje, segundo a Food and Drug Administration (FDA), vrias metodologias de citologia de monocamada, como por exemplo, AutoCyte PREP (AutoCyte, Burlington [NC], United States), ThinPrep Pap Test (Cytic Corp., Boxborough [Mass], United States), e DNA-CITOLIQ (DIGENE, Brasil) (Chang, A R, 1999). Apresentando nestes casos trs processos diferentes de preparao das amostras, a saber: centrifugao (Autocyte), a vcuo (Thinprep), ou por imerso ( imprint) do material biolgico em lmina (DNA-CITOLIQ); com o mesmo objetivo que , de um modo geral, reteno e degradao de elementos indesejveis em excesso (como por exemplo, hemcias, polimorfos e material degradado) no prprio meio lquido, permitindo que o fundo da lmina fique limpo e as clulas mais isoladas sejam mais bem visualizadas (Agency for Health Care Policy and Research , 1999). Alm claro de: diminuir o tempo de analise de cada amostra por tratar -se de amostras contidas no centro da lmina, em uma circunferncia de aproximadamente 13mm de dimetro; e permitir a repetio da amostra analisada sem a necessidade de nova coleta, ou a realizao de outras metodologias como Captura hbrida e Reao em Cadeia Polimerase para o HPV com a mesma amostra (Pereira, SMM et al 2003; ACS GUIDELINE, 2002). Como destaque negativo desta metodologia de citologia de base lquida, porm, podemos ressaltar o seu alto custo operacional, em funo do materail a ser adguirido para a sua realizao como lminas, meios lquidos especficos de conservao e fixao das clulas, filtros utilizados na metodologia e a substancial despesa com os equipamentos especficos para a realizao das mesmas. Alm claro da necessidade de treinamento especfico das pessoas que vo executar e analisar o material proveniente destas preparaes, visto que, h leves alteraes de conformaes estruturais e de tamanhos celulares com utilizao destas metodologias (Chang, AR,1999). Neste estudo, ento, buscamos realizar um estudo comparativo para evidenciar e divulgar, em forma de educao continuada, alguns aspectos das diferenas citolgicas relativas s alteraes celulares inflamatrias, limtrofes, pr -malignas e malignas observadas em esfregaos de citologia convencional e citologia de base lquida (Sistema DNA-CITOLIQ - Digene).

ANLISE COMPARATIVA ENTRE CITOLOGIA CONVENCIONAL E CITOLOGIA DE BASE LQUIDA

Coleta das Amostras O material crvico-vaginal deve ser coletado por profissional da rea de sade devidamente esclarecido e treinado sobre os aspectos da coleta para citologia convencional e para a citologia de base lquida. Neste estudo foram realizadas duas coletas consecutivas e imediatas para cada paciente, permitindo a utilizao das duas metodologias para anlise dos esfregaos. Utilizando -se primeiro esptula de Ayre, escova endocervical e lmina para microscopia na citologia convencional, e posteriormente o quite de coleta do sistema DNA-CITOLIQ para a coleta de material para citologia de base lquida, composto por um tubete com 1ml de soluo Universal Collection Medium (UCM) e escova endocervical do quite, a qual era mantida no tubete at o posterior processamento do material. interessante observar, que os princpios de coleta das amostras no so alterados e/ou modificados em funo da coleta para citologia de base lquida ou citologia convencional. Com a grande vantagem prtica observada na coleta para citologia de base lquida sendo o fato de que o material proveniente desta metodologia conservado na totalidade das clulas coletadas e fixado imediatamente aps a introduo da escova ginecolgica no lquido fixador do quite, e no distribudo diretamente em lmina como na citologia convencional. Este procedimento, alm de simplificador, evita o manuseio da lmina de vidro e eventuais acidentes, assim como o acmulo de interferentes (excesso de bactrias, hemcias, leuccitos e muco) e a conservao de grande quantidade de material celular para futuras anlises ou repeties. O mtodo de citologia lquida (Sistema DNA-CITOLIQ - Digene), porm, teve como possvel complicador na coleta de clulas endocervicais o tipo de escova ginecolgica que vem no quite fornecido pelo fabricante, isto porque, a base desta escova muito larga, em comparao com a escova ginecolgica tradicional (Figura 1), impedindo assim a sua utilizao adequada, que deveria permitir a introduo da mesma no canal do colo uterino em pelo menos em 2 cm. Gerando desta forma risco de no observao de leses pr-malignas e malignas mais profundas no canal da colo uterino.

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Figura 1. Comparao entre as escovas ginecolgicas utilizadas para a coleta endocervical (canal do colo do tero), utilizadas nos mtodos de: A. Citologia Convencional (CC) e, B. Citologia de Base Lquida (CBL).

Preparao, cuidados e anlise de material proveniente da Citologia Convencional.

Como critrios de qualidade para a boa visualizao e screening do exame de citologia convencional o material coletado deve ser espalhado sobre a lmina de modo uniforme, sem ultrapassar os limites da lmina, e fixado imediatamente aps a coleta, e posteriormente, transportado ao laboratrio, em suporte plstico de lmina, onde so realizadas as coloraes do mesmo pelo mtodo de Papanicolaou, tradicional ou modificado. O Exame de Papanicolaou convencional (Citologia Convencional), assim, notoriamente um dos grandes sucessos diagnsticos de triagem j desenvolvidos para a preveno do cncer de colo do tero em toda a histria da humanidade, principalmente em funo do baixo custo desta metodologia e de sua eficcia no diagnstico de leses precoces de cncer do colo do tero. Porm, eventualmente pode apresentar tambm limitaes quanto sensibilidade e reprodutibilidade, com altos ndices de amostras insatisfatrias e limitadas por razes tcnicas como: ressecamento (Figura 2B); baixa celularidade (Figura 2A); excesso de leuccitos (Figura 3A), bactrias (Figura 3B), hemcias (Figura 3C) ou muco (Figura 3D); impossibilidade de repetio do teste a partir de uma mesma coleta, alm dos altos percentuais de falso-negativos associados a amostras inadequadas por ausncia de representao da zona de transformao (JEC), material espesso (Figura 4A), mal corado ou fixado (Figura 4B), excesso de material fora dos limites de anlise da lmina (Figura 4C), e em relao ao nmero e tamanho das amostras para screenings (Michalas, 2001, Stoler, M H, 2000).

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Figura 2. Limitaes tcnicas associadas ao Mtodo de Citologia Convencional. A. Baixa celularidade na amostra. A. Ressecamento da amostra.

Figura 3. Limitaes tcnicas associadas ao Mtodo de Citologia Convencional. A. Excesso de leuccitos na amostra. B. Excesso de bactrias na amostra. C. Excesso de hemcias na amostra. D. Excesso de muco na amostra.

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Figura 4. Limitaes tcnicas associadas ao Mtodo de Citologia Convencional. A. Esfregao espesso. B. Esfregao mal corado ou mal fixado. C. Esfregao de material fora dos limites de anlise da lmina.

Preparao, cuidados e anlise do material proveniente da Citologia de base Lquida.

O material cervico-vaginal coletado pelo mtodo de citologia de base lquida, que armazenado junto com a escova ginecolgica no tubete que contem o meio lquido de transporte desta metodologia, e conseqentemente imediatamente fixado, por sua vez, s deve ser processado no laboratrio. Quando da retirada, e desprezo em recipiente prprio de descarte biolgico, da escova ginecolgica do tubete de transporte e fixao da amostra, e homogeneizao do material contido no mesmo, devidamente tampado, em vrtex por 20 segundos a 3.000 rpm; aliquotagem de 200 l da amostra e dispensao da mesma de maneira uniforme e rpida sobre a superfcie central da membrana acomodada no sistema de imprint do quite DNA -CITOLIQ , com capacidade para 12 lminas. Ao qual a tampa do suporte do sistema fechada com o conjunto lmina/membrana e travado por 10 segundos, com posterior fixao das amostras em lcool 95% e colorao pelo mtodo de Papanicolaou modificado. O uso da citologia de base lquida, porm, como tem sido observado na literatura, apresenta uma srie de vantagens em relao ao esfregao tradicional, como a reduo da rea a ser analisada (Figura 5A) e do tempo de screening de cada amostra; e dos interferentes como ressecamento da amostra, pedido de repetio da amostra em caso de amostra inadequada para a anlise citolgica, em funo do excesso de muco, hemcias, leuccitos, restos celulares e agentes infecciosos, que so nesta metodologia removidos da amostra, graas ao qumica do meio de transporte, e assim permite que todas as amostras apresentem-se com fundo de lmina limpo. Permitindo assim ao citopatologista a interpretao e leitura das clulas atpicas, pr malignas, ou malignas no esfregao com maior clareza; e de forma mais segura e eficaz. Porm, esta citologia de base lquida requer tambm que o citopatologista esteja bem treinado, e familiarizado, com o processamento da amostra impedindo assim falhas metodologicas como amostras com baixa celularidade (Figura 5B), excesso de material fora dos limites de anlise da lmina (Figura 5C) ou impedindo a anlise do material (Figura 5D). E tambm esteja bem treinado e familiarizado com as alteraes celulares, proveniente desta metodologia (Sawaya,G. F. & Grimes,D.A., 1999; Pitolli, J. E. et al, 2003; Pereira, SMM et al 2003), visto que pelo mtodo de citologia de base lquida as clulas endocervicais (Figura 6) e metaplsicas (Figura 7) tendem a ser vistas isoladas, de tamanho menor e de aspecto mais redondo em comparao com estes tipos celulares observados na citologia convencional; a flora coco bacilar melhor observada, e quase que exclusivamente, quando associada ao citoplasma das clulas escamosas (sendo menos evidente o habitual fundo "arenoso" dos esfregaos de vaginoses bacterianas) (Figura 8) em comparao com o observado na citologia convencional; os Trichomonas vaginalis que so menores e menos visveis (Figura 9) em comparao com o observado na citologia convencional; porm, os esporos de Candida sp. (Figura 10) na citologia de base lquida se apresentam com morfologia semelhante a observada na

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citologia convencional.

Figura 5. Limitaes tcnicas associadas ao Mtodo de Citologia de Base Lquida. A. Esfregao ideal para anlise. B. Esfregao com baixa celularidade. C. Esfregao com material fora dos limites de anlise da lmina. D. Esfregao muito espesso impedindo a anlise do material.

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Figura 6. Fotomicrografias mostrando as diferenas possveis de serem observadas em relao s clulas endocervicais, em seus aspectos em favo de mel ou empalhiadas, pelos mtodos de Citologia Convencional (A e C) ou de Citologia de Base Lquida (B e D).

Figura 7. Fotomicrografias mostrando as diferenas possveis de serem observadas em relao clulas metaplsicas pelos mtodos de Citologia Convencional (A e C) ou de Citologia de Base Lquida (B e D).

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Figura 8. Fotomicrografias mostrando as diferenas possveis de serem observadas em relao identificao da Gardnerella vaginalis pelos mtodos de Citologia Convencional (A. fundo "arenoso" e aspecto em mosaico e C. clue cell), ou de Citologia de Base Lquida (B e D), melhor observada, quase exclusivamente, quando associada ao citoplasma das clulas escamosas (clue cell).

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Figura 9. Fotomicrografias mostrando as diferenas possveis de serem observadas em relao identificao do Trichomonas vaginalis pelos mtodos de Citologia Convencional (A e C), mostrando o efeito de aglomerados de leuccitos prximos s clulas infectadas ou mesmo do agente prximos aos aglomerados celulares (setas); ou de Citologia de Base Lquida (B e D), mostrando o mesmo efeito de aglomerados de leuccitos, porm, com o agente de tamanho menor e menos visvel, prximo as clulas.

Figura 10. Fotomicrografia mostrando a presena de esporos de Candida sp. pelo mtodo de Citologia de Base Lquida (setas). No tendo sido observadas diferenas entre os mtodos de Citologia Convencional ou de Citologia de Base Lquida para este agente.

Comparao das Alteraes Celulares Inflamatrias, Pr-malignas, de Significado Indeterminado e Malignas Observadas nos Mtodos de Citologia Convencional e Citologia de Base Lquida.

O reconhecimento das alteraes celulares inflamatrias em material cervico-vaginal coletado pelo mtodo de citologia de base lquida, ou citologia convencional, passa pela observao de vrios critrios citolgicos inflamatrios como: a presena e a quantificao dos polimorfonucleares presentes na amostra (Figura 12B); presena ou ausncia do agente agressor biolgico (bactrias, fungos, protozorios, helmintos e vrus); a presena de vacuolizaes citoplasmticas; halo perinuclear (Figura 11); condensao da cromatina nuclear e disceratose (Figura 12); apagamento ou dobramento das bordas citoplasmticas (Figura 13); pseudo -eosinofilia (policromasia) (Figura 14A); aumento do volume nuclear (Figura 15B); cariorex (Figura 14B); multinucleao ou bi-nucleao (Figura 15A); dentre outras (CARVALHO, 1999; SCHINEIDER, 1998; SILVA Filho, 2000). Nossa experincia, neste sentido, tem mostrado que, independente da metodologia, as alteraes e os critrios citolgicos inflamatrios so facilmente observados, e preservados com as mesmas caractersticas, tanto na citologia de base lquida como na citologia convencional. A deteco de clulas com caractersticas que definem leses pr-cancergenas, associadas ou no ao HPV (Figura 16), de significado indeterminado, sem excluir malignidade, e cancergenas, passa pela definio e caracterizao dos Critrios de Malignidade, e que so associados a observao da presena de clulas em fibra , em girino (Figura 19A), em raquete, ovais ou elpticas; pleomorfismo (tamanho e formas variveis das clulas) (Figura 17); vacuolizaes celulares atpicas; ceratinizao (Figura 12); cariomegalia (ncleo de tamanho acima do usual); hipercromasia (maior afinidade tintorial do ncleo) (Figura 17); multinucleao ou bi-nucleao (Figura 15A); irregularidade da membrana nuclear (Figura 17 e 19A); cromatina grosseira e irregular; espaos vazios no ncleo; e presena de nuclolos mltiplos, proeminentes (Figura 19B) e irregulares. Podendo, porm, estas atipias celulares serem encontradas em uma grande variedade de entidades patolgicas do trato genital feminino, que vo desde os processos reacionais benignos, metaplasias associadas inflamao, at Atipias de clulas escamosas (ASC) de significado indeterminado (ASC-US) (Figura 18), no podendo excluir leso de alto grau (ASC -H); Leses intra-epiteliais escamosas de baixo grau (LSIL) (Figura 16); Leses intra-epiteliais escamosas de alto grau (HSIL) (Figura 17 e 19); e Carcinomas escamosos ou glandulares

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invasivos (CARVALHO, 1999; SCHINEIDER, 1998; SILVA Filho, 2000). Nossa experincia, neste sentido, tem mostrado que, o uso da metodologia de citologia de base lquida permite a melhor visualizao das alteraes e critrios citolgicos pr-malignos, de significado indeterminado e de malignidade, em comparao com a metodologia de citologia convencional. Graas visualizao das clulas na citologia de base lquida em um campo menor de anlise, e ao fato das mesmas, encontrarem-se mais isoladas e livres de interferentes como excesso de hemcias, leuccitos, muco ou mesmo em agregados celulares.

Figura 11. Fotomicrografia mostrando critrios citolgicos inflamatrios (fundo "arenoso" e halo perinuclear, setas) observados pelo mtodo de Citologia de Base Lquida. No tendo sido observadas diferenas entre os mtodos de Citologia Convencional ou de Citologia de Base Lquida para este critrio.

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Figura 12. Fotomicrografias mostrando critrios citolgicos inflamatrios observados pelos mtodos de Citologia Convencional (A), disceratose (setas); ou de Citologia de Base Lquida (B), polimorfonucleares, condensao da cromatina nuclear e disceratose (setas).

Figura 13. Fotomicrografias mostrando critrios citolgicos inflamatrios (setas), de dobramentos de bordas celulares (clulas naviculares), observados pelos mtodos de Citologia Convencional (A) ou de Citologia de Base Lquida (B).

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Figura 14. Fotomicrografias mostrando critrios citolgicos inflamatrios (setas), de pseudo-eosinofilia (policromasia) e cariorex, observados pelo mtodo de Citologia de Base Lquida. No tendo sido observadas diferenas entre os mtodos de Citologia Convencional ou de Citologia de Base Lquida para estes critrios.

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Figura 15. Fotomicrografias mostrando critrios citolgicos inflamatrios (setas), de aumento do volume nuclear e multinucleao (bi -nucleao), observados pelo mtodo de Citologia de Base Lquida. No tendo sido observadas diferenas entre os mtodos de Citologia Convencional ou de Citologia de Base Lquida para estes critrios.

Figura 16. Fotomicrografias mostrando critrios citolgicos (setas) pr -malignos (Leses intra -epiteliais escamosas de baixo grau - LSIL) associados HPV e observados pelos mtodos de Citologia Convencional (A) ou de Citologia de Base Lquida (B).

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Figura 17. Fotomicrografias mostrando critrios citolgicos (setas) pr -malignos, de pleomorfismo, quebra da relao ncleo -citoplasma, hipercromasia e irregularidades da membrana nuclear, associados a Leses intra-epiteliais escamosas de alto grau (HSIL), e observados pelos mtodos de Citologia Convencional (A e C) ou, confirmado, pelo mtodo de Citologia de Base Lquida (B e D).

Figura 18. Fotomicrografias mostrando critrios citolgicos (setas), de cariomegalia (ncleo de tamanho acima do usual) e quebra da relao ncleocitoplasma, associados a Atipias de clulas escamosas de significado indeterminado (ASC-US), e observados, e confirmado, pelo mtodo de Citologia de

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Base Lquida (A e B).

Figura 19. Fotomicrografias mostrando critrios citolgicos (setas) pr -malignos, de pleomorfismo, quebra da relao ncleo -citoplasma, clulas em girino, nuclolos proeminentes e irregularidades da membrana nuclear, associados a Leses intra-epiteliais escamosas de alto grau (HSIL), e observados pelos mtodos de Citologia Convencional (A e B). No tendo sido possvel, neste caso, sua demonstrao pelo mtodo de Citologia de Base Lquida.

Agradecimentos
Agradecemos aos Ministrios da Sade do Brasil, Secretaria Executiva de Cincia, Tecnologia e Meio Ambiente (SECTAM) e ao Fundo Estadual de Cincia do Estado do Par, pelo apio financeiro e cientfico para a realizao deste trabalho.

Bibliografa
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