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BRUNO FRITZSONS BONIN

EFEITO DO TRATAMENTO COM EXTRATO DE PITUITRIA


EQUINA NA RESPOSTA OVARIANA E EFICINCIA
REPRODUTIVA DE GUAS IDOSAS EM PROGRAMA DE
TRANSFERNCIA DE EMBRIES








Dissertao
Mestrado







Botucatu-SP
2009


BRUNO FRITZSONS BONIN








EFEITO DO TRATAMENTO COM EXTRATO DE PITUITRIA EQUINA NA
RESPOSTA OVARIANA E EFICINCIA REPRODUTIVA DE GUAS IDOSAS
EM PROGRAMA DE TRANSFERNCIA DE EMBRIES





Dissertao apresentada Faculdade de
Medicina Veterinria e Zootecnia da
Universidade Estadual Paulista, campus
de Botucatu, como parte das exigncias
para obteno do ttulo de Mestre em
Medicina Veterinria, rea de Reproduo
Animal.


Orientador: Professor Adjunto Marco Antnio Alvarenga


Botucatu-SP
2009


ii
AGRADECIMENTOS
A Deus que nos permite caminhar todos os dias vencendo batalhas e trilhando
nosso caminho em companhia de nossas famlias e amigos.
A minha famlia, Bruna, Sophia e Matheus (a caminho) por sempre estarem ao
meu lado entendendo o trabalho sem horrio, conciliado com vrios anos de
estudo longe de casa.
Aos meus familiares, pelos incessantes incentivos na busca constante de
novas informaes e formao pessoal.
Ao meu orientador e amigo, Prof. Dr. Marco Antonio Alvarenga, pelos
ensinamentos e confiana durante a realizao do curso de Mestrado.
Ao Mdico Veterinrio e amigo Jos Antonio DellAqua Jnior pelo auxilio na
avaliao estatstica dos dados.
Aos docentes, colegas ps-graduandos e funcionrios do Departamento de
Reproduo Animal e Radiologia Veterinria da FMVZ, Unesp-Botucatu.
Ao amigo e proprietrio da Central de Reproduo, Guilherme Gregolin, pela
viabilizao da conduo deste trabalho, nas dependncias de sua Central.







iii
LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Efeito da idade da gua doadora nas taxas de
recuperao embrionria........................................................................

15

Tabela 2 Nmero mdio de ovulaes por ciclo, nmero mdio de
embries por ciclo, nmero mdio de embries por ovulao e nmero
mdio de embries por guas.................................................................


22

Tabela 3 Nmero de ovulaes por gua no G1, G2 e G3................. 23

Tabela 4 Nmero de embries recuperados por gua no G1, G2 e
G3............................................................................................................

24

Tabela 5 Durao da fase folicular, tempo em dias da aplicao da
prostaglandina (D8) at a ovulao por gua no G1, G2 e
G3............................................................................................................
.


25

Tabela 6 - Condizncia entre o Estagio de desenvolvimento para
cada embrio recuperado e o dia da recuperao (D8 do ciclo), no
G1, G2 e G3............................................................................................


26

Tabela 7 - Taxa de prenhez obtida por embries recuperados no G1,
G2 e G3...................................................................................................

26

Tabela 8 - Taxa de prenhez por ciclo obtidas no G1, G2 e G3............. 27


iv
LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Porcentagem de guas em atividade reprodutiva natural de
acordo com idade......................................................................................

03

Figura 2 Taxa de pario em guas de acordo com idade.................... 04

Figura 3 FSH e LH centralizado para ovulao..................................... 08


v
SUMRIO
1. INTRODUO........................................................................................ 01
2. REVISO DE LITERATURA.................................................................. 03
2.1 Senilidade, dinmica ovariana e ciclo estral................................. 04
2.2 Alteraes hormonais relacionadas idade................................. 06
2.3 Alteraes da genitlia externa e interna relacionadas idade..... 10
2.4Senilidade e qualidade de ocitos e embries................................ 11
3. OBJETIVOS........................................................................................... 17
4. MATERIAL E MTODO......................................................................... 18
4.1 Perodo e Local do Experimento............................................................ 18
4.2 Animais e Grupos Experimentais........................................................... 18
4.3 Delineamento Experimental................................................................... 18
4.3.1 Exames Ultrassonogrficos..................................................... 19
4.3.2 Colheita de Smen, Inseminaes e Induo das Ovulaes 19
4.3.3 Tratamentos............................................................................. 20
4.3.4 Colheita, Manipulao e Transferncia dos Embries............ 20
4.3.5 Diagnstico de Gestao......................................................... 21
4.4 Anlise Estatstica......................................................................... 21
5. RESULTADOS....................................................................................... 22
6. DISCUSSO........................................................................................... 28
7. CONCLUSES....................................................................................... 34
8. REFERNCIAS...................................................................................... 35


vi
RESUMO
BONIN, B.F., Efeito do tratamento com extrato de pituitria equina na
resposta ovariana e eficincia reprodutiva de guas idosas em programa
de transferncias de embries. Botucatu, 2009.
Dissertao (Mestrado) Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia,
Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista.
O presente trabalho objetivou avaliar os efeitos de doses baixas do extrato de
pituitria eqina (EPE) no crescimento folicular, taxa de ovulao e de
recuperao embrionria em guas idosas. Doadoras de embrio (n=20) da
raa Quarto de Milha de um programa comercial com idade de 15 a 20 anos de
idade, foram utilizadas em 3 ciclos consecutivos. O primeiro e o terceiro ciclo
foi utilizado como grupo controle e entre eles o grupo tratado com EPE no
segundo ciclo. Em todos os ciclos, a ultrassonografia transretal dos ovrios foi
realizada diariamente aps aplicao de prostaglandina e monitorando os dois
maiores folculos. Durante os trs ciclos as guas foram inseminadas com
smen a fresco ou refrigerado do mesmo garanho e receberam uma aplicao
de acetato de deslorelina aps a deteco de pelo menos um folculo de 35 a
40 mm de dimetro. A recuperao embrionria foi realizada por lavado uterino
8 dias ps ovulao seguidas da administrao de prostaglandina. No ciclo
tratado, injees de EPE (7mg/IM/duas vezes ao dia) se iniciaram no dia 8
aps a ovulao at que um folculo pr-ovulatrio fosse observado. A
porcentagem de guas com mais de uma ovulao foi comparada pelo teste de
Fisher e a mdia do nmero de ovulaes e embries, assim como o dimetro
folicular, entre os ciclos foram comparados usando teste de Students. A
porcentagem de guas com mais de uma ovulao e o nmero de ovulaes
foram maiores (p<0,05) no ciclo tratado com EPE (65% das guas e 1,8
ovulaes) do que o grupo controle antes (5% e 1,0) e depois do tratamento
(5% e 1,0). O nmero de embries recuperados por ciclo tambm foi maior
(p<0,05) no grupo tratado com EPE (1,0/ciclo) comparado com os ciclos
controle (0,42/ciclo). Entretanto a taxa de embrio recuperado por ovulao foi
similar (p>0,05) entre os grupos controles (0,4 embries/ovulao) e o ciclo


vii
tratado (0,6 embries/ovulao). O tratamento com EPE possibilitou a
recuperao de embries com estgio de desenvolvimento mais compatveis
ao estgio embrionrio. A taxa de prenhez dos embries transferidos foi similar
entre os embries recuperados no ciclo tratado (14/20-70%) e nos ciclos
controle (9/17-55%). Baseado nos resultados do presente experimento,
conclumos que o tratamento com EPE foi capaz de aumentar a eficincia
reprodutiva de guas idosas doadoras de embrio, recuperando ao menos um
embrio por ciclo. O aumento nas taxas de recuperao embrionria nos ciclo
tratados com EPE aparentam estar mais relacionados ao nmero de ovulaes
por ciclo do que uma melhora no ocito ou maturao folicular.

Palavras-chave: gua, idade, ovulaes mltiplas, extrato de pituitria eqino,
transferncia de embries


viii
ABSTRACT
BONIN, B.F., Effect of equine pituitary treatment on ovarian response and
reproductive efficiency of old mares in a embryo transfer program.
Botucatu, 2009.
Dissertao (Mestrado) Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia,
Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista.
The present study aimed to evaluate the effect of the use of low doses of
equine pituitary extract (EPE) on follicular growth, ovulation rate and embryo
recovery rates in old mares. Embryo donors (n=20) of Quarter Horse breed
from a commercial embryo center aging 15 to 20 years old , were used during
3 consecutive cycles. The first and third cycles were use as control being the
EPE treatment performed on the second cycle. In all cycles transrectal
ultrasonography of the uterus and ovaries was performed daily after PG
injection to follow the development of the two largest follicles. During the 3
estrus mares were inseminated with cooled or fresh semen from the same
stallion and received an injection of deslorelin (1 mg i.m.) upon detection of at
least one follicle of 35 to 40 mm in diameter. The embryo flushings were
performed on day 8 post-ovulation and were always followed by administration
of PG. On the treated cycle, EPE injections (7mg twice daily i.m.) were started
on day 8 after ovulation until a pre-ovulatory follicle was observed. The
percentage of mares with more than one ovulation was compared by means
using Fischers test and the mean number of ovulations and embryos, as well
as follicular diameters, between cycles were compared using Students t test.
The percentage of mares with more than one ovulation and number of
ovulations were higher (p<0.05) in the EPE-treated cycle (65% of mares and
1.8 ovulations) than in the control cycle before (5% and 1.0) and after treatment
(5% and 1.0). Also the mean number of embryos recovered per cycle were
higher (p<0.05) on EPE treated cycle (1.0 /cycle) than in no treated cycles
(0.42/cycle). However the embryo rate per ovulation was similar (p>0.05)
between no treated cycles (0.4 embryo/ovulation) and treated cycle (0.6
embryo/ovulation). The treatment with EPE allowed the recovery of embryos in


ix
stage of development more compatible with the embryonic age. The pregnancy
rates of the transferred embryos was also similar between embryos recovered
on treated (14/20-70%) an non treated cycles (9/17 -55%). Based on the results
of the present experiment we can concluded that EPE treatment was able to
increase the reproductive efficiency of old embryo donor mares, providing the
recovery of at least one embryo on average per cycle. The improvement on
embryo recovery rates on EPE treated cycle seems to be more related with the
increase in the number of ovulations per cycle than with improvement on oocyte
or follicle maturation.

Key words: mare, age, multiple ovulations, equine pituitary extract, embryo
transfer.
,QWURGXomR

1
1. INTRODUO
Fmeas mamferas apresentam um declnio gradativo na capacidade
reprodutiva com o avanar da idade. Diferente de outros animais domsticos,
as guas com o avanar da idade permanecem como parte da populao de
reprodutoras ativas nos haras.
O declnio da fertilidade relacionado idade em fmeas tem pelo menos
dois componentes bsicos: a diminuio da taxa de concepo/prenhez por
ciclo e um aumento das taxas de morte embrionria e abortamento nestes
animais.
As guas so mais valiosas com sua prognie comprovada ou por seu
maior tempo destinado a vitrias em competies, isso geralmente ocorre
quando a gua possui aproximadamente 15 anos de idade, coincidindo com a
queda em seu ndice de fertilidade. Havendo assim um grande interesse dos
criadores de cavalo em manter estas reprodutoras de idade superior aos 15
anos na reproduo, justificado nos valores de venda de seus produtos.
Visando um maior aproveitamento e intensificao do ritmo do
melhoramento gentico e da eficincia reprodutiva, se faz necessrio
utilizao de biotecnologias reprodutivas, desta forma a transferncia de
embries busca suprir a demanda existente em relao a produtos oriundo de
guas mais velhas com alto potencial gentico.
Um dos problemas que interfere na eficincia reprodutiva de programas
de transferncia diz respeito ao elevado percentual de guas idosas existentes
nestes programas, pois sabidamente estas guas tm uma eficincia
reprodutiva mais baixa do que guas jovens.
As guas idosas ainda podem apresentar uma maior porcentagem de
deformidades anatmicas, prejudiciais para reproduo como m coaptao e
conformao de vulva. Alm de serem mais susceptveis a endometrite ps-
cobertura, pela reduo das contraes miometriais, sistema linftico
deficiente, tero mais penduloso e a incompetncia de crvix.
A fmea eqina por natureza monovular, o que significa dizer que a
cada ciclo estral, geralmente, uma nica ovulao ir ocorrer. A possibilidade
de se incrementar o nmero de ovulaes no ciclo estral da gua traz consigo
,QWURGXomR

2
potenciais benefcios, como o aumento no nmero de ocitos disponveis para
aplicao de diferentes tcnicas de reproduo assistida e aumento no nmero
de embries recuperados em uma nica colheita, com conseqente reduo
dos custos do programa de transferncia de embries.
A ocorrncia de ovulaes duplas espontneas em guas um fator que
incrementa a recuperao de embries. Assim sendo, alguns grupos de
pesquisa tm se dedicado ao estudo dos fatores responsveis pela baixa
recuperao embrionria em guas superovuladas e ao desenvolvimento de
protocolos que driblem esses fatores, que produzam menos efeitos adversos e
promovam estimulao moderada e no excessiva dos ovrios.
Farinasso (2004) utilizou doses de EPE mais baixas do que as
tradicionalmente utilizadas para superovulao e obteve aumento no nmero
mdio de ovulaes, provocado pela maior incidncia de ovulaes duplas e
triplas e de embries recuperados em guas. Por outro lado Jacob, 2008
demonstraram que guas idosas apresentam baixo nveis de hormnio
luteinizante (LH) srico no perodo periovulatrio.
O referidos trabalhos nos motivaram a investigar a aplicabilidade de uma
baixa dose de EPE para incrementar o nmero de ovulaes e embries
recuperados em guas, partindo da hiptese de que a aplicao exgena de
EPE poderia atuar beneficamente aumentando o nmero de ovulaes por
ciclo bem melhorando a maturao folicular e ou oocitria por levar a um
aumento dos nveis sricos de LH.
5HYLVmRGH/LWHUDWXUD

3
2. REVISO DE LITERATURA
Na industria eqina em geral e entre os criadores principalmente, existe
um mercado interessado em aumentar a eficincia reprodutiva de seus animais
mais valiosos, as fmeas eqinas obtm seu maior valor econmico quando
sua prognie se destaca. Isto ocorre na gua quando passado sua vida mdia
reprodutiva, coincidindo com a diminuio dos ndices de fertilidade, a partir de
15 17 anos de idade (LOSINNO et. al, 2000).


Fonte : LOSINNO,2006

Figura 1 Porcentagem de guas em atividade reprodutiva natural de acordo
com idade, adaptado por BAKER, 1993.

A diminuio da eficincia reprodutiva com o avanar da idade fica
evidente quando avaliadas as taxas de nascimentos com idade materna aps
14 16 anos e aumento da morte embrionria precoce em guas idosas (BALL
et al., 2000, BAKER, 1993).
As reprodutoras mais idosas (acima 16 anos), representam de 10 25%
das guas que esto em um programa de reproduo (BAKER, 1993).
grande a diferena da eficincia reprodutiva entre guas idosas e jovens,
quanto a prenhez/ciclo (32% e 65 % respectivamente), nascimentos (54% e
5HYLVmRGH/LWHUDWXUD

4
82%, respectivamente) e perda embrionria (29% e 7% respectivamente)
(VANDERWALL, 1989).

Fonte: LOSINNO,2006

Figura 2 Taxa de pario em guas de acordo com idade, adaptado por
BAKER, 1993.

Corroborando com estes trabalhos, em um experimento com guas
pnei, cobertas com o mesmo garanho, guas jovens (5 7 anos) e idosas (>
15 anos), obtiveram respectivamente, 100% de prenhez no dia 12 vs 32%, a
morte embrionria no d50 foi de 62% nas guas idosas contra 11 % nas jovens
(CARNEVALE & GUINTER, 1992).
Esta diminuio da eficincia reprodutiva, demonstrada por menores
ndices de prenhez e menores taxas de nascimentos, pode estar relacionada,
como em outros mamferos a disfunes neuro-endcrinas, perda gestacional
ou uma combinao de todas elas. (BALL et al., 2000).

2.1. Efeito da senilidade no ciclo estral

A divergncia em trabalhos muito grande relacionado idade, onde
cada pesquisador seleciona e classifica as guas nas faixas etrias como
jovens, intermedirias e idosas, dificultando a comparao entre os grupos.
5HYLVmRGH/LWHUDWXUD

5
Conforme publicado pelos seguintes autores: Carnevale et. al, (1993): 5-7 anos
nas jovens, 15-19 anos idade intermediria e > 20 anos nas idosas; Vanderwall
et. al,(1993) : 16 20 anos nas guas idosas; Carnevale & Ginther (1995): 5
7 anos nas jovens e > 15 anos nas idosas; Fleury et al (1989) : jovens < 3
anos, intermedirias de 3 18 anos e idosas > 18 anos; Vogelsang &
Vogelsang (1989): jovens de 2 8 anos, intermedirias de 9 17 anos e idosas
de 18 a 28 anos; Alonso et. al.(2005) : jovens de 2 17 anos e idosas de 18 -
26 anos; Losinno (2006) :jovens de 3 - 8 anos e idosas >15 anos e Jacob
(2008) : jovens de 4 a 6 anos, intermediria de 10 a 14 anos e idosas >18
anos; Rambags et. al. (2008) jovens < 12 anos e idosas > 15 anos.
Originalmente, as guas tm aproximadamente 40.000 folculos
primordiais e ciclam continuamente por 25 anos. Presumivelmente o pool de
folculos primordiais finito principalmente, por no ter sido citado, at o
presente momento, a ocorrncia de mitoses em oognias de potras ou guas
(GINTER, 1993). A gua polistrica estacional, com ciclos reprodutivos
regulares durante o perodo de maior intensidade de luz e intervalos
transicionais no incio e fim do perodo ovulatrio da estao (CARNEVALE,
2008).
O efeito da idade sobre a atividade ovariana tem sido caracterizado
tambm pelo decrscimo do volume ovariano, pela reduo do nmero de
folculos antrais e pela menor vascularizao do estroma intra-ovariano em
mulheres idosas (KUPESIC et al., 2003). A disfuno ovariana tambm tem
sido responsabilizada como causa do decrscimo da eficincia reprodutiva em
guas idosas (WESSON & GUINTER, 1981).
Com o avanar da idade mudanas no ciclo estral ocorrem refletindo
alteraes na funo ovariana. Caractersticas comparadas no ciclo de guas
de meia idade (15 -19 anos) e guas jovens (5 7 anos) mostraram que a fase
luteal no diferiu , porm houve reduo de 15 % da fase folicular , 9,4 dias das
guas jovens contra 8,0 dias das guas de meia idade e as guas de meia
idade ovularam com folculos menores (CARNEVALE, 2008).
Diferenas significativas no foram encontradas na durao do ciclo
estral entre guas velhas e jovens da primeira para segunda ovulao
(VANDERWALL et al,.1993). Diferentemente Carnevale et al., (1993)
5HYLVmRGH/LWHUDWXUD

6
encontraram intervalos de 23,9 0,6, 23,0 0,8 e 26,5 0,7 dias para guas
jovens (5 - 7 anos), com idade intermediria (15-19 anos) e idosas (>20 anos)
respectivamente.
Em outro estudo Jacob (2008) relatou que a durao do perodo
interovulatrio para as guas jovens, de idade intermediria e idosas foram,
respectivamente 22,6 0,48, 22,4 0,38 e 23,9 0,55 dias (p= 0,0567). A
taxa de crescimento (mm/dia) nos 4 dias antes da ovulao nas guas jovens,
de meia idade e idosas foi de 3,0 ,18; 2,5 0,13 e 2,1 0,32
respectivamente.
Um prolongado perodo interovulatrio deveu-se ao prolongamento da
fase folicular e conseqentemente ao prolongado intervalo da induo da
lutelise at a ovulao, foi citado por Vanderwall et al,. (1993) em guas
velhas (16 a 20 anos), quando comparado ao das guas entre 10 e 11 anos.
Entretanto como todas as guas foram cobertas, os autores sugeriram que o
prolongado intervalo entre ovulaes pode ter se devido no deteco de
perda embrionria precoce nos animais idosos.
Em mulheres, observa-se que nos anos que antecedem o perodo de
transio para a menopausa, ocorrem ovulaes regulares, enquanto o ciclo
menstrual progressivamente encurtado. Fenmeno este que se deve ao
encurtamento da fase folicular em mulheres idosas (KLEIN et al., 2002).
guas com mais de 20 anos possuem significantemente um maior
intervalo interovulatrio, com fase luteal similar, mas com longa fase folicular
comparada s guas jovens. Fato associado com atraso de 3 dias para na
emergncia do folculo dominante e o crescimento mais lento do folculo
ovulatrio (CARNEVALE et al.,1993).

2.2. Alteraes hormonais e da dinmica ovariana relacionadas
senilidade

Na gua, a idade pode tambm afetar os nveis dos hormnios
reprodutivos (CARNEVALE et al., 1993), embora em bovinos os nveis de
gonadotrofinas no tenham sido afetados pela idade das vacas (MALHI et al.,
2005).
5HYLVmRGH/LWHUDWXUD

7
O efeito da idade sobre a concentrao plasmtica de progesterona no
foi observada durante os dois perodos ovulatrios em guas (VANDERWALL
et al., 1993). Diferentemente Carnevale et al., (1993) observaram maiores
concentraes de progesterona em guas idosas quando comparadas a guas
com idade intermediria.
Carnevale et al (1993) demonstraram o efeito da idade sobre a funo
do corpo lteo, sendo que o grupo de guas velhas apresentou concentrao
de progesterona mais elevada, aps a segunda ovulao, do que o grupo de
meia idade, embora o mesmo no tenha sido observado na primeira ovulao.
As concentraes sistmicas do hormnio folculo estimulante (FSH) e
a atividade folicular durante a fase luteal so maiores em guas de meia-idade
(de 15 a 19 anos), quando comparadas s de guas idosas (> 20 anos) ou
jovens (de 5 a 7 anos) (CARNEVALE et al., 1993).
No trabalho de Jacob (2008) no foi observado efeito de idade sobre as
concentraes de FSH, progesterona e estradiol sricos, em guas pnei com
meia-idade ou idosas.
Resultados observados por Carnevale et al.(1993), revelaram que a
concentrao de LH no diferiu entre as fmeas do grupo 1 (5 a 7 anos), e
grupo 2 (15 a 19 anos), embora o grupo 3 (20 anos ou mais) apresentou uma
baixa concentrao de LH durante um segundo perodo ovulatrio, porem, a
concentrao de LH foi suficiente para induzir a ovulao.
Um efeito significativo de grupo foi observado sobre o LH ao redor da
ovulao e no perodo periovulatrio (Figura 3). Assim, a concentrao de LH
em guas jovens ao redor da ovulao foi mais elevada do que em guas de
idade intermediria e nas idosas. Foram observados menores nveis sricos de
LH ao redor da ovulao ou seja 4 dias antes do momento ovulatrio, em
guas pneis com mais de 18 anos (JACOB,2008).
Elevadas concentraes de FSH, sem aumento na concentrao de LH,
aparentam ser os sinais iniciais da idade alterando a reproduo em guas
(SOULES et al, 2000). Estas alteraes poderiam estimular uma maior
proporo de folculos primordiais a entrar neste grande pool de folculos e
acelerar a depresso da reserva de folculos primordiais (RICHARDSON et
al.,1987).
5HYLVmRGH/LWHUDWXUD

8
O primeiro sinal da idade afetando a reproduo o encurtamento do
ciclo estral com elevadas concentraes de hormnio folculo estimulante
(FSH), seguido de ciclos longos com intermitentes ovulaes e elevadas
concentraes de FSH e LH, se cessando com a falha no crescimento folicular
com gonadotrofinas elevadas aparentemente pela falncia dos ovrios
(CARNEVALE et al.,2008).


LH
Dias da Ovulao
-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4
L
H

(
n
g
/
m
l
)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
Jovem
Mdia
Velha

FSH
Dias da ovulao
-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4
F
S
H

(
n
g
/
m
l
)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20

Fonte : JACOB, 2008

)LJXUD: FSH e LH centralizado para ovulaao



Segundo Carnevale et al (1993) a reduo da concentrao de LH
relatada em guas velhas pode ter sido devido ao prolongamento da fase
5HYLVmRGH/LWHUDWXUD

9
folicular. Diferentemente, Jacob, 2008, no encontrou aumento da fase
folicular, nem houve diferenas entre as faixas etrias quanto fase luteal.
Jacob (2008) verificou ainda um efeito de idade sobre a taxa de
crescimento folicular envolvendo o folculo dominante. Em guas velhas, a taxa
de crescimento folicular no diferiu das guas de meia idade, porm foi menor
(P<0,05) que nas guas jovens, mesmo no havendo diferenas entre ciclos
nem no dimetro do maior folculo.
Nas guas velhas os folculos subordinados ao redor da ovulao foram
menores do que as guas de meia-idade e jovens (JACOB, 2008). Muitas
guas idosas (> 20 anos) eram reprodutivamente ativas, porm, os ovrios de
poucas guas poderiam ser classificados como senescentes (Wesson &
Ginther, 1981).
Estudando as diferentes classes foliculares, Carnevale et. al, (1993),
encontraram efeito de idade significativo sobre o nmero de folculos de 16 a
20 mm de dimetro, bem como interao significativa para o dimetro do maior
folculo e o nmero de folculos de 11 a 15 mm, sugerindo que a maior
atividade folicular ocorreu no final fase ltea para o grupo de (15 a 19 anos) em
relao aos grupos de (5 a 7 anos) e grupo (20 anos ou mais), associada aos
nveis de FSH durante o meio da fase luteal.
Em outro estudo no foram observadas diferenas do nmero de
folculos ovarianos de 11 a 20 mm de dimetro, quando foram comparadas das
guas velhas e guas jovens, durante o perodo periovulatrio na primeira e
segunda ovulao (VANDERWALL et al., 1993).
Este autor tambm observou crescimento folicular mais rpido do
folculo dominante em guas jovens (5 e 6 anos), ao redor da ovulao de
quatro dias antes h quatro dias aps sua ocorrncia, o nmero de folculos
para as classes foliculares de 5,1 a 10, 10,1 a 15, 15,1 a 20 mm foi menor nas
guas velhas. Embora observadas algumas diferenas entre os grupos etrios
neste estudo, demonstrou-se que os hormnios reprodutivos e atividade
folicular so mantidos em guas velhas (JACOB, 2008).
A literatura tem registrado falha de ovulao associada idade. Em dois
experimentos foram documentadas que quatro guas idosas de um grupo no
ovularam durante um perodo de 60 e 90 dias na estao fisiolgica.
5HYLVmRGH/LWHUDWXUD

10
Entretanto, essas guas tinham 29, 30, 30 e 33 anos de idade enquanto tais
falhas no foram observados no grupo de guas jovens (VANDEWALL et al.,
1993).

2.3. Alteraes da genitlia externa e interna relacionadas idade

Outros estudos relacionando o efeito da idade sobre a capacidade
reprodutiva de fmeas tm focalizado anormalidades morfolgicas do trato
genital. Dentro deste contexto, tem-se concludo que anormalidades estruturais
so mais comuns em animais idosos. guas velhas podem ser afetadas por
problemas reprodutivos como outros que no esto relacionados ao eixo
hipotalmico hipofisrio gonadal como m conformao na genitlia externa,
patologias uterinas e tubricas. Relata-se tambm que a endometrite mais
freqente em guas velhas do que nas guas jovens (CARNEVALE, 2008).
Brinsko et al., (1996), fizeram avaliaes histopatolgicas na ampola e
stimo da tuba uterina de guas no encontrando diferenas entre as faixas
etrias (velhas e jovens) nem associao entre idade e incidncia de salpingite.
Clinicamente anormalidades no endomtrio so consideradas como
importantes fatores que resultam em baixa fertilidade em guas velhas.
Inmeros estudos caracterizaram mudanas degenerativas no endomtrio com
o aumento da idade da gua e como conseqncia, declnio da fertilidade.
Estas mudanas incluem endometrose, endometrite e alteraes vasculares
(BALL, 2000).
O sistema imune da gua sofre um declnio na sua eficincia com
avanar da idade, com reduo da habilidade do sistema de fornecer fagcitos,
imunoglobulinas e componentes do sistema complemento (MELO et al., 2008).
guas com idade avanada e susceptveis a endometrite demonstraram
menor capacidade de limpeza uterina, acumulando fluido uterino aps contato
com o espermatozide ou inoculao bacteriana durante o estro, sendo o
principal fator relacionado instalao da inflamao uterina (LEBLANC,
1997). O fluido pode estar presente devido a menor limpeza uterina seja
5HYLVmRGH/LWHUDWXUD

11
atravs do crvix, ou devido atividade diminuda dos vasos linfticos, em
funo de distrbio no mecanismo de contrao uterina (LEBLANC, 1994).
A razo da menor limpeza uterina no est bem estabelecida, mas
anormalidade miometrial, exausto do msculo liso uterino, sinais hormonais
inapropriados controlando as contraes uterinas e conformao perineal
anormal tem sido implicada como fatores etiolgicos (VANDERWALL &
WOODS, 2003).
Alteraes vasculares degenerativas na parede uterina de guas idosas
tambm tm sido descritas como fatores relacionados deficincia do
mecanismo de defesa uterino, porm no est determinado se essas
alteraes podem afetar o suprimento sanguneo miometrial. A posio do
tero mais voltado para o abdmen em guas idosas pode tambm alterar e
prejudicar a eficincia da limpeza uterina (TROEDSSON, 1999).
As guas mais velhas possuem uma maior incidncia de degenerao e
alteraes inflamatrias crnicas no endomtrio. Contudo, quando
morfologicamente normais embries em estgio de blastocisto transferidos nos
teros de receptoras jovens e idosas no obtiveram diferenas estatsticas de
prenhez (55% vs 45% respectivamente) no dia 12 da gestao. O impacto das
alteraes de endomtrio, seria em perodos mais avanados da gestao
destas guas com a maior taxa de morte embrionria nas receptoras mais
velhas (BALL, 2000).

2.4. Senilidade e qualidade de ocitos e embries

O declnio da fertilidade em guas velhas est bem documentado
nestes ltimos anos. Para as guas jovens e idosas respectivamente, a
concepo por ciclo foi de 57% vs 31% e taxa de nascimento 82% vs 48%
segundo Madill, 2002. Outros trabalhos relacionando idade com a fertilidade se
preocuparam em estudar ocitos de guas jovens (3-8 anos) e guas idosas
(> 15anos) de Aguilar et al.(2002) e Losinno, (2006). A queda na eficincia
reprodutiva de guas idosas (14 -16 anos) e os efeitos da idade da doadora
sobre a taxa de recuperao embrionria em eqinos (grupo de maior idade >
5HYLVmRGH/LWHUDWXUD

12
16 anos) foram tambm relatados por Ball et. al, (2000) e Duarte & Vieira,
(2005).
O decrscimo da eficincia reprodutiva foi demonstrado por baixas
prenhezes e menor produo de potros em guas de idade superior a 15 anos,
e como em outras espcies existe uma relao com a falha na ovulao, pobre
qualidade do ocito e morte embrionria (LOSINNO, 2006).
As causas deste declnio em guas idosas (acima de 20 anos),
aparentam estar relacionados com a prolongada fase folicular, ovulao
irregular, menor nmero de folculos, menor taxa de crescimento do folculo
ovulatrio e inatividade folicular que podem finalmente levar a alteraes na
maturao do ovcito (CARNEVALE et al., 1993).
A qualidade do ocito o fator primrio que afeta a performance
reprodutiva em guas e mulheres mais velhas, as causas e o momento que isto
ocorre no esto bem determinadas (SAUER et al., 1994, CARNEVALLE et
al, 2008).
A menor taxa de fertilidade em guas idosas pode resultar da fertilizao
de ocitos que no sofreram maturao meitica adequada ou porque os
ocitos de guas idosas podem ter maior prevalncia de complementos
cromossomais anormais (BRINSKO et al., 1994).
A deteriorao de ocitos associados com aumento da idade foi descrita
em muitas espcies. Examinando in vitro a maturao oocitria de guas
jovens e idosas, foi observado que ocitos de guas idosas possuem mais
falhas na maturao para metfase II comparado aos das guas jovens
(BRINSKO et al., 1995).
Utilizando modelos in vivo Carnevalle & Guinther,(1995), demonstraram
pela primeira vez na gua a relao entre idade cronolgica e danos a ocitos
e embries, ou seja prximo da ovulao e estgios iniciais de
desenvolvimento.
Estudos em guas sugerem que os problemas relacionados com a
reproduo de guas idosas ocorram no perodo de pr-blastocisto.
Comparando taxa de fertilizao entre guas jovens e idosas no revelou
diferenas significativas, porm mostrando tendncia (p<0,1) das guas jovens
5HYLVmRGH/LWHUDWXUD

13
com uma taxa maior de fertilizao de 96% contra 81% das guas idosas. As
taxas de recuperao embrionria no dia 4 ps-ovulao foram maiores no
grupo de guas jovens contra o grupo de guas idosas 92% contra 65%,
respectivamente. Embries que foram recuperados e transferidos para
receptoras jovens os ndices de prenhez foi de 84% para embries das guas
jovens e de 25% para os embries das guas idosas, tendo ocorrido uma
perda embrionria de 9 % nos embries provenientes de guas jovens contra
62% para os de guas idosas (BALL et al, 1989). Demonstrando que
infertilidade relacionada idade nas guas est alteraes estruturais ou
funcionais do perodo embrionrio inicial, intra-oviduto sendo menos importante
ambiente tubrico .
Carnevale et al.,(1993), descreveram uma taxa e fertilizao
significativamente maior em guas jovens versus guas idosas no dia 1,5 ps-
ovulao (88% em guas jovens contra 45% em guas idosas). Estes dados se
correlacionam com as menores taxas de recuperao embrionria em guas
doadoras jovens versus idosas (LOSINNO & ALVARENGA 2006).
Carnevale & Ginther (1995) reportando os resultados da transferncia
intrafalopiana de gametas (GIFT), com ocitos coletados de folculos pr-
ovulatrios, de guas velhas (> 20 anos) e jovens (6 10 anos) e somente os
ocitos maduros transferidos para receptoras jovens inseminadas, observaram
menores taxas de prenhez quando transferiram os ocitos de guas velhas
obtiveram 31% versus 92%. Confirmando assim o declnio da fertilidade com a
idade sendo o ocito um dos fatores primrios de reduo da fertilidade.
Existem diferenas significativas quanto ao desenvolvimento embrionrio
entre os grupos etrios e anomalias morfolgicas observadas nos ocitos de
guas idosas. Ainda os ocitos das guas mais velhas possuem muitas
anormalidades morfolgicas como: vescula ocupando > 50% do ooplasma,
diferentes formas, partes do ooplasma sem organelas e outras alteraes
(CARNEVALE et al., 1999).
As causas dos defeitos morfolgicos de ocitos de fmeas mais velhas
no esto bem determinadas. Supe-se que mutaes no cido
desoxirribonuclico (DNA) e a produo de espcies radioativas de oxignio
5HYLVmRGH/LWHUDWXUD

14
(ROS), afetam diretamente os ocitos, assim como os danos mitocndriais
tambm foram descritos (RAMBAGS et al.,2005).
Rambags et al, (2008), estudando atravs de PCR o nmero de cpias
de acido desoxirribonuclico (DNA) de ocitos e embries provenientes de
guas jovens (< 12 anos) e idosas (>15 anos), observaram que os embries de
guas jovens possuam mais mitocndrias do que seus ocitos, j nas guas
idosas a quantidade de mitocndrias no aumentou nos embries quando
comparado aos seus ocitos, indicando um atraso na replicao mitocondrial.
Segundo Losinno (2006) as guas velhas ovulam ocitos com
alteraes morfolgicas com mais freqncia com danos estruturais na
cromatina nuclear, diminuindo assim o ndice de fertilidade desta categoria.
Este autor comparando ocitos de guas velhas e jovens, obtidos aps recente
ovulao, obteve uma maior proporo de ocitos com citoplasma fragmentado
tendo sido estes valores de 18,5% em guas velhas e 5,6% em guas jovens.
Comparando o estagio de maturao nuclear (metfase x no determinado)
obteve em ocitos de guas jovens 71,4% metfase (I ou II) e 28,6% no
determinado e no grupo de guas velhas, 46,6% metfase (I ou II) e 53,4% no
determinado.
Os achados de Losinno (2006) so concordantes com os dados de
fertilidade em campo, monta natural, inseminao artificial ou transferncia de
embrio, onde se encontra a fertilidade mdia por ciclo nestas categorias de 70
% para guas jovens e 40% nas guas velhas (WOODS, 1989).
Segundo Ball, (2000) aps transferncia do embrio, quando este se
apresenta morfologicamente normal, a taxa de prenhez na receptora no diferiu
estatisticamente (55% versus 45% dia 12) entre guas receptoras jovens e
velhas, respectivamente nos dias 12 e 28 de gestao, o impacto das
alteraes uterinas seriam em perodos mais longos da gestao.
Vogelsang & Vogelsang (1989), observaram que de 624 tentativas de
coletas foram recuperados 271 embries, gerando 159 prenhezes. Quando
subdivididos em faixas etrias no grupo das guas de idade de 2-8 anos as
taxas foram 61% recuperao, 70 % de prenhez e 14 % morte embrionria
precoce. Por outro lado no grupo das guas de 9-17 anos foi obtido 51%
recuperao embrionria, 52% de prenhez e 24 % de morte embrionria. No
5HYLVmRGH/LWHUDWXUD

15
grupo das guas velhas de 18-28 anos foram obtidos 30% recuperao
embrionria, 56% prenhez e 30 % de morte embrionria.
Duarte & Vieira (2005), tambm observaram que a idade da doadora
alterou as taxas de recuperao embrionria em eqinos quando divididos em
grupos de diferentes idades, sendo 2-4 anos, 4-17 anos e >17 anos, as taxas
de recuperao obtidas foram, 81,1%, 73,2% e 53,3% respectivamente.
A literatura contraditria quanto possibilidade dos embries
coletados provenientes de guas velhas (acima 18 anos) levarem uma
gestao a termo. Onde alguns autores encontraram um ndice de prenhez
similar aos 15 e 50 dias (ALONSO et al., 2005). Hunt et al, (2005) observaram
queda na eficincia reprodutiva de guas idosas em programa de transferncia
de embries (tabela 1).

Idade Taxa de Recuperao Taxa de Prenhez Eficincia
4-7 (n=30) 81,5% 64,3% 52,4%
8-14(n=113) 101,6% 65,4% 66,4%
15-19(n=59) 70,4% 59,1% 41,6%
>20(n=10) 46,2% 54,2% 25%
Adaptado de HUNT et al. 2005
Tabela 1 Efeito da idade da gua doadora nas taxas de recuperao
embrionria*

Um estudo demonstrou que blastocistos provenientes de guas idosas
apresentavam menos clulas totais, menores escores de qualidade e tendiam a
ter menor dimetro. Nele foram sugeridos que os defeitos de desenvolvimento
do embrio ou ambiente do oviduto podem explicar a falha no estabelecimento
da gestao em guas idosas e subfrteis (CARNEVALE et al., 1993).
Embries de guas velhas possuem menos blastmeros e um escore de
classificao mais pobre que os embries de guas jovens (BRINSKO et al.,
1994).
consenso que o envelhecimento reprodutivo associado idade est
relacionado a uma perda da viabilidade de ocitos e embries. Em bovinos
entre os sinais mais evidentes est no aumento da quantidade de
ovcitos/embries com anomalias cromossmicas, ativao partenognica
5HYLVmRGH/LWHUDWXUD

16
espontnea, fragmentao citoplasmtica associada a apoptose dos ovcitos,
polispermia, desenvolvimento anormal dos embries e aumento da morte
embrionria precoce (ARMSTRONG, 2001).
Segundo Carnevale (2008) a idade associada s alteraes de
fertilidade e atividade cclica na gua tm a provvel causa a falha na atividade
ovariana. O declnio da fertilidade est correlacionado com a reduo da
viabilidade do ocito podendo ser resultado de seu tempo em estgio meitico
nos ovrios por dcadas.
2EMHWLYRV

17
3. OBJETIVOS
O presente trabalho teve como objetivo avaliar o efeito do tratamento
com extrato de pituitria eqina (EPE) na resposta ovariana e na eficincia
reprodutiva de guas idosas em programa de transferncia de embries.
0DWHULDOHPHWRGR

18
4. MATERIAL E MTODO
4.1. Perodo e Local do Experimento
O presente trabalho foi realizado durante a estao reprodutiva
2006/2007 e 2007/2008, mais especificamente entre os meses de setembro a
janeiro dos anos citados, nas dependncias da Central de Reproduo de
Eqinos Guilherme Gregolin Services Center Inc., localizada no municpio de
Tatu, So Paulo.
4.2. Animais e Grupos Experimentais
Foram utilizadas 20 guas doadoras de embrio da raa Quarto de
Milha, com idade entre 15 e 20 anos (mdia de 16,9 anos) e pesando 450 a
550 Kg. Todas as guas utilizadas estavam em plena atividade reprodutiva.
As guas doadoras eram mantidas em piquetes de capim coast
cross (Cynodon dactylon) e capim-transvala (Digitaria decumbens) com acesso
a gua e sal mineralizado vontade e 2 kg de rao comercial peletizada
prpria para eqinos duas vezes ao dia.
4.3. Delineamento Experimental
Aps terem sido monitoradas e inseminadas durante o estro
imediatamente anterior ao incio do experimento, as guas doadoras foram
submetidas ao procedimento de colheita de embrio no oitavo dia ps-
ovulao. Nesse mesmo dia, as mesmas recebiam, por via intramuscular, 7,5
mg de dinoprost-trometamina e eram includas no grupo experimental. Trs
ciclos estrais consecutivos foram monitorados em todas as guas pertencentes
ao grupo experimental, de modo que o primeiro e o terceiro ciclo estudado
serviram de controle e no segundo ciclo foram realizados os tratamentos a
base de extrato de pituitria eqina (EPE). Dessa forma, cada animal utilizado
foi o seu prprio controle. As colheitas de embrio eram sempre seguidas da
administrao de agente luteoltico.

0DWHULDOHPHWRGR

19
4.3.1 Exames ultra-sonogrficos
Nos trs ciclos estudados, desde o dia 10 (dia 0 = ovulao) dois
dias aps a colheita do embrio (dia 8), at a ovulao seguinte, as guas
doadoras tiveram a atividade ovariana e condio uterina monitoradas
diariamente por ultra-sonografia transretal com auxlio de um aparelho
equipado com um transdutor linear de 6 a 8 MHz (Pie-Medical 485, Holanda).
Os dimetros dos maiores folculos foram determinados por meio da mdia
aritmtica das duas maiores distncias transversais do antro folicular em uma
nica imagem congelada no monitor do aparelho de ultra-sonografia
(GINTHER, 1995) em todos os grupos.
Os folculos foram mensurados (altura e largura) e posteriormente
desenhados em ficha prpria de acordo com suas posies nos ovrios, sendo
usado como referncia a presena do corpo lteo e outros folculos a fim de
manter-se a identidade dos dois maiores folculos. Quando observados mais
de um folculo dominante foi feita mdia entre eles para comparaes futuras.
4.3.2 Colheita de Smen, Inseminaes e Induo das Ovulaes
Smen proveniente de um nico garanho de fertilidade comprovada
foi utilizado para as inseminaes. Aps a colheita, realizada com auxlio de
uma gua em cio, por meio de vagina artificial prpria para garanhes, o
smen era filtrado para a remoo da frao gelatinosa. A concentrao
espermtica era determinada com auxlio de uma cmara de Neubauer, a
motilidade espermtica avaliada em microscpio de luz e o smen diludo na
concentrao de 25 50 milhes de espermatozides por mililitro (mL), em
meio diluente base de leite desnatado Botu-smen (Biotech Botucatu
Botucatu - SP)
Durante o estro, aps a deteco de pelo menos um folculo com 35 mm
de dimetro, as guas eram inseminadas com no mnimo 1.000 x 10
6

espermatozides mveis. As inseminaes foram repetidas a cada 48 horas,
quando necessrio, at que fosse detectada a ovulao. As ovulaes foram
induzidas por meio da administrao de 1 mg de acetato de deslorelina
0DWHULDOHPHWRGR

20
intramuscular, mediante a deteco de pelo menos um folculo ovariano com
35 a 40 mm de dimetro. Vale ressaltar que os protocolos de inseminao
artificial e induo das ovulaes foram os mesmos para os ciclos controle e
tratado.
4.3.3 Tratamentos
Passado o ciclo controle e finalizada a colheita e a avaliao do
embrio no oitavo dia ps-ovulao, era iniciado o tratamento para induo de
ovulaes mltiplas a base de extrato de pituitria eqina (EPE). Esse
tratamento foi administrado do dia 8 at o dia anterior induo das ovulaes
por meio da administrao de 1mg de acetato de deslorelina.
Os animais pertencentes ao Grupo EPE (n=20) receberam 7,0 mg
de extrato de pituitria eqina por via intramuscular duas vezes (entre 7 e 8
horas da manh e nova aplicao entre 5 e 6 horas da tarde) ao dia durante o
perodo especificado. O extrato de pituitria utilizado no presente trabalho foi
produzido no Laboratrio de Reproduo Animal do Departamento de
Reproduo Animal e Radiologia Veterinria, FMVZ, Unesp-Botucatu, SP,
Brasil, conforme descrito por GUILLOU e COMBARNOUS (1983).
4.3.4 Colheita, Manipulao e Transferncia dos Embries
Os embries foram recuperados no oitavo dia ps-ovulao por meio
de lavagem uterina usando trs litros de soluo de Ringer com lactato, a 35
C, conforme descrito (ALVARENGA et. al., 1993). Aps a identificao e
classificao quanto ao grau de desenvolvimento do embrio, o mesmo era
submetido dez passagens de meio e mantido por menos de uma hora em
meio de manuteno filtrado at o momento da transferncia.
Os embries foram transferidos atravs do mtodo no-cirrgico
(transcervical) para receptoras ciclantes que haviam ovulado entre 5 e 8 dias
antes da transferncia. Resumidamente, os embries eram acondicionados
entre colunas de meio de manuteno e ar no interior de uma palheta de 0,25
ou 0,5 ml e colocadas no inovulador. O inovulador era recoberto ento por
0DWHULDOHPHWRGR

21
uma camisa sanitria plstica. Antes da transferncia as receptoras tinham a
cauda enfaixada, o contedo fecal retirado da ampola retal e as regies
perivulvar e perianal higienizadas. O inovulador contendo o embrio era
conduzido atravs da crvix da receptora, a camisa sanitria rompida e o
embrio depositado lentamente no corpo do tero.
4.3.5 Diagnstico de Gestao
As receptoras foram examinadas por meio de ultra-sonografia
transretal, quatro a seis dias aps a transferncia do embrio para se
determinar presena ou no de vescula embrionria.
4.4 Anlise Estatstica
Valores percentuais para variveis qualitativas foram comparados
pelo teste exato de Fischer. Foi considerada diferena significativa quando
p<0,05. Variveis quantitativas (nmero de ovulaes e embries por ciclo,
durao da fase folicular e crescimento mdio dirio do folculo dominante)
foram comparadas utilizando-se anlise de varincia (ANOVA) seguido quando
necessrio pelo teste Tukey a 5% de significncia.
5HVXOWDGRV

22
5. RESULTADOS
O percentual de guas com mltiplas ovulaes no ciclo pr-
tratamento (G1), ciclo tratado com EPE (G2) e ciclo ps-tratamento (G3) foi de
5% (1/20), 65% (13/20) e 5% (1/20), respectivamente (p<0,05).Em nenhum dos
ciclos foi observado falha da ovulao ou mesmo desenvolvimento de folculos
hemorrgicos. Nos ciclos com mais de uma ovulao as mesmas aconteceram
em intervalo de tempo mdio de 24 a 48 horas entre as ovulaes.
O tratamento com EPE (G2) resultou em um maior nmero de
ovulaes e embries por ciclo (p<0.05) em comparao aos ciclos controles
no pr-tratamento (G1) e ps-tratamento (G3). No foram contudo observadas
diferenas significativas (p>0,05) no nmero de ovulaes entre os grupos
controle. Da mesma forma no foram encontradas diferenas significativas
quando comparado o nmero de embries recuperados por ovulao entre G1,
G2 e G3 (p>0,05). O nmero de ovulaes por gua foi significativamente
superior nos ciclos tratados com EPE (G2) quando comparados aos obtidos
nos grupos controle (G1 e G3). O tratamento com EPE tambm resultou em um
maior nmero de embries recuperados por gua por ciclo (p< 0,05) em
comparao aos controles (G1 e G3). Os resultados esto sumarizados na
tabela 2 e particularizados nas tabelas 3 e 4.
Tabela 2 : Nmero mdio de ovulaes por ciclo, nmero mdio de embries
por ciclo e nmero mdio de embries por ovulao.
Pr-Tratamento
(G1)
Tratamento
(G2)
Ps-Tratamento
(G3)
Ovulaes/ciclo 1,05 1,8
b
1,05
Embries/ciclo 0,45 1,0
b
0,4
Embrio/ovulao 0,4 0,6 0,4

5HVXOWDGRV

23
Tabela 3: Nmero de ovulaes por gua no ciclo pr-tratamento, ciclo tratado
com EPE (7 mg b.i.d) e no ciclo ps-tratamento.
Animal Pr Tratamento Tratamento Ps Tratamento
01 1 1 1
02 1 2 1
03 1 3 1
04 1 1 1
05 1 3 1
06 1 2 1
07 1 1 1
08 1 2 1
09 1 2 1
10 1 2 2
11 1 2 1
12 1 2 1
13 1 1 1
14 1 2 1
15 1 3 1
16 2 1 1
17 1 2 1
18 1 1 1
19 1 1 1
20 1 2 1
1,05 1,8
b
1,05
5HVXOWDGRV

24
Tabela 4: Nmero de embries recuperados por gua no ciclo pr-tratamento
(G1), no ciclo tratado com EPE (7 mg b.i.d) e no ciclo ps-tratamento (G3).

Animal Pr-Tratamento Tratamento Ps-Tratamento
01 0 0 0
02 0 1 1
03 0 0 1
04 1 1 0
05 0 0 0
06 0 1 0
07 1 1 0
08 1 1 1
09 0 2 1
10 0 2 1
11 1 2 0
12 0 1 1
13 0 1 0
14 0 2 0
15 1 2 1
16 2 0 0
17 1 1 0
18 0 0 0
19 0 0 0
20 1 2 1
0,45 1,0
b
0,4
5HVXOWDGRV

25
Os ciclos que no se obteve embrio recuperado ou lavado negativo
foram de 60% (12/20), 30% (06/20) e 60% (12/20) nos grupos G1, G2 e G3
respectivamente, mostrando tendncias de significncia do grupo tratado com
EPE em relao aos grupos controle (p=0,11). Quando agrupamos os grupos
controle (G1 + G2) em comparao ao grupo tratado com EPE (G1) obtivemos
uma diferena significativa de lavados negativos (p<0,05) dos grupos controle
60% (24/40) contra 30% (6/20) do grupo tratado.
Conforme mostra a tabela 5, o tratamento com baixa dose de EPE
(G2) resultou em um encurtamento da fase folicular (diminuio do nmero de
dias) da aplicao da prostaglandina (D8) at 1 dia antes da ovulao (p< 0,05)
diferindo do ciclo controle ps-tratamento (G3). Mas no houve diferena
significativa entre o grupo tratado (G2) e o grupo pr-tratamento (G1).

Tabela 5: Mdia em dias da durao da fase folicular da aplicao da
prostaglandina (D8) at a ovulao por gua nos grupos G1, G2 e G3.

Pr- Tratamento (G1) Tratamento (G2) Ps-Tratamento (G3)
10,2 1,7
ab
9,4 1,9
a
10,9 1,4
b


No foram observadas diferenas estatsticas (p>0,05) quanto ao
crescimento folicular mdio (mm) do folculo dominante do dia D10 at oum dia
antes da ovulao nos diferentes grupos. Tendo sido de 19,7 6,3 mm, 21,4
5,4 mm e 22,9 4,5 mm, os valores mdios de crescimento para G1, G2 e G3.
Da mesma forma no foram observadas diferenas significativas, havendo
contudo tendncia significncia (p=0,1) ser maior a taxa de crescimento
dirio do folculo dominante no grupo tratado. Onde observamos uma taxa de
crescimento mdio dirio de foi de 2,5 0,7 mm, 2,8 0,6 mm e 2,6 0,4 mm
no G1, G2 e G3 respectivamente. Em 40 % (8/20) dos ciclos tratados com EPE
e 15 % (6/40) dos ciclos no tratados observou-se crescimento folicular mdio
dirio a 3mm (p<0,05).
5HVXOWDGRV

26
O tratamento com baixa dose de EPE resultou em um maior nmero
de embries (p<0.001) oito dias aps a ovulao com grau de desenvolvimento
condizente com idade gestacional em D8 (blastocistos ou blastocistos
expandidos) ou mrulas e blastocistos iniciais em D6 nas ovulaes
assincrnicas nas guas com mltiplas ovulaes. Por outro lado no foram
observadas diferenas significativas no grau de desenvolvimento dos embries
recuperados entre os grupos controle (Tabela 6).
Tabela 6: Condizncia entre o estgio de desenvolvimento para cada
embrio recuperado e o dia da recuperao (D8 do ciclo), no G1, G2 e G3.

Grau de
Desenvolvimento
Pr-Tratamento
(G1)
Tratamento
(G2)
Ps-Tratamento
(G3)
No Condizente 44,45%(4/9) 0%(0/20)
b
75%(6/8)
Condizente 55,55%(5/9) 100%(20/20)
b
25%(2/8)

Conforme mostra a tabela 7, o tratamento com baixa dose de EPE
(G2) no foram observadas uma maior taxa de prenhez (70 %), quando
comparado aos grupos controle no pr-tratamento (G1) e ps-tratamento (G3),
55,5% e 50% respectivamente (p=0.07). No houve diferenas significativas
(p>0,05) do nmero de prenhezes obtidas pelos embries recuperados do
grupo tratado com EPE (G2) em comparao aos controles (G1 e G3).
Tabela 7: Taxa de prenhez obtida por embries recuperados no G1, G2 e G3

Pr-Tratamento (G1) Tratamento (G2) Ps-Tratamento (G3)
Prenhez 55,5% (5/9) 70,0%(14/20) 50,0%(4/8)

Conforme mostra a tabela 8, no tratamento com EPE foram
observadas diferenas significativas (p<0,01), para melhoria da taxa de
prenhez por tentativa de transferncia de embrio em comparao aos
controles no pr-tratamento e ps-tratamento.
Tabela 8: Taxa de prenhez por ciclo obtidas no G1, G2 e G3.
5HVXOWDGRV

27

Pr-Tratamento
(G1)
Tratamento
(G2)
Ps-Tratamento
(G3)
Prenhez/Ciclo 25% (5/20) 70%(14/20)
b
20%(4/20)

A eficincia do programa (taxa de recuperao embrionria x taxa de
prenhez) entre ciclos tratados e ciclos no tratados foi de 21.8% ( 42% x 52%)
para os grupos controle (G1 e G2) e de 70% (100% x 70%) para o grupo
tratado (G2) com diferena significativa (p<0,05).
A taxa de morte embrionria precoce aos 50 dias nas guas tratadas
com EPE (G2) foi de 7,1% (01/14), no diferenciando ( P>0.05) dos grupos
controle que foi de 20% (01/05) no G1 e 0% (0/04) no G3.
'LVFXVVmR

28
6. DISCUSSO
No presente trabalho o tratamento com EPE foi capaz de estimular
com eficincia a atividade ovariana em guas idosas cclicas, onde o
percentual de guas com mltiplas ovulaes no ciclo tratado com EPE (G2) foi
de 65% (13/20) enquanto os grupos controles no pr e ps-tratamento foram
de 5% (1/20) e 5% (1/20) respectivamente. Valores diferentes, mais altos, so
relatados por autores como Douglas (1979) que relatam 75% de resposta nas
guas com tratamento superovulatrio, Farinasso (2004) descreve uma
porcentagem de 76,9% de mltiplas ovulaes utilizando doses de 4 e 6 mg
uma vez ao dia de EPE em guas ciclantes e Carmo (2007) 84% de resposta e
outro valor mais baixo como de 30,8% Rocha Filho (2004) estes trabalhos
foram realizados com guas jovens e frteis. Em nenhum dos ciclos dos grupos
controle ou grupo tratado foi observado falha da ovulao ou mesmo
desenvolvimento de folculos anovulatrios, o que seria esperado segundo
alguns autores tanto para guas superovuladas, (DIPPERT et. al, 1994; LAPIN
& GINTHER, 1997) como em guas idosas (NEWCOMBE et al.,1997; McCUE
& SQUIRES, 2002).
No presente trabalho obtivemos em mdia 1,0 embrio por ciclo,
mdia superior aos grupos controle que tiveram 0,45 e 0,4 embrio por ciclo. A
mdia do grupo tratado foi muito prxima ao obtido no experimento
desenvolvido por Carmo et. al, (2003) trabalhando com superovulao em
guas jovens, que obteve em mdia 1,1 embrio por ciclo , havendo contudo
este autor utilizado uma dose mais alta de EPE (25 mg a cada 12 horas) que a
do presente trabalho onde este autor obteve uma taxa de recuperao
embrionria por ovulao de 30%, mais baixa que a do presente experimento.
Outros trabalhos com mltiplas ovulaes relatam a recuperao de
aproximadamente 1 a 2 embries por ciclo (DOUGLAS, 1979; WOODS &
GUINTER, 1984; McCUE, 1996, MACHADO, 2003; FARINASSO, 2004).
Considerando mdia de recuperao embrionria do grupo controle (0,45 e
0,4) pode-se verificar que estas foram menores que as mdias esperadas (0,6
embries/ciclo) em programas de transferncia de embries segundo
Alvarenga et. al, (2008) e de 0,7 reportada por Hunt et. al, (2005) em guas de
'LVFXVVmR

29
15 19 anos e similares s reportadas por Vogelsang & Vogelsang, (1989) que
obteve 51% de recuperao em guas de 9-17 anos. Contudo superior as
relatadas por Fleury et al, (1989), relatando uma taxa de 24,1 % em guas com
mais de 18 anos.
Analisando o nmero de embries recuperados por ovulao
obtivemos 0,4 (40%) nos grupos controle e 0,6 (60%) no grupo tratado, o que
no diferiu significativamente . Estes dados so similares aos descritos por
Woods & Ginther (1984) em guas jovens tratadas com EPE para mltiplas
ovulaes onde relataram uma taxa de 0,6 e 0,7, no grupo tratado e no grupo
controle, respectivamente. Mas superiores quando comparados aos trabalhos
de Alvarenga, (2001); Scoggin et al, (2002); Carmo et. al., (2003); Machado et.
al, (2003), onde obtiveram 49%, 43,2%, 30,2% e 26% respectivamente.
Estando de acordo com o trabalho de Carmo et. al., (2005) que observou ser
maior taxa de recuperao por ovulao em guas com menos de 3 ovulaes
por ciclo.
Comparando os lavados que no recuperaram embries, ao
agruparmos os grupos controle (G1 + G3) em comparao ao grupo tratado
com EPE (G2) obtivemos 60% (24/40) de lavados negativos nos grupos
controle contra 30% (6/20) no grupo tratado diferindo estatisticamente. As
guas do grupo tratado tiveram uma taxa de lavados negativos similares ao
reportado na literatura para guas no superovuladas reprodutivamente jovens
e normais. E inferiores aos dados apresentados por Farinasso (2004) no
trabalho com mltiplas ovulaes em guas jovens que obteve 45% de lavados
negativos e Machado et al (2003) 70% de lavados negativos. Mas superiores
ao trabalho de Adans et al (1993) que obteve 24% de lavados negativos em
guas jovens.
Das reprodutoras analisadas no presente trabalho, quatro delas
(nmero 01,05,18 e 19) no obtivemos nenhum embrio coletado, mesmo com
o tratamento. Estas guas tambm no foram responsivas as doses de 7 mg
b.i.d de EPE, suas idades so de 15, 18, 19 e 19 anos. Sugerindo que outros
fatores ligados infertilidade como obstruo tubrica, conforme relatado por
'LVFXVVmR

30
Allen (2008), desta forma o transito dos gametas e /ou embries estaro
impossibilitados por um aspecto mecnico.
Os dados na literatura so variados quando avaliado o perodo em
dias entre a aplicao de prostaglandina at a primeira ovulao. No presente
trabalho o tempo decorrido entre a aplicao de prostaglandina e primeira
ovulao observada foi de 9,4 dias para o grupo tratado com EPE, e de 10,2 e
10,9 dias nos grupos controle pr (G1) e ps-tratamento (G3) respectivamente.
Farinasso (2004) observou intervalo de tempo inferior ou seja de 7,4 dias no
tratamento com 4mg e 5,6 dias com 6mg, resultados semelhantes a Dippert et.
al, (1994) que relataram 7,0 dias, trabalhos estes que selecionaram de acordo
com a populao de folculos ovarianos (menores que 25 mm), para as guas
jovens tratadas e um perodo de 8,3 dias de Alvarenga et. al, (2001). Entretanto
outro trabalho relata um perodo mais longo de 10,2 dias de Rosas et al (1998).
Em ciclos no estimulados exogenamente a maioria dos autores relata uma
mdia de 9 dias entre aplicao de prostaglandina na fase intermediaria do
diestro e ovulao, valor este que no difere dos obtidos no presente trabalho.
Analisando o crescimento folicular mdio (mm) do folculo dominante
do dia D10 at 1 dia antes ovulao nos diferentes grupos obtivemos 19,7 mm,
21,4 mm e 22,9 mm os valores mdios de crescimento para G1, G2 e G3, no
foram observadas diferenas significativas entre eles, quando observado dois
ou mais folculos era feita mdia entre eles.
Da mesma forma no foram observadas diferenas significativas,
havendo contudo tendncia significncia (p=0,1) nas mdias de crescimento
dirio do folculo dominante nos diferentes grupos que foram de 2,5mm, 2,8
mm e 2,6 mm no G1, G2 e G3 respectivamente.. As taxas de crescimento
folicular nos trabalhos com mltiplas ovulaes mostraram-se dentro da faixa
de variao tambm observadas por outros autores como: variaes de 2,6
mm em mdia obtidos por CARMO, (2007) 2,1 mm em guas Pneis
(PALMER, 1993) e 3,0 mm observados por Ginther (1986) em guas no
superovuladas e 2,25 mm/dia relatado por (GINTHER et al, 1992 e MACHADO,
2003) tambm em guas no tratadas.
'LVFXVVmR

31
Quando analisado individualmente foi observado no grupo tratado
com EPE um maior percentual de guas com folculos com taxa de
crescimento igual ou maior a 3,0 mm (40% x15%). Jacob, (2008) observou que
nos 4 dias anteriores a ovulao a taxa de crescimento do folculo dominante
das guas jovens se aproximou de 3,0 mm por dia tendo sido superior as taxas
de crescimento folicular observadas em guas de meia idade (2.5 mm/dia) e
idosas (2.1 mm/dia).
Observamos que o tratamento com baixa dose de EPE resultou em um
maior nmero de embries aos oito dias aps a ovulao com grau de
desenvolvimento compatvel com idade gestacional em D8 (blastocistos ou
blastocistos expandidos) ou mrulas e blastocistos iniciais em D6 nas
ovulaes assincrnicas nas guas com mltiplas ovulaes. Um atraso no
desenvolvimento de at 36 horas esperado nos embries de guas velhas
em relao aos embries de guas jovens (CARNEVALE et al, 1993). Este
atraso no desenvolvimento embrionrio pode ser consequncia de defeitos
intrinsicos nos embries, meio de desenvolvimeto pobre na tuba uterina e/ou
tero e inseminao ps-ovulatria (GUINTER,1992). Brisnsko et al (1996)
observaram um atraso no desenvolvimento embrionrio aps realizao de
fertilizao in vitro em ocitos de eguas idosas, demostrando ser o fator
qualidade do ocito implicado no retardo do embrio. Ball et. al, (1989)
corroborando com esta linha de raciocinio observou que fatores inerentes a
formacao o embrio so mais importantes que o ambiente tubarico no que diz
respeito a perda embrionaria na fase tubarica.
Rambags et. al, (2008), observaram que os embries de guas jovens
(<12 anos) possuam mais mitocndrias do que seus ocitos, j nas guas
idosas (>15 anos) a quantidade de mitocndrias no aumentou nos embries
quando comparado aos seus ocitos, indicando um atraso na replicao
mitocondrial. Observamos no presente trabalho que em 58.8% dos embries
recuperados nos grupos controle estavam com desenvolvimento no
condizentes como D8, atrasados, ou seja eram mrulas ou blastocistos iniciais.
Entretanto ao tratar estas guas com EPE este atraso no foi verificado em
'LVFXVVmR

32
100% dos embries, sugerindo que o EPE teve um efeito na maturao deste
ocito e transporte mais rpido deste embrio ao tero.
A taxa de prenhez por ciclo dos embries coletados foi de 25%
(5/20) no G1, 70% (14/20) no grupo tratado com EPE (G2) e 20% (4/20) no G3.
Se compararmos a taxa de prenhez por ciclo nas guas idosas temos uma
mdia de 32% de prenhez (Vanderwall,1989), um pouco acima do grupo
controle mas muito inferior ao grupo tratado com EPE.
A taxa de prenhez por embrio transferido das guas tratadas com
EPE (G2) foi de 70 % (14/20), mostrou tendncia (p=0.07) em ser superior nos
ciclos tratados diferenciando do grupo controle que foi de 55,5% no G1 e 50%
no G3. Autores demonstraram que a taxa de prenhez de embries de guas de
15 - 19 anos foi de 54,2 % citado por HUNT et al (2005), 52 % em guas 9 - 17
anos e 56% em guas de 18-28 anos citado por Vogelsang & Vogelsang
(1989), 65% em guas de 10 18 anos, citado por Carnevale et. al.,2000.
Valores semelhantes foram encontrados no presente trabalho nos grupos
controle G1 e G3 com idade de 15 -20 anos. Os embries com estgio mais
lento de desenvolvimento, menores que esperados e estgios iniciais de
desenvolvimento no dia 7 ou 8 (D7 ou D8) resultam em taxas menores de
prenhez aps inovulao (CARNEVALE et al., 1993). Entretanto ao
compararmos a taxa de prenhez por embrio do grupo tratado com EPE (G2)
de 70% foi superior ou semelhante literatura s taxas de prenhezes de
embrio de doadoras jovens no tratadas, como 67,7 % em guas de 2 9
anos (CARNEVALE et al, 2000), 65,4% nas guas de 8 14 anos (HUNT et al,
2005) e com a taxa mdia de prenhez em programas de transferncia de
embrio de 60% (ALVARENGA et al,2008) e 70% (SQUIRES & SEIDEL, 1995).
A eficincia do programa, ou seja, a relao entre a taxa de prenhez
e taxa de recuperao embrionria foi superior nas guas tratadas com EPE
(70%) quando comparadas as no tratadas (21.8 %), demonstrando que o uso
do EPE em baixas doses beneficia altamente as guas na faixa etria do
presente experimento (15 a 20 anos).
'LVFXVVmR

33
No que diz respeito s taxas de perda embrionria precoce (at 50
dias) os resultados no diferiram entre os grupos. Reafirmando os achados de
vrios autores (FLEURY et al, 1989; ALONSO et al, 2005) os quais observaram
taxas similares de perda embrionria entre guas idosas e jovens aps TE
para o tero de receptoras reprodutivamente saudveis. Contudo contradizem
os resultados de Carnevale et al,(2000) que observaram uma taxa de perda
embrionria de 20,5% em embries de guas idosas transferidos contra 13,3%
em guas jovens e Vogelsang & Vogelsang (1989), 24% em guas de 9 - 17
anos e 14 % em guas de 2 - 8 anos.
&RQFOXV}HV

34
7. CONCLUSES
Os resultados obtidos no presente experimento permite concluir que
a administrao de Extrato de Pituitria Equina em guas idosas doadoras de
embries:
1- Interferiu positivamente na dinmica de crescimento do folculo dominante e
codominante
2- Aumentou a incidncia de multiplas ovulaes
3- Incrementou a da taxa de recuperao embrionria por ciclo
3-Propiciou a recuperao de embries em fase de desenvolvimento mais
condizente com a idade do embrio no D8
4- Melhorou a eficincia reprodutiva das doadoras tratadas.
5HIHUHQFLDV

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