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BRUNO FRITZSONS BONIN
EFEITO DO TRATAMENTO COM EXTRATO DE PITUITRIA EQUINA NA
RESPOSTA OVARIANA E EFICINCIA REPRODUTIVA DE GUAS IDOSAS
EM PROGRAMA DE TRANSFERNCIA DE EMBRIES
Dissertao apresentada Faculdade de
Medicina Veterinria e Zootecnia da
Universidade Estadual Paulista, campus
de Botucatu, como parte das exigncias
para obteno do ttulo de Mestre em
Medicina Veterinria, rea de Reproduo
Animal.
Orientador: Professor Adjunto Marco Antnio Alvarenga
Botucatu-SP
2009
ii
AGRADECIMENTOS
A Deus que nos permite caminhar todos os dias vencendo batalhas e trilhando
nosso caminho em companhia de nossas famlias e amigos.
A minha famlia, Bruna, Sophia e Matheus (a caminho) por sempre estarem ao
meu lado entendendo o trabalho sem horrio, conciliado com vrios anos de
estudo longe de casa.
Aos meus familiares, pelos incessantes incentivos na busca constante de
novas informaes e formao pessoal.
Ao meu orientador e amigo, Prof. Dr. Marco Antonio Alvarenga, pelos
ensinamentos e confiana durante a realizao do curso de Mestrado.
Ao Mdico Veterinrio e amigo Jos Antonio DellAqua Jnior pelo auxilio na
avaliao estatstica dos dados.
Aos docentes, colegas ps-graduandos e funcionrios do Departamento de
Reproduo Animal e Radiologia Veterinria da FMVZ, Unesp-Botucatu.
Ao amigo e proprietrio da Central de Reproduo, Guilherme Gregolin, pela
viabilizao da conduo deste trabalho, nas dependncias de sua Central.
iii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Efeito da idade da gua doadora nas taxas de
recuperao embrionria........................................................................
15
Tabela 2 Nmero mdio de ovulaes por ciclo, nmero mdio de
embries por ciclo, nmero mdio de embries por ovulao e nmero
mdio de embries por guas.................................................................
22
Tabela 3 Nmero de ovulaes por gua no G1, G2 e G3................. 23
Tabela 4 Nmero de embries recuperados por gua no G1, G2 e
G3............................................................................................................
24
Tabela 5 Durao da fase folicular, tempo em dias da aplicao da
prostaglandina (D8) at a ovulao por gua no G1, G2 e
G3............................................................................................................
.
25
Tabela 6 - Condizncia entre o Estagio de desenvolvimento para
cada embrio recuperado e o dia da recuperao (D8 do ciclo), no
G1, G2 e G3............................................................................................
26
Tabela 7 - Taxa de prenhez obtida por embries recuperados no G1,
G2 e G3...................................................................................................
26
Tabela 8 - Taxa de prenhez por ciclo obtidas no G1, G2 e G3............. 27
iv
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Porcentagem de guas em atividade reprodutiva natural de
acordo com idade......................................................................................
03
Figura 2 Taxa de pario em guas de acordo com idade.................... 04
Figura 3 FSH e LH centralizado para ovulao..................................... 08
v
SUMRIO
1. INTRODUO........................................................................................ 01
2. REVISO DE LITERATURA.................................................................. 03
2.1 Senilidade, dinmica ovariana e ciclo estral................................. 04
2.2 Alteraes hormonais relacionadas idade................................. 06
2.3 Alteraes da genitlia externa e interna relacionadas idade..... 10
2.4Senilidade e qualidade de ocitos e embries................................ 11
3. OBJETIVOS........................................................................................... 17
4. MATERIAL E MTODO......................................................................... 18
4.1 Perodo e Local do Experimento............................................................ 18
4.2 Animais e Grupos Experimentais........................................................... 18
4.3 Delineamento Experimental................................................................... 18
4.3.1 Exames Ultrassonogrficos..................................................... 19
4.3.2 Colheita de Smen, Inseminaes e Induo das Ovulaes 19
4.3.3 Tratamentos............................................................................. 20
4.3.4 Colheita, Manipulao e Transferncia dos Embries............ 20
4.3.5 Diagnstico de Gestao......................................................... 21
4.4 Anlise Estatstica......................................................................... 21
5. RESULTADOS....................................................................................... 22
6. DISCUSSO........................................................................................... 28
7. CONCLUSES....................................................................................... 34
8. REFERNCIAS...................................................................................... 35
vi
RESUMO
BONIN, B.F., Efeito do tratamento com extrato de pituitria equina na
resposta ovariana e eficincia reprodutiva de guas idosas em programa
de transferncias de embries. Botucatu, 2009.
Dissertao (Mestrado) Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia,
Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista.
O presente trabalho objetivou avaliar os efeitos de doses baixas do extrato de
pituitria eqina (EPE) no crescimento folicular, taxa de ovulao e de
recuperao embrionria em guas idosas. Doadoras de embrio (n=20) da
raa Quarto de Milha de um programa comercial com idade de 15 a 20 anos de
idade, foram utilizadas em 3 ciclos consecutivos. O primeiro e o terceiro ciclo
foi utilizado como grupo controle e entre eles o grupo tratado com EPE no
segundo ciclo. Em todos os ciclos, a ultrassonografia transretal dos ovrios foi
realizada diariamente aps aplicao de prostaglandina e monitorando os dois
maiores folculos. Durante os trs ciclos as guas foram inseminadas com
smen a fresco ou refrigerado do mesmo garanho e receberam uma aplicao
de acetato de deslorelina aps a deteco de pelo menos um folculo de 35 a
40 mm de dimetro. A recuperao embrionria foi realizada por lavado uterino
8 dias ps ovulao seguidas da administrao de prostaglandina. No ciclo
tratado, injees de EPE (7mg/IM/duas vezes ao dia) se iniciaram no dia 8
aps a ovulao at que um folculo pr-ovulatrio fosse observado. A
porcentagem de guas com mais de uma ovulao foi comparada pelo teste de
Fisher e a mdia do nmero de ovulaes e embries, assim como o dimetro
folicular, entre os ciclos foram comparados usando teste de Students. A
porcentagem de guas com mais de uma ovulao e o nmero de ovulaes
foram maiores (p<0,05) no ciclo tratado com EPE (65% das guas e 1,8
ovulaes) do que o grupo controle antes (5% e 1,0) e depois do tratamento
(5% e 1,0). O nmero de embries recuperados por ciclo tambm foi maior
(p<0,05) no grupo tratado com EPE (1,0/ciclo) comparado com os ciclos
controle (0,42/ciclo). Entretanto a taxa de embrio recuperado por ovulao foi
similar (p>0,05) entre os grupos controles (0,4 embries/ovulao) e o ciclo
vii
tratado (0,6 embries/ovulao). O tratamento com EPE possibilitou a
recuperao de embries com estgio de desenvolvimento mais compatveis
ao estgio embrionrio. A taxa de prenhez dos embries transferidos foi similar
entre os embries recuperados no ciclo tratado (14/20-70%) e nos ciclos
controle (9/17-55%). Baseado nos resultados do presente experimento,
conclumos que o tratamento com EPE foi capaz de aumentar a eficincia
reprodutiva de guas idosas doadoras de embrio, recuperando ao menos um
embrio por ciclo. O aumento nas taxas de recuperao embrionria nos ciclo
tratados com EPE aparentam estar mais relacionados ao nmero de ovulaes
por ciclo do que uma melhora no ocito ou maturao folicular.
Palavras-chave: gua, idade, ovulaes mltiplas, extrato de pituitria eqino,
transferncia de embries
viii
ABSTRACT
BONIN, B.F., Effect of equine pituitary treatment on ovarian response and
reproductive efficiency of old mares in a embryo transfer program.
Botucatu, 2009.
Dissertao (Mestrado) Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia,
Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista.
The present study aimed to evaluate the effect of the use of low doses of
equine pituitary extract (EPE) on follicular growth, ovulation rate and embryo
recovery rates in old mares. Embryo donors (n=20) of Quarter Horse breed
from a commercial embryo center aging 15 to 20 years old , were used during
3 consecutive cycles. The first and third cycles were use as control being the
EPE treatment performed on the second cycle. In all cycles transrectal
ultrasonography of the uterus and ovaries was performed daily after PG
injection to follow the development of the two largest follicles. During the 3
estrus mares were inseminated with cooled or fresh semen from the same
stallion and received an injection of deslorelin (1 mg i.m.) upon detection of at
least one follicle of 35 to 40 mm in diameter. The embryo flushings were
performed on day 8 post-ovulation and were always followed by administration
of PG. On the treated cycle, EPE injections (7mg twice daily i.m.) were started
on day 8 after ovulation until a pre-ovulatory follicle was observed. The
percentage of mares with more than one ovulation was compared by means
using Fischers test and the mean number of ovulations and embryos, as well
as follicular diameters, between cycles were compared using Students t test.
The percentage of mares with more than one ovulation and number of
ovulations were higher (p<0.05) in the EPE-treated cycle (65% of mares and
1.8 ovulations) than in the control cycle before (5% and 1.0) and after treatment
(5% and 1.0). Also the mean number of embryos recovered per cycle were
higher (p<0.05) on EPE treated cycle (1.0 /cycle) than in no treated cycles
(0.42/cycle). However the embryo rate per ovulation was similar (p>0.05)
between no treated cycles (0.4 embryo/ovulation) and treated cycle (0.6
embryo/ovulation). The treatment with EPE allowed the recovery of embryos in
ix
stage of development more compatible with the embryonic age. The pregnancy
rates of the transferred embryos was also similar between embryos recovered
on treated (14/20-70%) an non treated cycles (9/17 -55%). Based on the results
of the present experiment we can concluded that EPE treatment was able to
increase the reproductive efficiency of old embryo donor mares, providing the
recovery of at least one embryo on average per cycle. The improvement on
embryo recovery rates on EPE treated cycle seems to be more related with the
increase in the number of ovulations per cycle than with improvement on oocyte
or follicle maturation.
Key words: mare, age, multiple ovulations, equine pituitary extract, embryo
transfer.
,QWURGXomR
1
1. INTRODUO
Fmeas mamferas apresentam um declnio gradativo na capacidade
reprodutiva com o avanar da idade. Diferente de outros animais domsticos,
as guas com o avanar da idade permanecem como parte da populao de
reprodutoras ativas nos haras.
O declnio da fertilidade relacionado idade em fmeas tem pelo menos
dois componentes bsicos: a diminuio da taxa de concepo/prenhez por
ciclo e um aumento das taxas de morte embrionria e abortamento nestes
animais.
As guas so mais valiosas com sua prognie comprovada ou por seu
maior tempo destinado a vitrias em competies, isso geralmente ocorre
quando a gua possui aproximadamente 15 anos de idade, coincidindo com a
queda em seu ndice de fertilidade. Havendo assim um grande interesse dos
criadores de cavalo em manter estas reprodutoras de idade superior aos 15
anos na reproduo, justificado nos valores de venda de seus produtos.
Visando um maior aproveitamento e intensificao do ritmo do
melhoramento gentico e da eficincia reprodutiva, se faz necessrio
utilizao de biotecnologias reprodutivas, desta forma a transferncia de
embries busca suprir a demanda existente em relao a produtos oriundo de
guas mais velhas com alto potencial gentico.
Um dos problemas que interfere na eficincia reprodutiva de programas
de transferncia diz respeito ao elevado percentual de guas idosas existentes
nestes programas, pois sabidamente estas guas tm uma eficincia
reprodutiva mais baixa do que guas jovens.
As guas idosas ainda podem apresentar uma maior porcentagem de
deformidades anatmicas, prejudiciais para reproduo como m coaptao e
conformao de vulva. Alm de serem mais susceptveis a endometrite ps-
cobertura, pela reduo das contraes miometriais, sistema linftico
deficiente, tero mais penduloso e a incompetncia de crvix.
A fmea eqina por natureza monovular, o que significa dizer que a
cada ciclo estral, geralmente, uma nica ovulao ir ocorrer. A possibilidade
de se incrementar o nmero de ovulaes no ciclo estral da gua traz consigo
,QWURGXomR
2
potenciais benefcios, como o aumento no nmero de ocitos disponveis para
aplicao de diferentes tcnicas de reproduo assistida e aumento no nmero
de embries recuperados em uma nica colheita, com conseqente reduo
dos custos do programa de transferncia de embries.
A ocorrncia de ovulaes duplas espontneas em guas um fator que
incrementa a recuperao de embries. Assim sendo, alguns grupos de
pesquisa tm se dedicado ao estudo dos fatores responsveis pela baixa
recuperao embrionria em guas superovuladas e ao desenvolvimento de
protocolos que driblem esses fatores, que produzam menos efeitos adversos e
promovam estimulao moderada e no excessiva dos ovrios.
Farinasso (2004) utilizou doses de EPE mais baixas do que as
tradicionalmente utilizadas para superovulao e obteve aumento no nmero
mdio de ovulaes, provocado pela maior incidncia de ovulaes duplas e
triplas e de embries recuperados em guas. Por outro lado Jacob, 2008
demonstraram que guas idosas apresentam baixo nveis de hormnio
luteinizante (LH) srico no perodo periovulatrio.
O referidos trabalhos nos motivaram a investigar a aplicabilidade de uma
baixa dose de EPE para incrementar o nmero de ovulaes e embries
recuperados em guas, partindo da hiptese de que a aplicao exgena de
EPE poderia atuar beneficamente aumentando o nmero de ovulaes por
ciclo bem melhorando a maturao folicular e ou oocitria por levar a um
aumento dos nveis sricos de LH.
5HYLVmRGH/LWHUDWXUD
3
2. REVISO DE LITERATURA
Na industria eqina em geral e entre os criadores principalmente, existe
um mercado interessado em aumentar a eficincia reprodutiva de seus animais
mais valiosos, as fmeas eqinas obtm seu maior valor econmico quando
sua prognie se destaca. Isto ocorre na gua quando passado sua vida mdia
reprodutiva, coincidindo com a diminuio dos ndices de fertilidade, a partir de
15 17 anos de idade (LOSINNO et. al, 2000).
Fonte : LOSINNO,2006
Figura 1 Porcentagem de guas em atividade reprodutiva natural de acordo
com idade, adaptado por BAKER, 1993.
A diminuio da eficincia reprodutiva com o avanar da idade fica
evidente quando avaliadas as taxas de nascimentos com idade materna aps
14 16 anos e aumento da morte embrionria precoce em guas idosas (BALL
et al., 2000, BAKER, 1993).
As reprodutoras mais idosas (acima 16 anos), representam de 10 25%
das guas que esto em um programa de reproduo (BAKER, 1993).
grande a diferena da eficincia reprodutiva entre guas idosas e jovens,
quanto a prenhez/ciclo (32% e 65 % respectivamente), nascimentos (54% e
5HYLVmRGH/LWHUDWXUD
4
82%, respectivamente) e perda embrionria (29% e 7% respectivamente)
(VANDERWALL, 1989).
Fonte: LOSINNO,2006
Figura 2 Taxa de pario em guas de acordo com idade, adaptado por
BAKER, 1993.
Corroborando com estes trabalhos, em um experimento com guas
pnei, cobertas com o mesmo garanho, guas jovens (5 7 anos) e idosas (>
15 anos), obtiveram respectivamente, 100% de prenhez no dia 12 vs 32%, a
morte embrionria no d50 foi de 62% nas guas idosas contra 11 % nas jovens
(CARNEVALE & GUINTER, 1992).
Esta diminuio da eficincia reprodutiva, demonstrada por menores
ndices de prenhez e menores taxas de nascimentos, pode estar relacionada,
como em outros mamferos a disfunes neuro-endcrinas, perda gestacional
ou uma combinao de todas elas. (BALL et al., 2000).
2.1. Efeito da senilidade no ciclo estral
A divergncia em trabalhos muito grande relacionado idade, onde
cada pesquisador seleciona e classifica as guas nas faixas etrias como
jovens, intermedirias e idosas, dificultando a comparao entre os grupos.
5HYLVmRGH/LWHUDWXUD
5
Conforme publicado pelos seguintes autores: Carnevale et. al, (1993): 5-7 anos
nas jovens, 15-19 anos idade intermediria e > 20 anos nas idosas; Vanderwall
et. al,(1993) : 16 20 anos nas guas idosas; Carnevale & Ginther (1995): 5
7 anos nas jovens e > 15 anos nas idosas; Fleury et al (1989) : jovens < 3
anos, intermedirias de 3 18 anos e idosas > 18 anos; Vogelsang &
Vogelsang (1989): jovens de 2 8 anos, intermedirias de 9 17 anos e idosas
de 18 a 28 anos; Alonso et. al.(2005) : jovens de 2 17 anos e idosas de 18 -
26 anos; Losinno (2006) :jovens de 3 - 8 anos e idosas >15 anos e Jacob
(2008) : jovens de 4 a 6 anos, intermediria de 10 a 14 anos e idosas >18
anos; Rambags et. al. (2008) jovens < 12 anos e idosas > 15 anos.
Originalmente, as guas tm aproximadamente 40.000 folculos
primordiais e ciclam continuamente por 25 anos. Presumivelmente o pool de
folculos primordiais finito principalmente, por no ter sido citado, at o
presente momento, a ocorrncia de mitoses em oognias de potras ou guas
(GINTER, 1993). A gua polistrica estacional, com ciclos reprodutivos
regulares durante o perodo de maior intensidade de luz e intervalos
transicionais no incio e fim do perodo ovulatrio da estao (CARNEVALE,
2008).
O efeito da idade sobre a atividade ovariana tem sido caracterizado
tambm pelo decrscimo do volume ovariano, pela reduo do nmero de
folculos antrais e pela menor vascularizao do estroma intra-ovariano em
mulheres idosas (KUPESIC et al., 2003). A disfuno ovariana tambm tem
sido responsabilizada como causa do decrscimo da eficincia reprodutiva em
guas idosas (WESSON & GUINTER, 1981).
Com o avanar da idade mudanas no ciclo estral ocorrem refletindo
alteraes na funo ovariana. Caractersticas comparadas no ciclo de guas
de meia idade (15 -19 anos) e guas jovens (5 7 anos) mostraram que a fase
luteal no diferiu , porm houve reduo de 15 % da fase folicular , 9,4 dias das
guas jovens contra 8,0 dias das guas de meia idade e as guas de meia
idade ovularam com folculos menores (CARNEVALE, 2008).
Diferenas significativas no foram encontradas na durao do ciclo
estral entre guas velhas e jovens da primeira para segunda ovulao
(VANDERWALL et al,.1993). Diferentemente Carnevale et al., (1993)
5HYLVmRGH/LWHUDWXUD
6
encontraram intervalos de 23,9 0,6, 23,0 0,8 e 26,5 0,7 dias para guas
jovens (5 - 7 anos), com idade intermediria (15-19 anos) e idosas (>20 anos)
respectivamente.
Em outro estudo Jacob (2008) relatou que a durao do perodo
interovulatrio para as guas jovens, de idade intermediria e idosas foram,
respectivamente 22,6 0,48, 22,4 0,38 e 23,9 0,55 dias (p= 0,0567). A
taxa de crescimento (mm/dia) nos 4 dias antes da ovulao nas guas jovens,
de meia idade e idosas foi de 3,0 ,18; 2,5 0,13 e 2,1 0,32
respectivamente.
Um prolongado perodo interovulatrio deveu-se ao prolongamento da
fase folicular e conseqentemente ao prolongado intervalo da induo da
lutelise at a ovulao, foi citado por Vanderwall et al,. (1993) em guas
velhas (16 a 20 anos), quando comparado ao das guas entre 10 e 11 anos.
Entretanto como todas as guas foram cobertas, os autores sugeriram que o
prolongado intervalo entre ovulaes pode ter se devido no deteco de
perda embrionria precoce nos animais idosos.
Em mulheres, observa-se que nos anos que antecedem o perodo de
transio para a menopausa, ocorrem ovulaes regulares, enquanto o ciclo
menstrual progressivamente encurtado. Fenmeno este que se deve ao
encurtamento da fase folicular em mulheres idosas (KLEIN et al., 2002).
guas com mais de 20 anos possuem significantemente um maior
intervalo interovulatrio, com fase luteal similar, mas com longa fase folicular
comparada s guas jovens. Fato associado com atraso de 3 dias para na
emergncia do folculo dominante e o crescimento mais lento do folculo
ovulatrio (CARNEVALE et al.,1993).
2.2. Alteraes hormonais e da dinmica ovariana relacionadas
senilidade
Na gua, a idade pode tambm afetar os nveis dos hormnios
reprodutivos (CARNEVALE et al., 1993), embora em bovinos os nveis de
gonadotrofinas no tenham sido afetados pela idade das vacas (MALHI et al.,
2005).
5HYLVmRGH/LWHUDWXUD
7
O efeito da idade sobre a concentrao plasmtica de progesterona no
foi observada durante os dois perodos ovulatrios em guas (VANDERWALL
et al., 1993). Diferentemente Carnevale et al., (1993) observaram maiores
concentraes de progesterona em guas idosas quando comparadas a guas
com idade intermediria.
Carnevale et al (1993) demonstraram o efeito da idade sobre a funo
do corpo lteo, sendo que o grupo de guas velhas apresentou concentrao
de progesterona mais elevada, aps a segunda ovulao, do que o grupo de
meia idade, embora o mesmo no tenha sido observado na primeira ovulao.
As concentraes sistmicas do hormnio folculo estimulante (FSH) e
a atividade folicular durante a fase luteal so maiores em guas de meia-idade
(de 15 a 19 anos), quando comparadas s de guas idosas (> 20 anos) ou
jovens (de 5 a 7 anos) (CARNEVALE et al., 1993).
No trabalho de Jacob (2008) no foi observado efeito de idade sobre as
concentraes de FSH, progesterona e estradiol sricos, em guas pnei com
meia-idade ou idosas.
Resultados observados por Carnevale et al.(1993), revelaram que a
concentrao de LH no diferiu entre as fmeas do grupo 1 (5 a 7 anos), e
grupo 2 (15 a 19 anos), embora o grupo 3 (20 anos ou mais) apresentou uma
baixa concentrao de LH durante um segundo perodo ovulatrio, porem, a
concentrao de LH foi suficiente para induzir a ovulao.
Um efeito significativo de grupo foi observado sobre o LH ao redor da
ovulao e no perodo periovulatrio (Figura 3). Assim, a concentrao de LH
em guas jovens ao redor da ovulao foi mais elevada do que em guas de
idade intermediria e nas idosas. Foram observados menores nveis sricos de
LH ao redor da ovulao ou seja 4 dias antes do momento ovulatrio, em
guas pneis com mais de 18 anos (JACOB,2008).
Elevadas concentraes de FSH, sem aumento na concentrao de LH,
aparentam ser os sinais iniciais da idade alterando a reproduo em guas
(SOULES et al, 2000). Estas alteraes poderiam estimular uma maior
proporo de folculos primordiais a entrar neste grande pool de folculos e
acelerar a depresso da reserva de folculos primordiais (RICHARDSON et
al.,1987).
5HYLVmRGH/LWHUDWXUD
8
O primeiro sinal da idade afetando a reproduo o encurtamento do
ciclo estral com elevadas concentraes de hormnio folculo estimulante
(FSH), seguido de ciclos longos com intermitentes ovulaes e elevadas
concentraes de FSH e LH, se cessando com a falha no crescimento folicular
com gonadotrofinas elevadas aparentemente pela falncia dos ovrios
(CARNEVALE et al.,2008).
LH
Dias da Ovulao
-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4
L
H
(
n
g
/
m
l
)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
Jovem
Mdia
Velha
FSH
Dias da ovulao
-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4
F
S
H
(
n
g
/
m
l
)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Fonte : JACOB, 2008