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APOSTILA DE BIOQUMICA - roteiros para aulas prticas

CURSO DE FARMCIA

APOSTILA DE BIOQUMICA ROTEIROS PARA AULAS PRTICAS

APRESENTAO

Esta apostila inclui os roteiros para as aulas prticas de Bioqumica Celular e Bioqumica Animal, alm do aspecto terico das aulas ministradas em laboratrio. A apostila tambm traz exerccios para estudo dirigido e questes para serem entregues em relatrio. necessrio observar, entretanto, que apenas as aulas de Bioqumica Celular exigem relatrio, enquanto que as aulas de Bioqumica Animal solicitam apenas a resoluo de questes de estudo dirigido.

IDENTIFICAO DO ALUNO NOME: ___________________________________________________________ CONTATO: ________________________________________________________ CURSO DE FARMCIA FACULDADES PEQUENO PRNCIPE 2009

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Professora Franciely Grose Colodi 2009

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AULA 1
PH E SOLUES TAMPO

OBJETIVOS Objetivo geral: - reconhecer a importncia do controle de pH na homeostase dos organismos, enfatizando os conceitos de pH e solues tampo Objetivos especficos: - determinar o pH de solues atravs de mtodo colorimtrico, utilizando indicador universal - entender o funcionamento de solues tampo e sua importncia fisiolgica EXPERIMENTO A. REAGENTES - Solues de pH determinado 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10 - Indicador universal 0,05g de laranja de metila; 0,15g de vermelho de metila; 0,3g de azul de bromotimol; 0,35g de fenolftalena e lcool etlico a 66% para 1L - Hidrxido de sdio NaOH 0,1 mol/L - cido clordrico HCl 0,1 mol/L - Soluo-tampo pH 7,0 B. TCNICA 1. ESCALA PADRO Preparar uma bateria de 8 tubos de ensaio Colocar em cada tubo 1 mL de soluo pH 3 a 10 Adicionar 5 gotas do indicador universal a cada tubo Adicionar 9 mL de gua destilada a cada tubo e homogeneizar RESPONDA: Qual a funo da escala padro?

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2. EXPERIMENTO I Preparar uma bateria de 4 tubos de ensaio, de acordo com a tabela abaixo: Tubos Reagentes Indicador universal gua destilada Soluo Tampo pH 7,0 pH 1 5 gotas 10 mL 2 5 gotas 9 mL 1 mL 3 5 gotas 10 mL 4 5 gotas 9 mL 1 mL

O pH deve ser avaliado de acordo com a escala padro preparada no item 1 e anotado na tabela anterior. 3. EXPERIMENTO II Aps o experimento I, adicionar os seguintes reagentes aos 4 tubos anteriores, de acordo com a tabela abaixo: Tubos Reagentes NaOH 0,1 mol/L HCl 0,1 mol/L pH Soprar o ar expirado pH HCl 0,1 mol/L 1 1 gota 15 segundos 2 1 gota 1 minuto 3 2 gotas 4 2 gotas Gota a gota n de gotas=_____

Anote na tabela o pH resultante aps a adio de NaOH e HCl aos tubos e depois sopre o ar expirado nos tubos 1 e 2 durante o tempo previsto na tabela e anote o resultado. Por fim adicione HCl 0,1 mol/L gota a gota no tubo 4 at que este resulte na cor do tubo 3 e anote o nmero de gotas. ASPECTOS TERICOS GUA: AMBIENTE CELULAR - Substncia mais abundante nos seres vivos - Perfaz 70% ou mais da massa da maioria dos organismos - Evoluo marcada pelas propriedades do meio aquoso, onde a vida comeou - Foras de atrao entre molculas de gua - Pequena tendncia da gua se ionizar - A molcula de gua e seus produtos de ionizao influenciam profundamente a estrutura, a automontagem e as propriedades de todos os componentes celulares - A gua pura ligeiramente ionizada H2O H+ + OH-

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IONIZAO DA GUA H2O H+ + OHA ionizao da gua expressa por uma constante de equilbrio (Ka) O Ka = [H+] [OH-]/ [H2O] = 1,8 x 10-16 mol/L a 25C gua cido fraco, s uma frao muito pequena se dissocia e se considera sua concentrao constante e = a 55,55mol/L (1000g/18 = 55,55mol/L) Produto inico da gua = [H+] [OH-] = Kw = 1,8 x 10-16 . 55,55 [H+] [OH-] = Kw = 1,0 x 10-14 O Kw expressa o produto da [ ] de H+ e ons OH- em solues aquosas Em gua pura a 25C, [H+] = [OH-] = 1 x 10-7 mol/L Assim se 0,1 mol/L de HCl for adicionado gua pura, a nova [] de H+ ser 0,1 mol/L (HCl cido forte, se dissocia completamente) e a de OH- 1 x 10-13, mantendo o valor de Kw = 1 x 10-14. pH: ESCALA E SIGNIFICADO Os valores de prtons e ons hidrxidos em solues diludas so muito pequenos Por isso foi definido o termo pH como escala logartmica de base 10: pH = log 1/[H+] = - log [H+] O termo pH expressa a concentrao de prtons O pH da gua pura , ento, pH = - log (10-7) = 7 importante notar que a diferena de uma unidade na escala de pH significa uma diferena de 10 vezes na concentrao de prtons Assim, uma soluo pH 4 possui [H+] = 10-4 mol/L e outra pH 5 possui [H+] = 10-5 mol/L

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SOLUO TAMPO Solues tampo consistem, basicamente, de solues mistas de cido fraco e sua base conjugada ou base fraca e seu cido conjugado em concentraes aproximadamente iguais. Uma soluo tampo corresponde a uma soluo na qual o pH resiste mudana quando cidos ou bases fortes so adicionadas. Se um cido for adicionado: A- + H+ HA Se uma base for adicionada: HA + OH- A- + H2O Se a [HA] for muito menor do que a de A (mais do que 10 vezes), quando for adicionada uma base, o pH aumentar por falta de H para neutraliz-la e vice-versa. EQUAO DE HENDERSON-HASSELBACH Para o cido actico por exemplo: Ka = [H+] [CH3COO-] / [CH3COOH] Aplicando-se log em ambos os lados e rearranjando: pH = pKa + log [CH3COO-] / [CH3COOH] Para um cido HA: pH = pKa + log [A-] / [HA] onde A- a base conjugada e H o cido no dissociado Esta equao descreve a variao do pH de uma mistura de um cido fraco nodissociado e sua base conjugada, relacionando pH da soluo e concentraes das espcies qumicas. MTODOS PARA SE DETERMINAR O PH Determinao colorimtrica: Indicadores universais e de papel de pH Conhecimento dos pKs dos indicadores (cidos ou bases fracos) Dissociao de um indicador cido Hin
cido

In- + H+
base

Cor A

Cor B

A cor do indicador uma funo do pH da soluo Os papeis so impregnados com indicadores

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MTODOS PARA SE DETERMINAR O PH Determinao potenciomtrica: potencimetro Mtodo mais preciso Eletrodo de calomelano (cloreto mercuroso em soluo KCl(aq) saturada) Eletrodo de vidro com um bulbo especial contendo soluo HCl 0,1mol/L Eletrodo imerso em soluo externa de concentrao desconhecida Cria-se um potencial entre as solues interna e externa Voltagem do eletrodo cte, assim a diferena de potencial entre os 2 eletrodos relacionada com a concentrao de H+ da soluo desconhecida IMPORTNCIA DE SISTEMAS TAMPO Equilbrio cido-base homeostase Exemplo Sistema-Tampo Bicarbonato (pH ~ 7,4)

quando h cido ltico produzido por exerccio vigoroso (excesso de H+) quando h produo de NH3 do catabolismo de protenas (pouco H+)

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RELATRIO pH e solues tampo O relatrio de aulas prticas deve ser realizado de acordo com as regras da ABNT. As questes que se seguem devem ser abordadas no relatrio. 1. De onde surgiu e qual a importncia da escala de pH? 2. O que soluo tampo e como funciona? 3. Qual a importncia dos sistemas tamponantes em nosso organismo? 4. Explique o que a Equao de Henderson-Hasselbach relaciona e demonstre sua deduo, considerando que o equilbrio de ionizao de um cido fraco pode ser representado pela equao: HA H+ + A-, onde HA e A- correspondem a um par cidobase conjugada. Lembre-se dos conceitos de constante de equilbrio de uma reao (K) e das constantes de ionizao dos cidos (pK). 3. Calcule o pH da soluo obtida quando 10 mL de NaOH 0,1M so adicionados a 10 mL e cido actico 0,2M (pK= 4,76). Utilize a equao de Henderson-Hasselbach. 5. Qual a importncia do estado cido-base do lquido intracelular ser influenciado e influenciar o estado cido-base do sangue?

DICAS PARA OS RELATRIOS Exemplo do relatrio sobre PROTENAS (prxima aula) - a introduo pode e deve ser breve, englobando os aspectos bsicos sobre a estrutura das protenas, como a constituio (aminocidos e ligaes peptdicas) e suas conformaes primria, secundria, terciria e quaternria. Alm dos princpios sobre solubilidade das protenas, ou seja, o que as permite que sejam solveis ou insolveis. - em materiais e mtodos devem estar descritos os materiais utilizados juntamente com os procedimentos (reagentes, tempo de aquecimento, etc.) realizados para cada um dos nove tubos. - em resultados e discusso devem ser abordados os resultados (colorao e precipitao) de cada um dos tubos, ou seja, o que ocorreu com cada um durante o processo experimental e o porqu destes resultados. O porqu dos resultados que constitui a discusso. Vocs devem explicar porque houve colorao, ou seja, qual o fundamento das reaes de colorao (tubos 1, 2 e 3) e porque houve precipitao ou solubilizao no restante dos tubos (4 a 9), explicitando tambm o fundamento das reaes ocorridas em cada tubo. No se esqueam de mencionar os processos de salting-in e salting-out, que so importantes para o isolamento/separao de diferentes protenas. - na concluso vocs retomam os objetivos da aula e concluem os resultados de maneira sucinta e objetiva. Na concluso no se discute nem se aborda qualquer novo tpico, mas sim se afirmam os resultados discutidos.

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AULA 2 CARACTERIZAO DE PROTENAS


OBJETIVOS Objetivo geral: - identificar protenas, enfatizando as propriedades gerais, estrutura e isolamento destas molculas Objetivos especficos: - caracterizar protenas em material biolgico atravs de reaes colorimtricas - verificar precipitao de protenas em diferentes condies, correlacionando as observaes com a estrutura das protenas EXPERIMENTO A. REAGENTES 1. Soluo de protenas a 10% 2. Soluo de ninhidrina 0,1% 3. Hidrxido de sdio (NaOH) 2,5 mol/L 4. Soluo de sulfato de cobre (CuSO4) a 1% 5. cido triclorocetico (TCA) a 10% v/v 6. Acetato de chumbo a (PbCH3COO-) 5% p/v 7. lcool etlico (CH3CH2OH) absoluto 8. Clara de ovo in natura 9. Cloreto de sdio (NaCl) 1 mol/L 10. Soluo saturada de sulfato de amnio [(NH4)2SO4] 76,6g% p/v B. PREPARO DOS REAGENTES 1. Soluo de protenas: preparar uma soluo de clara de ovo a 10% v/v em soluo salina (NaCl 0,9g/100mL) ou tampo fosfato 10mmol/L, pH 7,0. 2. Soluo de ninhidrina: pesar 100mg de ninhidrina e dissolver em 100mL de tampo fosfato 0,01 mol/L, pH 7,0. Conservar em frasco escuro e em geladeira. C. TCNICA 1. REAES DE COLORAO REAO DA NINHIDRINA TUBO 1 - 2mL de ninhidrina + 1mL protena a 10%, banho-maria por 5 min., a 100C. Anotar o resultado. REAO DO BIURETO TUBO 2 - 1 mL de protena a 10 % + 5 gotas de NaOH 2,5 mol/L e 3 gotas de sulfato de cobre a 1%. Anotar o resultado. TUBO 3 - 1 mL de gua destilada + 5 gotas de NaOH 2,5 mol/L e 3 gotas de sulfato de cobre a 1%. Anotar o resultado.
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2. REAES DE PRECIPITAO AO DO CALOR TUBO 4 - 2 mL de protena a 10 %, aquecer em banho-maria a 100C por 3 min. Anotar o resultado. REAO COM REAGENTES PARA ALCALIDES TUBO 5 - 1 mL de protena a 10 % + 1mL de TCA 10%. Anotar o resultado. REAO COM SAIS DE METAIS PESADOS TUBO 6 - 1 mL de protena a 10 % + 1 mL de acetato de chumbo a 5%. Anotar o resultado. REAO COM SOLVENTES ORGNICOS TUBO 7 - 1 mL de protena a 10 % + 3 mL de lcool etlico. Anotar o resultado. EFEITO DA ADIO DE SAIS TUBO 8 - 3 mL de clara in natura + 3mL de gua destilada. Agitar com basto at a formao de precipitado esbranquiado. Adicionar NaCl 1 mol/L gota a gota e homogeneizar o contedo do tubo at o precipitado redissolver. Anotar o resultado. TUBO 9 - 2 mL da soluo anterior + 4 mL de soluo saturada de sulfato de amnio. Observar. Adicionar 4 a 6 mL de gua destilada e observar o efeito. Anotar o resultado.

ASPECTOS TERICOS Fundamentos das reaes

NINHIDRINA

AMINOCIDO

NINHIDRINA

PIGMENTO PRPURA
Fig. 1 - reao da ninhidrina

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Fig. 2 - reao do biureto

CONSTITUINTES DAS PROTENAS Constitudas por aminocidos Estrutura bsica dos aminocidos grupos AMINO e CARBOXILA cargas negativas e positivas carter dos grupamentos R (+ ou -; polares ou apolares) conformao protica LIGAO PEPTDICA Ligaes peptdicas desidratao e constituio da ligao ESTRUTURA DAS PROTENAS Estrutura PRIMRIA aminocidos ligados por ligaes peptdicas Estrutura SECUNDRIA cadeias -hlice e folha Estrutura TERCIRIA dobramentos Estrutura QUATERNRIA mais de 1 protena (subunidades; exemplo - Hemoglobina)

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DESNATURAO DE PROTENAS As estruturas 4, 3 e 2 podem ser desfeitas A estrutura 1 mantida Agentes desnaturantes promovem floculao e coagulao (precipitao) pH alteram as cargas dos aminocidos calor alteram interaes que estabilizam a estrutura tridimensional reagentes para alcalides (cidos) combinam com protenas de carga positiva e formam complexos insolveis sais de metais pesados combinam com protenas de carga negativa e formam proteinatos insolveis solventes orgnicos (etanol) promovem grande atrao entre cargas opostas e precipitam (porque estes solventes tm constante dieltrica inferior gua) F = e+ e- / D . r2 (D da gua maior do que do etanol) D= constante dieltrica (inversamente proporcional a F) Se D pequeno, F tende a ser grande, por isso a F (fora de atrao entre as cargas e+ E e-) maior e a agregao das cargas favorece a precipitao Se D grande, F tende a ser pequeno, por isso a F (fora de atrao entre as cargas e+ E e-) menor e a solubilizao favorecida SOLUBILIDADE DE PROTENAS Variao da solubilidade depende da proporo dos grupos polares e apolares Protena solvel: interao protena-gua Protena insolvel: interao protena-protena

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PRECIPITAO E SOLUBILIZAO DE PROTENAS Podem precipitar protenas sem desnatur-las: Variao de pH Alteraes da fora inica do meio Ao de solventes orgnicos baixa temperatura Quando o pH varia: os radicais dos aa se dissociam e no ponto isoeltrico a fora de atrao eletrosttica mxima, tendendo a precipitar a protena SALTING-IN e SALTING-OUT - influncia de sais neutros em funo da fora inica (protenas no sofrem desnaturao) concentrao reduzida de sal SALTING-IN - solvel diminui interao protena-protena (protena- fica solvel) concentrao aumentada de sal SALTING-OUT insolvel tira gua de solvatao, aumenta interao protena-protena (protena- fica insolvel) IMPORTNCIA: diferentes concentraes de sal podem ser usadas para separar (precipitar/salting-out) diferentes protenas REAES DE COLORAO So possveis devido presena de: GRUPOS AMINO LIGAES PEPTDICAS Reao com NINHIDRINA (aa) colorao prpura grupos amino Reao do BIURETO (oligo/peptdeos) colorao lils grupos de ligaes peptdicas

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RELATRIO caracterizao de protenas O relatrio de aulas prticas deve ser realizado de acordo com as regras da ABNT. As questes que se seguem devem ser abordadas no relatrio. 1. Quais os fundamentos das reaes de colorao, as quais envolvem ninhidrina e sulfato de cobre? 2. Qual a importncia das reaes de precipitao de protenas por reagentes para alcalides e por sais de metais pesados? 3. Explique os mecanismos que levam uma protena a se dissolver quando h um pequeno aumento na fora inica da soluo e os mecanismos que levam uma protena precipitar quando h um grande aumento na fora inica da soluo. 4. As solubilidades de duas protenas em funo da concentrao de sulfato de amnio esto mostradas no diagrama abaixo. Como esta observao pode ser usada para separar as protenas A e B?

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AULA 3 ESPECTROFOTOMETRIA: DETERMINAO DA CONCENTRAO DE PROTENAS


OBJETIVOS Objetivo geral: - abordar a espectrofotometria como mtodo analtico para se determinar a concentrao de solues Objetivos especficos: - elaborar curva de calibrao de acordo com o mtodo espectrofotomtrico - determinar diferentes concentraes de protenas em amostra-problema EXPERIMENTO A. REAGENTES Soluo padro de protena (albumina bovina) 5 mg/mL Amostra problema Reagente de Biureto B. TCNICA A. CURVA DE CALIBRAO 1. Organizar uma bateria com seis tubos e ensaio 2. Identific-los com nmeros de 1 a 6 3. Adicionar os reagentes conforme a tabela abaixo: Tubos Regentes (mL) Soluo padro de protena (5mg/mL) gua destilada Reagente de Biureto 1 1,0 5,0 2 0,2 0,8 5,0 3 0,4 0,6 5,0 4 0,6 0,4 5,0 5 0,8 0,2 5,0 6 1,0 5,0

4. Agitar os tubos e deixar em repouso por 10 minutos 5. Utilizar o tubo 1 para calibrar o espectrofotmetro: 0 de absorbncia em 540 nm 6. Determinar a absorbncia das solues dos tubos 2 a 6 e anotar na tabela abaixo Tubos Absorbncia 1 1 branco 2 3 4 5 6

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B. DETERMINAO DA CONCENTRAO DE PROTENAS EM AMOSTRA PROBLEMA 1. Separar dois tubos de ensaio 2. Identific-los como tubo A e tubo B 3. Adicionar os reagentes conforme abaixo, considerando que o volume da amostra a ser analisada ser de 1mL. Reagentes (mL) Amostra gua destilada Reagente de Biureto Tubos A 1,0 5,0 B* 0,5 0,5 5,0

4. Agitar os tubos e deixar em repouso por 10 minutos. 5. Utilizar o tubo 1 do experimento A para calibrar o espectrofotmetro: 0 de absorbncia em 540 nm. 6. Determine a concentrao de protenas (mg/mL) presente nas amostras problema utilizando a curva de calibrao (prxima aula no Laboratrio de Informtica). 7. Calcule a concentrao de protenas (mg/mL) presente nas amostras problema utilizando a relao AD/AP = CD/CP. Considere a absorbncia do padro de concentrao igual a 3mg/mL (tubo 4) do experimento A (curva de calibrao). (* Anotar fator de diluio da amostra = __________ ) Tubos Absorbncia 1 A B

ASPECTOS TERICOS A espectrofotometria uma tcnica analtica que avalia a capacidade dos solutos absorverem luz em comprimentos de onda especficos. A medida da luz absorvida permite inferir sobre a concentrao do soluto em determinada soluo ou material biolgico. Este mtodo fsico conhecido tambm por fotometria ou colorimetria, e indicado para se determinar a concentrao de solutos normalmente corados como tambm dos incolores, mas passveis de adquirir cor mediante o emprego ajustado de certos reativos. Compostos desconhecidos podem ser identificados por seus espectros caractersticos ao ultravioleta, visvel ou do infravermelho. As concentraes de solues de compostos conhecidos podem ser determinadas medindo-se a absoro em um ou mais comprimentos de onda. Reaes enzimticas podem ser frequentemente seguidas medindo-se espectroscopicamente o aparecimento ou desaparecimento de substrato. O aparelho utilizado o espectrofotmetro e os componentes principais so: A. fonte luminosa (energia radiante); B. dispositivo de focalizao (colimador), o qual transmite um intenso feixe retilneo de luz; C. monocromador (prisma ou grade) utilizado na resoluo da radiao emitida pela fonte luminosa em seus vrios comprimentos de onda (); D. dispositivo para selecionar o comprimento de onda desejado; E. compartimento para a amostra contida em um tubo de ensaio ou cubeta; F. detector com clula fotoeltrica; G. medidor eltrico (galvanmetro) para registrar a intensidade de energia captada pelo detector.

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O monocromador permite selecionar o comprimento de onda ou faixa de comprimentos de onda que incide sobre a soluo, usando-se um prisma ou um filtro tico (vidro colorido). O prisma apresenta maior poder de resoluo, permitindo anlises tanto na regio do visvel quanto do ultravioleta caso do espectrofotmetro. O filtro tico deixa passar faixas de comprimentos de onda e de uso limitado regio do visvel caso do fotocolormetro, uma verso simplificada do espectrofotmetro. As relaes quantitativas nesta tcnica so dadas pela combinao de duas leis: - Lei de Lambert: quando um feixe de luz passa atravs de um meio absorvente (slido ou lquido), pores iguais deste meio iro absorver luz. - Lei de Beer: a absoro da luz proporcional concentrao do soluto na soluo. Da conjuno das duas leis tem-se a Lei de Lambert-Beer, sendo que atravs dessa lei intensidades da radiao incidente e emergente podem ser relacionadas com as concentraes do material presente na soluo. Deve-se levar considerar que: 1. So considerados desprezveis os efeitos de reflexo, refrao e espalhamento 2. A radiao incidente deve ser monocromtica Assim, de acordo com a Figura 1, I0 e I so, respectivamente, as intensidades da radiao incidente e transmitida pela amostra. Muitas vezes, a intensidade transmitida decai exponencialmente com o aumento do caminho percorrido na soluo (comprimento l da Figura 1), e tambm com o aumento da concentrao c: Fig. 1 - Diagrama da absoro de um feixe de luz atravessando uma cubeta de
tamanho l.

log I0/I = l c sendo c a concentrao do material em estudo, l o comprimento interno do recipiente que contm a soluo e () o coeficiente de extino ou absortividade ou coeficiente de absoro, um fator caracterstico da substncia absorvedora (e o solvente), que depende do comprimento de onda da radiao. A grandeza que medimos experimentalmente a absorbncia A, e equivale ao logaritmo da razo entre a intensidade incidente e a transmitida: A = log I0 / I sendo que A = l c O logartmo da relao inversa I / I0 (intensidade transmitida/ intensidade incidente) tambm mensurvel e definido como transmitncia T: T = log I / I0 T = 10l c

Desta forma, destaca-se que: A = l c A absorbncia , portanto proporcional concentrao e espessura da soluo. A constante ou coeficiente de extino corresponde absorbncia de uma soluo de concentrao unitria, por unidade de distncia percorrida pela luz incidente. Quando a concentrao (c) expressa em mol/L e a espessura (l) expressa em centmetros. A absorbncia e transmitncia so lidas em escalas duplas no espectrofotmetro. A absorbncia lida em escala logartmica enquanto que a transmitncia lida em porcentagem em uma escala linear de o a 100%.

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Estabelece-se a seguinte relao: A = log I0 / I log 100/I log 100 log I 2 log I Ento: Quando I0 Quando I Quando I Quando I = 100% =1 = 100% = zero A = 2 log I A=2 A=0 A=

A transmisso medida em termo de luz incidente e luz emergente mas, na realidade, os instrumentos no medem luz incidente uma vez que, se ela for considerada para efeito e clculo, a soluo absorvente parecer mais concentrada do que realmente , devido absoro do tubo (cubeta) e dos outros reagentes eventualmente utilizados. Por isso, necessrio descontar todas as interferncias possveis durante a medida da absorbncia de um soluto especfico. Para tanto, faz-se a calibrao do espectrofotmetro com uma soluo contendo um sistema como o estudado, exceto o composto de anlise, em um tubo (cubeta) igual quele que contm a soluo-problema. Este tubo conhecido como branco e com ele calibra-se o instrumento para 100% de transmitncia o que significa zero e absorbncia. Molculas de substncias diferentes tm diferentes nveis moleculares de energia, por isso cada substncia absorve a radiao de maneira peculiar. Dito de outra forma, os comprimentos de onda que certa substncia absorver so caractersticos da sua estrutura, enquanto outras substncias absorvero outros comprimentos de onda. Se levantarmos dados referentes a intensidade de luz absorvida por uma substncia, em funo dos comprimentos de onda da radiao, estaremos obtendo uma curva chamada espectro de absoro da substncia. O importante que cada substncia tem um espectro caracterstico e, desse modo, se quisermos identificar um material desconhecido, poderemos faz-lo a partir de sua curva de absoro, que pode ser construda testando-se as absorbncias em diferentes comprimentos de onda em um espectrofotmetro. Portanto a seleo do comprimento de onda () a ser utilizado nos mtodos de quantificao de substncias (exemplo: determinao da concentrao de protenas pelo mtodo do biureto que utiliza igual a 540nm) feita de acordo com a sensibilidade mxima, isto , quando h maior alterao na absorbncia por unidade modificada na concentrao.

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CURVA PADRO OU DE CALIBRAO A determinao da concentrao de um soluto em uma soluo-problema pelo mtodo espectrofotomtrico envolve a comparao da absorbncia da soluo-problema com uma soluo de referncia, na qual j se conhece a concentrao do soluto. Em geral utilizada uma soluo-padro com diferentes concentraes que tm sua absorbncia determinada. Com os valores de absorbncia e concentrao conhecidos pode-se traar um grfico cujo perfil conhecido como curva de calibrao ou curva-padro. A reta, que deve passar obrigatoriamente pela origem, indica a proporcionalidade entre o aumento da concentrao e da absorbncia. A poro linear da reta corresponde ao limite de sensibilidade do mtodo espectrofotomtrico para o soluto em questo. Caso os valores de absorbncia das amostras de concentrao desconhecida estejam fora do limite de sensibilidade do mtodo, estes valores devem ser desconsiderados, repetindo-se o experimento com a amostra mais diluda, no caso de absorbncias superiores ao limite mximo da curva ou mais concentrada, no caso de absorbncias inferiores ao limite mnimo da curva de sensibilidade. Pois valores fora da sensibilidade no permitem confiabilidade na concentrao final resultante. Aplicando-se a lei de Lambert-Beer, ao se plotar o valor da absorbncia da amostraproblema no grfico da curva de calibrao pode-se, por projeo, determinar a concentrao do soluto. Isto s ser vlido se a absorbncia, tanto do padro quanto da soluo-problema for determinada utilizando-se as mesmas condies experimentais [comprimento de onda (), espessura (l) e coeficiente de extino molar ()]. Considerando-se ento duas solues, padro (P) e desconhecida (D), temos: AP = . l . CP AD = . l . CD

Como e l so iguais para as duas situaes:

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RELATRIO espectrofotometria O relatrio de aulas prticas deve ser realizado de acordo com as regras da ABNT. As questes que se seguem devem ser abordadas no relatrio. 1. Qual a finalidade e o fundamento da tcnica espectrofotomtrica? 2. O que significa faixa de sensibilidade do mtodo espectrofotomtrico e como ela determinada? 3. Que critrio deve ser usado para selecionar determinado comprimento de onda para uma tcnica espectrofotomtrica? 4. Qual o contedo e a finalidade do tubo branco? 5. De acordo com as Leis de Lambert-Beer, se um determinado composto apresenta um mximo de absoro em 545nm e para uma concentrao de 3mg/mL foi obtida uma absorbncia de 0,22, calcule a concentrao deste composto correspondente a uma absorbncia de 0,15, sabendo-se que o limite de sensibilidade do mtodo utilizado de 0,5 a 5mg/mL.

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AULA 4 LABORATRIO DE INFORMTICA: CONSTRUO DA CURVA PADRO PARA DETERMINAO DA CONCENTRAO DE PROTENAS (ESPECTROFOTOMETRIA)
OBJETIVOS Objetivo geral: - aprender a construir curvas de calibrao no programa Excel , utilizando-se de ferramentas para conferir a confiabilidade da curva Objetivos especficos: - elaborar curva de calibrao para determinar a concentrao de protenas das amostras problema da aula anterior - relembrar clculos de concentraes - resolver exerccios CLCULOS DE CONCENTRAO Calcular a concentrao em cada um dos tubos da curva de calibrao, de acordo com a tabela utilizada para a construo da curva (aula 3 - espectrofotometria): TABELA UTILIZADA PARA CONSTRUIR A CURVA DE CALIBRAO Tubos Regentes (mL) Soluo padro de protena (5mg/mL) gua destilada Reagente de Biureto 1 1,0 5,0 2 0,2 0,8 5,0 3 0,4 0,6 5,0 4 0,6 0,4 5,0 5 0,8 0,2 5,0 6 1,0 5,0

Clculos de concentrao para o tubo 3, por exemplo:

Ci

Vi

Cf Cf (?) Cf

. .

Vf 1 mL (0,6 + 0,4mL)

5 mg/mL 5 x 1

0,4 mL = 0,4 =

Cf = 2 mg/mL

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ROTEIRO PARA UTILIZAR O EXCEL 1. Aps encontrar as concentraes de protena para cada tubo da curva de calibrao deve-se correlacion-las com a absorbncia e cada tubo. Inserindo estes dados numa planilha do Excel, como se segue:
TUBO 1 2 3 4 5 6 [ ] mg/mL 0 1 2 3 4 5 ABS. (nm) 0,000 0,07 0,15 0,23 0,31 (Exemplo com valores hipotticos de absorbncia) 0,39

2. Selecionar primeiramente a coluna [ ] mg/mL (eixo de X, abscissa) e depois a coluna ABS. (nm) (eixo de Y, ordenada). Para selecionar as colunas: pressionando o boto esquerdo do mouse arraste-o sobre a primeira coluna a ser selecionada e ento pressionando a tecla CTRL seleciona-se a outra coluna. 3. Com as colunas selecionadas solicita-se que o programa monte o grfico: a. No menu INSERIR selecione a opo GRFICO b. No ASSISTENTE DE GRFICO selecione: Tipo de grfico DISPERSO e o subtipo DISPERSO COM PONTOS DE DADOS CONECTATO POR LINHA SUAVES e clique em AVANAR c. A opo Intervalo de dados deve estar selecionada na opo SRIES EM COLUNAS e ento clique em AVANAR d. Preencha os dados do seu grfico, clicando nas diferentes fichas que esto disponveis: TTULO (ttulo do grfico, eixo X e eixo Y); EIXOS (preencha as duas quadrculas de opes para que paream os dois eixos); LINHAS DE GRADE (desmarque todas as quadrculas); LEGENDA (desmarque a quadrcula de legenda); RTULOS DE DADOS (deixe todas as quadrculas desmarcadas tambm) e finalmente clique em AVANAR e depois CONCLUIR e. Selecione o quadro cinza do grfico resultante e delete apertando a tecla DELETE no teclado 4. Clique na curva do grfico resultante com o boto direito do mouse e ento clique na opo ADICIONAR LINHA DE TENDNCIA: a. selecione o tipo LINEAR na ficha TIPO b. e na ficha OPES selecione as trs ltimas quadrculas (Definir interseo = 0, Exibir equao no grfico e Exibir o valor de R-quadrado no grfico) e clique em OK c. Ento, utilizando-se da equao do grfico verifique a confiana atravs da anlise do valor de R-quadrado exibido. Quanto mais prximo de +1 o valor do R 2, mais confivel est sua curva de calibrao. Partindo da equao do grfico possvel descobrir a concentrao da amostra problema, pois: y = a x + b, logo y corresponde ao valor de absorbncia da amostra problema, enquanto o valor de x ser correspondente concentrao da amostra problema. Portanto basta colocar o valor da absorbncia da amostra problema e isolar x, desta forma encontrase a concentrao da amostra em questo. Posto que a equao gerada pelo programa Excel nos permite obter os valores de a e b. Sendo que o valor de b no foi gerado devido a opo Definir interseo = 0 que obriga que a curva passe no ponto e origem, desta forma a curva cruza o eixo y em 0, logo b zero.

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EXERCCIOS 1. Construa a curva padro para os seguintes dados experimentais:


Conc. (mg/mL) Abs 1 Abs 2 Abs 3 Abs 4 Abs 5 Abs Mdia (nm)

1 2 3 4 5

0,08 0,15 0,23 0,30 0,37

0,07 0,17 0,25 0,31 0,40

0,09 0,15 0,22 0,33 0,40

0,05 0,13 0,26 0,30 0,35

0,06 0,16 0,21 0,32 0,44

Considere que as absorbncias, em triplicata, das amostras-problema foram:


Amostra Abs 1 Abs 2 Abs 3 Abs Mdia (nm)

A B C

0,09 0,15 0,31

0,07 0,17 0,33

0,08 0,16 0,32

Sendo a amostra A, a amostra C diluda (fator de diluio = 4), calcule as concentraes das amostras A, B e C utilizando dois mtodos: - da relao AD / AP = CD / CP - equao da reta obtida com a construo da curva-padro 2. Trs mililitros de uma soluo A foram diludos a 7,5 mL com gua destilada (sol. B). A absorbncia da soluo a 550nm foi de 0,4. Como voc determinaria a concentrao da soluo A?

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AULA 5 CINTICA ENZIMTICA I


OBJETIVOS Objetivo geral: - entender como se d a compreenso dos mecanismos de ao das enzimas, atravs do estudo da cintica enzimtica, a qual permite determinar a velocidade da reao e como esta se altera em funo das mudanas nos parmetros experimentais Objetivo especfico: - analisar o efeito da variao concentrao da enzima e do tempo de incubao sobre a atividade enzimtica EXPERIMENTO A. REAGENTES 1. Soluo de enzima invertase a10% (v/v) 2. Substrato: Sacarose 0,2 mol/L 3. Soluo tampo acetato 0,05 mol/L, pH 4,7 4. Soluo alcalina de 3,5-dinitro-salicilato 5. Solues pH 4, 5, 6, 7 e 8 B. PREPARO DOS REAGENTES 1. Soluo de enzima invertase (0,1 mg protena/mL): isolamento a partir de leveduras. Pesar 50 mg de leveduras secas (fermento de po), suspender em 250 mL de bicarbonato de sdio 0,15 mol/L e manter em banho-maria a 37C durante 6 horas, com agitao ocasional. Centrifugar o sobrenadante por 20 min. a 3.500 rpm. Coletar o sobrenadante, o qual contm a enzima ativa. Conservar a temperatura de 4C. Normalmente a concentrao de enzimas para os ensaios de 0,1 mg protena/mL. 2. Substrato: Sacarose 0,2 mol/L (68 g para 1L de gua, balo volumtrico) usar esta soluo para obter as solues mais diludas. 3. Soluo tampo acetato 0,05 mol/L, pH 4,7: Acetato de sdio 0,05 mol/L(A), cido actico 0,05 mol/L (B). Misturar 150 mL da soluo A e 300 mL da soluo B. 4. Soluo alcalina de 3,5-dinitro-salicilato: dissolver sob aquecimento 5g de cido 3,5dinitro-saliclico em 100 mL de NaOH 2 mol/L. Separadamente dissolver sob aquecimento 150 g de tartarato duplo de sdio e potssio em 250 mL de gua destilada. Misturar as duas solues e completar o volume para 500 mL com gua destilada.

ATENO!!! OS GRFICOS DESTA AULA, DEVERO SER PLOTADOS NA AULA NO LABORATRIO DE INFORMTICA

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C. TCNICA 1. EFEITO DA VARIAO DA CONCENTRAO DA ENZIMA Organizar uma bateria de 6 tubos de ensaio, numerando de 1 a 6 e adicionar os reagentes de acordo com a tabela: ATENO: A ENZIMA SEMPRE A LTIMA ADIO!! TUBOS 1 2 3 4 5 Tampo acetato (0,05 mol/L pH4,7) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 gua destilada 1,0 0,9 0,8 0,6 0,2 Sacarose (0,2 mol/L) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Soluo de Enzima (0,1 mg/mL) 0,1 0,2 0,4 0,8 Banho-maria a 25C por 5 minutos 3,5-di-nitrosalicilato 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Banho-maria 100C por 5 minutos e deixar resfriar por 5 minutos gua destilada 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 REAGENTES (mL) 6 1,0 0,5 1,0 1,0 6,5

1 2 3 4 5 6 7 8

9. Calibrar o espectrofotmetro a 540nm com o TUBO 1 10. Proceder a leitura das absorbncias dos demais tubos 11. Trace o grfico: concentrao de enzima (g/mL) X absorbncia (Obs. Utilize a relao C1.V1=C2.V2, para encontrar a concentrao final de enzima (protena) em cada tubo, sendo o volume final (V2) igual a 2,5mL. Interprete os resultados) TUBOS ABSORBNCIA 1 branco 2 3 4 5 6

2. EFEITO DA VARIAO DO TEMPO DE INCUBAO Organizar uma bateria de 5 tubos de ensaio, numerando de 1 a 5 e adicionar os reagentes de acordo com a tabela: ATENO: A ENZIMA SEMPRE A LTIMA ADIO!! TUBOS 1 2 3 4 5 Tampo acetato (0,05 mol/L pH4,7) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 gua destilada 1,0 0,8 0,8 0,8 0,8 Sacarose (0,2 mol/L) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Soluo de Enzima (0,1 mg/mL) 0,2 0,2 0,2 0,2 Banho-maria a 25C durante os tempos indicados abaixo para os tubos 2, 3, 4 e 5 TEMPO (min) 0 5 10 15 3,5-di-nitrosalicilato 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Banho-maria 100C por 5 minutos e deixar resfriar por 5 minutos gua destilada 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 REAGENTES (mL)

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10. Calibrar o espectrofotmetro a 540nm com o TUBO 1 11. Proceder a leitura das absorbncias dos demais tubos 12. Trace o grfico: tempo (min) X absorbncia e interprete os resultados TUBOS ABSORBNCIA 1 branco 2 3 4 5

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AULA 6 CINTICA ENZIMTICA II


OBJETIVOS Objetivo geral: - entender como se d a compreenso dos mecanismos de ao das enzimas, atravs do estudo da cintica enzimtica, a qual permite determinar a velocidade da reao e como esta se altera em funo das mudanas nos parmetros experimentais Objetivo especfico: - analisar o efeito da variao o pH e da concentrao de substrato sobre a atividade enzimtica - enfatizar a importncia do estudo da cintica enzimtica para aplicao da ao das enzimas EXPERIMENTO TCNICA 3. EFEITO DA VARIAO DO pH SOBRE A ATIVIDADE ENZIMTICA Organizar uma bateria de 6 tubos de ensaio, numerando de 1 a 6 e adicionar os diferentes tampes e os demais reagentes conforme a tabela: ATENO: A ENZIMA SEMPRE A LTIMA ADIO!! REAGENTES (mL) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Tampo acetato (0,05 mol/L pH 4,0) Tampo acetato (0,05 mol/L pH 5,0) Tampo fosfato (0,05 mol/L pH 6,0) Tampo fosfato (0,05 mol/L pH 7,0) Tampo fosfato (0,05 mol/L pH 8,0) gua destilada Sacarose (0,2 mol/L) Soluo de Enzima (0,1 mg/mL) TUBOS 1 1,0 1,0 0,5 2 1,0 0,8 0,5 0,2 3 1,0 0,8 0,5 0,2 4 1,0 0,8 0,5 0,2 5 1,0 0,8 0,5 0,2 6 1,0 0,8 0,5 0,2 1,0 6,5

Banho-maria a 25C por 5 minutos 3,5-di-nitrosalicilato 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Banho-maria fervente por 5 minutos e resfriar por 5 minutos gua destilada 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5

13. Calibrar o espectrofotmetro a 540nm com o TUBO 1 14. Proceder a leitura da absorbncia dos demais tubos 15. Trace o grfico: variao do pH X absorbncia e interprete o resultado TUBOS ABSORBNCIA
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4. EFEITO DA VARIAO DA CONCENTRAO DO SUBSTRATO Organizar uma bateria de 6 tubos de ensaio, numerando de 1 a 6. Adicionar os reagentes de acordo com a tabela: ATENO: A ENZIMA SEMPRE A LTIMA ADIO!! REAGENTES (mL) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Tampo acetato (0,05 mol/L pH 4,7) gua destilada Sacarose (0,01M) 4mM Sacarose (0,02M) 8mM Sacarose (0,05M) 20mM Sacarose (0,1M) 40 mM Sacarose (0,2M) 80mM Soluo de Enzima (0,1 mg/mL) TUBOS 1 1,0 1,3 0,2 2 1,0 0,3 1,0 0,2 3 1,0 0,3 1,0 0,2 4 1,0 0,3 1,0 0,2 5 1,0 0,3 1,0 0,2 6 1,0 0,3 1,0 0,2 1,0 6,5

Banho-maria a 25C por 5 minutos 3,5 dinitro-salicilato 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Banho-maria fervente por 5 minutos e resfriar por 5 minutos gua destilada 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5

13. Calibrar o espectrofotmetro a 540nm com o TUBO 1 14. Proceder a leitura da absorbncia dos demais tubos 15. Trace o grfico: concentrao final de substrato (mM) X absorbncia 16. Trace o grfico Duplo-Recproco e calcule o Km (constante de Michaelis) TUBOS ABSORBNCIA Interprete os resultados 1 branco 2 3 4 5 6

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ASPECTOS TERICOS TCNICA A invertase uma enzima que catalisa a hidrlise da molcula de sacarose. As unidades de hexose resultantes (-D-glucose e -D-frutose), em meio alcalino e a quente, formam enediis que cedem eltrons para reduzir o reagente 3,5-di-nitrosalicilato (DNS) (de cor amarelo forte) a 3-amino-5-nitrosalicilato (de cor laranja-marrom forte). Cada mol de acar redutor presente na soluo formar 1 mol de 3-amino-5-nitrosalicilato. Portanto, pela determinao da luz absorvida a 540nnm pelo 3-amino-5-nitrosalicilato, pode-se determinar a concentrao de acar redutor presente na soluo. A sensibilidade da tcnica de determinao de acar redutor pelo DNS de 120mols de glucose.

Fig. 1 Hidrlise da sacarose pela enzima invertase

Fig. 2 Reao de deteco dos produtos da hidrlise da sacarose empregando o 3,5-di-nitrosalicilato

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CINTICA ENZIMTICA Enzimas so protenas catalisadoras de reaes que sob condies naturais seriam muito lentas. O aumento da velocidade de uma reao se deve diminuio da energia livre de ativao. O estudo da velocidade das reaes qumicas chama-se cintica e a cintica enzimtica tem por objetivo a compreenso do mecanismo de ao das diferentes enzimas e da velocidade das reaes por elas catalisadas. Este estudo avalia tambm as alteraes na velocidade da reao em resposta a modificaes de parmetros experimentais, como a concentrao do substrato, o tempo de incubao, a temperatura de incubao ou a variao de pH. A quantidade de enzima utilizada em experimentos indicada como unidades de enzima e definida como a quantidade de enzima necessria para transformar 1mol de substrato em produto por minuto e sob condies adequadas. Esta definio dita Unidade Internacional ou simplesmente Unidade. A atividade pode ser tambm definida como a atividade especfica em que se considera a relao entre unidades de enzima e a quantidade de protena. Atividade enzimtica especfica = unidade/mg de protena Atividade enzimtica especfica = mols de produto/minuto/mg de protena

Em 1913 Leonor Michaelis e Maud L. Menten propuseram uma teoria geral para a atividade enzimtica, em que: Enzima + Substrato Complexo Enzima-Substrato Enzima + Produto E + S [ES] E + P Um procedimento comum para se determinar a velocidade de uma reao enzimtica consiste em se misturar enzima com substrato e se observar a formao de produto imediatamente aps se fazer a mistura. Desta forma, evita-se a interferncia da variao da concentrao do substrato e tem-se que a concentrao deste ser muito prxima do valor inicial. Esta situao aplicada a um experimento cintico permite a medida da velocidade inicial (V0) da reao, quando [S] geralmente muito maior que [E], ou seja, pode-se considerar a concentrao de substrato como sendo sempre saturante. O estudo do efeito da variao da [S] na velocidade inicial da reao, quando [E] e tempo de incubao so constantes, fornece um grfico com um perfil de hiprbole retangular perfeita: Analisando o grfico para a condio: concentrao de enzima constante X aumento da concentrao de substrato

Fig. 1 Efeito da concentrao do substrato sobre a velocidade da reao (Km = constante de Michaelis-Menten)

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Em baixa concentrao de substrato [S] tem-se quase toda a enzima na forma livre e a velocidade ser proporcional concentrao de substrato porque o equilbrio de E + S ES ser deslocado para ES medida que [S] aumenta. A velocidade mxima (Vmx) desta reao ser atingida quando toda a E est presente como ES e a concentrao de enzima livre, [E], infinitamente pequena. Nestas condies E est saturada por S e cada molcula de enzima estar catalisando a formao de produto to rapidamente quanto as condies experimentais o permitirem. Neste caso, qualquer aumento em [S] exercer um efeito desprezvel sobre Vmx. Esta condio existir quando [S] for suficientemente elevada para que toda E esteja na forma de ES. Quando E inicialmente misturada com um excesso de S, h um perodo inicial de aumento da concentrao de ES. Esta etapa geralmente muito rpida para ser facilmente detectada. A reao ento atinge um estado no qual a [ES] permanece aproximadamente constante num certo perodo de tempo. Este o perodo onde a velocidade da reao conhecida como Velocidade Inicial (v0) relativa a Vmx. O tratamento matemtico da reao E + S [ES] E + P permitiu o desenvolvimento da equao de Michaelis-Menten:

Em que: Km conhecida como constante de Michaelis e representa concentrao de substrato necessria para se atingir a metade da velocidade mxima. Km expressa em mols de substrato por litro de soluo. Uma vez que no plot de Michaelis-Menten os valores de Vmx e Km no podem ser precisamente determinados, em 1934, H. Lineweaver e D. Burk desenvolveram um tratamento adequado sua determinao. Este tratamento considera o inverso da concentrao de substrato (1/[S]), ou seja, a recproca do plot de Michaelis-Menten. Obtm-se ento uma equao linear na forma y = mx + n cnhecida como Equao de Linewever-Burk ou Equao do Duplo-recproco.

Analisando a equao em relao ao grfico (Figura 2): y = 1/Vmx mx = Km/Vmx . [S] n = 1/Vmx (interseco) m = Km/Vmx (inclinao da reta) Abcissa dada por 1/[S]

Fig. 2 Grfico do duplo-recproco: 1/v0 posto em grfico como funo de 1/[S]. A inclinao Km/Vmx, interseco com o eixo vertical 1/Vmx, e a interseco com o eixo horizontal -1/Km.

Quando 1/v0 = zero (ou y = zero) tem-se que 1/[S] = -1/Km


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O valor numrico de Km de interesse por diversas razes: - Km uma constante particular de cada enzima para um determinado substrato e seu valor fornece um meio de comparao entre as enzimas; - um variao no valor real de Km induzida por um ligante uma maneira de regular a atividade enzimtica; - quando se conhece Km, pode-se ajustar as condies experimentais para se obter [S] >> Km e se determinar a velocidade mxima da reao; - Km indica a interao de substratos alternativos para uma determinada enzima. O substrato com menor valor de Km tem uma afinidade maior para a enzima; - Km permite avaliar se a um nvel intracelular de substrato a enzima estar ativa.

MOTTA, V.T. Bioqumica Bsica: Enzimas, Captulo 3. Autolab Anlises Clnicas; p. 68-101, 2000-2004. In:

RELATRIO cintica enzimtica I e II O relatrio deve seguir as regras da ABNT, sendo que as seguintes questes devem estar respondidas e/ou abordadas no relatrio (as questes que no forem abordadas no corpo do relatrio devero estar apresentadas em ANEXO): 1. Descreva a ao enzimtica da invertase. 2. Como se pode determinar a concentrao dos produtos da reao catalisada pela invertase? 3. Qual o Km obtido para a invertase e qual o seu significado? 4. Qual o pH timo determinado para a invertase e qual o seu significado? 5. Pesquise a importncia de se compreender os mecanismos de ao das enzimas e correlacione este fato com o uso industrial destas protenas.
ATENO AOS GRFICOS QUE FORAM SOLICITADOS E S SUAS INTERPRETAES

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AULA 7 LABORATRIO DE INFORMTICA: ENZIMOLOGIA


OBJETIVOS Objetivo geral: - demonstrar o estudo da cintica enzimtica utilizando-se os dados obtidos dos experimentos realizados nas aulas 8 e 9 com a enzima invertase (enzima modelo) Objetivos especficos: - analisar do efeito da variao da concentrao de enzima, do tempo de incubao, do pH e da concentrao de substrato sobre a atividade enzimtica aps traar os grficos que correlacionam a velocidade inicial com estes parmetros experimentais - traar o grfico duplo-recproco da variao experimental concentrao de substrato - relembrar e aprimorar os conceitos e mtodos da utilizao do programa Excel na produo de plotagens grficas ATIVIDADES Utilizando-se dos dados obtidos nas aulas anteriores 5 e 6: A. Traar o grfico: Concentrao de Enzima (g/mL) X Absorbncia* (nm) GRFICO 1 EFEITO DA CONCENTRAO DA ENZIMA NA VELOCIDADE INICIAL DA REAO DE HIRLISE CATALISADA PELA ENZIMA INVERTASE
*Absorbncia equivale a Velocidade Inicial (V0)

1. Encontrar a concentrao da enzima em cada um dos tubos de ensaio e correlacion-las com a absorbncia e cada um. Inserindo estes dados numa planilha do Excel, como se segue:
TUBO 1 2 3 4 5 6 [E] g/mL 0 4 8 16 32 40 ABS. (nm) 0,000 0,161 0,373 0,798 1,500 1,990 Ci . Vi = Cf Cf Cf . . Vf 2,5mL

0,1mg/mL 0,1 2,5

0,1mL = 0,1 = 4 g/mL

Cf = 0,004 mg/mL =

2. Selecionar primeiramente a coluna [E] g/mL (eixo de X, abscissa) e depois a coluna ABS. (nm) (eixo de Y, ordenada). Para selecionar as colunas: pressionando o boto esquerdo do mouse arraste-o sobre a primeira coluna a ser selecionada e ento pressionando a tecla CTRL seleciona-se a outra coluna. 3. Com as colunas selecionadas solicita-se que o programa monte o grfico: a. No menu INSERIR selecione a opo GRFICO

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b. No ASSISTENTE DE GRFICO selecione: Tipo de grfico DISPERSO e o subtipo DISPERSO COM PONTOS DE DADOS CONECTATOD POR LINHA SUAVES e clique em AVANAR c. A opo Intervalo de dados deve estar selecionada na opo SRIES EM COLUNAS e ento clique em AVANAR d. Preencha os dados do seu grfico, clicando nas diferentes fichas que esto disponveis: TTULO (ttulo do grfico, eixo X e eixo Y); EIXOS (preencha as duas quadrculas de opes para que paream os dois eixos); LINHAS DE GRADE (desmarque todas as quadrculas); LEGENDA (desmarque a quadrcula de legenda); RTULOS DE DADOS (deixe todas as quadrculas desmarcadas tambm) e finalmente clique em AVANAR e depois CONCLUIR e. Selecione o quadro cinza do grfico resultante e delete apertando a tecla DELETE no teclado 4. Compare o grfico resultante com o modelo do grfico terico que relaciona a Concentrao de Enzima com a Velocidade da reao enzimtica e ento interprete e discuta os resultados.

B. Traar o grfico: Tempo (min) X Absorbncia GRFICO 2 EFEITO DO TEMPO DE INCUBAO DA ENZIMA A 25C NA VELOCIDADE INICIAL DA REAO DE HIRLISE CATALISADA PELA ENZIMA INVERTASE 1. Relacionar os tempos de incubao da enzima com as absorbncias de cada um dos tubos de ensaio. Inserindo estes dados numa planilha do Excel, como se segue:
TUBO TEMPO (min.) ABS. (nm) 1 _ 0,000 2 0 0,784 3 5 0,788 4 10 0,789 5 15 0,789

2. Selecionar primeiramente a coluna TEMPO (min.) (eixo de X, abscissa) e depois a coluna ABS. (nm) (eixo de Y, ordenada). Seguem-se ento as mesmas orientaes para o GRFICO 1 (Pontos 2 e 3). 3. Compare o grfico resultante com o modelo do grfico terico que relaciona o Tempo e incubao com a Velocidade da reao enzimtica e ento interprete e discuta os resultados.

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C. Traar o grfico: Variao do pH X absorbncia GRFICO 3 EFEITO DA VARIAO DO pH NA VELOCIDADE INICIAL DA REAO DE HIRLISE CATALISADA PELA ENZIMA INVERTASE 1. Relacionar a ABS. encontrada em cada tubo com seus respectivos valores de pH. Inserindo estes dados numa planilha do Excel, como se segue:
TUBO 1 2 3 4 5 6 pH _ 4 5 6 7 8 ABS. (nm) 0,000 0,391 0,558 0,320 0,093 0,072

2. Seguem-se ento as mesmas orientaes para o GRFICO 1 e 2. 3. Compare o grfico resultante com o modelo do grfico terico que relaciona a Variao de pH com a Velocidade da reao enzimtica e ento interprete e discuta os resultados.

D. Traar o grfico: Concentrao final de substrato (mmol/L) X absorbncia GRFICO 4 EFEITO DA CONCENTRAO FINAL DE SUBSTRATO NA VELOCIDADE INICIAL DA REAO DE HIRLISE CATALISADA PELA ENZIMA INVERTASE 1. As concentraes de substrato j constam na tabela do roteiro de aula prtica, mas caso no estivesse elas poderiam ser calculadas da mesma forma que no Grfico 1 para a concentrao de enzima. Portanto, basta correlacionar as concentraes de substrato com as absorbncias de cada um dos tubos. Insira estes dados numa planilha do Excel, como segue:
TUBO 1 2 3 4 5 6 [S] (mM) 0 4 8 20 40 80 ABS. (nm) 0,000 0,045 0,083 0,245 0,364 0,450

2. Seguem-se ento as mesmas orientaes para os grficos 1, 2 e 3. 3. Compare o grfico resultante com o modelo do grfico terico que relaciona a Concentrao de substrato com a Velocidade da reao enzimtica e ento interprete e discuta os resultados.

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E. Traar o grfico Duplo-Recproco da concentrao final de substrato X absorbncia (V0). No esquecer de inverter os valores de [S] (1/[S]) e Absorbncia (1/Abs. = 1/V0). GRFICO 5 DUPLO-RECPROCO DO EFEITO DA CONCENTRAO FINAL DE SUBSTRATO NA VELOCIDADE INICIAL DA REAO DE HIRLISE CATALISADA PELA ENZIMA INVERTASE 1. Deve-se inverter a concentrao de substrato e os valores de absorbncia e ento coloca-los na planilha do Excel:
TUBO 1 2 3 4 5 6 1/[S] mM 0 0,2500 0,1250 0,0500 0,0250 0,0125 1/ABS. (nm) 0,000 22,22 12,05 4,08 2,75 2,22

2. Seguem-se ento as mesmas orientaes para os grficos 1, 2, 3 e 4. 3. Clique na curva do grfico resultante com o boto direito do mouse e ento clique na opo ADICIONAR LINHA DE TENDNCIA: a. selecione o tipo LINEAR na ficha TIPO b. e na ficha OPES selecione as duas ltimas quadrculas (Exibir equao no grfico e Exibir o valor de R-quadrado no grfico) e clique em OK c. Ento, utilizando-se da equao do grfico encontre a Vmx e depois o Km, lembrando-se da equao de Lineweaver-Burk. d. Lembre-se que o valor de Km expresso em concentrao, pois refere-se a concentrao de substrato presente quando a Vo igual a Vmx pela metade. Por isso a concentrao deve ser ajustada para mmol/L de soluo, pois no experimento tnhamos um volume final de 10mL o eu equivale a 0,01L.

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AULA 8 HIDRLISE E CARACTERIZAO DO AMIDO


OBJETIVOS Objetivo geral: - caracterizao do amido, enfatizando dois diferentes tipos de hidrlise e suas implicaes Objetivo especfico: - caracterizar o amido atravs de hidrlise cida - revisar os conceitos de estrutura desse carboidrato juntamente com as propriedades das enzimas EXPERIMENTO A. REATIVOS 1. Soluo de amido a 1 % 2. Soluo de lugol fraco 3. Reativo de DNS (3,5-dinitrosalicilato) 4. HCl concentrado B. TCNICA HIDRLISE CIDA DO AMIDO: teste do iodo e reao do DNS 1. Colocar 5mL de soluo de amido em um tubo de ensaio (tubo de hidrlise) e lev-lo ao banho-maria fervente. Deixar 1 minuto para homogeneizar a temperatura. Observar se a soluo passa a ficar translcida. 2. Para dar incio hidrlise, adicionar ao tubo 0,2 mL de HCl concentrado, misturar e retirar em outros 2 tubos de ensaio: 0,2mL para o teste do iodo 0,2mL para o teste de acares redutores (DNS) ESTE O TEMPO ZERO DA REAO 3. Imediatamente aps a retirada das alquotas do tempo zero (item 2), recolocar o tubo de hidrlise (soluo de amido mais HCl concentrado) no banho-maria fervente. A seguir nos tempos 5, 10, 20 e 30 minutos de hidrlise, retirar novas alquotas de 0,2mL para o teste do iodo e dosagem do acar redutor.

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PROTOCOLOS PARA OS TESTES DO IODO DE DO DNS: O teste do iodo realizado tomando-se: 0,2mL da amostra (amido + HCl) 3 gotas de lugol 5mL de gua destilada. A dosagem de acar redutor (teste do DNS), consiste em adicionar: 0,2mL da amostra (amido + HCl) 1,0mL de gua 1,0mL de DNS Deve-se aquecer em banho-maria fervente por 5 min e ento adicionar 3mL de gua destilada.

A intensidade das coloraes resultantes deve ser anotada na tabela abaixo: TEMPO (min) TESTE DO IODO (indicar a intensidade da cor) DNS (indicar a intensidade da cor) Interpretar os resultados 0 5 10 20 30

ASPECTOS TERICOS O monossacardeo glucose a mais importante unidade de formao de polissacardeos na natureza. Os polissacardeos de reserva das plantas (amido), dos animais (glicognio) e os polissacardeos estruturais das plantas (celulose) so formados exclusivamente de glucose. O amido encontra-se largamente distribudo no reino vegetal, sendo encontrado em sementes, tubrculos, etc. Dentro das clulas encontra-se na forma de grnulos, sendo caracterstica a aparncia microscpica dos amidos de diferentes fontes. Os principais constituintes do grnulo de amido so a amilose e a amilopectina, polissacardeos que diferem na estrutura molecular. Quando se aquece uma suspenso de amido em gua os grnulos se desintegram e formam uma soluo coloidal de amido. Quando se adiciona uma soluo de iodo ao amido desenvolve-se uma colorao azul, que devida a formao de um complexo de amido com o iodo. O amido um gro formado por dois polissacardeos: amilose e amilopectina. Estes polissacardeos de reserva vegetal constituem-se em unidades de glucose ligadas por ligaes glicosdicas do tipo (14) (amilose) e unidades de glucose ligadas por ligaes glicosdicas do tipo (14) e (16), a amilopectina, que possui pontos de ramificao.

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A reao com iodo utilizada para a pesquisa do amido (carboidrato), que forma um complexo colorido com o iodo. A amilose d origem a uma colorao negro-azulada, enquanto que a amilopectina d origem a uma colorao vermelho-violcea. Este complexo se dissocia por aquecimento e torna a se formar quando a soluo resfriada. A explicao para este fenmeno advm do fato das cadeias lineares de amilose apresentarem uma conformao helicoidal capaz de ocluir o iodo, resultando no desenvolvimento da colorao azul-intensa tpica. Para cada 6 resduos glicosil ligados por (14) da amilose estabelecese um passo da hlice. O aquecimento da soluo de amido deve ento alterar esta conformao e como conseqncia abolir a colorao resultante da interao amilose-iodo. A amilopectina apresenta uma reao semelhante mas a formao da hlice fica em parte dificultada pelos pontos de ramificao da molcula (= ligaes (16). Por esta razo a intensidade da cor iodo-amilopectina menor e seu matiz (mximo de absroo) tambm diferente (violceo-avinhado). No glicognio, ainda mais ramificado que a amilopectina, este impedimento maior e a cor resultante acastanhada. Numa soluo de amido em presena de cido (HCl) e aquecimento, ocorre hidrlise das ligaes glicosdicas dos polissacardeos. Em funo do tempo de hidrlise encontramse produtos intermedirios (oligossacardeos), sendo que o produto final da hidrlise cida a glucose.
Colorao do amido com lugol (iodo): - Amido: negro-azulado - Oligossacardeos maiores: azul prpura - Oligossacardeos menores: avermelhados - Glucose: no desenvolve cor com lugol

ligao glicosdica (14)

extremidade redutora

ligao glicosdica (16)

Fig. 1 Amilopectina: ligaes glicosdicas (14) e (16)

RELATRIO hidrlise e caracterizao do amido O relatrio deve seguir as regras da ABNT, sendo que as seguintes questes devem estar respondidas e/ou abordadas no relatrio (as questes que no forem abordadas no corpo do relatrio devero estar apresentadas em ANEXO): 1. Com relao natureza dos produtos de hidrlise, diferencie a ao de um cido mineral da -amilase salivar sobre o amido. 2. Explicar os resultados obtidos na hidrlises cida do amido, em funo da evoluo das cores obtidas (aos zero, 5, 10, 0 e 30 minutos) com o iodo. 3. Fundamento do mtodo do 3,5-di-nitrosalicitato para dosagem de acares redutores. 4. Supondo que a hidrlise cida mineral do amido fosse parcial a ponto de permitir o isolamento preferencial de dissacardeos qual seria a estrutura dos mesmos (tipos de ligaes glicosdicas)?
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AULA 9 CARACTERIZAO DE TRIACILGLICERIS


OBJETIVOS Objetivo geral: - caracterizar lipdios de acordo com suas caractersticas fsico-qumicas, enfatizando a importncia biolgica destas molculas Objetivos especficos: - identificar triacilgliceris atravs de reaes de hidrlise alcalina: reao de saponificao - evidenciar a formao dos produtos de hidrlise (sabes) pelas suas propriedades - identificar a presena de cidos graxos insaturados por reao de halogenao EXPERIMENTO A. REATIVOS - soluo alcolica de hidrxido de sdio: 1 volume de hidrxido de sdio a 40% e 1 volume de etanol a 95% - leos vegetais - cido actico concentrado - soluo de cloreto de clcio a 10% - soluo saturada de cloreto de sdio B. TCNICA A. REAO DE SAPONIFICAO 1. Em um tubo de ensaio grande colocar: - 30 gotas de leo vegetal - 10mL de soluo alcolica de hidrxido de sdio 2. Aquecer em banho-maria fervente durante 30 min. Nestas condies, o leo saponificado obtendo-se uma soluo opalescente de sais de potssio de cidos graxos (sabes) e glicerol.

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B. PROPRIEDADES DOS SABES A partir da soluo de sabes realizar os seguintes testes: ABAIXAMENTO DA TENSO SUPERFICIAL ERLENMEYER: adicionar 2mL de sabo a um erlenmeyer e adicionar gua destilada (at ~20mL). Agitar a soluo de sabes e verificar a formao de espuma. PRECIPITAO DE CIDOS GRAXOS TUBO 1: a um tubo de ensaio adicionar 1mL de sabo e depois adicionar gota a gota cido actico concentrado (na capela) at notar o aparecimento de um precipitado branco de cidos graxos, que so insolveis devido ao seu baixo grau de dissociao. PRECIPITAO DE SABES DE CLCIO TUBO 2: ao segundo tubo de ensaio adicionar 1mL de sabo e depois adicionar cloreto de clcio a 10% gota a gota at notar o aparecimento de um precipitado de sabes de clcio PRECIPITAO POR EXCESSO DE ELETRLITOS TUBO 3: ao terceiro tubo de ensaio adicionar 1mL de sabo e igual volume de soluo saturada de cloreto de sdio. Observar a formao de um precipitado de sabo por excesso de sais neutros, sendo explicada pelo efeito do on comum, que reprime a dissociao dos sabes fazendo que as micelas percam a carga e precipitem. C. TESTE DO IODO REAGENTES - amostra (leo) - soluo de lugol fraco: iodo 1g, iodeto de potssio 5g, gua destilada para completar 100mL TCNICA TUBO 4: Colocar num tubo de ensaio 1mL da amostra (leo) Adicionar 3 gotas de lugol Aquecer CAUTELOSAMENTE em banho-maria fervente Observe e analise, descrevendo as alteraes do meio reacional abaixo: Colorao ANTES do banho-maria Colorao DEPOIS do banho-maria

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ASPECTOS TERICOS TESTE DE SOLUBILIDADE Este teste permite identificar a presena de lipdios nas amostras. Para isso utilizamos algumas substncias como ter, clorofrmio, gua, cido clordrico e hidrxido de sdio. Sabendo que os lipdios so molculas apolares e conhecendo a lei de dissoluo "semelhante dissolve semelhante", certamente as amostras que contm lipdios formaro solues de apenas uma fase com as substncias apolares; e com as substncias polares solues onde observaremos mais de uma fase. Testando a Solubilidade da amostra que contm lipdio, temos: - ter; Clorofrmio Solvel - gua; cido clordrico; Hidrxido de sdio - Insolvel TESTE DE SAPONIFICAO O teste da saponificao identifica a presena de cido graxo. Para isso coloca-se a amostra na presena de uma base como KOH (hidrxido de potssio) ou NaOH (hidrxido de sdio). Os compostos resultantes, sais de cido graxo (fig. 1), so molculas anfipticas, com uma "cabea" polar (COO- Na+) e uma cauda apolar formada pelo radical "R". Quando em meio aquoso, molculas anfipticas tendem a se agrupar formando estruturas esferides, as micelas. Este o princpio da limpeza de gorduras produzida pelo sabo.

Fig. 1 Reao de Saponificao

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TESTE DO IODO Este teste identifica a presena de cido graxo insaturado. Ocorre uma reao de halogenao, em que o iodo reage com as duplas ligaes do cido graxo insaturado.

Fig. 2 Reao de Halogenao

Se houver dupla ligao, o iodo ser consumido e a colorao caracterstica da soluo de iodo diminuir de intensidade. UM POUCO MAIS SOBRE O LIGAES SATURADAS E INSATURADAS leos so lipdios constitudos principalmente por ligaes duplas, ou seja, insaturadas, enquanto que gorduras (pastosas, consistentes) so constitudas por ligaes simples entre os carbonos das longas cadeias carbnicas, por isso so chamadas gorduras saturadas. A margarina de origem vegetal, advinda da hidrogenao de leos poliinsaturados. A reao de hidrogenao caracteriza-se pela quebra das duplas ligaes (insaturadas) sendo que a ligao quebrada substituda por duas molculas de hidrognio, por isso hidrogenao, adio de hidrognios. Reaes de hidrogenao so produzidas artificialmente com catalisadores inorgnicos e altas temperaturas, portanto os hidrognios so adicionados inespecficamente e desta forma podem formar as gorduras do tipo TRANS. Antes todas as insaturaes eram hidrogenadas, mas com a descoberta de que triglicerdeos saturados aumentam os riscos de desenvolvimento de problemas circulatrios e cardacos, nem todas as insaturaes so hidrogenadas, apenas as necessrias para atingir a consistncia da margarina.

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RELATRIO caracterizao de triacilgliceris O relatrio deve seguir as regras da ABNT, sendo que as seguintes questes devem estar respondidas e/ou abordadas no relatrio (as questes que no forem abordadas no corpo do relatrio devero estar apresentadas em ANEXO): 1. Explique cada uma das reaes ocorridas no ERLENMEYER e nos tubos 1, 2, 3 e 4, fundamentando-as. 2. Cite as principais funes biolgicas dos lipdios correlacionando-as com a estrutura destas molculas. 3. Por que se utiliza etanol na reao de saponificao? 4. Explique a ao detergente dos sabes. 5. Explique o que ocorre na reao de halogenao no teste com iodo. 6. Os lipdios podem ser saturados (apenas ligaes simples) ou insaturados (ligaes duplas). As gorduras so lipdios consistentes, pois as molculas apresentam apenas ligaes simples, enquanto os leos so lquidos devido s insaturaes. A manteiga e a margarina so produzidas com gordura animal e leos vegetais, respectivamente. Ento como se explica que ambas sejam consistentes, posto que leos so caracteristicamente lquidos?

CURIOSIDADE: Sabes na indstria farmacutica... ZANIN, S. M. W.; MIGUEL, M. D.; BUDEL, J. M.; DALMAZ, A. C., Desenvolvimento de sabo base transparente. Revista Viso Acadmica, Curitiba, v. 2, n. 1, p.19-22, Jan./Jun, 2001.

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AULA 10 CARACTERIZAO DE DNA


OBJETIVOS Objetivo geral: - abordar o controle celular realizado pelo DNA, enfatizando a estrutura e propriedades fsicas destas macromolculas Objetivos especficos: - extrair DNA de cebola, kiwi, banana, morango ou tomate - confirmar a presena de DNA atravs da aglomerao destas molculas (fibras visveis) - destacar a estrutura do DNA e suas propriedades fsicas - analisar alteraes na viscosidade do DNA perante aquecimento e resfriamento EXPERIMENTO A. REATIVOS - Soluo de lise - lcool etlico 95% B. PREPARO DOS REATIVOS - soluo de lise: 10mL de detergente concentrado e 6g de cloreto de sdio (equivalente a uma colher sopa) em 100mL de gua destilada. Agitao suave a fim de evitar a formao de espuma. C. TCNICA A. EXTRAO DE DNA 1. Picar o material do qual se extrair o DNA (cebola ou tomate) ou ainda macerar no caso do kiwi, banana ou morango com o auxlio de um saco plstico 2. Adicionar 100mL de soluo de lise ou at que se encubra o material picado ou macerado em um bquer 3. Homogeneizar a mistura, agitando com um basto de vidro suavemente 4. Colocar a mistura em banho-maria a 60C por 15 minutos e agitar de maneira suave esporadicamente, macerando o material 5. Resfriar a mistura em banho de gelo por 5 minutos e agitar de maneira suave esporadicamente 6. Filtrar a mistura com auxlio de uma touca 7. Recolha o filtrado em um bquer, mantendo-o em banho de gelo

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B. PRECIPITAO DO DNA EXTRADO 1. Com o auxlio de um basto de vidro adicionar 2 volumes de etanol 95% gelado ao filtrado da extrao, pela borda do bquer, procurando no misturar as duas solues. 2. O material esbranquiado formado na interfase das duas solues pode ser enrolado, cuidadosamente em movimentos circulares suaves, no basto de vidro. C. ALTERAES NA VISCOSIDADE 1. O material esbranquiado enrolado no basto de vidro deve ser transferido para um tubo de ensaio e dissolvido em 5mL de gua destilada com auxlio do basto de vidro 2. Aquecer esta soluo de DNA em banho-maria fervente por 10 min e observar a viscosidade transferindo o contedo do tubo para outro tubo de ensaio (situao A) 3. Resfriar esta mesma soluo que permaneceu em banho-maria a 100C, com auxlio de uma banho de gelo durante 10 minutos e observar a viscosidade da mesma forma que anteriormente (situao B) Comparar a viscosidade do DNA de cada tubo transferindo o contedo dos tubos para outro tubo de ensaio. Descreva o que pode ser observado: Condies A B Grau de Viscosidade

UM POUCO MAIS SOBRE... Reao em cadeia da polimerase (em ingls Polymerase Chain Reaction - PCR) um mtodo de amplificao (de criao de mltiplas cpias) de DNA, a partir de Escherichia coli ou leveduras, por exemplo. Inventada em 1983 por Kary Mullis, a PCR uma das tcnicas mais comuns utilizadas em laboratrios de pesquisas mdicas e biolgicas para diversas tarefas, como o seqenciamento de genes e diagnstico de doenas hereditrias, identificao de fingerprint gentico (usado em testes de paternidade e na medicina forense), deteco de diagnstico de doenas infecciosas e criao de organismos transgnicos.
Adaptado de http://pt.wikipedia.org

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ASPECTOS TERICOS CARACTERSTICAS DO DNA Uma caracterstica importante do DNA o fato de suas duas cadeias poderem ser separadas quando as pontes de hidrognio entre suas bases so rompidas. Isto pode ser conseguido, por exemplo, por meio do aquecimento da soluo de DNA em altas temperaturas. O ponto mdio de uma faixa de temperaturas nas quais as cadeias de um DNA se separam conhecido como temperatura de fuso Tm (melting temperature). Esta separao pode ser monitorada pelo aumento da densidade ptica da soluo de DNA ou pela perda da viscosidade. Cada molcula de DNA tem uma temperatura de fuso caracterstica e que depende principalmente da proporo de pares de base G-C. Uma vez que cada par G-C apresenta trs pontes de hidrognio, ele mais estvel que o par A-T que forma duas pontes de hidrognio. Quanto mais pares G-C presentes no DNA maior ser a energia necessria para separar as duas fitas. O valor de Tm aumenta cerca de 0,4C cada vez que a quantidade do par G-C aumenta em 1%. Uma soluo de DNA sob condies fisiolgicas apresenta geralmente um valor de Tm de 85-95C. Um DNA com 40% de G-C (tpico de genoma de mamferos) apresenta uma Tm de 87C enquanto que um DNA com 60% de G-C tem um Tm de 95C, ambos sob condies fisiolgicas. O resfriamento da soluo contendo o DNA desnaturado, permite que as pontes de hidrognio voltem a se formar e o DNA readquira as propriedades que podem ser medidas tanto pela diminuio da densidade ptica como pelo aumento da viscosidade. O fato do DNA se desnaturar pela variao da temperatura permitiu o estabelecimento de tcnica de PCR (polymerase chain reaction).

Figura 1 - Representao esquemtica entre dois nucleotdeos

Figura 2 - Detalhe das ligaes de hidrognio entre as bases nitrogenadas

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EXERCCIOS (no necessrio entregar relatrio) 1. Qual a importncia da homogeneizao e agitao espordica no processo de extrao do DNA? 2. Qual a funo dos componentes da soluo de lise: detergente e NaCl? 3. Porque importante colocar a mistura em temperatura por alguns minutos e depois provocar um choque trmico? 4. Qual o papel da filtrao neste processo e qual a funo do etanol? 5. A que se deve a diferena de viscosidade do DNA observada nos experimentos?

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BIOQUMICA ANIMAL
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AULA 1 CROMATOGRAFIA
OBJETIVOS Objetivo geral: - demonstrar a aplicao da cromatografia como mtodo de separao e identificao de compostos de interesse biolgico Objetivos especficos: - separar e identificar uma mistura de aminocidos atravs de cromatografia em papel EXPERIMENTO A. REAGENTES mistura problema solues padro aminocidos 0,1 mol/L: glicina, alanina, triptofano, isoleucina eluente: iso-butanol : cido frmico : gua (20:6:5) (v/v/v) revelador: soluo acetnica de ninhidrina 0,1% B. TCNICA CORRIDA CROMATOGRFICA 1. Colocar eluente num bquer de 1L at a altura aproximada de 0,5cm e tamp-lo com um vidro de relgio (para vedar bem utilize PARAFIM) 2. Preparar o suporte cromatogrfico, cortando um papel filtro na forma de um retngulo de 11x9cm e com um lpis traar uma linha de origem a 1cm da borda inferior e uma linha de limite a 2cm da borda superior. 3. Marcar, com um lpis, na extremidade superior do papel, a abreviao dos aminocidos padres e da mistura-problema correspondente aos locais de aplicao de cada um. 4. Aplicar, com tubos capilares distintos, alquotas da mistura-problema e dos aminocidos padres espaando-as por 1,5cm, secando com o secador de cabelo a cada alquota aplicada no papel. Cuidar para que as amostras sejam aplicadas sempre num mesmo ponto, sem exceder um dimetro de 0,5cm. 5. Assim que todas as amostras aplicadas apresentem-se secas, iniciar a corrida cromatogrfica, colocando o papel no bquer com eluente (extremidade onde foram aplicadas as amostras), de forma que o eluente alcance os pontos de aplicao das amostras por capilarizao ascendente, de forma linear. 6. No momento em que o eluente alcanar a linha de limite superior, pode-se retirar o papel cromatogrfico da cuba, com o auxlio de uma pina e apoi-lo em um vidro de relgio para que este seja levado estufa semi-aberta para o processo de secagem.

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REVELAO DO CROMATOGRAMA 7. Uma vez que se tenha evaporado todo o solvente do cromatograma, deve-se proceder a submerso rpida do papel na soluo reveladora de ninhidrina e ento lev-lo estufa fechada por 5 minutos. ANLISE DOS RESULTADOS 8. Para facilitar a anlise dos resultados, demarcar as manchas utilizando-se lpis. 9. Calcular os Rf. 10. Aps a revelao do cromatograma, observa-se a variao de matriz dos aminocidos padres frente ninhidrina e identificam-se alguns aminocidos presentes na mistura-problema, comparando-os com os Rf dos padres.

ESTUDO DIRIGIDO 1. Qual a importncia da tcnica cromatogrfica para a bioqumica? 2. Em relao s fases estacionria e mvel, explicar a diferena entre cromatografia de adsoro e partio. 3. Explique a nvel molecular (levando em considerao a diferenciao quanto aos grupamentos R) a razo que permite prever a separao dos distintos aminocidos por tcnicas cromatogrficas.

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ASPECTOS TERICOS

CROMATOGRAFIA
PRINCPIOS BSICOS

FACULDADES PEQUENO PR NCIPE FRANCIELY G. COLODI

DEFINIO
CROMATOGRAFIA um mtodo fsico-qumico de separao dos componentes de uma mistura, realizada atravs da distribuio destes componentes entre duas fases que esto em contato

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FUNDAMENTO
Uma das fases permanece estacionria enquanto a outra move-se atravs desta Durante a passagem da fase mvel sobre a fase estacionria, os componentes da mistura so distribudos entre as duas fases, de tal forma que cada componente seletivamente retido pela fase estacionria, o que resulta em migraes diferenciais dos componentes

CLASSIFICAES
Podem ser feitas segundo diferentes crit rios: 1. Tcnica empregada 2. Diferentes tipos de fases utilizadas 3. Mecanismo de separao

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classificaes)

1. TCNICA EMPREGADA
A forma fsica do sistema de cromatografia define a tcnica geral: Cromatografia em coluna a fase estacionria colocada em um tubo cilndrico Cromatografia planar a fase estacionria colocada em uma superfcie planar

classificaes)

2. TIPOS DE FASES
Estado fsico da FASE MVEL: Cromatografia gasosa fase mvel um gs Cromatografia lquida fase mvel um lquido Cromatografia supercrtica fase mvel um vapor pressurizado, em temperatura acima da sua temperatura crtica

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classificaes)

2. TIPOS DE FASES
A Cromatografia lquida pode ser realizada presso atmosfrica ou presses mais elevadas Cromatografia lquida clssica em colunas
de vidro, sob presso atmosfrica, fluxo da fase mvel devido fora da gravidade

Cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) em colunas metlicas, sob presses de fase
mvel elevadas, obtidas com aux de uma bomba de alta presso. Vantagem de lio atingir-se uma elevada eficincia na separa o.

classificaes)

2. TIPOS DE FASES
Estado fsico da FASE ESTACIONRIA: Lquido o lquido pode estar espalhado sobre um suporte slido ou imobilizado sobre este Slido fase estacionria no estado slido

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classificaes)

Classificao de cromatografia pelas formas f sicas


CROMATOGRAFIA
tcnica

PLANAR

EM COLUNA

fase mvel

LQUIDO

GS

FLUIDO SUPERCRTICO

LQUIDO

fase estacionria

LQUIDO SLIDO FASE LIGADA

LQUIDO SLIDO FASE LIGADA

SLIDO

FASE LIGADA

LQUIDO SLIDO

FASE LIGADA

classificaes)

2. TIPOS DE FASES
POLARIDADE RELATIVA das fases: Cromatografia gasosa fase mvel inerte e a separao ocorre devido as interaes das molculas da amostra com a fase estacionria Cromatografia lquida polaridade de ambas as fases importante

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classificaes)

2. TIPOS DE FASES
POLARIDADE RELATIVA das fases: Cromatografia lquida
com FASE NORMAL: quando a fase estacion ria MAIS POLAR do que a fase mvel com FASE REVERSA: quando a fase mvel MAIS POLAR e a fase estacionria mais APOLAR

classificaes)

3. MECANISMO DE SEPARAO
a classificao mais importante, dada por processos: A. Fsicos B. Qumicos C. Mecnicos

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mecanismo de separa o - classificaes)

A. FSICOS
Processos de SORO:

adsoro ou absoro (partio) baseados em atraes eletrostticas ou dipolares (foras de van der Waals) e/ou ainda formao de pontes de hidrognio

mecanismo de separao - classificaes)

A. FSICOS
ADSORO
A dessoro do soluto implica na volta deste fase mvel

fase estacionria slida: a adsoro do soluto ocorre na interface entre o slido e a fase mvel, devido a presena de grupos ativos nas suas superfcies

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mecanismo de separao - classificaes)

A. FSICOS
PARTIO / ABSORO
A volta dos componentes fase mvel depende de sua volatilidade (fase mvel gasosa) ou de usa solubilidade (fase mvel lquida)

fase estacionria lquida: processo intrafacial, ocorre por absoro e baseia-se nas diferentes solubilidades dos componentes da amostra na fase estacionria

mecanismo de separa o - classificaes)

B. QUMICOS
a. Fases estacionrias quimicamente ligadas so preparadas reagindo-se alguns grupos hidroxlicos que se encontram na superfcie do slido (slica), com grupos alquilas ou alquilas substitudos

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mecanismo de separao - classificaes)

B. QUMICOS
a. Fases estacionrias quimicamente ligadas o mecanismo de separao destas fases um compromisso entre PARTI O e ADSORO e as suas contribuies dependem da quantidade relativa de cada tipo de grupo funcional

mecanismo de separao - classificaes)

B. QUMICOS
b. Fases estacionrias com grupos ionizveis constitudas de uma matriz onde so adicionados grupos funcionais ioniz veis, assim so obtidos trocadores aninicos que possuem stios ativos carregados positivamente (retm nions) e trocadores catinicos que possuem s tios carregados negativamente (retm c tions)

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mecanismo de separao - classificaes)

B. QUMICOS
b. Fases estacionrias com grupos ionizveis o mecanismo de separao destas fases um por troca inica, desta maneira se a fase estacionria retm ctions, a fase mvel deve conter ctions capazes de substitu-los preferencialmente

mecanismo de separao - classificaes)

B. QUMICOS

mecanismo de separao por troca inica

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mecanismo de separao - classificaes)

B. QUMICOS
c. Fases estacionrias com grupos de especificidade biolgica quimicamente ligados s matrizes estes grupos podem ser, por exemplo, antgenos, enzimas ou lecitinas e retiram da fase mvel apenas os componentes complementares, os anticorpos, prote nas ou acares, respectivamente, deixando passar todas as outras espcies da amostra

mecanismo de separao - classificaes)

B. QUMICOS

mecanismo de separao por complementariedade

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mecanismo de separao - classificaes)

C. MECNICOS
cromatografia de excluso

Fase estacionria constituda por uma matriz de composio inerte, com partculas de forma, tamanho e porosidade uniformes o mecanismo de separao mecnico, chamando-se cromatografia de excluso

mecanismo de separa o - classificaes)

C. MECNICOS
cromatografia de excluso

na cromatografia de excluso as molculas da amostra so separadas porque as menores so capazes de penetrar facilmente em todos os poros da fase estacionria, equilibrando-se com a fase mvel intrasticial e intersticial, enquanto as maiores so excludas de todos os poros, passando entre os grnulos acompanhando a fase mvel intersticial, isto , a fase mvel que fica fora dos poros

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mecanismo de separao - classificaes)

C. MECNICOS
cromatografia de excluso

as molculas com tamanho efetivo intermedirio migram com velocidades variveis entre os dois extremos, sendo que possuem penetrao seletiva nos poros, entrando em alguns, mas no em todos, e saindo da coluna em ordem relacionada com seu tamanho efetivo

CROMATOGRAFIA: TERMOS TCNICOS


- aplicaes qualitativas e quantitativas - anlise dos cromatogramas desenvolvidos
superfcie planar: anlise direta em coluna: sinais registrados por detector

- mtodos de se obter informaes qualitativas so especficos para cada tipo de cromatografia - termos e definies comuns a todos os tipos de cromatografia

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termos tcnicos)

cromatografia planar
na cromatografia planar, a fase mvel, proveniente de um reservatrio, passa atravs dos pontos de partida da amostra e arrasta os componentes da amostra durante o processo de desenvolvimento define-se por dr a distncia percorrida pelos componentes e por dm a distncia percorrida pela fase mvel

termos tcnicos)

cromatografia planar
o fator de reteno para a cromatografia planar definido por: Rf = dr / dm comparaes do valor de Rf da amostra com o de um padro o mtodo qualitativo mais usado na cromatografia planar

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termos tcnicos)

cromatografia em coluna
na cromatografia em coluna, a linha de base representa a passagem somente da fase mvel atravs do detector quando eluem os componentes so registrados os picos, cujos perfis so proporcionais s concentraes respectivas

termos tcnicos)

cromatografia em coluna
denomina-se dR a distncia percorrida pelo papel desde o instante da injeo da amostra no sistema cromatogrfico at o mximo do pico traado, e de dM a distncia desde a injeo at a eluio de um componente que no interage com a fase estacionria
o dM tambm representa a distncia gasta por uma molcula da fase mvel para ir do ponto de injeo at o detector

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termos tcnicos)

cromatografia em coluna
para a cromatografia em coluna mais comum utilizar ou tempo ou volume, em vez de distncia medida no papel, pois tempo ou volume podem ser diretamente relacionados com o processo ocorrendo na coluna cromatogrfica tR o tempo gasto desde o ato da injeo at a sada do componente do sistema por isso o tempo de reteno (tR) a varivel impressa pelos dispositivos eletrnicos acoplados a sistemas automatizados de cromatografia

termos tcnicos)

cromatografia em coluna
diferente da cromatografia planar, a cromatografia em coluna, normalmente, procede com fluxo contnuo de fase mvel, at que todos os componentes tenham sado da coluna e as suas presenas sejam detectadas pelo detector e indicadas graficamente alternativamente, o eluato pode ser coletado em fra es de volumes idnticos, as suas concentra es medidas e o cromatograma construdo, considerando o nmero do tubo de cada frao equivalente a uma unidade de distncia

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AULA 2 CARACTERIZAO DE UMA ENZIMA MITOCONDRIAL: SUCCINATO DESIDROGENASE


OBJETIVOS Objetivo geral: - demonstrar a integrao entre: ciclo do cido ctrico e cadeia transportadora de eltronsfosforilao oxidativa, enfatizando a importncia destes sistemas na manuteno das funes celulares Objetivos especficos: - caracterizar a frao mitocondrial pela presena da desidrogenase succnica - revisar conhecimentos sobre propriedades das enzimas - enfatizar a importncia de reaes colorimtricas EXPERIMENTO A. REATIVOS 1. Meio de extrao 2. Cloreto de 2,3,5-trifenil-tetrazlio 0,56g%; pH 7,3 3. Succinato de sdio 0,5M; pH 7,3 4. Suspenso de mitocndrias com concentrao de protenas entre 40 e 50 mg/mL 5. Tampo fosfato 0,02M; pH 7,3 B. PREPARO DOS REATIVOS 1. Meio de extrao: sacarose 0,32M em tampo fosfato 0,02M contendo EDTA 0,01M, pH da mistura ajustado para 7,3. 2. Soluo de cloreto de 2,3,5-trifenil-tetrazlio 0,56g%; pH 7,3: pesar 0,56g de sal e solubilizar em 100mL de tampo fosfato 0,02M de pH 7,3. 3. Soluo de succinato de sdio 0,5M; pH 7,3: pesar 9,2g de cido succnico e dissolver em 50mL de gua destilada, titular at pH 7,3 com uma soluo NaOH 10M e completar o volume para 100mL. 4. Soluo de malonato de sdio 0,1M; pH 7,3: pesar 1,04g de cido malnico, dissolver em 50mL de gua destilada, ajustar o pH da soluo para 7,3 com uma soluo de NaOH 10M e completar o volume para 100mL. 5. Isolamento e obteno da suspenso de mitocndrias: fgado de rato deve ser mergulhado em meio de extrao logo aps remoo e ser lavado para remoo do sangue; corta-se o fgado em pedaos minsculos com auxlio de uma tesoura (gelada) e o suspende em 5 volumes de meio de extrao para ser ento homogeneizado mecanicamente ou com liquidificador de baixa velocidade. A suspenso centrifugada por 10 minutos a 1000xg, descarta-se o precipitado e o sobrenadante centrifugado novamente a 8000xg por 10 minutos (precipitao das mitocndrias). O precipitado suspenso em meio de extrao e usado como fonte de enzima (a concentrao desta suspenso deve estar entre 40-50mg de protena por mL).

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C. TCNICA Determinao da atividade da desidrogenase succnica: - identificar 4 tubos de ensaio numerando-os de 1 a 4 - preparar solues em 4 diferentes condies, de acordo com a tabela abaixo: Tubos Reagentes (mL) Tampo fosfato 0,02M pH7,3 Succinato Na 0,5M pH 7,3 Tatrazlio 0,56% Suspenso de mitocndrias Suspenso de mitocndrias fervida por 10 em banho-maria 1 1,4 0,1 0,25 2 1,4 0,25 0,2 3 1,3 0,1 0,25 0,2 4 1,3 0,1 0,25 0,2 -

- aps pipetagem incubar todos os tubos a 37C em banho termostatizado por 30 - observar a alterao da colorao desde os 10 at os 30 de incubao (a cada 5) - anotar resultados em uma tabela que relacione tubos e tempo de incubao e interpretar resultados em funo dos componentes de cada tubo ATENO!! O tubo 3 deve ser preparado da seguinte forma: - adiciona-se 1,3mL de tampo foafato e 0,2mL de suspenso de mitocndrias em um tubo de ensaio, homogeneiza-o e coloca-o em banho-maria fervente por 10 minutos - aps os 10 minutos retira-se cuidadosamente do banho-maria e adiciona-se o succinato (0,1mL) e o tetrazlio (0,25mL) - assim pode-se ento incubar o tubo 3 a 37C juntamente com os outros tubos (1,2 e 4)

Tabela para interpretao dos resultados: Tubos 1 2 3 4 10 15 20 25 30

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ASPECTOS TERICOS

ESTUDO DIRIGIDO 1. Cite a funo dos tubos 1, 2 e 3 no experimento e explique o que aconteceu no tubo 4. 2. Cite a importncia do tampo fosfato e do processo de incubao a 37C no experimento. 3. Cite os aceptores finais de eltrons na mitocndria (sistema biolgico) e no experimento e descreva um exemplo de leso por hipxia e suas conseqncias. 4. Monte um mapa conceitual a partir da palavra ENERGIA e utilize pelo menos 10 das palavras/termos seguintes: ligaes altamente energticas; reaes enzimticas; respirao celular; mitocndrias; ATP; vias anablicas; vias catablicas; funes celulares; O2; reaes de oxidao; acetil CoA; ciclo do cido ctrico; oxidao do succinato; succinato desidrogenase; FADH2; membrana mitocondrial interna; cadeia transportadora de eltrons; fosforilao oxidativa; gradiente de prtons; malonato, fumarato.

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AULA 3 AVALIAO DA GLICEMIA: CURVA GLICMICA


OBJETIVOS Objetivo geral: - verificar a velocidade de captao, pelos tecidos, de um excesso de glucose adicionada circulao Objetivos especficos: - correlacionar as observaes experimentais com os conceitos tericos sobre regulao hormonal da glicemia - aplicar os conhecimentos, j adquiridos, sobre espectrofotometria e clculos envolvendo fatores de diluio PRINCPIO A concentrao de glucose ser determinada em vrios tempos durante o teste. As amostras de sangue devem ser coletadas na presena de fluoreto de sdio que, alm de anticoagulante, inibe a via glicoltica. O seguinte procedimento deve ser adotado: a. Aps 12 a 18 horas de jejum, coletar uma amostra de sangue. b. O paciente deve ingerir de 50 a 100g de glucose (1g/kg de peso para adultos, 1,75g/kg de peso para crianas). c. Coletar amostras de sangue em 60, 120 e 180 minutos aps a ingesto do acar. d. Dosar a concentrao de glucose de cada uma das amostras empregando uma metodologia adequada. EXPERIMENTO A. TCNICA 1. Deixar reagentes atingirem a temperatura ambiente antes da realizao do teste 2. Identificar tubos de ensaio com: Branco, Padro e Testes (jejum, 1h, 2h e 3h aps glucose) Tubos Amostra Padro(1) Reagente de cor (2) Branco 3000 L Padro 30 L 3000 L Teste (J) 30 L 3000 L Teste (1h) 30 L 3000 L Teste (2h) 30 L 3000 L Teste (3h) 30 L 3000 L

3. Homogeneizar bem e incubar os tubos durante 5 min em banho-maria a 37C 4. Ler absorbncia do Padro (Ap) e do Teste (At) zerando o aparelho com o Branco em 500nm 5. A cor estvel durante 2 horas

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ASPECTOS TERICOS O teste de tolerncia a glucose usado no diagnstico de Diabetes Mellitus, embora respostas anormais tambm ocorram em outros estados de doena tais como nefrite e algumas anormalidades endcrinas. O teste mede a capacidade do indivduo para remover da circulao um excesso de glucose adicionada. Normalmente, isto ocorre a uma velocidade tal que a concentrao do sangue no excede o limiar renal e pouca ou nenhuma glucose aparece na urina. A glicemia se eleva na primeira hora, voltando gradativamente ao normal aps duas horas, conforme pode ser verificado atravs da curva glicmica normal, mostrada a seguir:
CURVA GLICMICA NORMAL
160 mg glucose/100mL sangue 140 120 100 80 60 40 0 30 60 90 120 minutos 150 180 210 240
VALORES MDIOS NORMAIS VALORES LIMITES NORMAIS

INSULINA EFEITOS METABLICOS entrada GLC (msculo/adipcitos) entrada GLC (fgado) sntese de glicognio (fgado/msculo) glicogenlise (fgado/msculo) gliclise e sntese de Acetil CoA sntese de cido graxo sntese de triacilgliceris (adipcitos) ENZIMA ALVO transporte de GLC Glucoquinase Glicognio sintase Glocognio fosforilase Fosfofrutoquinase/ Piruvato desidrogenase Acetil CoA carboxilase Lipoprotena lipase

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GLUCAGON EFEITOS METABLICOS glicognese (msculo/fgado) glicogenlise (msculo/fgado) gliclise / produo Acetil CoA (fgado) liplise (adipcito) gluconeognese (fgado) cetognese ENZIMA ALVO Glicognio sintase Glicognio fosforilase Fosfofrutoquinase / piruvato desidrogenase Lipase hormnio sensitiva do adipcito Frutose 1,6-bipase Carnitina acil transferase (c. graxo p/ mit.)

ESTUDO DIRIGIDO 1. Calcule a concentrao de glucose (mg/100mL de sangue) de cada uma das amostras de sangue. 2. Trace a curva glicmica plotando mg de glucose por 100mL de sangue contra o tempo (minutos). 3. Analise e interprete a curva glicmica obtida experimentalmente. CASOS CLNICOS
DIABETES MELLITUS E OBESIDADE D.M., um rapaz de 24 anos, 1,78 m de altura, estudante de ps-graduao, foi atendido em uma clnica para diabticos. Suas principais queixas eram cansao, perda de peso, aumento do apetite, sede e da freqncia urinria. Ele se considerava bem at seis meses atrs, antes da sua consulta. Naquela poca ele se cansava facilmente, tinha tendncia para dormir nas aulas, principalmente depois do almoo. Atribua isso pesada carga de trabalho, um projeto de pesquisa difcil e uma vida relativamente agitada. Os sintomas continuaram e durante os dois meses precedentes perdeu 6,8 kg do seu peso normal de 72,7 kg. Seu apetite era bom; na realidade, era excessivo. Nas 3 ou 4 semanas precedentes tem estado com muita sede e tem urinado mais do que o normal. Comeou a levantar-se at trs vezes por noite para urinar. Com a contnua perda de perda de peso, fraqueza muscular, e freqncia urinria aumentada, tornou-se aparente para D.M. que seu estilo de vida no era a causa desses problemas. Ele se dirigiu ao servio mdico dos estudantes e foi encaminhado para a clnica de diabetes. Na sua histria familiar era significante que seu av materno tinha tido diabetes mellitus, e que morreu aos 50 anos de infarto do miocrdio. O paciente tem uma irm mais velha, 40 anos de idade, obesa, e que recentemente foi diagnosticada como um caso de diabetes de adultos. Desde a idade de 15 anos o paciente experimentou vrios episdios de fraqueza, durante os quais se sentiu trmulo e tinha tonturas. Ele descobriu que comer um doce melhorava os sintomas, e que eles geralmente ocorriam algumas horas depois da refeio. Um exame mdico de rotina aos 18 anos revelou traos de acar na sua urina. Seu mdico fez ento uma glicemia ps-prandial, que foi normal, 5,0 mmol/L (90 mg/ dl). Exames subseqentes de urina no revelaram glicosria. A anlise precedente positiva foi atribuda a um frasco contaminado e esse dado foi deixado de lado. O exame fsico do paciente estava essencialmente dentro dos limites de normalidade. Estudos laboratoriais mostraram uma contagem de glbulos sangneos normal. O exame de urina apresentou uma densidade especfica de 1040 e era 4 + positiva para glicose, usando um tablete de Clinitest; o contedo de glicose em uma anlise de 24 horas foi 0,19 mol (35g). Foram encontrados, 14% de hemoglobina glicosilada. A urina tambm mostrou uma quantidade discreta de corpos cetnicos determinados por tablete de Acetest. Um teste de tolerncia glicose foi feito e uma amostra de sangue foi analisada tambm para outras substncias, como indicado abaixo.

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Questes bioqumicas 1. Quais os fenmenos bsicos que explicam os sintomas do paciente? 2. O que hemoglobina glicosilada? O que os nveis elevados refletem nesse paciente? 3. Quais as diferenas da resposta insulina de um diabtico obeso e um diabtico no obeso? 4. A partir dos valores de eletrlitos, poder-se-ia dizer que o paciente estava em acidose? 5. Os sintomas e os achados laboratoriais poderiam ser devidos a nveis inadequados de insulina? 6. Na entrada do paciente no hospital, qual seria a expectativa dos nveis de glicognio tissular?

CETOACIDOSE DIABTICA CAUSADA POR HIPERTIREOIDISMO Uma mulher de 18 anos de idade chegou a um servio de emergncia em coma profundo. Sua me disse que ela estava dormindo h pelo menos 24 horas. A paciente tinha diabetes mellitus h 8 anos e vinha tomando insulina duas vezes ao dia. Ela normalmente cuidava muito bem de si mesma, analisando seu nvel de acar sanguneo quatro vezes ao dia, cuidando de sua dieta e de exerccios. Sua hemoglobina A1c era normal. Ao longo dos ltimos 3 meses, contudo, sua necessidade de insulina vinha crescendo e agora ela estava tomando 40% mais insulina. A despeito disto, seus valores de glicose estavam na faixa de 18 a 24 mM (normal, 3,5 a 6) e vinha excretando grandes quantidades de corpos cetnicos na urina, reclamando de suor, nervosismo e tremores crescentes, e havia perdido cerca de 14 Kg ao longo dos ltimos 3 meses, a despeito de um apetite voraz. Ao exame fsico, verificou-se que ela no acordava, mas movia todos os membros aps estmulo doloroso. Ela apresentava um tremor leve de repouso e hlito agradvel. Sua presso sangunea era 120/80, com pulso de 140, mas a presso caiu a 70/40, com um pulso de 180, quando foi colocada sentada. Sua pele estava quente, mas seca. Seus olhos pareciam fundos e sua boca estava muito seca. A glndula tireide estava aumentada; cerca de 100 g (normal, 15 a 20). O restante do exame foi normal. Exames de laboratrio mostraram: acar sanguneo 32 mM (normal, 3,5 a 6), sdio, 125 mEq/ L (normal, 137 a 145), potssio, 3,4 mEq/L (normal, 3,5 a 5), cloreto, 84 mEq/L (normal, 95 a 104) e bicarbonato, 6 mEq/L (normal, 22 a 28). O pH do sangue era 7,05 (normal, 7,40 a 7,45). O -hidroxibutirato srico era 15 mM (normal, <0,3). A contagem de clulas brancas estava moderadamente elevada a 11.000, mas o diagnstico diferencial no indicava uma infeco. O exame radiolgico do trax e o ECG foram normais. O exame de urina mostrou nveis elevados de glicose e de cetonas, mas nenhuma infeco. Testes de tireide indicaram tiroxina livre de 4,7 pg/ ml (normal, 0,6 a 2,1), com um nvel de TSH de 0,1 ng/ml (normal, 0,5 a 5,8). Questes bioqumicas 1. Definir a sndrome que ocorre nesta paciente. 2. Explicar as bases bioqumicas de sua patogenia. 3. O que iniciou a cetoacidose? (Considere que o hipertireoidismo aumenta as necessidades de insulina, uma vez que causa resistncia este hormnio e aumenta a velocidade de sua destruio)

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AULA 4 DOSAGEM DE COLESTEROL TOTAL


OBJETIVOS Objetivo geral: - realizar a dosagem de colesterol utilizando-se sangue como material biolgico, seguindo as instrues do Kit de determinao do colesterol por metodologia enzimtica-colorimtrica Objetivos especficos: - revisar as principais funes do colesterol no organismo - correlacionar valores de quantificao do colesterol com possveis anormalidades metablicas EXPERIMENTO A. AMOSTRA A determinao do colesterol deve ser feita em soro ou plasma, sendo que anticoagulantes como heparina, oxalato, fluoreto ou EDTA no interferem. As amostras lipmicas devem ser bem misturadas antes de se iniciar a dosagem. No utilizar amostras fortemente hemolisadas. A amostra de sangue deve ser colhida aps um jejum de 12 horas para evitar a interferncia da lipemia ps-prandial, que geralmente est presente em amostras obtidas sem jejum. B. PREPARO DA AMOSTRA Centrifugar o sangue coletado por 10min a 2.000 rpm. C. TCNICA 1. Deixar reagentes atingirem a temperatura ambiente antes da realizao do teste 2. Identificar tubos de ensaio com: Branco, Padro e Teste Tubos Amostra Padro(1) Reagente de cor (2) Branco 3000 L Padro 30 L 3000 L Teste 30 L 3000 L

3. Homogeneizar bem e incubar os tubos durante 5 min em banho-maria a 37C 4. Ler absorbncia do Padro (Ap) e do Teste (At) zerando o aparelho com o Branco em 500nm 5. A cor estvel durante 2 horas

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ASPECTOS TERICOS

COLESTEROL

25 a 30%

70 a 75%
Formas de colesterol encontrados no plasma

70 a 75%

Reao catalisada pela COLESTEROL ESTERASE

Reao catalisada pela COLESTEROL OXIDASE

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LIPOPROTENAS COMPOSIO MDIA (%) PROTENAS TRIGLICERDEOS COLESTEROL STERES DE COLESTEROL FOSFOLIPDIOS Q 2 84 2 5 7 VLDL 9 54 7 12 18 IDL 21 19 8 27 25 LDL 21 11 8 37 22 HDL 50 4 2 20 24

ESTUDO DIRIGIDO 1. Quais so as principais funes do colesterol em nosso organismo? 2. O que colesterol endgeno e por que sua produo necessria, posto que nosso tubo digestivo capaz de absorver o colesterol ingerido? 3. Por que os nveis de colesterol LDL esto correlacionados com o risco de doena arterial coronariana (DAC) enquanto os nveis de colesterol HDL so inversamente proporcionais ao risco desta doena? 4. Por que o processo de hemoconcentrao pode aumentar os valores de colesterol? 5. Como e por que a presena da Vitamina C (ascorbato) produz interferncia na metodologia utilizada para dosagem de colesterol?

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BIOQUMICA ANIMAL

AULA 5 DETERMINAO DA URIA EM MATERIAL BIOLGICO


OBJETIVOS Objetivo geral: - realizar a dosagem de uria utilizando-se urina e/ou sangue como material biolgico, seguindo as instrues do Kit de determinao de uria pelo mtodo enzimticocolorimtrico Objetivos especficos: - revisar o ciclo da uria, a qual sintetizada no fgado derivada da amnia resultante da desaminao oxidativa de aminocidos e da hidrlise de grupos amida presentes na glutamina e asparagina - correlacionar valores de quantificao da uria com possveis anormalidades metablicas EXPERIMENTO A. AMOSTRA A determinao de uria pode ser feita em urina, soro ou plasma heparina, oxalato, fluoreto ou EDTA. No devem ser utilizados anticoagulantes que contenham sais de amnio. A urina de 24 horas deve ser colhida em frasco contendo 2mL de HCl a 50% (v/v) e deve ser centrifugada antes de ser processada. B. PREPARO DA AMOSTRA Centrifugar o sangue coletado ou a urina por 10 min a 2.000 rpm. C. PROCEDIMENTO A. TAMPO DE USO Adicionar o contedo do frasco TAMPO-ESTOQUE (1) a um balo volumtrico de 500mL e completar com gua destilada. Armazenar em frasco mbar. Estvel por 12 meses entre 28C. B. REAGENTE ENZIMTICO DE USO (fotossensvel) Adicionar REAGENTE ENZIMTICO (2) ao TAMPO DE USO na proporo de 1mL de Reagente Enzimtico para 20mL de Tampo de Uso e homogeneizar. Armazenar em frasco DE VIDRO mbar. No armazenar em frasco plstico. Estvel por 21 dias. C. REAGENTE DE COR DE USO Adicionar o contedo do frasco REAGENTE DE COR-ESTOQUE (3) a um balo volumtrico de 500mL e completar com gua destilada. Armazenar em frasco DE PLSTICO. No armazenar em frasco de vidro. Estvel por 12 meses entre 2-8C.

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D. TCNICA Para a dosagem na urina, diluir a amostra 1:50 (0,1mL de urina + 4,9mL de gua destilada). Multiplicar o resultado obtido por 50. Para dosagem no plasma sanguneo, basta utilizar 20L do mesmo. 1. Identificar tubos de ensaio com: Branco, Padro e Teste Tubos Branco Padro Teste Amostra 20 L Padro 20 L Reagente enzimtico de uso 2000 L 2000 L 2000 L Homogeneizar bem e incubar os tubos durante 5 min em banho-maria a 37C Reagente de cor de uso 2000 L 2000 L 2000 L 2. Homogeneizar bem e incubar os tubos durante 5 min em banho-maria a 37C 3. Ler absorbncia do Padro (Ap) e do Teste (At) zerando o aparelho com o Branco em 600nm 4. A cor estvel durante 2 horas

ASPECTOS TERICOS

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ESTUDO DIRIGIDO 1. INTOXICAO POR AMNIA RESULTANTE DE DIETA COM DEFICINCIA DE ARGININA. Em um estudo realizado alguns anos atrs, depois de jejum por uma noite, alguns gatos receberam uma nica refeio de uma dieta de aminocidos completa, mas sem arginina. Dentro de 2 horas, os nveis de amnia sanguneos aumentaram de um nvel normal de 18g/litro para 140g/litro e os gatos apresentaram sintomas clnicos de intoxicao pela amnia. Um grupo controle alimentado com uma dieta completa de aminocidos ou com uma dieta de aminocido, em que a arginina foi substituda pela ornitina, no apresentou nenhum sintoma clnico anormal: A. Qual era o papel do jejum nesse experimento? B. O que induziu o aumento dos nveis de amnia? Por que a ausncia de arginina levou intoxicao pela amnia? A arginina um aminocido essencial nos gatos? Justifique sua resposta. C. Por que a ornitina pode substituir a arginina? 2. O CICLO DA URIA E AS REAES DE TRANSAMINAO. A aspartato aminotransferase (AST) ou TGO (transaminase glutmico-oxaloactica) tem a maior atividade de todas as aminotrasnferases no fgado dos mamferos. Por qu? 3. ALANINA E GLUTAMINA NO SANGUE. O plasma sanguneo contm todos os aminocidos necessrios para a sntese das protenas corporais, entretanto eles no esto presentes em concentraes iguais. No plasma sanguneo humano, dois aminocidos, alanina e glutamina, esto presentes em concentraes muito maiores do que todos os demais aminocidos. Sugira as possveis razes para esse fato.

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ANEXO I MODELO DE RELATRIO

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REFERNCIAS COLLINS, C.H., BRAGA, G.L. e BONATO, P. S. Introduo a Mtodos Cromatogrficos. 7 ed., Editora da Unicamp, Campinas, 1997. Gold Analisa Diagnstica Ltda., Instrues de uso do kit de dosagem Glicose-PP, agosto, 2005. Gold Analisa Diagnstica Ltda., Instrues de uso do kit de dosagem Colesterol-PP, agosto, 2005. Katal Biotecnolgica Ind. Com. Ltda., Instrues de uso do kit de dosagem Uria enzimtica colorimtrica, maio 2007. LEHNINGER, A. L. Princpios de bioqumica. So Paulo: Sarvier, 2004. Universidade Estadual de Campinas. Departamento de Bioqumica Instituto de biologia. Laboratrio de Aula Prtica: Cromatografia, abril/2007. Disponvel em: http://www.bdc.ib.unicamp.br/rbebbm/baixandoArquivo.php? idMaterial=451&tipoArquivo=codigoBinario&idioma=pt& Universidade Federal do Paran. Departamento de Bioqumica. Bioqumica: aulas prticas. 6 ed. Curitiba: Editora da UFPR, 2001, 178p.

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