Artigo tipo Case Report

UTILIZAO DO DIAGNSTICO GENTICO PRIMPLANTAO NUM CASAL COM HISTRIA DE ABORTAMENTOS DE REPETIO

Nuno Reis Pereira Ferreira da Silva Mestrado Integrado em Medicina Ano Lectivo 2009/2010 Orientador: Dr. Jorge Sousa Braga

ndice

Resumo .............................................................................2 Introduo ..........................................................................3 Case Report.......................................................................3 Discusso ..........................................................................6 Concluso ........................................................................10 Referncias bibliogrficas ................................................11

RESUMO Uma mulher de 37 anos e o marido de 34 anos com histria de abortamentos de repetio recorreram a uma clnica de fertilidade especializada com o desejo de engravidar. A paciente foi sujeita a um ciclo de tratamentos de reproduo medicamente assistida associada a diagnstico gentico pr-implantao. Neste processo foram aspirados 7 folculos de onde resultaram 5 ovcitos que foram fertilizados por injeo intracitoplasmtica de espermatozides. Aps o estudo de hibridao fluorescente in situ apenas 2 embries eram viveis e foram transferidos para o tero da paciente. Obtevese um teste de gravidez, por quantificao da gonadotrofina corinica humana, positivo, contudo a gravidez clnica no foi atingida. Palavras-chave: abortamentos de repetio, reproduo medicamente assistida, diagnstico implantao ABSTRACT A 37-years-old woman and her 34-years-old husband with history of recurrent miscarriages have resorted to a specialized fertility clinic with the intent to conceive. The patient was subjected to a cycle of assisted reproduction treatments associated to preimplantation diagnosis. Seven follicles were aspirated from which resulted five oocytes that were fertilized by intracytoplasmic sperm injection. After the study of fluorescent in situ hybridization only two embryos were viable and were transferred to the uterus of the patient. A pregnancy test, for quantification of human chorionic gonadotropin, was positive, yet the clinical pregnancy was not achieved. Key words: recurrent pregnancy loss, assisted reproduction, preimplantation genetic diagnosis, Robertsonian translocation, implantation failure gentico pr-implantao, translocao Robertsoniana, falhas de

INTRODUO O diagnstico gentico pr-

estadio de blastocisto o que permite uma maior quantidade de material gentico disponvel para testar. Contudo, este mtodo apresenta algumas desvantagens, como o fato de nem todas as culturas possurem condies que permitam ao embrio atingir o estadio de blastocisto in vitro; alm disso, os embries devem ser transferidos para o tero antes do 6 dia aps a fecundao e com esta tcnica pouco o tempo disponvel para fazer o diagnstico. O material (PCR) biopsado ou pode depois in ser situ testado por polimerase chain reaction hibridizao fluorescente (FISH) e os embries no afetados so ento transferidos para o tero (normalmente no so transferidos mais que dois).

implantao (DGPI) o teste realizado a embries para defeitos genticos antes de serem implantados no tero. Desde 1990 que esta tcnica tem sido usada em casais cuja descendncia apresenta risco aumentado para doenas Mendelianas, alteraes cromossmicas e doenas mitocondriais severas. Casais com translocaes Robertsonianas e translocaes recprocas representam a grande maioria da populao que beneficia do DGPI, visto que apresentam altas taxas de infertilidade, abortamentos e nascimento de bebs com alteraes fenotpicas significativas, muitas vezes resultando em bito pr-natal. O DGPI utiliza tcnicas standard da reproduo medicamente assistida, como so a estimulao ovrica, recolha de ovcitos, fertilizao in vitro/injeo intracitoplasmtica de espermatozides e cultura de embries. necessria a biopsia de clulas do embrio e a tcnica mais utilizada consiste na bipsia do blastmero ao 3 dia aps a fecundao, altura em que constitudo por 5 a 10 clulas. A zona pelcida pode ser quebrada usando laser ou uma soluo cida e so ento retiradas 1 ou 2 clulas. Outra opo a bipsia no

CASE REPORT Um casal, constitudo por uma mulher de 37 anos e um homem de 33 anos, recorreu a um centro de procriao medicamente assistida por histria de dois abortamentos precoces. O casal foi sujeito a uma bateria de exames que incluiu histerossalpingografia, caritipo do casal, estudo de hemofilias Todos excepto e o doseamento exames hormonal. normais estes

foram

caritipo do casal onde se encontrou uma translocao Robertsoniana na mulher: 45, XX, der (13;14) (q10;q10). Para satisfazer o desejo do casal de ter um filho recorreu-se reproduo medicamente assistida e ao DGPI. A estimulao ovrica foi iniciada pela aplicao diria via subcutnea com doses fixas de FSH recombinante (FSH-r) (Gonal-F), a partir do 2 dia do ciclo menstrual. No 5 dia do ciclo menstrual iniciou-se o controlo ecogrfico endovaginal seriado com a adaptao das doses subsequentes de FSH-r em funo da resposta ovrica. A monitorizao ovrica ecogrfica foi realizada at se atingir dimetro folicular mdio de 18 a 20 mm, altura em que foi administrada foi medida gonadotrofina por ecografia A corinica plvica aspirao humana (hCG). A espessura endometrial

Decorrido este perodo, o complexo cumulus-corona tipo o VIII foi removido a 5 pela colocao em soluo de hialuronidase permitindo foram classificao ovcitos em definitiva quanto ao grau de maturao e resultado metfase II. Procedeu-se ento injeo intracitoplasmtica dos espermatozides. Utilizando uma micropipeta apreensora, o ovcito foi posicionado com o primeiro corpsculo polar direcionado para 6:00 horas. Aps sua do foi imobilizao (PVP) seu aspirado e flagelo, em a o pela polivinilpirrolidona desestabilizao espermatozide

micropipeta injetora. Em seguida, foi injetado no citoplasma do ovcito s 3:00 horas, isto , no eixo equatorial do ovcito. Os foram ovcitos micromanipulados em cultura e a mantidos

endovaginal

seriada.

fertilizao foi confirmada cerca de 16 a 18 horas depois da ICSI (dia +1), pela presena ou ausncia de pr-ncleos (PN). Foi observada fertilizao normal pela presena de dois prncleos (2PN) e a extruso do segundo corpsculo polar na fase de zigoto em 3 ovcitos. A ausncia de PNs, classificada como falha de fertilizao, foi observada em 1 ovcito. Para a bipsia, retirou-se o embrio do meio de cultura e colocou-se

folicular para a colheita de ovcitos realizou-se pela via transvaginal guiada ecograficamente, administraodo com propofol. 35 de Foram horas aps a O 7 hCG. aspirados

procedimento foi executado sob sedao folculos tendo-se obtido 5 ovcitos. Os ovcitos permaneceram incubados aps a sua captura em meio de cultura HTF (human tubal fluid) a 37 5,0% de C, CO2, por um perodo entre 4 e 6 horas.

num meio prprio para biopsias que tem a particularidade de no ter magnsio nem clcio. Este meio especial ajuda a fluir as ligaes da parede do embrio facilitando assim a biopsia. Ao embrio foi ento adicionada uma gota de soluo tampo (soluo de Tyrode) para quebrar a zona pelcida. Neste procedimento foram utilizadas 3 pipetas, cada uma com uma funo especfica: segurar o embrio na posio mais apropriada, injetar a soluo de Tyrode e realizar a aspirao de blastmeros. Foi tido o cuidado de selecionar clulas com ncleo posterior para de permitir estudo a realizao FISH. Os

citoplasmticos efetuada desidratada paraformaldedo e

com e a

pepsina. fixao lmina a secar

Foi com foi

nova

deixada

temperatura ambiente. As sondas foram preparadas conforme as instrues do fabricante e adicionadas ao material gentico em estudo. Realizou-se a codesnaturao numa placa aquecida a 75 graus clsius durante 3 minutos. Deixouse em repouso durante cerca de 16 horas para ocorrer a hibridao e posteriormente lavou-se para remover o excesso de sonda. Procedeu-se a nova desidratao Adicionou-se permitir a como atrs descrito. 4,6-diamidino-2-fenilindol sua visualizao em

blastmeros aspirados foram colocados e fixados em lmina. Foi adicionada lmina uma soluo cida, constituda por HCl, Tween 20 e gua, que permite a dissoluo do citoplasma das clulas deixando o ncleo intacto. A zona da lmina que continha as clulas foi marcada na sua face inferior com caneta de diamante para permitir a localizao da zona a ser observada com microscpio. As lminas foram depois levadas para um laboratrio de gentica mdica. A lmina passou por um processo de desidratao numa serie ascendente de lcoois (etanol a 80%, 90% e 100%). Seguiu-se remoo digesto de enzimtica, possveis para restos

(DAPI) para contrastar o ncleo e microscpio de fluorescncia, que est equipado com filtros para a visualizao de diferentes cores. Procedeu-se, finalmente, identificao do nmero de sinais por blastmero. O resultado foram 2 embries normais/equilibrados e outro com trissomia 14. (fig.1) Finalmente transferncia selecionados. dos Neste procedeu-se 2 embries

procedimento,

similar a um exame ginecolgico de rotina, colocou-se o espculo na vagina e com um cateter adequado colocaramse os embries na cavidade uterina. A transferncia indolor, portanto no foi necessria anestesia ou analgesia.

Embrio normal/equilibrado

Embrio com trissomia 14

Figura 1 TEL14q

LEGENDA FOTOS - sinais vermelhos: sonda especfica, LSI13q; sinais verdes: sonda telomrica

15 dias aps a transferncia foi quantificada a presena de beta-hCG no sangue da paciente. O resultado foi compatvel com uma gravidez, contudo, 2 semanas depois, quando se realizou o estudo ecogrfico concluiu-se que se tratava de uma gravidez bioqumica.

acrocntricos (13, 14, 15, 21 e 22). Este tipo de rearranjo envolve dois cromossomas acrocntricos, homlogos ou no, que se fundem prximos da regio do centrmero com perda de seus braos curtos. O caritipo resultante em humanos se possui As somente 45 cromossomas j que dois cromossomas uniram. translocaes combinaes translocaes, de os

DISCUSSO Este o caso de um casal com histria de abortamentos de repetio devido a uma translocao Robertsoniana presente no caritipo da mulher. Translocaes Robertsonianas so alteraes cromossmicas que resultam na fuso de cromossomas

Robertsonianas j foram observadas envolvendo cromossomas como em portadores Robertsonianas normais, mas todas outras de so existe acrocntricos. Assim

translocaes fenotipicamente um risco de

formao de gametas no-equilibrados

que podem levar a abortamentos e uma descendncia anormal. A translocao mais comum em humanos envolve os cromossomas 13 e 14 e observada em cerca de 0,97/1000 recm-nascidos e corresponde a 75% de todas as translocaes Robertsonianas (Nussbaum e colegas, 2007). O risco de abortamento quando esta translocao est presente aproximadamente 15% (Scriven e colegas, 2001). Est provado que o DGPI diminui a frequncia de abortamentos de Fisher e em portadores cromossmicas. alteraes colegas

estudos sobre a eficcia do DGPI em casais com translocaes Robertsonianas e recprocas (Lim e colegas e Otani e colegas) com taxas de gravidez com sucesso que variam entre 70 e 95% e taxas de abortamento que variam entre 5 e 15%. Aps a gravidez ser atingida, a probabilidade desejado recprocas, maior translocaes de obter o desfecho entre e de semelhante Robertsonianas o nmero

contudo nas

embries viveis para transferncia translocaes Robertsonianas. Este facto confere um melhor prognstico quanto obteno de uma gravidez com sucesso. Os embries viveis e resultam so de normais/equilibrados

descreve no seu estudo sobre a eficcia do DGPI em casais com histria de abortamentos de repetio uma diminuio das taxas de abortamento de 88,5% sem DGPI para 13% quando estas tcnicas so utilizadas. Estes valores esto prximos dos encontrados no estudo de Munn e colegas em que o uso do DGPI diminui a frequncia de abortamentos de 95% para 12,5%. No estudo de Fisher e colegas foram atingidas atingiram taxas o 3 de gravidez ou que que trimestre

segregao alternada. O estudo de Alves e colegas, que analisou o padro de segregao quando est presente uma translocao Robertsoniana, provou um predomnio da segregao alternada com valores de 63,9% (39/61); isto tambm se observa para as translocaes entre os cromossomas 13 e 14 com taxas de segregao alternada de 65% (31/48). Esta concluso est presente tambm em outros estudos (Conn e colegas, Iwarsonn e colegas e Escudero e colegas). Alm do aumento da percentagem de sucesso no que diz respeito ao

culminaram em nascimento de 94%, 33% de gravidez com sucesso por ciclo de tratamento e 38% de gravidez com sucesso por ciclo de tratamento com transferncia de embrio. Estes resultados so apoiados por outros

nmero de gravidezes o DGPI tem a vantagem necessrio de para diminuir atingir a o tempo gravidez.

tratamento

falhados

em

que

foram

transferidos para o tero embries de boa qualidade, necessrio investigar a causa ou causas que originaram o insucesso das tentativas anteriores e, se possvel, trat-las. As causas que levam ao insucesso da implantao do embrio podem agrupar-se em 3 categorias: diminuio da recetividade endometrial, defeitos do embrio ou multifatorial (endometriose, hidrossalpinge). A patologia diminuio pode no da ser recetividade causada por as endometrial

Goddjin e colegas relatou que, em mdia, eram necessrios 6 anos (com valores entre 2 e 9 anos) de tratamentos com vrios ciclos de fertilizao in vitro para obter uma gravidez com sucesso. Por outro lado, no trabalho de Fisher a gravidez, recorrendo a tcnicas de DGPI, foi alcanada com sucesso, em mdia, apenas com 1,4 ciclos de fertilizao in vitro, um valor muito perto do encontrado por Otani e colegas de 1,2 ciclos. Estes dois estudos demonstram que quando se recorre ao DGPI menos de 3 meses de tratamento so necessrios para atingir uma gravidez com sucesso. As taxas de gravidez usando injeo intracitoplasmtica de espermatozides com ou sem DGPI so semelhantes, podemos ento concluir que a biopsia do embrio no diminui a probabilidade de gravidez (Anderson e colegas, 2008). Quando implantao o com embrio sucesso falha a muitos

diagnosticada,

principais so: hiperplasia, plipos e endometrite. No estudo de Demirol e Gurgan as pacientes em que foram observadas alteraes na histeroscopia e essas alteraes foram tratadas apresentaram taxas de gravidez mais elevadas (32,5%) que as pacientes do grupo controlo (21,6%), em que no foram realizadas histeroscopia. No grupo em que a histeroscopia no revelou qualquer patologia a taxa de gravidez foi de 30,4%. No estudo de de Geyter e colegas a presena de um endomtrio pouco desenvolvido no influenciou a taxa de gravidez atingida. Apesar desta observao de de Geyter vrios especialistas continuam a defender que uma expessura mnima de 4 a 8 mm necessria para haver uma implantao com sucesso. Para atingir este objetivo

pacientes frequentemente desistem. No s pela desiluso e desgaste emocional mas tambm pelos elevados valores monetrios que so necessrios para novo ciclo no de tratamento. Contudo e quando desistem Margalioth

colegas defende que, aps 3 ciclos de

alguns

autores com que a

defendem estimulao originar pode

uma do uma

Estudos de Chao e colegas (1997), Magli e colegas (1998) e Nakayama e colegas (1999) mostraram um aumento significativo das taxas de implantao e gravidez com sucesso aps ecloso assistida. As taxas de implantao e gravidez esto diminudas em mulheres com endometriose (Kuivasaari e colegas, 2005). Uma meta-anlise (Sallam e colegas, 2006) de trs estudos indica que o tratamento com agonistas da hormona libertadora de gonodotrofinas (GnRH) durante 3 a 6 meses antes da execuo das tcnicas de reproduo medicamente para dos o assistida A aumenta maioria a dos probabilidade de atingir uma gravidez qudruplo. investigadores concorda que a exrese endometriomas no apresenta vantagens antes do incio das tcnicas de reproduo medicamente assistida (Garcia-Velasco e colegas, 2004; Wong e colegas, 2004). Outra abordagem endometriose consiste na utilizao de danazol, um derivado da etisterona, um esteride sinttico que impede a libertao de gonadotrofinas. No estudo de Tei e colegas (2003), 81 pacientes com histria de implantao mal sucedida o tratamento com danazol resultou num aumento das taxas de gravidez de 19,5% para 40%. Tambm a hidrossalpinge, presena de lquido na

abordagem endomtrio

reao pseudo-decidual que aumenta a probabilidade da implantao. Friedler e colegas descreveu um protocolo para pacientes com histria de insucesso na altura da implantao que inclui histeroscopia, curetagem, antibioterapia e tratamento com estrognio. Com esta abordagem 43% das pacientes alcanaram a gravidez desejada. Barash e colegas efetuou bipsias repetidas em 45 pacientes. Os resultados de gravidezes e nascimentos aps biopsia nos ciclos de tratamento aumentaram para o dobro, concluindo assim que a estimulao sucesso. Outro mecanismo sugerido por De Vos e Van Steirteghem para o insucesso na implantao a incapacidade da zona pelcida romper aps o desenvolvimento do blastocisto. A zona pelcida torna-se rgida naturalmente aps a fertilizao para evitar a entrada de mais do que um espermatozide. Para contrariar este fenmeno foram desenvolvidas algumas tcnicas de ecloso assistida que consistem na abertura da zona pelucida de forma mecnica, fsica ou recorrendo a laser antes da transferncia do embrio. local do endomtrio aumenta as taxas de implantao com

trompa de Falpio, obstruda devido a infeo, endometriose ou cirurgia prvia, diminui a probabilidade de implantao de embries com sucesso. A hidrossalpinge interfere com as taxas de implantao e gravidez por trs motivos: o lquido presente na trompa em contacto com o tero desloca o embrio dificultando a sua implantao, o lquido possui vrias substncias txicas para o embrio e diminui a recetividade do endomtrio. estudos com em Numa que se o meta-anlise efetuaram nmero de (Jonhson e colegas, 2004) com trs salpingectomias profilticas em mulheres hidrossalpinge gravidezes e nascimentos foi o dobro do atingido no grupo controlo. Assim, a salpingectomia com laparoscpica antes dos recomendada em todas as mulheres hidrossalpinge tratamentos de reproduo medicamente assistida. Existem muitas causas, conhecidas e desconhecidas, para o insucesso na altura da implantao e nem sempre possvel identific-las. Apesar de no haver um protocolo 100% eficaz todos os especialistas da rea concordam que aps uma tcnica falhar mais que uma vez aconselhvel utilizar uma abordagem diferente (Makrigiannakis A, Minas V., 2007).

CONCLUSO Est provado que a reproduo medicamente assistida associada ao diagnstico gentico pr-implantao pode ajudar casais com histria de abortamentos de repetio de causa cromossmica a engravidar. De toda a populao que beneficia do DGPI, as translocaes Robertsonianas so as situaes que apresentam maiores taxas de sucesso pois existe maior nmero de embries viveis disponveis. Quando comparamos a histria natural dos casais com alteraes cromossmicas com os resultados obtidos quando se recorre ao DGPI torna-se claro que esta opo deve estar presente em qualquer sistema nacional de sade. Os portadores de alteraes cromossmicas conhecidos e que j tm histria de abortamentos de repetio devem ser informados que esta tcnica pode ser muito til para satisfazer o seu desejo de ter um filho visto que at 60% dos abortamentos precoces so devidos a aneuploidia. O objetivo do DGPI para aneuploidia aumentar a probabilidade de um casal atingir a gravidez, reduzir o risco de abortamento, e melhorar a sua hiptese de levar para casa um beb saudvel aps fertilizao in vitro.

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REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS 1. Alves C, Sousa M, Silva J and Barros A.. Preimplantation genetic diagnosis using FISH for carriers of Robertsonian translocations: the Portuguese experience. Prenatal 5.

sperm

and

embryos

from

two

45,XY,t(13;14)(q10;q10) Prenat Diagn 20: 599602.

carriers.

ESHRE PGD Consortium Steering Committee. 2002. ESHRE preimplantation genetic diagnosis consortium: data collection III (May 2001). Hum Reprod 17: 233246

Diagnosis 2002; 22: 11531162 2. Andersen Ferraretti Nygren monitoring European Reproduction Felberbaum AN, AP, R, KG. Goossens Bhattacharya de Mouzon European of V, S, J, IVFHuman 6.

Fischer

J,

M.S., T,

Colls M.S.,

P, and

Ph.D.,Escudero

Munne S, Ph.D. Preimplantation genetic diagnosis (PGD) improves pregnancy outcome for translocation carriers with a history of recurrent losses. Reprogenetics, LLC, Livingston, New Jersey. 7. Goddijn M, Joosten JHK, Knegt AC, Van der Veen F, Franssen MTM, Bonsel GJ, et al. Clinical relevance of diagnosing structural in chromosome abnormalities

(EIM) Society and

Consortium, Embryology

(ESHRE). Assisted Reproductive Technology in Europe; 2004 results generated from European registers by ESHRE. Hum Reprod 2008;23:756771. 3. Conn CM, Harper JC, Winston RML, Delhanty JDA. diagnosis carriers fluorescent in 1995. for using situ 8. Preimplantation translocation multicolour

couples with repeated miscarriage. Hum Reprod 12004;9:101317. Iwarsson E, Malmgren H, Inzunza J, et al. 2000. Highly abnormal cleavage Preimplantation 20: 10381047. divisions embryos in from

trisomies 13, 14, 18 and 21 in

hybridisation. Am J Hum Genet 57(Suppl.): A1611. 4. Escudero T, Lee M, Carrel D, Blanco J, Munne S. 2000. Analysis of chromosome abnormalities in

translocation carriers. Prenat Diagn

11

9.

Lim CK, Jum JH, Min DM, Lee HS, Kim JY, Koong MK, et al. Efficacy and clinical outcome of preimplantation genetic diagnosis using FISH for couples of reciprocal and Robertsonian translocations: the Korean experience. Prenat Diagn 2004;24:55661.

In: Thompson, Thompson (eds). Genetics in Medicine. Philadelphia: WB Saunders, 2007, 7576. 15. Otani T, Roche M, Mizuikea M, Colls P, Escudero T, Munn_e S. Preimplantation genetic diagnosis significantly improves the pregnancy outcome of translocation carriers with a history of recurrent miscarriage and failing to produce a live birth. Reprod Biomed Online 2006;13: 87994. 16. Scriven P, Flinter F, Braude P,

10. Margalioth E.J., Ben-Chetrit A., Gal M. and Elden-Geva T., investigation and treatment of repeated implantation failure following IVFET, Human Reproduction, 2006, vol. 21, no.12 pp 3036-3043. 11. Makrigiannakis Mechanisms Reprodutive A., of Minas V.,

Mackie Ogilvie C. Robertsonian translocations-reproductive risks and indications for preimplantation genetic diagnosis. Hum Reprod 2001;16:22672273. 17. Verlinsky Y, Cohen J, Munne S, Gianaroli L, Simpson JL, Ferraretti AP, Kuliev A. Over a decade of experience with preimplantation genetic diagnosis: a multicenter report. Fertil Steril 2004;82:2924. 18. Winter E., Wang J., Davis M. and
Norman R., Early pregnancy loss following technology assisted reproductive Human

implantation, online,

BioMedicine

vol. 14. Comp. No 1.75-82, 2007. 12. Munn S, Escudero T, Sandalinas M, Sable D, Cohen J. 2000.Gamete segregation in female carriers of Robertsonian translocations. Cytogenet Cell Genet 90: 303308. 13. Munn S, Morrison L, Fung J, et al. 1998b. Spontaneous abortions are reduced after preconception diagnosis of translocations. J Assist Reprod Genet 15: 290296. 14. Nussbaum R, McInnes R, Willard H. Principles of clinical Cytogenetics.

treatment,

Reproduction vol.17, no 12 pp. 3220-3223, 2002.

12