RODRIGO ROCHA LATADO

CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS INFRAESTRUTURA

rea de Preparo de Meios de Cultura - gua: destilador e deionizador, osmose reversa ultra purificao

- balanas: analtica ou eletrnica (g at Kg) e (mg at g) - agitador magntico, com aquecimento - distribuidor de meio de cultivo - pHmetro - drogas (sais) - vidrarias
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INFRAESTRUTURA
rea de Esterilizao e Lavagem de Vidraria - autoclave - estufa para secagem - estufa para esterilizao - mquina de lavar vidraria

INFRAESTRUTURA
rea de Manipulao e Exame das Culturas - Capela (cmara) de fluxo laminar - Microscpios: comum, invertido (com fluorescncia) (cmara fotogrfica ou acoplamento a vdeo) - Material para manipulao (pinas, bisturis, esptulas, etc...) - Lupa - Centrfuga - Eletroporador
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INFRAESTRUTURA
Cmara de fluxo laminar vertical

INFRAESTRUTURA
Cmara de fluxo laminar horizontal

INFRAESTRUTURA
rea de Incubao das Culturas - sala com luz e temperatura, controladas - incubadora - agitador orbital (Shaker) rea de Aclimatizao das Plantas - cmara mida - casa-de-vegetao - telado
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MEIOS NUTRITIVOS

Desenvolvimento de Plantas Inteiras

- nutrientes minerais (solo, gua) - CO2 - Cfixado + minerais: sntese de vitaminas e hormnios - sntese de compostos orgnicos ocorre em diferentes rgos Desenvolvimento de Segmentos de Tecidos ou rgos Isolados Cultivo in vitro - condies inadequadas de iluminao e CO2 - plantas no so completamente autotrficas - explantes com baixo teor ou ausncia de clorofila - necessidade de fornecer compostos orgnicos
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MEIOS NUTRITIVOS
Meio Nutritivo ou Meio de Cultura fornecer substncias essenciais para o crescimento permitir que os explantes se desenvolvam em ambiente artificial baseados nas exigncias das plantas inteiras em sais minerais suplementados com componentes orgnicos controlam o padro de desenvolvimento in vitro

MEIOS NUTRITIVOS

HISTRICO
- primeiros trabalhos: solues inorgnicas simples soluo de Knop (1865) soluo de Knudson (1925) soluo de Hoagland & Arnon (1938) - atualmente: meios de cultura mais completos White (White, 1943) MS (Murashige & Skoog, 1962) B5 (Gamborg et al., 1968) KM (Kao & Michayluk, 1975) WPM
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GUA - Mtodos de Purificao

gua grau primrio - alto ndice de impurezas - alta condutividade - utilizada para lavar vidraria gua grau de laboratrio - alto ndice de pureza - baixo nvel de orgnicos e microorganismos - utilizada no preparo de meios de cultura (microbiologia) gua ultrapura (tipo 1) - estdio posterior destilao e deionizao - alta resistividade, baixo nvel de orgnicos e microorganismos - utilizada em tcnicas analticas (HPLC, eletroforese capilar) - utilizada em biologia molecular

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MTODOS DE PURIFICAO DE GUA

Destilao: aquecer ferver evaporar a gua condensar o vapor e coletar alto consumo de energia (1KW/litro) alto consumo de gua (30l/litro) resistividade 1M-cm no elimina CO2, amnia e volteis processo lento

Deionizao: resina de troca inica H+ OHctions nions

processo contnuo resistividade 18M-cm no elimina orgnicos

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MTODOS DE PURIFICAO DE GUA

Osmose Reversa: presso > presso osmtica 90-98% ons orgnicos 100% contaminantes no inicos molculas orgnicas PM >100 no remove gases normalmente associado a resina de troca inica

Adsoro por Carvo Ativado

remove cloro, orgnicos dissolvidos instalado antes do equipamento de purificao

Filtrao em Microporo: filtro de 0.22m elimina bactrias e esporos de fungos

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MEIOS NUTRITIVOS

Componentes Inorgnicos

macronutrientes micronutrientes

Componentes Orgnicos vitaminas fonte de C reguladores vegetais outros: mio-inositol aminocidos antioxidantes substncias complexas carvo ativado
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MEIOS NUTRITIVOS
COMPONENTES INORGNICOS MACRONUTRIENTES

Nitrognio: NH4NO3 e KNO3 Fsforo: Potssio: Clcio: Magnsio: KH2PO4 ou K2HPO4 KH2PO4 e KI CaCl2*2H2O MgSO4*7H2O

Enxofre:

MgSO4*7H2O, MnSO4*H2O, ZnSO4*7H2O, CuSO4*H2O e FeSO4*7H2O

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MEIOS NUTRITIVOS
COMPONENTES INORGNICOS MACRONUTRIENTES

Nitrognio: participa do desenvolvimento geral das plantas

Ninorg aminocidos protenas

NO3-: nitrato [25 - 40mM] NH4+: amnia [2 - 20mM] Total de N: [25 - 60mM]

Norg: aminocidos c. orgnicos casena hidrolisada

Fsforo: parte integrante de c. nuclicos e compostos estruturais

PO4-: [1 - 3mM] Fosfato de sdio ou de potssio
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MACRONUTRIENTES

Potssio: atividades de membrana, controle da osmolaridade

acompanha nitratos e fosfatos

K+ : [20 - 30mM]

Clcio: cofator de enzimas, sntese da parede celular

cloreto ou nitrato de clcio

Ca+2: [1 - 3mM]

Magnsio: integrante da clorofila, atividade de enzimas

sulfato de magnsio

Mg+2 : [1 - 3mM]

Enxofre: estrutura das protenas, presente em aminocidos

sulfato de magnsio

SO4-2 : [1 - 3 mM]

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MICRONUTRIENTES

Boro: atividade enzimtica, biossntese de lignina cido brico: [100mM] Cobalto: cloreto de cobalto: [0.1mM] Cobre: atividade enzimtica sulfato de cobre: [0.1mM] Iodo: iodeto de potssio [5mM] Ferro: sntese de clorofila, reaes de oxi-reduo presente na forma de quelato (EDTA) sulfato de ferro: [100mM]

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MICRONUTRIENTES

Mangans: atividade enzimtica (respirao e fotossntese) sulfato de mangans: [30 - 100mM] Molibdnio: cofator de enzimas molibdato de sdio: [1mM] Zinco: atividade enzimtica sulfato de zinco: [5 - 30mM]

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COMPONENTES ORGNICOS - Fontes de C: sacarose [2 - 5%] hidrolisado em glicose + frutose glicose manitol, maltose, outros - Vitaminas: (mg/l) tiamina: essencial (metabolismo de carboidratos e biossntese de aminocidos) c. nicotnico piridoxina - Outros: mio-inositol: carbohidrato (desenvolvimento de membranas e parede celular)
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- Substncias Complexas: gua de coco extrato de levedura extrato de malte casena hidrolisada - Antioxidantes: cido ascrbico PVP (adsoro de fenis) cido ctrico - Carvo Ativado: [0.2 - 3.0%] - adsoro fenis liberados no meio de cultura - adsoro de componentes orgnicos (auxinas, citocininas) - contribui com o desenvolvimento de razes
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HORMNIOS / REGULADORES DE CRESCIMENTO - essenciais, pois direcionam o processo morfogentico em cultura de tecidos vegetais ( 1 M at 40 M)

Auxinas: primeiro hormnio vegetal identificado (AIA) associadas a stios de alta diviso celular

in vivo: alongamento de clulas dominncia apical formao de raiz adventcia

in vitro: diviso celular, associada a citocinina formao de calo diferenciao de razes inibe desenvolvimento de gemas laterais induo de embriognese somtica
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COMPONENTES ORGNICOS
Auxinas auxina natural: IAA - cido 3-indol actico IBA - cido 3-indol butrico

auxina sinttica: NAA - cido naftaleno actico 2,4-D - cido 2,4-diclorofenoxi actico 2,4,5-T - cido 2,4,5-triclorofenoxi actico

substitutos de auxina: picloram, dicamba - alta concentrao so herbicidas - in vitro atividade de auxina
inibidores da sntese de auxina: HNB - 5-hidroxi-nitrobenzil bromide 7-AZA - 7-azaindole inibidores do transporte de auxina: TIBA - cido 2,3,5-triiodobenzico PCIB - acido isobutrico clorofenoxi actico NPA - cido naftilphthalamico
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COMPONENTES ORGNICOS

Citocininas - dominncia apical (induo de brotaes mltiplas) - balano citocinina/auxina - diviso celular citocinina natural: zeatina 2iP - 2-isopentenil adenina citocinina sinttica: BAP - 6-benzilaminopurina cinetina derivados de feniluria: TDZ thidiazuron atividade de citocinina in vitro estimula sntese de citocinina natural

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COMPONENTES ORGNICOS

Giberelinas: isolada do fungo Gibberella fujikoroi relacionada com alongamento (altura) das plantas cido giberlico (GA3) in vitro: inibe organognese inibe enraizamento estimula alongamento de brotos cido Abscsico: relacionado com a dormncia de sementes e gemas relacionado com a senescncia, absciso de folhas in vitro: diminui o crescimento modera efeito de auxina/citocinina regula desenvolvimento de embries somticos

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AGENTES GELIFICANTES polissacardeos, que servem como suporte as plantas ou explantes. gar-gar produzido pela alga (Gelidium amansii) sofre hidrlise, quando autoclavado em meio cido

Gelrite (Merck) produzido pela bactria (Pseudomonas elodea) usado em menor quantidade (2,5 g/L) mais transparente Phytagel (Sigma) usado em menor quantidade (3,0 g/L) mais transparente
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AGENTES GELIFICANTES Agarose purificado a partir do gar Mais puro, porm muito mais caro vrios tipos (diferentes pontos de solidificao)

-Agentes gelificantes podem podem induzir a hiperhidricidade (vitrificao) dos brotos ou plantas cultivadas in vitro. Hiperhidricidade ou vitrificao - anomalia do tecido, na qual este fica rgido e quebradio, havendo mal formao dos estmatos na plntula e dificuldade de enraizar.

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PREPARO DE MEIOS DE CULTURA PROCEDIMENTOS E CUIDADOS - dissolver sais em gua pura - dissolver auxinas em KOH+ gua pura e estril - dissolver citocininas em HCl + gua pura e estril no misturar produtos que podem precipitar armazenar solues de sais e vitaminas em geladeira armazenar reguladores de crescimento em freezer antes do uso, verificar se no h contaminao ou precipitao

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PREPARO DE MEIOS DE CULTURA UNIDADES DE CONCENTRAO - Porcentagem de volume (% v/v): exemplo: 5% de gua de coco = - Porcentagem de peso (% p/v): exemplo: 2% de sacarose = 20g de sacarose em 1000ml 50ml gua coco + 950ml gua

- Molar (M):

peso molecular (g/L)

1M de AIA= 175,18g/L
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ex. PM do AIA=175,18g

UNIDADES DE CONCENTRAO - Milimolar (mM): 1 M = 1.000 mM 1 mM = 1/1000M ex. PM do AIA=175,18g logo = 0,001M = 10-3 M

1M de AIA= 175,18g/L

1 mM AIA = ??
como 1mM = 1/1000 M 1 mM = 0,1758 g/L = 175,18 mg/L de AIA

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UNIDADES DE CONCENTRAO - Micromolar ( M): 1 M = 1.000.000 M 1 M = 1/1.000.000 M = 10-6 M ex. PM do AIA=175,18g logo 1 M AIA = ?? 1M de AIA= 175,18g/L

como 1 M = 1/1.000.000 M

1 mM = 0,1758 g/L ou 175,18 mg/L de AIA 1 M = 0,0001758 g/L ou 0,17518 mg/L de AIA

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UNIDADES DE CONCENTRAO - mg/L ex. reguladores de crescimento - Ppm: partes por milho = mg/L 1 ppm = 1 parte em 1.000.000 partes 1 L gua pura 1 mL 1 L logo pesa pesa pesa 1 Kg 1g 1 mg (mg/K) (L/L) (mg/L) ou ou
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1 ppm = 1 mg em 1 Kg 1 L em 1 L 1 mg em 1 L

MEIO DE CULTURA MS (Murashige & Skoog, 1962) Meio lquido ajustar o pH 5,8 a 6,0 esterilizar (filtrao ou autoclavagem) Meio semi-slido ou slido ajustar o pH 5,8 a 6,0 acrescentar agente gelificante (Phytagel, gar) esterilizar (filtrao ou autoclavagem)

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ASSEPSIA E ESTERILIZAO Assepsia - Conjunto de procedimentos para tornar um explante livre de microorganismos (bactrias, fungos filamentosos, leveduras, etc...).

Contaminao: crescimento bactria) no meio de cultura.

Fontes:

de microorganismos (fungo

e/ou

explante meio de cultura meio ambiente (rea de trabalho/materiais) operador

Explantes: obtidos de plantas cultivadas no campo, em estufas ou in vitro.

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ASSEPSIA E ESTERILIZAO Assepsia: folhas, sementes, gemas, etc...) lavar em gua corrente com detergente lavar em gua corrente banho em lcool 70% hipoclorito de sdio (3:1) + gotas de tween agitar 15 - 20 min. na cmara assptica, lavar com gua esterilizada (3x)

Meios de Cultura - Autoclave: calor mido (121o C/ 15 - 20min.) - Filtrao: produtos sensveis temperatura (membrana 0,22m)

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ASSEPSIA E ESTERILIZAO rea de Trabalho/Materiais - Esterilizao de Vidraria e Material: calor seco (estufa: 140 - 180o C/ 2 a 4h.) calor mido (autoclave) + secagem (estufa) raios-gama: plsticos descartveis

Flambagem das pinas e bisturis durante o trabalho

- Limpeza Laboratrio e Vidraria lcool: balco e capela detergente + H2O destilada: vidraria desinfetante: cho

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