MINISTRIO DA EDUCAO E DO

DESPORTO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARAN

CONSELHO NACIONAL DE
DESENVOLVIMENTO CIENTFICO
E TECNOLGICO

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM
BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR
DA UFPR

DEFESA PBLICA DE
DOUTORADO
JOO RICARDO M. ALVES COSTA
Bilogo Licenciado
(Cincias Biolgicas UFPR)
M.Sc., Cincias Biolgicas: Morfologia
(Biologia Celular UFPR)
CRBio: 41428

PADRONIZAO DE METODOLOGIAS PARA O USO DE BIOMARCADORES
DE CONTAMINAO AMBIENTAL EM TRARA
(HOPLIAS MALABARICUS, ERYTHRINIDAE):
PARMETROS HEMATOLGICOS, OXIDATIVOS E VITELOGENINA

Orientao:
Prof. Dr. Ciro Alberto de Oliveira Ribeiro
Lab.
o
TOXICOLOGIA CELULAR
Dept.
o
Biologia Celular

Co-orientao:
Prof.
a
Dr.
a
Helena Cristina da Sliva de Assis
Lab.
o
TOXICOLOGIA AMBIENTAL
Dept.
o
Farmacologia
BIOMARCADORES

RESPOSTA BIOLGICA de um organismo ( INDIVIDUAL ) que
ocorre da EXPOSIO do mesmo a um XENOBIONTE

ALTERAES FISIOLGICAS ou MORFOLGICAS
em VIAS METABLICAS,
CLULAS, TECIDOS ou
SISTEMAS INTEGRADOS do organismo

PROCESSO ALTERADO: uma RELAO (causa-efeito) de
componentes de um sistema biolgico entre si e entre
os componentes daquilo que no o sistema biolgico em
questo.

DETECTVEL ou MENSURVEL por mtodos
bioqumicos, fisiolgicos, histolgicos ou morfolgicos (imagem)
POUCA
RELEVNCIA
ECOLGICA
GRANDE
RELEVNCIA
ECOLGICA
RESPOSTA A
LONGO PRAZO
RESPOSTA A
CURTO PRAZO
parmetros
bioqumicos
enzimas de
desintoxicao
parmetros
imunolgicos

parmetros
histopatolgicos

condies
bioenergticas
populaes &
comunidades
capacidade
reprodutiva
parmetros
fisiolgicos
ADAMS et alii
1989
OBJETIVOS

exteno
ou
extrapolao




ensaios
prvios
spp BR

mtodos
fceis e
baratos

MOLCULA CLU
LA
TECIDO RGO SISTEMA ORGA
NISMO
POPULAO COMUNIDADE ECOSSISTEMA
repostas moleculares
possuem propriedades
RESULTANTES
em nveis
mais complexos e
SUBSEQNTES...
SISTEMA HEPTICO
(HEPATCITO)

Expresso de METALOTIONENA
indut.: metais, EsROx e ESxH
tolerncia a EsROx, p.ex.:H
2
O
2

atividade antioxidante


HOMEOSTASE OXIDATIVA
tolerncia a EsROx
atividade antioxidante:
SOD, CATALASES,
peroxidases, GSHp
GSH S-t, GSHr
[GSH]


Expresso de P450
uso de EsROx em oxidaes
l catabolismo (MFOS):
oxidao de esterides
l ativ. monoxigenases associadas
p.ex.: EROD


Expresso de VITELOGENINA
regulada por 17|-Estradiol

xenobionte com:
ativ. estrognica
(machos e jovens)
ativ. anti-estrognica
(fmeas)

HOMEOSTASE DE Zn
&
ATIVIDADE DE METALOENZIMAS
SISTEMA REPRODUTOR
NEUROENDCRINO

CREBRO

HIPOTLAMO
GtRH (+) / DPM ()

HIPFISE
GtH I & GtH II (+)
e outros (+/)

TESTCULO/OVRIO
ESxH e outros fatores
dimorfismo sexual
gametognese (Zn)
incorpora VT (GtH I)

o-ALAd

inibio :
ANEMIA
PORFIRIA

l [ pre-HEME ]
[ HEME ]
l [ o-ALA ]

ESTRESSE
OXIDATIVO
COMPOSTOS DE OXIGNIO PARCIALMENTE REDUZIDOS
e
-
e
-
e
-
e
-

O
2
O
2

H
2
O
2
OH

H
2
O

superxido dismutase
O
2
-
+ O
2
-
+ 2 H
+
H
2
O
2
+ O
2


CATALASE

2 H
2
O
2
2 H
2
O + O
2


CATALASE

R-O-OH + AH
2
H
2
O + R-OH + A
GSSG red
GS-SG + 2 NADPH 2 GSH + 2 NADP
+

GSH perox
2 GSH + ROOH GSSG + H
2
O + ROH

Glutationa S-transf

GSH + ROH GSROH
tiol transferases

GSH + R-SH

GSSR

citocromo P450

O
2
+ RH ROH
I
II
Exemplo de CONJUGAO (fase II)
com uso da GLUTATIONA como substrato;
outros possveis substratos (outras enzimas):
glicuronil, sulfato, metil, acetil, glicil
Atividade das CATALASES
como PEROXIDASES:
aumento da
HIDROSOLUBILIDADE
PEROXIDAO
SUBSTRATOS PARA
OXIDAES BIOLGICAS
Interaes de demanda
e produo de substratos

Glutationa S-transf

GSH + ROH GSROH
tiol transferases

GSH + R-SH

GSSR

citocromo P450

O
2
+ RH ROH
superxido dismutase
O
2
-
+ O
2
-
+ 2 H
+
H
2
O
2
+ O
2


CATALASE

2 H
2
O
2
2 H
2
O + O
2


CATALASE

R-O-OH + AH
2
H
2
O + R-OH + A
GSSG red
GS-SG + 2 NADPH 2 GSH + 2 NADP
+

GSH perox
2 GSH + ROOH GSSG + H
2
O + ROH
I
II
Interaes de demanda
e produo de substratos

Glutationa S-transf

GSH + ROH GSROH
tiol transferases

GSH + R-SH

GSSR

citocromo P450

O
2
+ RH ROH
superxido dismutase
O
2
-
+ O
2
-
+ 2 H
+
H
2
O
2
+ O
2


CATALASE

2 H
2
O
2
2 H
2
O + O
2


CATALASE

R-O-OH + AH
2
H
2
O + R-OH + A
GSSG red
GS-SG + 2 NADPH 2 GSH + 2 NADP
+

GSH perox
2 GSH + ROOH GSSG + H
2
O + ROH
I
II
Interaes de demanda
e produo de substratos

Glutationa S-transf

GSH + ROH GSROH
tiol transferases

GSH + R-SH

GSSR

citocromo P450

O
2
+ RH ROH
superxido dismutase
O
2
-
+ O
2
-
+ 2 H
+
H
2
O
2
+ O
2


CATALASE

2 H
2
O
2
2 H
2
O + O
2


CATALASE

R-O-OH + AH
2
H
2
O + R-OH + A
GSSG red
GS-SG + 2 NADPH 2 GSH + 2 NADP
+

GSH perox
2 GSH + ROOH GSSG + H
2
O + ROH
I
II
Interaes de demanda
e produo de substratos

Glutationa S-transf

GSH + ROH GSROH
tiol transferases

GSH + R-SH

GSSR

citocromo P450

O
2
+ RH ROH
superxido dismutase
O
2
-
+ O
2
-
+ 2 H
+
H
2
O
2
+ O
2


CATALASE

2 H
2
O
2
2 H
2
O + O
2


CATALASE

R-O-OH + AH
2
H
2
O + R-OH + A
GSSG red
GS-SG + 2 NADPH 2 GSH + 2 NADP
+

GSH perox
2 GSH + ROOH GSSG + H
2
O + ROH
I
II
Interaes de demanda
e produo de substratos
ERYTHRINIDAE
GNERO Hoplias (TRARAS)
ampla distribuio geogrfica:
NEOTROPICA
posio elevada na CADEIA TRFICA
BIOENSAIOS REPRODUZVEIS
ADAPTVEIS
S CONDIES
DE LAB
o
.
Hoplias malabaricus
Pb
++

Hoplias COMO
MODELO EXPERIMENTAL
IN VIVO

EXPOSIO SUBLETAL
SUBCRNICA (< 10 % longv.)
POR VIA TRFICA
DESINFECO e DESINFESTAO das traras
ACLIMATAO sempre > 20 DIAS
30 l de GUA FILTRADA ( celulose > carvo ativado ) por TRARA
AERAO CONSTANTE por sistema integrado de bombas de ar
TEMPERATURA (21 2
o
C) controlada por TERMOSTATOS
FOTOPERODO: 12 horas CLARO // 12 horas ESCURO
LIMPEZA: TROCA DE 1/3 DA GUA a CADA 5 DIAS
ALIMENTAO A CADA 5 DIAS:
PEIXES VIVOS com ~ 10 % da BIOMASSA DA TRARA
a
L
a
70 DIAS
14 doses
MS222
cido etil-ster-3-aminobenzico
0,02% (v/v)
ATIVIDADE DA ALAd

PARMETROS
HEMATOLGICOS

TEORES DE
METALOTIONENA

CAPTULOS
I e II:
MATERIAIS,
MTODOS
DOSES NOMINAIS INGERIDAS

Pb(NO
3
)
2
em SOLUO AQOSA NEUTRA
para:
21 g Pb
++
.g
-1
trara per 120 horas

CH
3
Hg.Cl em SOLUO HCl
aq
1 mN (pH 2)
para:
75 ng H
3
C-Hg
+
.g
-1
trara per 120 horas

PEIXE PESO quantidade (g) Injetado no usar 10% da [SE]: diluir 1:10 (v/v)
AQ.No. (g) de HgCH
3
+
/trara vetor (ml)
1 190 14,25 0,17 81,59 g HgCH
3
+
.ml
-1
2 176 13,20 0,16 81,59 soluo estoque
3 191 14,33 0,18 81,59 diluda (SED)
pH 3
C = C
M
.MM
o
= 1000.d.T = C
N
.E
o
acidificao da Soluo Estoque
pH = 7 (neutro: equilbrio a 25
o
C)
[H
+
] = [OH
-
] = 10
-7
M
para pH = 2
[H
+
] = 10
-2
M = 0,01 M
>> adicionar mono-cido (HCl)
em concentrao final de 0,01 N = 0,01 M
>> cada diluio 1:10 (v/v) da SE
em gua destilada a 25
o
C
aumenta 1,00 unidade de pH
>> INJETADO: soluo pH 3
25 ml 0,01 N 0,02 ml 12,08 N (MM = 36,45 g/mol )
\\ 0,03 % \\ 37 % ( d = 1,19 g/ml )
V
f
C
f
V
i
C
i
V
f
. C
f
= C
i
. V
i
2,4 > pH > 4,2
o-ALAs: sintetase do o-aminolevulinato
o-ALA: o-aminolevulinato (linear)
o-ALAd: desidratase do o-aminolevulinato
PBG: porfobilinognio (1 anel)
sHEME: heme-sintetase ou ferro-quelatase
4PBG
o-ALAd
PBG
o-ALA + o-ALA
o-ALAs
o-ALA
GLICINA +
4X
5 ENZIMAS
4 ETAPAS
3 COMPOSTOS
INTERMEDIRIOS
PROTOPORFIRINA IX
(4 anis)
KREBS
SUCCINIL-CoA
HEME
(4 anis)
HEMEs
Fe
++

o-ALA
o-ALA
o-ALA
o-ALA
o-ALA o-ALA
o-ALA
o-ALA
0,1 m 0,1 m 0,1 m
OLIVEIRA RIBEIRO te al., 2006
HEMOCITMETRO DE NEUBAUER
contagem de:
ERITRCITOS (x 10
6
RBC.mm
-3
)

CONCENTRAO de HEMOGLOBINA
[HB] (g.dl
-1
)
curva padro de referncia

HEMATCRITO Ht (%)
micro-hematcrito em capilares

VOLUME CORPUSCULAR MDIO - MCV ( m
3
ou fl )
volume mdio dos eritrcitos
MCV = Ht (abs) x 1000 / 106 RBC.mm
-3


HEMOGLOBINA CORPUSCULAR MDIA - MCH ( pg.clula
-1
)
quantidade mdia de hemoglobina por eritrcito
MCH = [HB] (g.dl-1) x 10 / 106 RBC.mm
-3


CONCENTRAO DE HEMOGLOBINA CORPUSCULAR MDIA
que a [Hb] (g.dl
-1
) no sangue total, corrigida para o volume
correspondente aos eritrcitos
MCHC ( g.dl
-1
)
MCHC = [HB] (g.dl
-1
) / Ht (abs)
PARMETROS
HEMATOLGICOS
PARMETROS HEMATOLGICOS
HEMOCITMETRO DE NEUBAUER - contagem de:
LEUCCITOS ( x 104 leuc.mm-3 )

CONTAGEM DIFERENCIAL DE LEUCCITOS
na periferia de ESFREGAOS distendidos em lmina
colorao de May-Grnwald // Giemsa:

NEUTRFILOS (citosol rseo)
neutrfilos / 100 leuccitos contados

MONONUCLEARES (citosol azul)
linfcitos + moncitos / 100 leuccitos contados
modificado de VIARENGO et al. (1997)
METALOTIONENA
homogeneizar tecido em TH (1:4, v/v)
sacarose 500 mM
PMSF 500 M e
|-mercaptoEt-OH 0,01 %
Tris-HCl 20 mM (pH = 8,6)
21 460 x g por 20 min., a 0-4
o
C
fracionao cida com
Et-OH (C
F
= 49,3 %)
Clorofrmio (C
F
= 3,8 %) a -20
o
C
precipitar PTS (1:45, v/v) com HCl 37 %
adicionar 3xV de Et-OH abs. (-20
o
C) para C
F
= 87 %
-20
o
C por 1 hora fechado
6 000 x g por 10 min., a 0-4
o
C; desprezar SN
ressuspender com
Et-OH (87 %)
Clorofrmio (1 %) em TH
6 000 x g por 10 min., a 0-4
o
C; desprezar SN; SECAR
ressuspender com NaCl a 250 mM
acidificar (1:2, v/v) com
Na
2
EDTA.2H
2
O (CF = 2 mM)
HCl (C
F
= 0,5 N)
adicionar o ressuspenso (1:14) em
DTNB 0,43 mM em NaCl 2 M
Na
2
HPO
4
200 mM (pH = 8)
3 000 x g por 5 min.

Milan Vak
&
Daniel W Hasler
-SH
-S-Cd-S-
1/3
CYS
MICROPLACA: 300 l a 405 nm
0 60 120 180 240 300 360 420 480 540
0
25
50
75
100
125
150
175
200
225
250
275
300
325
350
375
400
425
450
[GSH] (M)
(
O
D
)
.
(
1
0
0
0
)
MICROPLACA: 200 l a 405 nm
(mdias dos 3 modos de leitura)
0 60 120 180 240 300 360 420 480 540
0
25
50
75
100
125
150
175
200
225
250
275
300
[GSH] (M)
(
O
D
)
.
(
1
0
0
0
)
CURVAS DE REFERNCIA
COM PADRES DE GSH
ler o SN: OD a 405 nm

BRANCO:
NaCl 125 mM
EDTA 2 mM
em HCl 0,5 N
-SH + DTNB COR AMARELA
ATIVIDADE DA ALAd

PARMETROS
HEMATOLGICOS

TEORES DE
METALOTIONENA

CAPTULOS
I e II:
RESULTADOS,
DISCUSSO
CTRL
H
3
C-Hg
+
0
50
100
150
200
250
300
350
400
n
m
o
l

-
S
H

.
g
-
1

t
e
c
i
d
o

(
p
.
u
.
)
CTRL
H
3
C-Hg
+
0
50
100
150
200
250
300
350
n
m
o
l

-
S
H

.
g
-
1

t
e
c
i
d
o

(
p
.
u
.
)
BRNQUIAS
FGADO
CINTICA da o-ALAd para Hoplias malabaricus
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
[o-ALA] (mM)
A
t
i
v
i
d
a
d
e

r
e
l
a
t
i
v
a
:

O
D
/
O
D
m
a
x
Lineweaver-Burk
-1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5
0.5
1.0
1.5
2.0
1/[o-ALA]
1
/
O
D
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
[o-ALA] (mM)
A
t
i
v
i
d
a
d
e

r
e
l
a
t
i
v
a
:

O
D
/
O
D
m
a
x
Lineweaver-Burk
-1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5
0.5
1.0
1.5
2.0
1/[o-ALA]
1
/
O
D
[ [o o- -ALA]: 4 mM ALA]: 4 mM
~ 11 vezes K
m
K
m
= 0,3653
7 animais 7 animais
r
2
= 0,917
Incubao a 37
o
C por 1 hora
valores de absorbncia a 550 nm
divididos pelo maior valor
obtido em cada animal
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
[o-ALA] (mM)
A
t
i
v
i
d
a
d
e

r
e
l
a
t
i
v
a
:

O
D
/
O
D
m
a
x
Lineweaver-Burk
-1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5
0.5
1.0
1.5
2.0
1/[o-ALA]
1
/
O
D
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
[o-ALA] (mM)
A
t
i
v
i
d
a
d
e

r
e
l
a
t
i
v
a
:

O
D
/
O
D
m
a
x
Lineweaver-Burk
-1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5
0.5
1.0
1.5
2.0
1/[o-ALA]
1
/
O
D
[ [o o- -ALA]: 4 mM ALA]: 4 mM
~ 11 vezes K
m
K
m
= 0,3653
7 animais 7 animais
r
2
= 0,917
Incubao a 37
o
C por 1 hora
valores de absorbncia a 550 nm
divididos pelo maior valor
obtido em cada animal
0 9 18 27 36 45 54 63 72 81
0.0
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
2.4
2.8
TEMPERATURA (
O
C )
O
D
/
O
D

A

3
7
O
C
POLINMIO DE POLINMIO DE
TERCEIRA ORDEM TERCEIRA ORDEM
(6 animais) (6 animais)
Temperatura de Incuba Temperatura de Incuba o: 37 o: 37
o o
C C
0 9 18 27 36 45 54 63 72 81
0.0
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
2.4
2.8
TEMPERATURA (
O
C )
O
D
/
O
D

A

3
7
O
C
POLINMIO DE POLINMIO DE
TERCEIRA ORDEM TERCEIRA ORDEM
(6 animais) (6 animais)
Temperatura de Incuba Temperatura de Incuba o: 37 o: 37
o o
C C
CTRL
Pb
++
HgCH
3
+
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
**
**
(
O
D
)
.
(
D
)
.
(
[
H
B
]
)
-
1
.
(
t
)
-
1
Enzymatic inhibition and morphological changes
in Hoplias malabaricus from dietary exposure
to lead (II) or methylmercury.

ALVES COSTA et alii, 2006. PRELO
EXPERIMENTO I EXPERIMENTO II
PARMETROS
Or igem: Toledo (PR) Or igem: FE Canguir i (UFPR)
Cont r ole EPM H3C-Hg
+
EPM Cont r ole EPM Pb
++
EPM

n
(1)
9 9 6 6

RBC
(2)
1,63 0,06 *1,91 0,09 1,90 0,13 1,99 0,07
[HB]
(3)
5,07 0,11 ***6,02 0,19 5,62 0,60 5,27 0,38
Ht
(4)
25,33 1,14 ***35,22 1,27 23,33 0,80 25,67 1,02
MCV
(5)
155,53 5,38 ***185,4 3,87 126,21 11,12 129,31 5,32
MCH
(6)
31,35 1,06 31,90 1,33 30,74 4,78 26,45 1,58
MCHC
(7)
20,36 1,07 *17,23 0,69 23,90 2,02 20,44 0,78

Lk
(8)
3,96 0,26 ***6,40 0,31 0,37 0,14 0,25 0,11
Nt
(9)
3,78 0,62 *8,89 1,73 3,33 1,23 3,83 0,87
Mn
(10)
96,22 0,62 *91,11 1,73 96,67 1,23 96,17 0,87


CTRL
Pb
++
HgCH
3
+
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
**
**
(
O
D
)
.
(
D
)
.
(
[
H
B
]
)
-
1
.
(
t
)
-
1
*p < 0,05
**p < 0,01
***p < 0,001
OBSERVAO INDIRETA DE
DANOS OXIDATIVOS
histopatologia: rim ant., fgado
RABITTO et al., 2005
citogentica: quebras e inverses
cometa: danos ao DNA
CESTARI et al., 2004
21 g Pb
++
.g
-1
biomassa a cada 5 dias
VITELOGENINA
E
REPRODUO
CAPTULO
III

ln N
m
[ ( n
m
n
i
) + 1 ]
ln N
i
[( n
i
n
i
) + ( n
i
N
i
)] ( RGS
i
RGS
e
)
IAR = 100
ln N
m
[ ( n
m
n
i
) + 1 ]
ln N
i
[( n
i
n
i
) + ( n
i
N
i
)] ( RGS
i
RGS
e
)
IAR = 100
AGOSTINHO, A. A.; SUZUKI, H. I.; SAMPAIO, A. A.; BORGES, J. D. R.
ndice de atividade reprodutiva: uma proposta para avaliao da
atividade reprodutiva em peixes. In: Encontro Brasileiro de Ictiologia, 9.,
1991. Resumos. Maring : UEM. p.53. 1991.
N
i
: nmero de indivduos na unidade amostral considerada
(um valor por rea amostrada);
n
i
: nmeros de indivduos em reproduo nas unidades amostrais consideradas
(um valor por rea amostrada);
N
m
: nmero de indivduos da maior unidade amostral;
n
m
: nmero de indivduos em reproduo na maior unidade amostral;
RGS = (massa das gnadas 100) massa total do animal;
RGS
i
: RGS mdia dos indivduos em reproduo na unidade amostral i ;
RGS
e
: maior valor individual de RGS.
CPUE = m
2
REDE TEMPO
-1
n
m
N
m
=
ln N
max
[ ( n
max
n ) + 1 ]
ln N [( n n ) + ( n N )] ( VTG VTG
max
)
I
VTG
= 100
ln N
max
[ ( n
max
n ) + 1 ]
ln N [( n n ) + ( n N )] ( VTG VTG
max
)
I
VTG
= 100
para Populaes Naturais
[( n n ) + ( n N )]
I
VTGe
= 100
[ ( N
E2
n ) + 1 ]
VTG
VTG
max
[( n n ) + ( n N )]
I
VTGe
= 100
[ ( N
E2
n ) + 1 ]
VTG
VTG
max
para BIOENSAIOS

I
VTGh
= 100
[( N
E2
n ) + 1]
[( n n ) + 1] (VTG VTG
C
)
VTG
max
ln n
ln N
E2
I
VTGh
= 100
[( N
E2
n ) + 1]
[( n n ) + 1] (VTG VTG
C
)
VTG
max
ln n
ln N
E2
ln n
ln N
E2
para ENSAIOS in vitro de
ESTROGENICIDADE
ln N
f
I
VTGf
= 100
[ ( n
f
n ) + ( n
f
N
f
) ]
[( n n ) + ( n N )] ln N VTG
VTG
max
ln N
f
I
VTGf
= 100
[ ( n
f
n ) + ( n
f
N
f
) ]
[( n n ) + ( n N )] ln N VTG
VTG
max
para para a Vitelognese, com
Fmeas como Controle Referencial
demonstra a
PRODUO MOLECULAR
de VTG ( expresso )
em populaes (ou grupos),
relacionando-a com a:

quantidade de indivduos
VTG[+] ( n )


MAGNITUDE AMOSTRAL
( N e N
max
)
dos grupos:
ANALISADO
e de
REFERNCIA
(denominador)

VITELOGENINA (VTG)

glico-fosfo-lipoprotena de alto massa molecular (de 170-200 kDa)

produzida em HEPATCITOS sob controle multi-hormonal: a transcrio do
RNA
m
ativada por estrgenos - 17|-estradiol ( E
2
)

principal constituinte do VITELO, liberada no sangue (exocitose)

relacionada a outros biomarcadores e ao
SISTEMA NEUROENDCRINO REPRODUTOR
de peixes

XENOESTRGENOS: substncias que so desreguladoras endcrinas
a expresso da VTG por hepatcitos,
ou a supresso da mesma, tm sido usadas em peixes
como indicadores de efeitos (ANTI)ESTROGNICOS:
estrognicos em machos e jovens
anti-estrognicos em fmeas.

seqncia aa da VTG: bem conservada entre distintas TAXA no tempo evolutivo

VTG de TELEOSTEI: National Center for Biotechnology Information
BioEdit v.5.0.9 e ClustalW
alinhadas em consenso:
56,8% de similaridade, duas a duas
nmero mdio de 1713 aa (DP = 50 aa)
187,95 kDa (DP = 5,15 kDa).
BioEdit v.5.0.9 e ClustalW

BioEdit v.5.0.9 e ClustalW

VITELOGENINA
E
REPRODUO
CAPTULO
III
MATERIAIS,
MTODOS

SILVERSAND, C.; HYLLNER, S. J. & HAUX, C. Isolation,
immunochemical detection, and observations of the instability of
vitellogenin from four teleosts. The Journal of Experimental Zoology,
v.267, p.587-597. 1993.

6HB-E
2
494,3 g
15 dias
linha 1: 200 nl dos animais 3 e 6 (pool de plasma), MACHOS jovens E
2
(-)
linha 2: 200 nl do animal 4, FMEA jovem E
2
(-)
linha 3: 50 nl do animal 11, sexo indefinido, iip E
2
(+)
linha 4: 200 nl do animal 11, sexo indefinido, iip E
2
(+)
linhas 5 a 8: 50 nl de VTG redissolvida em NaCl 1 M, aps PRECIPITAO (2x), com EDTA/MgCl
2
e H
2
O
linha 5: [EDTA] : [Mg
++
] = 1,0 : 2,5
linha 6: [EDTA] : [Mg
++
] = 1,0 : 2,0
linha 7: [EDTA] : [Mg
++
] = 1,0 : 1,5
linha 8: [EDTA] : [Mg
++
] = 1,0 : 1,0
animal 11, iip E
2
(+) :
1 2 3 4 5 6 7 8
MWM
205 kDa
116 kDa
97,4 kDa
66 kDa
45 kDa
29 kDa
linha 1: 200 nl dos animais 3 e 6 (pool de plasma), MACHOS jovens E
2
(-)
linha 2: 200 nl do animal 4, FMEA jovem E
2
(-)
linha 3: 50 nl do animal 11, sexo indefinido, iip E
2
(+)
linha 4: 200 nl do animal 11, sexo indefinido, iip E
2
(+)
linhas 5 a 8: 50 nl de VTG redissolvida em NaCl 1 M, aps PRECIPITAO (2x), com EDTA/MgCl
2
e H
2
O
linha 5: [EDTA] : [Mg
++
] = 1,0 : 2,5
linha 6: [EDTA] : [Mg
++
] = 1,0 : 2,0
linha 7: [EDTA] : [Mg
++
] = 1,0 : 1,5
linha 8: [EDTA] : [Mg
++
] = 1,0 : 1,0
animal 11, iip E
2
(+) :
1 2 3 4 5 6 7 8
MWM
205 kDa
116 kDa
97,4 kDa
66 kDa
45 kDa
29 kDa
SANGUE >>> PLASMA
PMSF a 1 mM; etanol a 0,5%
fora = 3000g por 30 min., 4
o
C
[EDTA

] [Mg
++
] = 1,0 2,5
[EDTA

] [Mg
++
] = 1,0 2,0
[EDTA

] [Mg
++
] = 1,0 1,5
[EDTA

] [Mg
++
] = 1,0 1,0
GRAU
PISTILO
-200
o
C
0,5 mg 30 dias 0,5 mg 15 dias BLEED 15 dias 0,25 mg 15 dias BLEED 15 dias 0,25 mg 15 dias BLEED
ANTI-SORO HOMLOGO:
contra VTG de Hoplias (HOPL)
ANTI-SOROS DA BIOSENSE

contra VTG de:

Salmo salar (SALA)
Salvelinus alpinus (SALP)
Sparus aurata (SPAU)

2 3 4 5 6 7 8 1 9 10
250 kDa
150 kDa
100 kDa
75 kDa
50 kDa
37 kDa
2 3 4 5 6 7 8 1 9 10 2 3 4 5 6 7 8 1 9 10
250 kDa 250 kDa
150 kDa 150 kDa
100 kDa 100 kDa
75 kDa 75 kDa
50 kDa 50 kDa
37 kDa 37 kDa
NC
Y
Y
+
A + B
2 3 4 5 6 7 8 1 9 10
250 kDa
150 kDa
100 kDa
75 kDa
50 kDa
37 kDa
25 kDa
2 3 4 5 6 7 8 1 9 10
250 kDa 250 kDa
150 kDa 150 kDa
100 kDa 100 kDa
75 kDa 75 kDa
50 kDa 50 kDa
37 kDa 37 kDa
25 kDa 25 kDa
VITELOGENINA
E
REPRODUO
CAPTULO
III
MATERIAIS,
MTODOS,
RESULTADOS,
DISCUSSO
TTBS com 5% de LEITE

anti-soro SAPAU
1:3000
40 s de reao
salina tamponada com Tris
pH 7,5 (TBS) contendo:

0,1% (v/v)
de Tween 20
(TTBS)

com oscilao orbital,
por 16 horas e a 810
o
C.
miosina: 207 kDa
|-galactosidase: 117 kDa
albumina de soro bovino: 95 kDa
ovalbumina: 45 kDa
miosina: 207 kDa miosina: 207 kDa
|-galactosidase: 117 kDa |-galactosidase: 117 kDa
albumina de soro bovino: 95 kDa albumina de soro bovino: 95 kDa
ovalbumina: 45 kDa ovalbumina: 45 kDa
2 3 4 5 6 7 8 1 9 10
250 kDa
150 kDa
100 kDa
75 kDa
50 kDa
37 kDa
25 kDa
2 3 4 5 6 7 8 1 9 10
250 kDa 250 kDa
150 kDa 150 kDa
100 kDa 100 kDa
75 kDa 75 kDa
50 kDa 50 kDa
37 kDa 37 kDa
25 kDa 25 kDa
TTBS SEM o LEITE do BLOQUEIO
anti-soro SALP 1:3000; 20 s de reao
salina tamponada com Tris
pH 7,5 (TBS) contendo 0,1% (v/v)
de Tween 20 (TTBS) e 5% de leite
(m/v), com oscilao orbital,
por 2 horas e a temp. ambiente.
250 kDa
150 kDa
100 kDa
75 kDa
50 kDa
37 kDa
25 kDa
2 3 4 5 250 kDa
150 kDa
100 kDa
75 kDa
50 kDa
37 kDa
25 kDa
2 3 4 5 250 kDa 250 kDa
150 kDa 150 kDa
100 kDa 100 kDa
75 kDa 75 kDa
50 kDa 50 kDa
37 kDa 37 kDa
25 kDa 25 kDa
2 3 4 5
250 kDa
150 kDa
100 kDa
75 kDa
50 kDa
37 kDa
25 kDa
2 3 4 5 250 kDa 250 kDa
150 kDa 150 kDa
100 kDa 100 kDa
75 kDa 75 kDa
50 kDa 50 kDa
37 kDa 37 kDa
25 kDa 25 kDa
2 3 4 5
250 kDa
150 kDa
100 kDa
75 kDa
50 kDa
2 3 4 5 6 7 8 1 9 10
37 kDa
25 kDa
250 kDa 250 kDa
150 kDa 150 kDa
100 kDa 100 kDa
75 kDa 75 kDa
50 kDa 50 kDa
2 3 4 5 6 7 8 1 9 10 2 3 4 5 6 7 8 1 9 10
37 kDa 37 kDa
25 kDa 25 kDa
anti-soro HOPL
1:3000
20 s de reao
anti-soro SALA
1:3000
15 min. de reao
anti-soro HOPL
1:3000
20 s de reao
250 kDa
150 kDa
100 kDa
75 kDa
50 kDa
37 kDa
25 kDa
2 3 4 5 6 7
8
1 9 10
250 kDa 250 kDa
150 kDa 150 kDa
100 kDa 100 kDa
75 kDa 75 kDa
50 kDa 50 kDa
37 kDa 37 kDa
25 kDa 25 kDa
2 3 4 5 6 7
8
1 9 10
anti-soro SALP
1:3000
15 min. de reao
g Pb
++
.g
-1
LEO
15 di as 15 di as
LEO LEO LEO
15 di as 15 di as

17|E
2
15 di as 15 di as
17|E
2
17|E
2
17|E
2
15 di as 15 di as

17|E
2
15 di as 15 di as
17|E
2
17|E
2
17|E
2
15 di as 15 di as
Pb
++
15 di as
15 di as
Pb
++
Pb
++
Pb
++
15 di as
15 di as 96 HORAS
21

21

21

100

100

100

63

63

63

7

7

7





2 3 4 5 6 7 8 1 9 10
250 kDa
150 kDa
100 kDa
75 kDa
2 3 4 5 6 7 8 1 9 10
250 kDa 250 kDa
150 kDa 150 kDa
100 kDa 100 kDa
75 kDa 75 kDa














21 63
FILIPAK NETO et al. (2006)
RPMI 1640 (pH 7.8):
HEPES a 15 mM
NaHCO3 a 6 mM
sulfato de gentamicina a 40 mg.l
-1
insulina bovina-suna a 0,2 U.ml
-1
aprotinina a 2 mg.l
-1
MS 222
cloro-hexidina
FLUXO LAMINAR

EDTA
a 2 mM
em PBS
por 1 h: 4 ml.min
-1
1 mm
lavagem

SUSPENSO

centrif.

lavagem

centrif.

lavagem
citometria
de fluxo

viabilidade
(azul de
tripano)
HPs (16 poos por grupo)

250 l da suspenso de HPs
com mdia de 150.000 clulas
troca do MC nos tempos
0, 2, 4, 7 e 10 dias
pool de 8 poos por tratamento:
20 min. >> EDTA / tripsina
citometria de fluxo











HPs (16 poos por grupo)

250 l da suspenso de HPs
com mdia de 150.000 clulas



troca do MC nos tempos
0, 2 e 4 dias
pool de 8 poos por tratamento:
20 min. >> EDTA / tripsina
citometria de fluxo
O O O O O O O O CTRL
O O O O O O O O CTRL
O O O O O O O O Et-OH
O O O O O O O O Et-OH
O O O O O O O O
17|E2 a 1 M
O O O O O O O O
17|E2 a 1 M
O O O O O O O O
TMX a 6 M
O O O O O O O O
TMX a 6 M
O O O O O O O O
17|E2 a 1 M + TMX a 6 M
O O O O O O O O
17|E2 a 1 M + TMX a 6 M
O O O O O O O O
O O O O O O O O
O O O O O O O O CTRL
O O O O O O O O CTRL
O O O O O O O O Et-OH
O O O O O O O O Et-OH
O O O O O O O O
17oEE2 a 1 M
O O O O O O O O
17oEE2 a 1 M
O O O O O O O O
TMX a 6 M
O O O O O O O O
TMX a 6 M
O O O O O O O O
17oEE2 a 1 M + TMX a 6 M
O O O O O O O O
17oEE2 a 1 M + TMX a 6 M
O O O O O O O O
O O O O O O O O
fmea em
vitelognese
( 240 g)
macho adulto
em idade
reprodutiva
( 980 g)
soro bovino fetal a 10% (v/v)
0,6.10
6
0,7.10
6
clulas . ml
-1

250 kDa
150 kDa
100 kDa
75 kDa
50 kDa
37 kDa
25 kDa
2 3 4 5 6 7
8
1 9 10
250 kDa 250 kDa
150 kDa 150 kDa
100 kDa 100 kDa
75 kDa 75 kDa
50 kDa 50 kDa
37 kDa 37 kDa
25 kDa 25 kDa
2 3 4 5 6 7
8
1 9 10
ge l_LINHA VOLUMES e m l V
AMOSTRA
V
TOTAL
AMOSTRA DE SEXO DESNATURAO V
equi v.
amostra TDA AMOSTRA apli cado l apli cado MEIO DE CULTIVO (MC) EXP. TDA T(
o
C) MC (l)
MM 1 250, 150, 100, 75, 50, 37, <=25 (20, 15, 10) MM re combi nante \ \ \ \ \ \ TA apli c.
MC + S10 2 50 2X 50 5,000 10,00 CTRL de SBF 10 %( MC + S10 ) COM |-me rc.Et 100 5,0
CTRL - F 3 25 2X 25 3,500 7,00 CTRL concent r ado 10X - TCA FMEA COM |-me rc.Et 100 35,0
CTRL - F 4 25 2X 25 3,500 7,00 CTRL concent r ado 10X - TCA 4 di as COM |-me rc.Et 100 35,0
EE
2
5 50 2X 50 5,000 10,00 EE
2
FMEA COM |-me rc.Et 100 5,0
EE
2
6 25 2X 25 3,500 7,00 EE
2
- concent r ado 10X - TCA APS COM |-me rc.Et 100 35,0
7 4
EE
2
8 10 4X 30 3,500 4,67 EE
2
- concent r ado 10X - TCA DIAS SEM |-me rc.Et TA 35,0
CTRL - M 9 50 2X 50 10,000 20,00 CTRL MACHO COM |-me rc.Et 100 10,0
E
2
10 50 2X 50 10,000 20,00 E
2
10 di as COM |-me rc.Et 100 10,0
2 h TA
o
C
SALP
1:3000
15 min.
2 3 4 5 6 7 8 1 9 10
250 kDa
150 kDa
100 kDa
75 kDa
50 kDa
37 kDa
25 kDa
2 3 4 5 6 7 8 1 9 10 2 3 4 5 6 7 8 1 9 10
250 kDa 250 kDa
150 kDa 150 kDa
100 kDa 100 kDa
75 kDa 75 kDa
50 kDa 50 kDa
37 kDa 37 kDa
25 kDa 25 kDa
ge l_LINHA VOLUMES e m l V
AMOSTRA
V
TOTAL culti vo pri mri o de he patci to V
equi v.
amostra TDA AMOSTRA apli cado (l) apli cado amostra de MC (l)
MM 1 250, 150, 100, 75, 50, 37, <=25 (20, 15, 10) MM re combi nante tra ra: DESNATURAO apli c.
CTRL 2 50,0 2X 50,0 5,0 10 grupo controle FMEA MEIO DE CULTIVO: 25,0
EE
2 3 50,0 2X 50,0 5,0 10 gr upo induzido: EE
2
a 9 M APS MC conce ntrado 25,0
TMX+EE
2 4 50,0 2X 50,0 5,0 10 EE
2
a 9 M + TMX a 9 M 4 5X com TCA 25,0
TMX 5 50,0 2X 50,0 5,0 10 tamoxi fe no (TMX) a 9 M DIAS 1 mi nuto a 100
o
C 25,0
CTRL 6 20 x 8 1X 8 poos 1 poo 20 grupo controle MACHO TDA 1X
Et-OH 7 20 x 8 1X 8 poos 1 poo 20 cont r ole de e tanol a 0,15% APS apli cado s obre
E
2 8 20 x 8 1X 8 poos 1 poo 20 gr upo induzido: E
2
a 1 M 10 as CLULAS
TMX+E
2 9 20 x 8 1X 8 poos 1 poo 20 E
2
a 1 M + TMX a 6 M DIAS do culti vo
TMX 10 20 x 8 1X 8 poos 1 poo 20 tamoxi fe no (TMX) a 6 M MACHO 10 mi nutos a 100
o
C
E
2
: 17|-est r adiol (C
18
H
24
O
2
) EE
2
: 17o-et inil-est r adiol: (C
20
H
24
O
2
) TMX: cit r at o de t amoxifeno (C
26
H
29
NO.C
6
H
8
O
7
)
250 kDa
150 kDa
100 kDa
75 kDa
50 kDa
2 3 4 5 6 7 8 1 9 10
37 kDa
25 kDa
250 kDa 250 kDa
150 kDa 150 kDa
100 kDa 100 kDa
75 kDa 75 kDa
50 kDa 50 kDa
2 3 4 5 6 7 8 1 9 10 2 3 4 5 6 7 8 1 9 10
37 kDa 37 kDa
25 kDa 25 kDa
M C E
2
Et-OH TMX M C EE
2
TMX
2 3 4 5 6 7 8 1 9 10
250 kDa
150 kDa
100 kDa
75 kDa
50 kDa
37 kDa
25 kDa
2 3 4 5 6 7 8 1 9 10
250 kDa 250 kDa
150 kDa 150 kDa
100 kDa 100 kDa
75 kDa 75 kDa
50 kDa 50 kDa
37 kDa 37 kDa
25 kDa 25 kDa
ssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssss
120 kDa
75 kDa

TRATAMENTO ctrl EE
NMERO DE CLULAS POR POO DE MICROPLACA N 129.471 145.807 92.357 106.128 ENTRA VALOR
CLULAS VTG (+) POR POO DE MICROPLACA n 129.471 145.807 92.357 106.128
CONCENTRAO RELATIVA (i nte nsi dade ) de VTG VTG 3.320.517 4.839.472 3.434.054 1.856.669 ENTRA VALOR
maior valor individual de VTG VTGmax 4.839.472 4.839.472 4.839.472 4.839.472
int ensidade de VTG no grupo CONTROLE VTGC 3.320.517 3.320.517 3.320.517 3.320.517
ESTROGENICIDADE no grupo = VTG - VTG
C
/ VTG
max 0,000000 0,313868 0,023461 -0,302481
NMERO DE CLULAS no gr upo controle i nduzi do ( EE
2
) N
E2 145.807 145.807 145.807 145.807
NMERO DE CLULAS VTG (+) no gr upo EE
2
n
E2 145.807 145.807 145.807 145.807
somat r io de n (Sn) 473764 473764 473764 473764
l n N 11,77 11,89 11,43 11,57
n / Sn 0,27 0,31 0,19 0,22
n / N 1,00 1,00 1,00 1,00
(n / Sn)+(n / N) 1,27 1,31 1,19 1,22
VTG - VTG
C
/ VTG
max 0,00 0,31 0,02 -0,30
nume rador 0,00 4,88 0,32 -4,28
l n N
E2 11,89 11,89 11,89 11,89
(N
E2
/ Sn)+1 1,31 1,31 1,31 1,31
de nomi nador 15,55 15,55 15,55 15,55
I
VTGh
= 0,00 31,39 2,06 -27,55

I
VTGh
= 100
[( N
E2
n ) + 1]
[( n n ) + 1] (VTG VTG
C
)
VTG
max
ln n
ln N
E2
I
VTGh
= 100
[( N
E2
n ) + 1]
[( n n ) + 1] (VTG VTG
C
)
VTG
max
ln n
ln N
E2
ln n
ln N
E2
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
40

n
d
i
c
e

V
i
t
e
l
o
g

n
i
c
o
CTRL
EE
2
EE
2
+ TMX
TMX
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
40

n
d
i
c
e

V
i
t
e
l
o
g

n
i
c
o
CTRL
EE
2
EE
2
+ TMX
TMX
n : nmero mdio de clulas viveis por unidade de cultivo
(poo de microplaca, lamnula ou garrafa)
no tratamento considerado;
N
E2
: nmero mdio de clulas viveis por unidade de cultivo
no grupo induzido (E2[+]);
VTG : concentrao ou quantidade de VTG aferida
nas unidades de cultivo do tratamento considerado;
VTG
C
: VTG aferida nas unidades de cultivo do grupo controle,
sem nenhum tratamento;
VTG
max
: maior valor individual de VTG
CONCLUSES
GERAIS
SISTEMA HEPTICO
(HEPATCITO)

Expresso de METALOTIONENA
indut.: metais, EsROx e ESxH
tolerncia a EsROx, p.ex.:H
2
O
2

atividade antioxidante


HOMEOSTASE OXIDATIVA
tolerncia a EsROx
atividade antioxidante:
SOD, CATALASES,
peroxidases, GSHp
GSH S-t, GSHr
[GSH]


Expresso de P450
uso de EsROx em oxidaes
l catabolismo (MFOS):
oxidao de esterides
l ativ. monoxigenases associadas
p.ex.: EROD


Expresso de VITELOGENINA
regulada por 17|-Estradiol

xenobionte com:
ativ. estrognica
(machos e jovens)
ativ. anti-estrognica
(fmeas)

HOMEOSTASE DE Zn
&
ATIVIDADE DE METALOENZIMAS
SISTEMA REPRODUTOR
NEUROENDCRINO

CREBRO

HIPOTLAMO
GtRH (+) / DPM ()

HIPFISE
GtH I & GtH II (+)
e outros (+/)

TESTCULO/OVRIO
ESxH e outros fatores
dimorfismo sexual
gametognese (Zn)
incorpora VT (GtH I)

o-ALAd

inibio :
ANEMIA
PORFIRIA

l [ pre-HEME ]
[ HEME ]
l [ o-ALA ]

ESTRESSE
OXIDATIVO
As condies fisico-qumicas de ambientes tropicais,
a exposio via alimento por longos perodos (subcrnica)
e a busca de respostas biolgicas subletais, detectveis e consistentes,
caracterizam Hoplias malabaricus como um excelente modelo experimental in vivo
para o estabelecimento de biomarcadores

A determinao da atividade da o-ALAd acompanhada
do monitoramento de parmetros hematolgicos so mtodos eficientes para o uso
de respostas biolgicas individuais (fisiolgicas) como biomarcadores em peixes

O mtodo empregado para a metalotionena no pde ser efetivado para o emprego
dessa resposta como biomarcadora. Sugere-se a utilizao de mtodos mais acurados,
com a quantificao direta (absoluta) da metalotionena.

A produo de vitelogenina plasmtica pelo fgado in vivo (em hepatcitos)
pde ser induzida experimentalmente com substncias estrognicas (iip) em Hoplias
malabaricus de ambos os sexos em idade reprodutiva, ou em indivduos sexualmente
imaturos.


O anti-soro homlogo produzido em coelhos contra a vitelogenina de Hoplias
malabaricus mostrou-se eficiente para a imuno-deteco.

Os anti-soros heterlogos obtidos comercialmente demonstraram diferentes graus de
especificidade e de intensidade de sinal (fosfatase alcalina) relacionados com
diferentes condies de estringncia da reao imuno-qumica cruzada com a VTG
de Hoplias malabaricus.

O chumbo inorgnico divalente no produziu nenhum efeito anti-estrognico
detectvel pelo mtodo empregado (imuno-deteco), aps bioensaio (iip).

O emprego de um modelo matemtico da ecologia, aplicvel em nvel populacional
e associado com respostas biolgicas individuais frente a condies adversas
possvel a priori dispondo-se do ndice Vitelognico. Este considerado como
um biomarcador para substncias que comprometem a reproduo de espcies de
peixes, apresentando efeitos (anti)estrognicos
avaliados pela produo de VTG in vivo.

Os ensaios in vitro com cultivo primrio de hepatcitos de Hoplias malabaricus
revelaram aspectos importantes dos mecanismos moleculares de citotoxicidade,
obtidos com a exposio das clulas a substncias com reconhecida
ao (anti)estrognica.

O aplicao do ndice Vitelognico para Ensaios in vitro de Estrogenicidade (I
VTGh
)
permitiu padronizar a comparao de grupos controlados em condies laboratoriais
(tratamentos in vitro). Isso porque o I
VTGh
representa a produo molecular de VTG
em cada tratamento in vitro, onde a resposta a ao (anti)estrognica e est
relacionada com a quantidade de clulas que expressam a protena em cada
unidade de cultivo e com a magnitude amostral dos grupos:
analisados (tratamentos)
e de referncia
(controle induzido com substncia de reconhecida ao estrognica)