Purificao de Proteases a partir do Bacillus Subtilis utilizando Cromatografia de Troca Inica para produo de detergentes.

Introduo

A utilizao de enzimas o ramo que merece maior destaque quando pensamos em produo.

Atualmente encontramos as mais variadas enzimas

sendo aplicadas em todos os tipos de indstrias.

As

proteases so usadas em diversos processos industriais.

50% das vendas gerais contabilizadas no ano de 2000,

chegando a 60% em 2006

Enzimas
Possuem a finalidade de aumentar a velocidade das

reaes qumicas que ocorrem em clulas e diferentes organismos sem afetar sua funo. Possuem a caracterstica de serem altamente seletivas e especficas, alm de apresentarem uma grande eficincia cataltica. As enzimas podem ser classificadas a 6 diferentes classes que so: Oxi-redutases, Transferases, Hidrolases, Liases,Isomerases e Ligases. Entre as vantagens que a sua utilizao possui a possibilidade de controlar a estabilidade em condies adversas de temperatura e pH, ou em solventes orgnicos.

Protease
So enzimas que quebram ligaes peptdicas

entre os aminocidos das protenas. Na produo de detergentes, por exemplo, a modificao realizada permite que a estabilidade no ambiente tpico de detergentes aumenta em aproximada 1000X atravs da deleo dos stios 7 de ligao do CA2+ e com a introduo de cargas negativas superficiais melhoram o desempenho durante a lavagem.

Industria de detergente
Estima-se que metade dos detergentes encontrados

no mercado, seja pra uso domstico ou industrial, contm enzimas em sua composio. As enzimas para serem usadas em determinados detergentes precisa satisfazer alguns requisitos,ela precisa ter uma atividade e estabilidade adequadas para valores de pH alcalinos e deve manter-se ativa e estvel em um gama de temperaturas diferentes como uma variao de 10 a 60C. Vantagens da aplicao de enzimas: permitem alm de aumentar a eficincia de lavagem e reduz o tempo pra concluir a lavagem, reduz muito os gastos energticos que esto associados com a agitao.

Objetivos
Este projeto teve como objetivo purificar a enzima Protease usando como fonte uma bactria gram-positiva no patognica e muito comum no meio ambiente, a Bacillus subtilis, utilizando como principal ferramenta de purificao a Cromatografia de Troca Inica, levando-se em considerao a grande utilidade de tais enzimas para o processo industrial de produo de detergentes.

Metodologia
Produo e Purificao da Protease:

Para a escolha do Bacillus subtilis o principal fator foi porque a protease produzida por esses microrganismos so mais eficientes pois solubilizam uma maior quantidade de protena e geram produtos com uma capacidade mais elevada de produo de espuma, principalmente quando comparados com proteases produzidas a partir de fungos.

Metodologia
Cultivo
Bacillus subtilis uma bactria gram positiva em

forma de bastonetes, aerbias ou anaerbias facultativas.

Alta

taxa de crescimento, curto tempo de fermentao, capacidade de excretar a enzima para o meio extracelular. ser usadas como fonte microrganismos a gua, a terra ou o ar. desses

Podem

 Aps o isolamento de uma dessas fontes o B. subtilis

colocado em fermentao.
A fermentao dos processos microbianos ocorrem

basicamente em cultivo submerso, onde o microrganismo se divide e excreta a enzima de interesse no meio de cultura.
O processo de fermentao atravs de cultivo submerso

tem como principal caracterstica a produo no seio do meio de cultura sob um agitao constante.
O

uso de um biorreator indispensvel para a fermentao, onde parmetros como pH , temperatura, consumo de oxignio, formao de CO2 so medidos e controlados frequentemente.

 Foi utilizada a batelada alimentada como modo de

operao do biorreator assim os nutrientes necessrios ao crescimento das clulas para a produo do nosso produto de interesse foram adicionados ao biorreator de forma intermitente, sem a retirada do material durante o processo. Essa forma a mais adequada para processos onde ocorre a produo de enzimas extracelulares.

Metodologia
Separao, concentrao e Purificao da Enzima

Aps o processo fermentativo, para a extrao da

nossa enzima de interesse, damos sequencia ao processo de separao, concentrao e purificao da protease. Como nossa molcula extracelular j diminumos o trabalho empregado, uma vez que no ser necessrio o rompimento da clula nem etapas extras de separao. Efetuamos uma centrifugao onde separamos substancialmente as clulas do meio de cultura. Foi utilizado o processo de ultrafiltrao tangencial,

Metodologia
Purificao Para realizar a purificao da proteases o mtodo

escolhido foi a cromatografia de troca inica. Este mtodo leva em considerao basicamente a carga lquida das protenas presentes na mistura. Um dos fatores que se mostrou como diferencial na escolha desse mtodo foi que ele tem a capacidade de processar grandes volumes de amostras em escala industrial

Metodologia
Cromatografia de Troca-inica

Essa tcnica comumente utilizada para purificar

protenas, pois, apresenta as seguintes caractersticas: simples, fcil ampliao de escala, alta resoluo,alta capacidade de adsoro e verstil. Tem ainda diversas aplicaes analticas e preparativas, tanto em pesquisa quanto em indstrias

 As etapas bsicas da cromatografia de troca-

inica so:
1) Matriz de troca aninica contendo ons (C-) adsorvidos 2) Adsoro da protena-alvo (P) presente na amostra

4) Regenerao da matriz

3) Eluio da protena-alvo. (N-) on utilizado para deslocar a protena alvo

Resultados esperados
Ao utilizar a cromatografia de troca inica para purificar

a protease usamos como base para a separao a carga lquida da protena. A carga lquida da enzima depende da proporo entre suas cargas positivas e negativas. Usamos um meio onde a carga liquida da amostra negativa, para evitar a desnaturao da enzima. Para uma efetiva ligao fase estacionria, usamos uma matriz de troca aninica. Escolhemos como matriz o gel de agarose que um polissacardeo natural complexo obtido do gar, essa uma matriz altamente porosa e possui uma adsoro no-especfica muito baixa. Como fase mvel, escolhemos o tampo Tris, em uma

 Durante a purificao, preciso um pr tratamento

da matriz onde so removidas as impurezas e ocorre o acondicionamento do contra-ion. Adicionamos soluo NaOH entre 3 a 5 vezes em um volume de 5 a 6 vezes o volume do adsorvente e lavamos com gua deionizada. Aplicamos uma soluo HCl e lavamos com gua deionizada para garantir as propriedade desejadas e em seguida adicionamos o tampo Tris,deixando a coluna pronta para receber a soluo contendo a protease a ser purificada. Adicionamos estabilizantes preservativos que leva nossa amostra a um estado de imobilizao enzimtica para que no se altere a sua atividade.

Viabilidade tcnica e econmica

Em um primeiro momento, tem-se um custo

razoavelmente elevado de implementao, na medida em que o equipamento necessrio para as anlises devem ser adquiridos, assim como os instrumentos e acessrios acoplados ao sistema como um todo, o que esperado para qualquer outra tcnica. Com vista a produo de escala industrial, subprodutos so uma boa alternativa econmica, pois o aproveitamento de resduos torna o processo mais barato e fornece, na maioria das vezes fontes aceitveis para o cultivo bacteriano

Bibliografias
[1] CABRAL, J.M.S., BARROS, M.R.A., GAMA, M.; Engenharia

Enzimtica, Lidel Edies Tcnicas Lda. 2003 [2] NELSON, DL; COX, MM. Lehninger - Principios de bioquimica. Traduzido por Simoes, A. A.; Lodi, W. R. N. 3a edio. Sao Paulo: Sarvier, 2002. [3] Marzzoco, A; Torres, BB. Bioquimica basica. 2a. Ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1999. [4] PESSOA, A. JR. VAHAN, B. M. Purificao de Produtos Biotecnolgicos. 1 edio. Baurueri, SP: Manole LTDA. 2005. [5] O que protease? http://www.jornallivre.com.br/158926/oque-eprotease. html: Acesso em 18 de maio de 2012 [6] Cromatografia inica. http://pt.scribd.com/doc/23561589/Acromatografia-detroca-ionica. Acesso em 20 de maio de 2012 [7] JANICE LUEHRING G. Caracterizao e aplicao de proteases por linhagens Bacillus. Discertao de mestrado UFRGS. P 2124. 2006

Dvidas??