Seminrio de Orgnica Experimental

Composio qumica e atividade biolgica de extrato oleoso de

prpolis: uma alternativa ao

extrato etanlico

 A prpolis uma resina de ampla utilidade para as abelhas e para o homem. A composio qumica da prpolis complexa e est relacionada com a flora da regio em que foi originada e a poca da coleta. Sua atividade farmacolgica tem sido atribuda aos compostos fenlicos, entre eles flavonides e cidos fenlicos, cujos teores tm sido propostos como parmetros para o controle da qualidade.

 Devido s inmeras propriedades benficas da prpolis, o seu uso comercial em produtos farmacuticos, cosmticos e de higiene pessoal na forma de extratos lquidos amplo.

 Devido a prpolis ser uma mistura muito complexa de substncias de polaridade variada o solvente mais utilizado o etanol em concentraes variadas.
Para a elaborao desses produtos, comumente utilizado o extrato obtido com lcool de cereais 70% v/v e tempos de extrao que variam de 1 dia at 6 meses.

 Entretanto, a presena de lcool na formulao confere um sabor no agradvel para alguns consumidores. Buscando superar esses inconvenientes, tm surgido muitas patentes que propem novos mtodos de extrao da prpolis com baixo teor alcolico ou isento de lcool. Dentre as alternativas propostas, destaca-se o extrato de prpolis obtido com leo vegetal, o qual conserva bem as caractersticas organolpticas da prpolis e possibilita a apresentao do produto em cpsulas gelatinosas.

Objetivo:
Avaliar o extrato oleoso de prpolis quanto a sua composio qumica qualitativa e quantitativa de compostos fenlicos extrados e comparar os resultados com aqueles obtidos de diferentes extratos etanlicos de prpolis.

Tcnicas:
Espectrometria de massas com ionizao por electrospray (ESIMS) Espectrofotometria no UV-VIS (espectroscopia no ultravioleta visvel) que envolve a espectroscopia de ftons. O extrato oleoso da prpolis foi avaliado in vitro em diferentes cepas de organismos patognicos e em linhagens de clulas tumorais humanas para estimar suas atividades antibacteriana e citotxica, respectivamente. Com os dados obtidos, foi feita a anlise das componentes principais para melhor comparar os extratos hidroalcolicos e oleosos de prpolis quanto aos teores de substncias fenlicas e rendimentos de extrao.

 Espectrometria de massas com ionizao por electrospray na anlise de misturas complexas Como os componentes da prpolis so na sua maioria compostos fenlicos, cidos carboxlicos e seus derivados, os mesmos podem ser desprotonados em solues bsicas e analisados por ESI(-)-MS.

 ESI(-)-MS mostrou ser uma tcnica analtica rpida e confivel para anlise direta de extratos hidroalcolicos de prpolis, possibilitando a classificao da prpolis brasileira em grupos, de acordo com ons marcadores observados nos espectros. Estes ons so caractersticos e indicam a origem regional da prpolis testada.

Determinao de fenlicos totais e flavonides Os compostos fenlicos presentes nas plantas, como flavonides e cidos fenlicos, tm sido muito estudados por suas PROPRIEDADES ANTIOXIDANTES. Os principais mtodos utilizados na sua quantificao so : cromatografia lquida de alta eficincia e a espectrofotometria no visvel empregando o reagente de FolinCiocalteau.

PARTE EXPERIMENTAL Materiais e equipamentos

A prpolis foi conservada em freezer at o momento da extrao. Os solventes utilizados na extrao da prpolis e nas medidas de absoro no visvel foram grau PA e grau espectrofotomtrico, respectivamente. A gua utilizada nas anlises por UV-VIS, ESI-MS e na preparao de todas as solues foi ultrapura destilada e deionizada (Human UP 900). O leo de canola foi adquirido no mercado. Os reagentes empregados na determinao dos teores de fenlicos e flavonides foram o Folin-Ciocalteau e o cloreto de alumnio da marca Biotec, o cido glico Vetec e a quercetina da Fischer.

Anlise qualitativa de extrato hidroalcolico e oleoso de prpolis por ESI(-)-MS

A comparao da composio qumica dos extratos oleoso e hidroalcolico de prpolis por ESI(-)-MS foi realizada aps a extrao. Extrao por macerao e agitao magntica por 24 h, utilizandose como solvente extrator etanol 95% v/v ou leo de canola. Aps esse perodo, as solues extrativas foram filtradas a vcuo e armazenadas em geladeira. Foram analisadas trs amostras por ESI(-)-MS - : amostra 1: leo de canola puro, utilizado como referncia para o extrato oleoso; amostra 2: extrato oleoso de prpolis obtido com leo de canola; amostra 3: extrato etanlico de prpolis obtido com etanol 95% v/v.

Preparo dos extratos hidroalcolicos de prpolis Amostras contendo 5 g de prpolis triturada foram extradas com 25 mL de solues etanlicas (30, 50, 70, 80, 95% v/v e etanol absoluto) durante 10 dias, a temperatura ambiente e com agitao ocasional. Aps esse perodo, filtrou-se e o filtrado foi deixado em repouso durante uma noite no freezer para precipitao e separao das ceras. O filtrado livre de ceras foi seco em evaporador rotativo e pesado, obtendo-se a massa dos extratos hidroalcolicos secos de prpolis.

Preparo dos extratos oleosos de prpolis O extrato oleoso foi obtido a partir de 5 g de prpolis triturada com 25 mL de leo de canola, a temperatura ambiente, e com agitao continuada durante 10, 30 e 90 dias. Aps o perodo de extrao estabelecido, filtrou-se a vcuo com papel de filtro Whatman faixa preta quantitativo e o filtrado foi particionado com metanol/H2O 8:2. A fase metanlica foi mantida em freezer por uma noite para precipitao das ceras. Aps separao das ceras por filtrao, a fase metanlica foi seca em evaporador rotativo a presso reduzida. O resduo obtido foi pesado obtendo-se assim a massa do extrato oleoso de prpolis.

Quantificao de fenlicos totais

Primeiramente foi construda uma curva analtica usando-se solues metanlicas padro de cido glico em concentraes entre 1 a 165 g /mL. Em balo volumtrico de 5 mL misturaram-se 125 L de cada soluo padro com 500 L de uma soluo tampo de carbonato e tartarato de sdio e potssio e 500 L do reagente Folin-Ciocalteau. Ajustou-se o volume com gua deionizada. Aps 30 min foi medida a absorbncia a 700 nm. A curva analtica foi ajustada pelo mtodo dos mnimos quadrados e o coeficiente de correlao linear obtido foi de 0,9986. Para determinao do teor de fenlicos totais nos extratos de prpolis foram pesados 25 mg de cada extrato de prpolis seco (hidroalcolico ou oleoso) e dissolvidos em 25 mL de metanol. Desta soluo foram retirados 125 L e reproduzido o procedimento descrito para as solues padro de cido glico. Cada determinao foi feita em triplicata.

Quantificao de flavonides
Para a curva analtica foram preparadas solues metanlicas padro de quercetina em concentraes entre 1 a 75 g /mL. Em balo volumtrico de 5 mL misturaram-se 500 L de cada soluo padro com 250 L de uma soluo 5% m/v de cloreto de alumnio em metanol. Ajustou-se o volume com metanol. Esperou-se 30 min para realizar as medidas de absorbncia em 425 nm. O coeficiente de regresso linear obtido foi de 0,9994. Para analisar o teor de flavonides nos extratos de prpolis hidroalcolico ou oleoso, 500 L das solues preparadas previamente dos extratos secos de prpolis foram tratados de maneira idntica aos padres de quercetina.

Anlise da atividade antibacteriana dos extratos de prpolis obtidos com etanol 30, 70, 95% v/v e leo de canola
A atividade antibacteriana foi avaliada atravs do mtodo de difuso em gar. Os microorganismos empregados foram os Gram-positivos: Staphylococcus aureus e Listeria monocitogenes e Gram-negativos: Escherichia coli; Salmonella tiphimurium; Pseudomonas aeruginosa. Os microrganismos foram cultivados em caldo de tripticase de soja a 37 C por 24h e aps padronizao foram semeados com o auxilio de swab estril em placas de Petri contendo 15 mL de meio gar tripticase de soja. Depois da absoro completa do inoculo, foram feitos poos de 7 mm no meio. Os extratos de prpolis obtidos com solues hidroalcolicas 30, 70 e 95% v/v e com leo de canola (extrao 90 dias) foram dissolvidos em etanol em uma concentrao 10% m/v. 50 L das solues dos extratos foram adicionados aos poos. Foram utilizados como controle negativo o etanol e como controle positivo o antibitico gentamicina (50 g /mL). As placas foram incubadas a 37 C por 24 h. Para quantificar a atividade antibacteriana foi medido o halo de inibio do crescimento bacteriano com o auxlio de paqumetro. Todos os ensaios foram realizados em triplicata.

Anlise da atividade citotxica dos extratos de prpolis obtidos com etanol 30, 70, 95% v/v e leo de canola Os extratos foram avaliados quanto a sua capacidade citotxica frente a 4 linhagens de clulas tumorais humanas: HL-60 (leucemia), HCT-116 (clon), MDA/MB-435 (mama) e SF-295 (glioblastoma), atravs do mtodo de MTT.40. um mtodo rpido, sensvel e barato que analisa a viabilidade e o estado metablico da clula, baseado na converso do sal 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenilbrometo de tetrazolium (MTT) em azul de formazan, a partir de enzimas mitocondriais presentes somente nas clulas metabolicamente ativas. O precipitado foi ressuspendido em 150 L de DMSO e foi feita a leitura em Espectrofotmetro de placa DTX-880, Beckman Coulter a 595 nm. O quimioterpico doxorubicina foi usado como controle positivo.

Resultados

Comparao por ESI(-)-MS da composio qumica dos extratos etanlico e oleoso de prpolis
Ao comparar os trs ESI(-)-MS obtidos do do leo de canola puro (referncia), do extrato etanlico e do extrato oleoso de prpolis , percebeu-se que o espectro de leo de canola puro, usado como referncia para o extrato de prpolis oleoso, apresentou poucos sinais, que correspondem aos principais cidos graxos presentes na sua composio em m/z 279 e 281 (cido olico e linolico). O extrato etanlico da prpolis apresentou ons intensos de m/z 299,3 e 301,3. O ESI(-)-MS do extrato oleoso da prpolis apresentou o mesmo perfil observado para o ESI(-)-MS do extrato etanlico, tendo muitos ons em comum.

Teores de fenlicos totais e flavonides de extratos etanlicos e oleosos de prpolis

Para melhor comparar os extratos hidroalcolicos e oleosos de prpolis quanto s variveis consideradas e correlacionar esses dados com o tipo de solvente e tempo de extrao empregado foi feita a anlise das componentes principais (ACP). Entre as amostras avaliadas pela ACP observou-se a formao de 3 grupos diferentes:

 Extratos oleosos que se relacionaram pela varivel tempo de extrao: O aumento deste tempo de 10 para 90 dias ocasionou um aumento dos rendimentos e dos teores de fenlicos totais e flavonides. No entanto, os extratos oleosos apresentaram os menores rendimentos em relao aos hidroalcolicos.

Extratos de prpolis obtidos com etanol 30 e 50% v/v: apresentou os menores rendimentos de extrao dentre as extraes hidroalcolicas, porm os maiores teores de substncias fenlicas no extrato seco de prpolis, sendo o extrato mais rico em fenlicos o obtido com etanol 30% v/v.
Extratos etanlicos 70, 80, 95% v/v e etanol absoluto: apresentou os maiores rendimentos de extrao e relacionou-se com as variveis teor de fenlicos e flavonides em relao prpolis bruta e ao extrato seco e solvente empregado na extrao. Observou-se para este grupo que ao mudar a composio do solvente de 70% v/v a etanol absoluto ocorreu diminuio dos teores de fenlicos e flavonides extrados em relao prpolis bruta e dos teores de fenlicos e flavonides no extrato seco.

Rendimento e teores de fenlicos e flavonides dos extratos hidroalcolicos e oleosos

Atividade antimicrobiana de extratos etanlico e oleoso de prpolis

Todos os extratos hidroalcolicos e oleoso testados apresentaram atividade contra as bactrias Gram-positivas Staphylococcus aureus e Listeria monocytogenes. Para Staphylococcus aureus, o extrato que apresentou maior atividade in vitro foi o obtido com etanol 30% v/v, o qual apresentou tambm a maior concentrao de compostos fenlicos. Quanto maior a concentrao de fenlicos mais potente a atividade contra esta bactria.

 Para Listeria monocytogenes, a maior atividade foi apresentada pelos extratos hidroalcolico 70% v/v e oleoso. Extratos hidroalcolicos de prpolis possuem atividade pronunciada contra bactrias Grampositivas e para determinados gneros como Streptococcus, Staphylococcus, Bacillus, Mycobacterium, porm so pouco efetivos ou inativos em relao a outros gneros, como Pseudomonas, Escherichia, Klebsiella, Proteus e Salmonella. A prpolis sempre apresenta atividade antimicrobiana, uma vez que seu efeito bactericida e fungicida indispensvel para preservar a vida na colmia.

Atividade citotxica de extratos etanlicos e oleoso de prpolis

Dentre os extratos testados, o extrato oleoso mostrou possuir potencial citotxico contra todas as linhagens celulares testadas, com CI50 variando de 0,8 a 22,6 g /mL para as linhagens de clon e mama. Tambm este extrato foi o nico que apresentou atividade contra gliobastoma, mostrando uma CI50 de 3.1 g /mL. Assim como o extrato de prpolis obtido com etanol 70% v/v, o extrato oleoso revelou maior especificidade e efeito antiproliferativo contra clulas tumorais de clon . J os extratos de prpolis obtidos com etanol 95 e 30% v/v mostraram potencial citotxico apenas contra carcinoma de mama (MDA/MB-435). Segundo critrios estabelecidos pelo National Cancer Institute (NCI, USA), o valor limite de CI50 para extratos com atividade citotxica promissora de 30 g/mL.

Concluses

 A espectroscopia de massas mostrou composio qumica qualitativa dos extratos oleosos e hidroalcolicos de prpolis bastante similar, sendo possvel identificar vrios cidos fenlicos e flavonides presentes em ambos os extratos. A extrao com leo vegetal apresentou, porm, rendimento inferior e menores teores de substncias fenlicas. Mesmo utilizando-se perodos de extrao superiores com leo, no foi possvel obter eficincia comparvel extrao hidroalcolica.

 Os teores de fenlicos totais em relao ao extrato seco foram maiores para o extrato obtido com etanol 30% v/v, diminuindo medida que se aumentou a proporo de etanol no solvente extrator. Extrato obtido com etanol 70% v/v apresentou o maior rendimento e tambm o maior teor de flavonides. Portanto, em relao prpolis in natura, a

extrao com etanol 70% apresentou as maiores porcentagens de extrao de fenlicos e flavonides.

 A partir dos testes antibacterianos realizados verificou-se que o extrato oleoso apresentou atividade contra bactrias Gram-positivas Staphylococcus aureus e Listeria monocytogenes. Nos testes de atividade citotxica o extrato oleoso de prpolis mostrou-se promissor contra todas as linhagens de clulas tumorais testadas, revelando maior especificidade contra aquelas de clon e glioblastoma.

Os resultados obtidos indicaram a viabilidade da extrao da prpolis com leo vegetal, mas tambm a necessidade de aprimorar a formulao e o processo de extrao para obter rendimentos e teores maiores de extrao das substncias fenlicas bioativas em tempos menores.