Contagem Padro em Placas Profa.

Leila Larisa Medeiros Marques

1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer procedimento para a contagem padro de microrganismos mesfilos aerbios estritos e facultativos viveis. Aplica-se a amostras de matrias-primas, gua e alimentos. 2. FUNDAMENTOS Baseia-se na semeadura da amostra ou de suas diluies em gar padro para contagem seguida de incubao em temperatura de 36 1C por 48 horas. 3. REAGENTES E MATERIAIS Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos; gar padro para contagem (PCA); Soluo salina peptonada 0,1%. 4. EQUIPAMENTOS Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos.

2) Meio de Cultura
2.1) gar Padro para Contagem (PCA): a) Composio:

Triptona Extrato de Levedura Glicose gar gua destilada

5,0 g 2,5 g 1,0 g 15,0 g 1000 ml

Dissolver os componentes em gua destilada. O pH final deste meio deve ser 7,0 0,2 Aquecer at completa dissoluo Esterilizar em autoclave a 121oC/15 min. Observaes: na forma desidratada, proceder conforme instrues do fabricante.

gar padro para contagem (PCA) desidratado Pesar o gar padro para contagem de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de gua destilada correspondente. Deixar em repouso por 15 minutos. Aquecer at completa dissoluo do gar. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir volumes de acordo com a necessidade. Esterilizar a 121 1C por 15 minutos. Identificar e armazenar adequadamente.

2.2) Soluo Diluente: Soluo salina peptonada 0,1% (Diluente): Pesar separadamente os seguintes componentes: Cloreto de sdio - 8,5 g Peptona - 1,0 g gua destilada/deionizada - 1000 mL pH 7,0 0,2 Transferir para recipiente adequado. Agitar com auxlio de basto de vidro at dissoluo. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio. Distribuir de forma a garantir o volume desejado aps a autoclavao. Identificar e datar. Autoclavar a 121 1C por 15 minutos. Armazenar adequadamente.

Obs. MEIOS DE CULTURA: Meios de cultura desidratados fornecidos por diferentes fabricantes podem apresentar pequenas diferenas em suas composies. Observar atentamente a quantidade necessria de meio desidratado, em gramas por litro de meio a ser preparado, o modo de preparo, o tempo e a temperatura de esterilizao em cada caso. Ao adquirir meios de cultura, observar atentamente a formulao, comparando-a com aquela indicada neste manual. s vezes, as diferentes marcas utilizam diferentes termos para uma mesma substncia. Por exemplo, os termos triptona e tripticase referem-se peptona de casena obtida por digesto trptica ou pancretica.

Grupo de risco de componentes de meio de cultura (Instruo Normativa 62 de 2003):

N = nocivo;

I = irritante;
T = txico; H = hidropoluente; P = perigoso para o meio ambiente; C = corrosivo; O = oxidante; F = inflamvel; E = explosivo; M = mutagnico; Co = comburente.

3. Metodologia e Tcnicas de Anlise

3.1. Tcnica de anlise: a) Retirar assepticamente 25g ou 25 ml da amostra e preparar diluies sucessivas; b) Pipetar alquotas de 1 ml de cada diluio para placas de Petri (100 x 20 mm) esterilizadas, fazendo de cada diluio placas em duplicata; c) Adicionar a cada placa 15 a 20 ml de gar padro para contagem, previamente fundido e resfriado temperatura de 44 a 46oC; d) Homogeneizar com movimentos suaves, em forma de oito (cerca de 10 vezes) e deixar a temperatura ambiente at a completa solidificao do gar; e) Aps a solidificao, incubar as placas em posio invertida a 35-37oC/48 horas. Obs.: Leitura: - Produtos em geral: Placas que contenham entre 25 e 250 colnias; - Amostras de gua: Placas que contenham entre 30 e 300 colnias.

Diluies Seriadas:
Homogeneizar
AMOSTRA DE ALIMENTO 225 ML DE DILUENTE (GUA PEPTONADA)

1 ml

1 ml

1 ml

9 ml

9 ml
diluente

Diluio 10-1 ou 1/10 ou 0,10

diluente

Diluio 10-2 ou 1/100 ou 0,010

Diluio 10-3 ou 1/1000 ou 0,0010

Diluio 10-4 ou 1/10000 ou 0,00010

As diluies seriadas devem ser realizadas para a partir delas se fazer a

inoculao nos meios de cultura; feita pelo menos uma inoculao de cada diluio Com o alimento diludo, fica mais fcil encontrar uma placa ideal para se fazer a contagem de microrganismos

Inoculao: semeadura pour plate A partir das diluies seriadas:

10-1
10-2
10-3 10-4

1 ml
MEIO MEIO

1 ml
MEIO

1 ml
MEIO
PLACA

1 ml

PLACA

PLACA

PLACA

PLACA PLACA PLACA PLACA

Aps inoculao, inverter as placas e incubar em estufa

PLACA

PLACA
PLACA

ESTUFA 37oC 24/48 h

PLACA

Passos da Tcnica de Semeadura da Amostra em Profundidade

3.2. Resultado: Transcorrido o tempo de incubao, considerar para contagem, somente as placas da mesma diluio que apresentarem de 25 a 250 colnias ou 30 a 300, conforme amostra; Multiplicar a mdia aritmtica das mesmas pelo respectivo fator de diluio e expressar o resultado em Unidades Formadoras de Colnia /1,0 g de amostra (UFC/g) Exemplo:
Placa 10-1 : Acima de 1000 UFC (unidades formadoras de colnia) Placa 10-2 : 250 UFC

Placa 10-3 : 23 UFC

Placa 10-4 : 0 UFC

A melhor placa para se obter o resultado desta contagem a

placa da diluio 10-2. Resultado: 250 x 102 = 250 x 100 = 25.000 UFC/g ou ml Expressar o resultado sempre em exponencial: 2,5 x 104 UFC/g de alimento.

4) Significado nos Alimentos

Esta contagem detecta em um alimento, o nmero de bactrias aerbias ou facultativas e mesfilas presentes tanto sob a forma vegetativa quanto esporulada;
A contagem padro em placas (CPP) tem sido usada como indicador da qualidade higinica dos alimentos, fornecendo tambm idia sobre seu

tempo til de conservao.

Sua presena em grande nmero indica:

Matrias-primas excessivamente contaminadas; Limpeza e desinfeco de superfcies inadequadas; Higiene inadequada na produo; Condies inadequadas de tempo/temperatura

durante a produo ou a conservao dos alimentos, ou uma combinao destas circunstncias. OBS 1.: Estudar a aula de microrganismos indicadoresmesfilos!!!!!!!!!! OBS2.: Para expresso dos resultados, consultar a IN62, 2003 (anexo IV- procedimento para contagem de colnias).