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OBJETIVO GERAL
Determinar a estrutura do biofilme e a biodiversidade dos microrganismos em mucosas de
pacientes com RSC, usando mtodos de imagem, bioqumicos e cultura convencional.
OBJETIVOS ESPECIFCOS
Caracterizar a estrutura do biofilme presente em pacientes acometidos de rinossinusite
crnica;
Determinar os microrganismos presentes no biofilme de pacientes acometidos de
rinossinusite crnica;
Estabelecer uma correlao entre dados demogrficos, hbitos e sintomas dos pacientes
acometidos com rinossinusite crnica e o tipo de biofilme e microrganismo isolados;
Investigar as macromolculas que compe a matriz extracelular (cidos nuclicos, protenas
e polissacardeos) do biofilme formado in vitro por microrganismos isolados de paciente com
rinossinusite crnica;
Avaliar as caractersticas hidrofbicas do biofilme formado in vitro a partir de microrganismos
isolados de paciente com rinossinusite crnica.
METODOLOGIA
Tipo de estudo
Estudo do tipo prospectivo.
Locais do estudo
Ambulatrio de otorrinolaringologia do Hospital Universitrio Walter Cantdio - Universidade
Federal do Cear.
Laboratrio de Bacteriologia do Departamento de Microbiologia Mdica, Centro de Cincias da
Sade - Universidade Federal do Cear
Comit de tica
O estudo ser submetido ao Comit de tica de Pesquisa em Seres Humanos do Hospital
Universitrio Walter Cantdio UFC (Fortaleza CE) de acordo com a Resoluo 466/12 do
CNS.
METODOLOGIA
Pacientes
Tambm sero coletados dados demogrficos (sexo, idade, uso de medicamentos, tabagismo,
presena de alergias e presena de asma), alm de achados da endoscopia nasal.
METODOLOGIA
Coleta do material
Pacientes com RSC tero o tecido da mucosa sinusal colhido a partir dos seios etmoidais
durante cirurgia endoscpica.
Fragmento de tecido
Meio de transporte
METODOLOGIA
Identificao das culturas bacterianas e fngicas
Aspirado sinusal
Meio de transporte
gar Sangue
gar Chocolate
gar Saboraud
Colorao de Gram
Identificao de bactrias
Identificao de fungos
METODOLOGIA
Ensaio de anlise da cintica dos biofilmes isolados
Tubo 3 da
escala de
MacFarland
Incubao
35C/ 24h
Suspenso
microbiana
Incubao
35C/ 6h
Ajuste da
turbidez
Cultura microbiana
isolada
Caldo BHI
Glicose 1%
9 x 108 UFC/mL
Quantificao
da biomassa
(Cristal violeta)
Quantificao
da biomassa
(Cristal violeta)
Incubao 35C
por 12h, 24h e 48h
Troca total do
meio de cultivo
METODOLOGIA
Ensaio de anlise da cintica dos biofilmes multiespcie
Tubo 3 da
escala de
MacFarland
Incubao
35C/ 24h
Suspenso
microbiana
Incubao
35C/ 6h
Ajuste da
turbidez
Culturas
microbianas
isoladas
Caldo BHI
Glicose 1%
9 x 108 UFC/mL
200 L de cada
suspenso celular
Quantificao
da biomassa
(Cristal violeta)
Quantificao
da biomassa
(Cristal violeta)
Incubao 35C
por 12h, 24h e 48h
Troca total do
meio de cultivo
METODOLOGIA
Anlise do biofilme por MEV
Fragmento de tecido
Observao em microscpio
eletrnico de varredura Quanta
600 FEG
Metalizao
Lavagem 3x
(NaCl, sacarose e gua
destilada)
Ps-fixao em OsO4 a 1% 1h
Desidratao em concentraes
crescentes de lcool etlico
70% - 100%
METODOLOGIA
Ensaio de avaliao da hidrofobicidade da superfcie celular
Repouso 20 min
Temperatura ambiente
METODOLOGIA
Extrao e anlise de DNA extracelular (eDNA) no biofilme formado
Incubao 1h
Proteinase K
Remoo do biofilme
Centrifugao
16000g/2min
Coleta da
fase aquosa
Anlise em Nanodrop
Centrifugao
16000g/10min
Centrifugao
16000g/5min
METODOLOGIA
Ensaio de quantificao de polissacardeos no biofilme formado
Remoo do biofilme
Centrifugao
16000g/2min
Ressuspenso
com gua
Colorao com azul de toluidina
a 0,1% em cido actico (1%) e
etanol (50%)
Precipitao dos
polissacardeos com cetavlon
(brometo de cetiltrimetilamnia)
0,1% - > 2h
Eletroforese em gel de
agarose (0,6%)
Protelise com
Prolav 750
(Prozyn)
Sobrenadante liofilizado e
pesado
METODOLOGIA
Ensaio de quantificao de protenas totais na matriz no biofilme formado
Remoo do biofilme
Centrifugao
16000g/2min
Biofilme formado aps
diferentes tempos de
cultivo 6, 12, 24 e 48h
Coleta do sobrenadante
1h
Liofilizado
ressuspenso em
soluo salina nas
diluies de 1:10,
1:20 e 1:50
Sobrenadante liofilizado e
pesado
(BRADFORD, 1976)
METODOLOGIA
Ensaio de quantificao de lipdeos totais na matriz no biofilme formado
Remoo do biofilme
Amostra sonicada
Biofilme formado aps
diferentes tempos de
cultivo 6, 12, 24 e 48h
Banho-Maria
100C /10 minutos
Resfrio em gua
corrente
Adio de 5ml de
reagente de cor
(vanilina)
Retirada de 20 L
do sobrenadante
Centrifugao
1000g/5min
Congelamento
-20C
METODOLOGIA
Anlises estatstica
Os resultados deste estudo sero analisados utilizando o programa GraphPad Prism
5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA). Ser realizada estatstica descritiva dos dados
individuais dos pacientes participantes da pesquisa, atravs de medidas de frequncia para as
variveis qualitativas, e medidas de posio e de variabilidade para as variveis quantitativas. A
anlise bivariada (Teste do Qui-Quadrado, Exato de Fisher e Teste de Mann-Whitney) foi
utilizada para comparar as caractersticas do biofilme microbiano associado a RSC com fatores
scio demogrficos dos pacientes (sexo, idade, uso de medicamentos, tabagismo, presena de
alergias e presena de asma), e variveis clnicas relacionadas RSC. A anlise de regresso
logstica ser realizada para avaliar o efeito das variveis independentes. O nvel de
significncia adotado ser de p<0,05.