EFEITO DO CIDO GIBERLICO, DO CIDO ABCSICO, E

DO CLCIO NA SNTESE E ACTIVIDADE DA -AMILASE,

EM SEMENTES DE HORDEUM VULGARE L.

Realizado por:
-Ana Rita Brs
-Marta Silva
-Pedro Mateus
-Tnia Moura

Unidade Curricular: Fisiologia Vegetal

Ano letivo: 2014/15
Faculdade de Cincias da Universidade do Porto

Objetivo do trabalho:
- O presente trabalho teve como objetivo verificar o papel do GA na sntese da amilase e a ao do GA, ABA, glucose e Ca2+ no nvel de atividade da enzima em
sementes de cevada.

As sementes de Cevada
As sementes utilizadas foram de
Hordeum vulgare L. mais conhecidas
como sementes de cevada. Para a
realizao do trabalho teve-se em conta
que com a germinao das sementes o
teor de amido vai diminuindo.
Fig.0 - sementes de cevada

Germinao nas sementes de cevada

H uma fase da germinao da
semente
que
requer
acares,
nomeadamente no crescimento do
embrio;
Por isso, numa fase em que
necessrio uma quantidade admirvel de
acares disponveis produzida
-amilase.
O amido hidrolisado na
endosperma amilfero.

Fig.1 -Processos na semente no desenvolvimento do

embrio

-amilase
A -amilase uma enzima induzida pelo
embrio das sementes sendo responsvel
pela hidrolizao do amido.

Fig.2 - -amilase

Fig.3 - amido

cido Giberlico (GA)

O cido giberlico produzido no interior
da sementes. Quanto maior a concentrao
de GA, maior ser a produo de amilase.

Fig. 4 - cido Giberlico

cido Abscsico (ABA)

Fito-hormona que controla a
maturao
das
sementes
.
Regulador do crescimento da
planta atravs da inibio de
produo da -amilase.
Fig.5 - cido asbcsico

Ca 2+
Os caties Ca2+ so importantes no
processo pois a -amilase necessita de se
ligar a eles para permanecer funcional e
estvel.

Fig.6 - Catio de clcio

A cicloheximida
A cicloheximida um inibidor da
sntese proteica em clulas, atuando
ao nvel da transcrio do DNA.

Fig.8 - Transcio do DNA

Fig. 7 - Cicloheximida

Material e Procedimento
Preparao de reagentes:
Lixvia a 10%: Preparar 100 mL a partir de lixvia comercial.
gua destilada e esterilizada: Preparar 1 L.
Tampo HEPES 0,01 M pH 6: Preparar 1 L. (MM = 238,3 g/mole).
Soluo de GA 10-6 M em tampo HEPES: Dissolver 18,25 mg de GA
em 500 mL de tampo HEPES; aquecer para dissolver, verificar o
volume o pH = 6,0.
Soluo de GA 10-6 M com CaCl2 10 mM em tampo HEPES:
Dissolver 0,147 g de CaCl2.2H2O em 100 mL da soluo GA 10-6 M
em tampo HEPES; verificar o pH.
Soluo de ABA 1 M + GA 10-6 M em tampo HEPES: dissolver ABA
em 1 mL de etanol 95%. Completar o volume com soluo de GA 10 -6
M em tampo HEPES.
Soluo de GA 10-6 M + cicloheximida 1 g/cm3 em tampo HEPES:
dissolver a cicloheximida em 1 mL de etanol 95%. Completar o
volume com soluo de GA 10-6 M em tampo HEPES (guardar a 4
C)

Parte I - Preparao e tratamento das sementes

1. Procedeu-se desinfeco de 250 sementes de cevada com lixvia a 10%, seguindo-se de
lavagens sucessivas com gua destilada. Manteve-se as sementes em papel de filtro humedecido,
em obscuridade, durante 24h, temperatura de 4C:
2. Seccionou-se transversalmente as sementes e separou-se as suas metade com e sem embrio

A identificao do embrio foi feita por comparao,

sendo a parte com embrio tenuemente mais clara.

Quando as sementes so esverdeadas o embrio

mais fcil de identificar;
Fig.9 - Esquema ilustrativo da separao
da metade com embrio da metade sem
embrio

As sementes so ricas em amido e, por isso, so susceptveis a ataques de

microorganismos.
Para prevenir esse ataque necessrio trabalhar com bastantes cuidados asspticos:
-As lminas utilizadas anteriormente foram passadas pela chama;
-Material lavado por autoclavagem(lavagem a altas presses e temperaturas);
-Trabalho a baixas temperaturas (4C);

Fig. 10-Corte das sementes

3. Catorze placas de Petri, com 2 discos de papel de filtro na base, foram esterilizadas por
autoclavagem;

Nota:
As metades devem ser colocadas com a
parte cortada em contacto com o papel
de filtro.

Fig. 11- Colocao das sementes na placa de Petri

4. Numeraram-se placas de Petri de 1 a 6, fazendo

duplicados, e pipetou-se 5 mL das seguintes solues
para cada tratamento:
Placas 1 e 2: tampo HEPES 0,01 M, pH 6;
Placa 3: GA 10-6 M em tampo HEPES;
Placa 4: GA 10-6 M + CaCl2 10 mM em tampo HEPES;
Placa 5: GA 10-6 M + ABA 1 M em tampo HEPES;
Placa 6: GA 10-6 M + cicloheximida em tampo HEPES;
Em cada uma das placas foram colocadas 15 metades das
sementes previamente preparadas: na placa 1 colocaramse metades com embrio e nas restantes placas sementes
sem embrio;

Fig. 12 - Placa de Petri com as sementes

5. Fecharam-se e vedaram-se as placas com parafilme e colocaram-se a incubar na obscuridade

durante 48h a uma temperatura de 250C;

Nota:
As plantas tm vrios tipos de
amilases, por isso importante ser
rigoroso com o tempo de incubao,
caso contrrio comeam a surgir outras
amlases ( amilase) e assim na
quantificao no teramos apenas a amilase;

Fig. 13 - Placa de Petri a ser vedada com parafilme

6. Procedeu-se ao congelamento das amostras at data da

extrao;
7. Procedeu-se quantificao da atividade da -amilase;

Fig. 14 - Placas de Petri completas e vedadas

Fig. 15 -Tubos contendo as amostras para

congelamento

Parte II - Preparao dos extratos para a quantificao de protenas

1. Em gelo, homogeneizaram-se as sementes
em 2mL de tampo de cido ctrico-citrato de
sdio 10 mM, pH 5;

Fig. 16 - Homogeneizado de
sementes

2. Foram adicionados mais 2 mL de tampo. Depois de todo o material estar bem

esmagado foi transferido com uma pipeta de Pasteur para um tubo de centrfuga. O
almofariz foi lavado com 2 mL de tampo que foi adicionado ao tubo com o extrato,
perfazendo um volume final de 6mL;

3. Centrifugou-se o extrato a 5000 rpm durante

5min., no frio. Transferiu-se o sobrenadante para
tubos envoltos em gelo;
Nota:
Para utilizar a centrfuga necessrio que o
suporte no lado oposto quele que contm a
nossa amostra tenha um mesmo peso para
contrabalanar.

Fig. 17 - Colocao das amostras na centrfuga

O pH pode desnaturar a -amlase e, por isso,

necessrio o uso de tampo que evita variaes
de pH;
Tambm ser necessrio trabalhar em gelo para
que as protenas no desnaturem, uma vez que
h tendncia de a temperatura subir.
Fig.18- Esquema ilustrativo de uma amostra depois
de centrifugada

Parte III - Quantificao de protenas pelo mtodo de Bradford

1. Preparam-se 10 mL 6 solues de albumina com concentraes crescentes com o intervalo de 0,2
mg/mL (0,0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 mg/mL);

2. Adicionou-se 1mL reagente de Bradford a 100 L de

cada sobrenadante diludo em cuvetes.
- Deixou-se repousar temperatura ambiente durante
15 min.;
3. L-se a absorvncia a 595 nm;

Fig. 19 - Utilizao do Reagente de Bradford

Nota:
O corante de Bradford tem uma cor acastanhada e reage com as protenas corando-as
de azul. A cor ideal neste caso em especfico aps os 15 min de reaco castanho.

Fig. 20 - Aspeto de cada soluo aps a reao com o reagente de Bradford

Parte IV-Quantificao da actividade da -amilase nos diferentes grupos de

sementes
1. Marcaram-se e prepararam-se os tubos de acordo com a seguinte tabela :
Tubos

Tratamento

Volume
extrato(mL)

Volume
amido(mL)

Tempo de
reao(min)

Controlo c/embrio

0,5

0,5-1

Controlo s/ embrio

0,5

2-3

GA

0,5

0,5-1

GA+Ca

0,5

0,5-1

ABA+GA

0,5

2-3

Ciclohexamida+GA

0,5

2-3

2. Pipetou-se 0,5 mL de extrato e 1mL de soluo de amido para cada tubo de ensaio.
Aps o tempo de reao tabelado adicionou-se 1,5 mL de HCl a 1M. Adicionaram-se
0,5mL Lugol a cada um dos tubos;
3. Mediu-se a absorvncia das solues a 580nm;
4. Determinou-se a quantidade de -amilase;

Tratamento de resultados
Tubo

Abs 595 nm

Concentrao
proteica
(g/mL)

Tempo de
reao
(min)

Abs 580 nm

% amido
hidrolisado /
mL/min

% de amido
hidrolisado /
minuto/g
de protena

0,967

4,4x102

0,50

0,437

112,6

0,5

0,729

3,4x102

2,53

0,400

23,7

0,1

0,806

3,7x102

0,50

0,347

130,6

0,7

0,785

3,6x102

0,58

0,454

94,1

0,5

0,732

3,4x102

1,00

0,308

69,2

0,4

0,914

4,2x102

2,58

0,300

27,1

0,1

-----

-----

----

1,088

----

----

Exemplo de clculos:
1. Determinao da concentrao de protenas na amostra
- Reta padro da atividade das protenas:

y = 0,0022x 0,0089

x concentrao de protenas na amostra (g/mL)

y absorvncia a 595 nm

Admitindo:
Absorvncia a 595 nm (extrato tubo 1) = 0,725

0, 725 0, 0022 x 0, 0089

x 333, 59 g/ mL
Concentrao proteica (x) = 333,59 g/mL

Se X representar a quantidade de amido presente no incio da reaco (A 580nm do tubo 7) e Y

representar o teor de amido presente no fim da reao (A 580nm de cada um dos tubo 1 - 6), ento:

X-Y=Z,

em que Z representa a quantidade de amido hidrolisado durante a reao em cada um dos tubos e,

100(Z/X),

representa a % de amido hidrolisado.

Exprimir os resultados % de amido hidrolisado/mL/min

Absorvncia a 580 nm tubo 7 = 1,7820 (X)
Absorvncia a 580 nm tubo 1 = 0,6683 (Y)

X - Y = 1,1137 (Z)
% de amido hidrolisado :

1,1137
100
62, 5%
1, 7820
Tempo de reao: 2,5 min
Ento:
62,50 % / 2,5 min = 25 % amido hidrolisado/min

Para calcular a % de amido hidrolisado por mL, temos:

25 % ---------- 0,5 mL (volume SN na mistura de reao)

X ---------- 1 mL

X = 50 %
Ento:
50 % amido hidrol/min/mL ----------- 333,59 g/mL protena
Y ----------- 1 g

Y = 0,1499 0,150 % amido hidrol/min/g protena

Resultados esperados:

Resultados obtidos:

Tubo

% amido
hidrolisado/min/g
de protena

Tubo

% amido
hidrolisado/min/g
de protena

1 - C/ emb

0,225

1 C / emb

0,5

2 - S/ emb

0,071

2 S/ emb

0,1

3 - C/ GA

0,379

3- C/ GA

0,7

4 - C/ GA + Ca

0,383

4 C/ GA + Ca

0,5

5 - C/ GA + ABA

0,171

5 C/ GA + ABA

0,4

6 - C/ GA +
ciclohex

0,094

6 C/ GA + ciclohex

0,1

Concluso e discusso dos

resultados

Com
embrio +
HEPES

Sem embrio
+
HEPES

0,225

0,071

Placa 1

Placa 2

Concluso: A produo de amilase est relacionado com a parte da semente que contm
o embrio, dado que ocorre maior degradao de amido na presena do embrio.
Mas, o que dar o sinal aleurona para iniciar a produo de amilase?

Sem embrio
+
HEPES
+
GA
0,379

Concluso: Nesta placa, tratamos a semente

sem embrio com GA e h um aumento de
amido hidrolisado, at maior que o verificado
na placa 1.
O GA responsvel pela induo de amilase
e, por isso, o sinal que libertado pelo
embrio.

Placa 3

21-Frmula estrutural do GA

Sem embrio
+ HEPES
+ GA
+ CaC

Sem
embrio
+ HEPES
+ GA
+ ABA

0,383

0,171

Placa 4

Placa 5

Concluses:
Na placa 4, houve um aumento da percentagem de amido hidrolisado, o que significa que o atua
como um estimulante ao de amilase.
Na placa 5, houve uma diminuio, o que se pode concluir que ABA um inibidor da produo de
amilase.

Como?

Etapas da sntese proteica:

1) Transcrio
2) Traduo

Sabe-se que ABA inibidor na fase da

transcrio.

Fig. 22-Mecanismo de sntese de protenas

Sem
embrio
+ HEPES
+ GA
+
cicloheximid
0,094
a

23-Frmula estrutural da
cicloheximida

Placa 6

Pressuposto: A cicloheximida inibidor da ao da amilase.

Concluso: Na presena de GA e de cicloheximida, amilase no atua. Logo, a cicloheximida
interfere na sntese proteica e o GA ativa a enzima, aps a sua formao.
Como?

Etapas da sntese proteica:

1) Transcrio
2) Traduo

Atualmente, sabe-se que a cicloheximida

interfere
na
fase
da
traduo,
nomeadamente, no deslocamento das
molculas tRNA e mRNA, ao nvel do
ribossoma.

Figura 23

Concluses finais

Neste trabalho, inferimos acerca dos papis de GA, ABA e de clcio na

sntese e atividade de -amilase.

Deste modo, verificamos que a induo da produo de a-amilase

comandada pelo embrio e que este, por sua vez, produz GA para
induzir tal produo. O GA estimula, pela anlise de resultados, a
produo de -amilase. Mas, em presena de cicloheximida, ocorre uma
inibio de produo de -amilase, o que indica que a cicloheximida
inibe a -amilase, numa fase anterior sua produo.

Quanto ao Ca2+ e tambm ao ABA, verifica-se que a produo de amilase aumenta e diminui, respetivamente. Logo, conclumos que o
Ca2+ tem um papel importante na estabilidade da enzima, enquanto que
o ABA interfere na fase da produo da protena que depois de ativada,
se torna na enzima em causa.

Bibliografia
Plant Physiology Lincoln Taiz & Eduardo Zeiger, Sinauer Associates, Inc.,
Publishers. 2010
http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0103-84782007000200010&script=sci_arttext
http://www.gepe.ufpr.br/pdfs/Crescimento%20de%20Hemerocallis%20hybrida
%20cv%20Graziela%20Barroso%20submetida%20a%20aplicacoes%20de
%20acido%20giberelico.pdf