Universidade Federal de Santa Maria

Programa de Ps-Graduao em
Farmacologia

Anlise filogentica e filogeogrfica de

isolados de Pythium insidiosum
atravs do marcador gentico exo1 e
susceptibilidade aos compostos
metlicos
Tatiana Corra Ribeiro
Orientador: Janio M. Santurio

Santa Maria, 26 de fevereiro de 2016.

Introduo
Pythium insidiosum o oomiceto aqutico
causador
da
pitiose,
uma
doena
piogranulomatosa que acomete animais e
humanos.

Fonte: EMBRAPA

Introduo
Brasil

Tailndia

Fonte: Google Maps

Reviso bibliogrfica
Pythium insidiosum
Reino Straminipila
Classe Oomycetes
Ordem Pythiales
Famlia Pythiaceae
Gnero Pythium

(Hendrix, 1964; Mendoza e Newton, 2005)

Reviso bibliogrfica
Caractersticas de P. insidiosum:

Crescimento micelial;
Produo de zosporos;
Ausncia de ergosterol;
Presena de celulose e -glucanas.

Gaastra et al.,

Reviso bibliogrfica
Desenvolvimento do
miclio

Formao
Zoosporngi
o
e Zosporos

Zosporos
livres

Ciclo
30C a 40C
Normal
Zosporos
em guas

Germinam
Fixam-se
nas plantas
da gua

paradas

Zosporos
atrados
por pelos
dos equinos
Fixam-se numa
ferida e
germinam

Crescimento
vegetativo
nos tecidos
(PITIOSE)

Reviso bibliogrfica
Espcies acometidas:

Fonte: Google (domnio

Reviso bibliogrfica
Diagnstico:

Aspectos clnicos e histopatolgicos;

Identificao do agente

Cultivo de
materiais
biolgicos

Tcnicas
imunolgic
as

Tcnicas
molecular
es

Reviso bibliogrfica
Tratamento:

Fonte: Google (domnio pblico)

Singularidades do agente
Dificuldade do tratamento
Geralmente necessrio utilizar associaes

Objetivo Geral
Analisar as caractersticas filogenticas e
filogeogrficas de isolados brasileiros e
tailandeses de P. insidiosum, bem como
caracterizar a susceptibilidade de P. insidiosum
frente a compostos metlicos.

Objetivos especficos
Utilizar o gene Exo-1,3--Glucanase (exo1) para a caracterizao
molecular de isolados de P. insidiosum oriundos de diferentes regies do
Brasil;
Caracterizar filogeneticamente os isolados brasileiros de P. insidiosum;
Comparar geneticamente os isolados brasileiros e tailandeses de P.
insidiosum empregando o marcador exo1;
Investigar o perfil filogeogrfico dos isolados brasileiros e tailandeses de P.
insidiosum;
Avaliar a susceptibilidade dos isolados de P. insidiosum frente aos
compostos metlicos de cobre (Cu), zinco (Zn), cdmio (Cd) e mangans
(Mn);
Detectar o metal com maior atividade antimicrobiana para ser empregado
no desenvolvimento de formulaes eficazes contra P. insidiosum.

Apresentao
O estudo foi conduzido na forma de dois manuscritos:
Manuscrito 1: Phylogenetic and phylogeographic
analysis of P. insidiosum isolates of Brazil and Thailand
based on Exo-1,3--Glucanase gene
Manuscrito 2: In vitro susceptibility of Pythium
insidiosum to metallic compounds containing cadmium,
lead, copper, manganese and zinc

Manuscrito 1
Phylogenetic and phylogeographic
analysis of P. insidiosum isolates of
Brazil and Thailand based on exo1,3--glucanase gene
Artigo a ser submetido Veterinary Microbiology
Tatiana Corra Ribeiro, Carla Weiblen, Maria Isabel de Azevedo, Snia
de Avila Botton, Lizandra Jaqueline Robe, Daniela Isabel Brayer Pereira,
Danieli Urach Monteiro, Douglas Miotto Lorensetti, Janio Morais Santurio

Objetivo

Manuscrito
1

Investigar
as
relaes
filogenticas
e
filogeogrficas entre isolados de P. insidiosum de
diferentes regies do Brasil e da Tailndia, usando
a anlise de sequncias do gene exo-1,3-glucanase (exo1).

Metodologia

Manuscrito
1

Isolados de P. insidiosum e extrao de DNA

16 isolados clnicos de equinos de diferentes
regies do Brasil
2 cepas-padro (ATCC 58637 and CBS 119452)

- Cultivo em caldo Sabouraud;

- Extrao do DNA total (Mller et al.,1992; Klassen et al.,
1996);
- Amplificao com P24F 3 P24R
- Purificao e sequenciamento

Manuscrito
1

Metodologia
Species

Isolate

Source

Geographic origin

Geographic coordinates

Latitude

Longitude

P. insidiosum

118

Equine

Jaguari

S2929'38.5595"

W5442'12.7069"

P. insidiosum

121

Equine

SantaMaria

S2941'14.303"

W5348'55.7168"

P. insidiosum

123

Equine

CachoeiradoSul

S302'0.5352"

W5253'35.8134"

P. insidiosum

138

Equine

Corumb

S190'35.3624"

W5739'17.0806"

P. insidiosum

178

Equine

Corumb

S190'35.3624"

W5739'17.0806"

P. insidiosum

187

Equine

Jari

S2917'33.7945"

W5413'27.2748"

P. insidiosum

210

Equine

Uruguaiana

S2945'42.8836"

W575'9.0341"

P. insidiosum

290

Equine

SantaMaria

S2941'14.303"

W5348'55.7168"

P. insidiosum

291

Equine

Pelotas

S3146'33.7148"

S3146'33.7148"

P. insidiosum

293

Equine

RioGrande

S321'59.5074"

W525'55.0118"

P. insidiosum

296

Equine

Pelotas

S3146'33.7148"

S3146'33.7148"

P. insidiosum

135

Equine

Corumb

S190'35.3624"

W5739'17.0806"

P. insidiosum

219

Equine

SoLourenodoSul

S3121'46.2841"

W5158'43.8845"

P. insidiosum

223

Equine

CachoeiradoSul

S302'0.5352"

W5253'35.8134"

P. insidiosum

143

Equine

Corumb

S190'35.3624"

W5739'17.0806"

P. insidiosum

232

Equine

Uruguaiana

P. insidiosum

ATCC58637

Equine

CostaRica

S2945'42.8836"
-

W575'9.0341"
-

P. insidiosum

CBS119452

Human

Thailand

Manuscrito
1

Metodologia
Species

P. insidiosum
P. insidiosum
P. insidiosum
P. insidiosum
P. insidiosum
P. insidiosum
P. insidiosum
P. insidiosum
P. insidiosum
P. insidiosum
P. insidiosum
P. insidiosum
P. insidiosum
P. insidiosum
P. insidiosum
P. insidiosum
P. insidiosum
P. insidiosum
P. insidiosum
P. insidiosum
P. insidiosum
P. insidiosum
P. insidiosum
Phytophthora sojae
Phytophthora capsici
Phytophthora
parastica
Phytophthora
infestans

Isolate

Geographic origin

Geographic coordinates
Latitude

Longitude

GenBank accession
number

P1
P2
P3
P6
P7
P9
P10
P11
P15
P16
P17
P19
P20
P22
P24
P25
P27
P28
P29
P30
P32
P40
Pi-S
P6497
CBOT129-H24

Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Unknown
Unknown

Bangkok
Lopburi
Chantaburi
Nan
Ayuthaya
Lumpang
NA
Saraburi
Yasothon
Saraburi
Chonburi
NA
NA
Patomthani
Supanburi
Nakornpatom
NA
NA
NA
Rachaburi
NA
Pichit
-

N1343'24.307"

E10028'34.4348"

N152'59.8459"
N1247'52.4231"
N1846'32.2745"
N1421'11.6489"
S621'25.002"
N1431'43"
N1547'33.5076"
N1431'43"
N1321'40"
N141'15.0208"
N1428'28.1611"
N1358'44.0004"
N1331'41.8415"

N1611'13.9268"
-

E10053'25.1156"
E1029'47.7785"
E10046'22.9501"
E10034'8.283"
E10632'37.2336"
E10054'41"
E1048'43.0177"
E10054'41"
E10059'6"
E10031'30.0994"
E1007'3.7661"
E10010'13.1725"
E9948'48.316"

E10020'59.2422"
-

GU994090a
GU994091a
GU994092a
GU994093a
GU994094a
GU994095a
GU994096a
GU994097a
GU994098a
GU994099a
GU994100a
GU994101a
GU994102a
GU994103a
GU994104a
GU994105a
GU994106a
GU994107a
GU994108a
GU994109a
GU994110a
GU994111a
LC033487b
XM_009541535c
BT032091

INRA-310

Unknown

XM_008895332c

Unknown

AF494014d

Krajaejun et al. 2010

Keeratijarut et al. 2015
c
Tyler et al. 2006
d
McLeod et al., 2003
a

Source

Metodologia

Manuscrito
1

Anlise de presses de seleo

Foi realizado o teste Z e a fora da presso de
seleo para cada codon (Nei & Gojobori, 1986; Felsenstein ,
1981)

Anlise filogentica

Neighbor Joining (NJ)

Mxima Parsimnia (MP)
Maxima Verossimiliana (ML)
Bayesiana (AB);

Metodologia

Manuscrito
1

Anlise filogeogrfica
31 amostras de origem geogrfica conhecida;
Diversidade Nmero de locus polimrficos, nmero
de substituies, heterozigose esperada e Pi
Neutralidade Teste D (Tajima, 1989) e FS (Fu , 1997)
Nvel de diferenciao entre os isolados FST
Anlise espacial de varincia molecular (SAMOVA) e
Anlise de varincia molecular (AMOVA) (Dupanloup et
al., 2002)

Manuscrito
1

Resultados
Clade
1

Clade
2

Clade
3

Figure 1: Phylogenetic relationship among the examined Pythium insidiosum isolates inferred by posterior
probability (PP), maximum likelihood (ML), maximum parsimony (MP), and Neighbor-Joining (NJ) analyses based
on Exo-1,3--Glucanase gene. The numbers along branches indicate bootstrap values and posterior probabilities

Manuscrito
1

Resultados
Tabela 2: Results of diversity analysis
Molecular diversity
indices
No. of polymorfism loci
Mean expected
heterozygosity
s.d. expected
heterozygosity
No. of transitions
No. of transversions
No. of substitutions
No. private subst. Sites
Pi

13

Thailan
d
73

0.04521

0.26352

0.15436

0.15437

0.12721

0.20256

0.16488

0.05328

9
4
13
7
4.159

43
33
76
67
24.244

26
24.042
18.5
20.506
44.5
44.548
37
42.426
14.20148 14.20182

Brazil

Mean

s.d.

43

42.426

No.: number
s.d.: standard
deviation
Pi: Nucleotide
diversity

Os ndices de diversidade tambm foram calculados para

as localidades amostradas, os valores para os isolados
brasileiros foram em geral menores que os observados
para os isolados tailandeses.

Resultados

Manuscrito
1

Figure 2: Map of locations sampled for Brazil and Thailand for analysis of genetic
diversity. The symbols represent the structure observed in AMOVA. Saraburi is
identified with a diferent symbol once has isolates in both clade 2 and 3.

Manuscrito
1

Resultados

Tabela 3: Analysis of molecular variance (AMOVA) for populations of P.

insidiosum from 3 groups of localities based on exo1 sequences.
Source of
Variation

d.f.

Sum of
squares

Variance
components

Percentage of
variation

Among
groups

588.138

15.75143Va

80.82

Among
populations
within groups

20

107.935

1.00103Vb

5.14

Within
populations

39

106.750

2.73718Vc

14.04

Total

61

802.823

19.48964

d.f: Degrees of freedom

Manuscrito
1

Resultados

Table 4: Pairwise FST values for the three populations obtained in the
AMOVA.
Brazil
Thai 1
Thai 2
Thai 1
Thai 2

0.90755*
0.78131*

0
0.75687*

*Significant
values

FST tambm foi calculado entre as localidades

amostradas, com valores significativos para os isolados
brasileiros.

Manuscrito
1

Resultados
Table 5: Results of neutrality tests (Tajimas D and
Fus Fs).
D de Tajima
Tajima's D
Tajima's D
p-value

Brazil

Thai1

Thai2

Mean

s.d.

0.94007

-0.65032

-1.33207

-0.34744

1.16596

0.875

0.281

0.082

0.41267

0.41257

-10.752
0

0.13087
0.504

1.02585
0.7

-3.19842
0.40133

6.55687
0.36112

FS de Fu
FS
FS p-value

Discusso

Manuscrito
1

As relaes filogenticas de P. insidiosum so

usualmente estudadas atravs de sequncias
nucleotdicas do gene mitocondrial citocromo c
oxidase subunidade II (cox II) e da regio nuclear
ITS (Schurko et al., 2003; Kammarnjesadakul et al., 2011; Azevedo et al., 2012).
Entretanto,
diferentes
marcadores
podem
apresentar histrias evolutivas diferentes (Rokas et al.,
2003, Kuramae et al., 2007, Shan & Gras, 2010).

Manuscrito
1

Discusso
Gene exo 1
2229pb
742 aminocidos
Domnios BglC e X8
(Keeratijarut et al., 2015)

Protena considerada um alvo em potencial para o

desenvolvimento de testes de diagnstico e
imunoterapia (Krajaejun et al., 2006)

Discusso

Manuscrito
1

Ausncia de sinal de presso positiva;

Anlise de uma poro da regio codificadora do
gene (37%), importante avaliar o restante do
gene;
Sequenciamento completo do genoma de P.
insidiosum (Ascunce et al., 2015) abre novas possibilidades
de estudos com genes at ento no conhecidos.

Manuscrito
1

Discusso

O gene exo 1 foi capaz de recuperar a filogenia observada em

estudos prvios com outros marcadores (Azevedo et al., 2012);
Foi possvel confirmar os isolados brasileiros como parafilticos
em relao aos tailandeses;
A rvore filogentica suporta a
neotropicais dos isolados asiticos;

derivao

dos

isolados

SAMOVA apresentou praticamente a mesma estrutura da rvore

filogentica e cerca de 81% da variao foi observada entre os 3
grupos, segundo a AMOVA. Sugerindo tratar-se de uma estrutura
antiga;
Os baixos valores de diversidade (Pi) e os sinais de expanso
recente (FST ) detectados para os isolados brasileiros suportam que
estes so derivados dos grupos tailandeses.

Concluso

Manuscrito
1

O gene exo1 foi capaz de esclarecer alguns padres

evolutivos relacionados a P. insidiosum, revelando-se
um importante marcador para o estudo da filogenia e
filogeografia deste patgeno.
A incluso de isolados destas e de outras regies do
mundo e a adio de uma perspectiva temporal para
estas anlises certamente vai ajudar a aprofundar o
conhecimento relacionado com a evoluo deste
microrganismo importante e ainda pouco conhecido. No
entanto, dada a escassez relacionados amostragem e
calibrao das taxas de relgio molecular, este
estudo certamente representa um primeiro passo
importante para compreender a epidemiologia e
evoluo do P. insidiosum.

Manuscrito 2
In vitro susceptibility of Pythium
insidiosum to metallic compounds
containing cadmium, lead, copper,
manganese and zinc
Artigo submetido Mycopathologia
Tatiana Corra Ribeiro, Carla Weiblen, Snia de Avila Botton, Daniela
Isabel Brayer Pereira, Francielli Pantella Kunz de Jesus, Camila Marina
Verdi, Leticia Trevisan Gressler, Janio Morais Santurio

Metodologia

Manuscrito
2

21 isolados clnicos de P. insidiosum e 2 cepaspadro (xx) foram utilizados;

Acetato de cobre, acetato de cdmio, acetato de
chumbo, acetato de mangans, acetato de zinco
e sulfato de zinco foram diludos em gua Milli-Q
para preparao das solues estoque;
Preparo do inoculo atravs da tcnica de induo
de zosporos descrita por Pereira et al., (2007);

Manuscrito
2

Metodologia

Teste de susceptibilidade realizado com base no

documento M38-A2 (NLSI, 2008)
Compostos foram diludos atravs de diluio
seriada em RPMI e testados em triplicata.
256 0,5
g/mL

CIM e CFM foram

calculadas
para todos os isolados.
Composto
s
metlicos

C- C+

Manuscrito
2

Resultados

Table6Minimuminhibitoryandfungicidalconcentrationsforleadacetate,zincacetate,zincsulfate,manganese
acetate,cadmiumacetateandcopperacetateagainstPythium insidiosum isolates(n=23).
Time
Metallic
compound
s
Lead
acetate
Zinc
acetate
Zinc
sulfate
Manganes
e
Acetate
Cadmium
acetate
Copper
acetate

48h

MIC
MFC

MIC
MFC

MIC
MFC

MIC
MFC

MIC
MFC

MIC
MFC

MIC or MFC

No. of isolates (%) with the following MIC 1 or MFC 2(g/mL):

2

16

32

64

128

256

>256

Range
(g/mL)

GM3
(mg/liter
)

MIC
504

23(100)
23(100)

>256
>256

>256
>256

>256
-

>256
-

23(100)
23(100)

>256
>256

>256
>256

>256
-

>256
-

23(100)
23(100)

>256
>256

>256
>256

>256
-

>256
-

23(100)

>256

>256

>256

>256

23(100)

>256

>256

2(8.7)
2(8.7)

3(13.1)
1(4.3)

5(21.7)
3(13.1)

7(30.4)
7(30.4)

6(26.1)
7(30.4)

3(13.1)

16-256
16->256

91.88
111.43

128
-

256
-

3(13.1)

7(30.4)

5(21.7)

4(17.4)

4(17.4)

4-64

15.52

64

1(4.3)

5(21.7)

5(21.7)

6(26.1)

1(4.3)

4(17.4)

1(4.3)

4-256

26.71

MIC,minimuminhibitoryconcentration;2 MFC,minimumfungicidalconcentration;3GM,geometricmean;4Minimalconcentrationto
inhibitthegrowthof50%ofisolates;5Minimalconcentrationtoinhibitthegrowthof90%ofisolates.
1

MIC
905

Discusso

Manuscrito
2

As infeces causadas por P. insidiosum

respondem fracamente quimioterapia e a
monoterapia costuma ser ineficiente (Pereira et al.,
2013);
A ausncia do ergosterol na parede celular de P.
insidiosum dificulta o uso da maioria dos
antifngicos disponveis (Gaastra et al., 2011);
A complexao de metais com antimicrobianos
apontada como uma alternativa promissora no
tratamento
de
infeces
resistentes
aos
quimioterpicos disponveis no mercado (Rocha et al.,
2011);

Discusso

Manuscrito
2

Este estudo mostrou que compostos contendo cobre e cdmio

foram capazes de inibir o crescimento in vitro de P.
insidiosum;
Muitos estudos foram realizados utilizando complexos de
cobre e substncias antimicrobianas para melhorar a sua
atividade contra bactrias (Chohan et al., 2006; Martnez Medina et al., 2014)
e fungos (Creaven et al., 2009; Urquiza et al., 2015);

O potencial teraputico do tiobendazol contra Candida albicans

foi significativamente aumentado quando tiabendazol foi
complexado com o cobre (Devereux et al., 2004);

Complexos de cobre com tiossemicarbazonas foram testados

contra os fungos patognicos humanos Aspergillus niger e
Paecilomyces variotii (West et al., 1995). A complexao de cobre
com tiossemicarbazonas reduziu a CIM frente a C. albicans (Mendes
et al., 2006).

Discusso

Manuscrito
2

Formulaes com nanopartculas de xido de

cobre demonstraram inibir o crescimento de
Pythium ultimum e P. aphanidermatum. O
mecanismo de ao sugerido envolve a influncia
no metabolismo do ferro (Zabrieski et al., 2015);
O ferro um metal importante na fisiopatologia
das infeces causadas por P. insidiosum (Zanette et
al., 2013);
Portanto sugere-se que o mecanismo de
toxicidade do cobre frente a P. insidiosum pode
estar relacionado a interferncia no metabolismo
do ferro.

Concluso

Manuscrito
2

Os resultados deste estudo permitem considerar o

desenvolvimento de agentes antimicrobianos
complexados com metais como uma alternativa
para o tratamento teraputico de doenas
causadas
por
microrganismos
com
baixa
sensibilidade s drogas disponveis.
Alm disso, sugere-se a utilizao de cobre e/ou
cdmio
no
desenvolvimento
de
novas
formulaes com atividade antimicrobiana contra
P. insidiosum. Mais estudos so necessrios para
avaliar o potencial dessas novas formulaes
contra P. insidiosum em modelos experimentais in
vitro e in vivo.

CONCLUSO
O emprego do gene exo1 demostrou que este um importante
marcador para o estudo da filogenia e filogeografia de P. insidiosum.
A anlise filogentica e filogeogrfica dos isolados brasileiros e
tailandeses a partir das sequncias parciais do gene exo1 foi capaz
de esclarecer os padres evolutivos deste oomiceto. Os isolados
brasileiros de P. insidiosum so derivados dos isolados tailandeses.
Os isolados tailandeses possuem uma diversidade muito maior que
os isolados brasileiros. Isto comprova a origem mais antiga dos
isolados de P. insidiosum tailandeses em relao aos brasileiros. Os
isolados brasileiros apresentam sinais de estruturao, o que
evidncia a necessidade de maiores estudos nestas populao, uma
vez que fenmenos evolutivos esto ocorrendo.
Este estudo certamente representa um primeiro passo importante
para compreender a epidemiologia e evoluo de P. insidiosum.

CONCLUSO
Isolados de P. insidiosum tiveram seu crescimento
inibido na presena de compostos contendo
cdmio e cobre. Portanto, podemos considerar
esses metais candidatos para o desenvolvimento
de quimioterpicos com grande potencial
teraputico contra a pitiose. Entretanto
necessrio mais estudos para a avaliar sua
toxicidade e eficcia in vivo.

Referncias bibliogrficas

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Agradecimentos

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