Técnicas de Diagnóstico

Molecular
 Técnicas real-time PCR
Biologia
Molecular

TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR

 Detecção do genoma viral

 Futuro do diagnóstico de vírus

 Necessidade de equipamento e pessoal treinado

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 2

 real-time PCR
TÉCNICAS Técnicas Biologia
Molecular

 Métodos de Amplificação
 Polimerase Chain Reaction (PCR)
 Restriction Fragment Lenght Position (RFLP)
 Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP)
 Reverse Transcriptase - Polimerase Chain Reaction (RT- PCR)
 Real-Time PCR
 Sequenciamento
 Métodos de Hibridização
 Captura Híbrida
 Southern Blot
 Hibridização em tiras
 CHIPS

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 3

Amostra
 Amostra (Cuidados)
 Não efetuar exame digital (toque), colposcopia ou assepsia
prévia
 Presença de sangue (não menstrual) ou de conteúdo vaginal
alterado não modifica o resultado
 Se houver necessidade da coleta de citologia, esta deve ser
realizada em primeiro lugar
 Introduzir 1 a 1,5 cm da escova no canal cervical e rodá-la 3
vezes no sentido horário
 A seguir, escovar a ectocérvix e, se desejar, as paredes vaginais
OBS: RECOMENDA-SE ABSTINÊNCIA SEXUAL DE 3 DIAS E EVITAR
O PERÍODO MENSTRUAL
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 5
 6


Extração de Ácidos Nucléicos
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
 real-time PCR
Extração Ácidos Nucléicos Técnicas
Biologia
Molecular

 Lise alcalina;
 Neutralização;
 Precipitação de Proteínas e detritos celulares;
 Purificação Ácidos Nucleicos
 Precipitação
 Eluição em colunas

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 7

 real-time PCR
Extração Ácidos Nucléicos Técnicas
Biologia
Molecular

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 8

 real-time PCR
Extração Ácidos Nucléicos Técnicas
Biologia
Molecular

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 9

 real-time PCR
Extração Ácidos Nucléicos Técnicas Biologia
Molecular

 Utilização Nucleases
 Remoção DNA
 Remoção RNA
Add DNase

+ DNase (protein)

Add RNase

+ RNase (protein)

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 10

 real-time PCR
Extração Ácidos Nucléicos Técnicas
Biologia
Molecular

Avaliação Ácidos Nucléicos por Espectofotometria UV

Estimar a concentração de DNA e RNA a ~260nm.

[dsDNA] ≈ A260 x (50 µg/mL)
[ssRNA] ≈ A260 x (40 µg/mL)

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 11

 12


Técnicas de Amplificação AN
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
 real-time PCR
Polymerase Chain Reaction Técnicas
Biologia
Molecular

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 13

 real-time PCR
Polymerase Chain Reaction Técnicas
Biologia
Molecular

 Amplifica um fragmento de DNA especifico;

 Amplificação através de ciclos repetidos que vão permitir obter milhões de

cópias do fragmento pretendido;

 Fragmento pretendido está localizado entre duas regiões de DNA de

sequência conhecida;

5’ – (…) ATGCGTATCGATCGATATCGATAAGCTAGCTAGGCTA (…) – 3’

3’ – (…) TACGCATAGCTAGCTATAGCTATTCGATCGATCCGAT (…) – 5’

Região Alvo

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 14

 real-time PCR
Polymerase Chain Reaction Técnicas
Biologia
Molecular

MISTURA DE REAÇÃO:
 DNA
 Primers: Oligonucleotídeos de cadeia simples com
sequência complementar às sequências alvo do
DNA (idealmente 20-24 nucleotídeos);
 Buffer: Solução tampão para estabilizar a reacção;
 Mg2+ (Magnésio): Ajuda na ligação dos
nucleotídeos e estabilidade da Taq;
 dNTPs: Nucleotideos livres (A, T, C, G);
 Taq polimerase: Enzima termo-estável (+/-72ºC)
que efetua a cópia da sequência alvo do DNA.

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 15

 real-time PCR
Polymerase Chain Reaction Técnicas Biologia
Molecular

PROCEDIMENTO

 1º Passo: Abertura do ADN cadeia dupla (T=95ºC);

 2º Passo: Annealing/Ligação dos Primers (Ta~50 a 65ºC);

 3º Passo: Activação da Taq polimerase (T~75ºC);

5’ – (…) ATGCGTATCGATCGATATCGATAAGCTAGCTAGGCTA (…) – 3’

ATCCGAT (…) – 5’

3’ – (…) TACGCATAGCTAGCTATAGCTATTCGATCGATCCGAT (…) – 5’

5’ – (…) ATGCGTA

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 16

 real-time PCR
Polymerase Chain Reaction Técnicas Biologia
Molecular

PROCEDIMENTO

 4º Passo: Repetição dos passos anteriores por 30-45 ciclos no máximo;

 FINAL: Obtenção de 2nºciclos copias do fragmento alvo.

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 17

 real-time PCR
Polymerase Chain Reaction Técnicas Biologia
Molecular

Electroforese em Gel de Agarose:

 Separa as moléculas (proteínas ou ácidos núcleicos) de acordo com o seu

peso molecular;

 DNA e RNA possuem carga elétrica negativa  migram para o pólo positivo
(quanto mais pequenas mais migram);

 Brometo de Etídeo: corante fluorescente que se vai intercalar na dupla

hélice de DNA e possibilitar a visualização dos fragmentos quando em
exposição a luz UV; ( cuidado=> carcinógeno!)

 Amostras da PCR carregadas no gel;

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 18

 real-time PCR
Polymerase Chain Reaction Técnicas Biologia
Molecular

Pólo Positivo (+)

Pólo Negativo (-)

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 19

 real-time PCR
Polymerase Chain Reaction Técnicas
Biologia
Molecular

APLICAÇÕES

 Detecção de sequências específicas de DNA viral

 Detecção AdV em amostras respiratórias
 Detecção EBV em biópsias Nasofaringe
 Detecção JCV em LCR
 ...

DESVANTAGENS
 Altamente sensível à contaminação com quantidades residuais de DNA.
 Falsos positivos e artefatos.

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 20

 real-time PCR
RestrictionFragment Length Técnicas
Biologia
Polymorphism (RFLP) Molecular

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 21

 real-time PCR
Restriction Fragment Técnicas
Length
Biologia
Polymorphism (RFLP) Molecular

 Baseada na técnica da PCR;

 Análise de polimorfismos (mutações pontuais funcionais);

 Variação no tamanho de fragmentos de DNA provocada pela atividade

diferencial de enzimas de restrição (cortam o DNA numa sequência
específica)

 Presença de polimorfismo  Perda ou ganho de local de restrição 

Variação no tamanho de fragmentos de DNA.

5’ – (…) ACTGA (…) – 3’

3’ – (…) TGACT (…) – 5’

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 22

 real-time PCR
Restriction Fragment Técnicas
Length
Biologia
Polymorphism (RFLP) Molecular

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 23

 real-time PCR
Restriction Fragment Length Técnicas
Biologia
Polymorphism (RFLP) Molecular

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 24

 real-time PCR
Restriction Fragment Length Técnicas Biologia
Polymorphism (RFLP) Molecular

APLICAÇÕES

 Detecção de variantes Virais

 Detecção variantes CMV – Associação com resposta a terapia
 Detecção variantes HPV – Associação com patologias
 Detecção variantes EBV – Associação com agressividade
 ...

DESVANTAGENS
 Todas as do PCR
 Sensível a contaminação por DNAses
 Artefactos
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 25
 real-time PCR
Single Strand Conformation Técnicas
Biologia
Polymorphism (SSCP) Molecular

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 26

 real-time PCR
Single Strand Conformation Técnicas Biologia
Polymorphism (SSCP) Molecular

 Baseada na técnica da PCR;

 Análise de polimorfismos/mutações;

 Diferenças de sequência de um único nucleotídeo são suficientes para que

cadeias simples de DNA adquiram uma conformação tri-dimensional
diferente;

 Gel de Poliacrilamida permite correr as amostras (apenas em cadeia

simples/desnaturadas) em função da sua conformação.

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 27

 real-time PCR
Single Strand Conformation Técnicas
Biologia
Polymorphism (SSCP) Molecular

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 28

 real-time PCR
Single Strand Conformation Técnicas Biologia
Polymorphism (SSCP) Molecular

APLICAÇÕES

 Detecção de variantes Virais

 Detecção variantes CMV – Associação com resposta a terapia
 Detecção variantes HPV – Associação com agressividade
 ...

DESVANTAGENS
 Todas as do PCR
 Contaminações
 Leitura gel poliacrilamida

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

 real-time PCR
Reverse Transcriptase PCR Técnicas
Biologia
Molecular

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 30

 real-time PCR
Reverse Transcriptase PCR Técnicas Biologia
Molecular

 Baseada na técnica da PCR;

 Análise de expressão de mRNA;

 Usa a enzima Transcritase Reversa para converter o mRNA em cDNA;

 Protocolo PCR para aumentar exponencialmente o número de cópias do

mRNA;

mRNA: 5’ – AUGCGUAUCGAUAUCGAUAAGCUA (…) AAAAAAAAA – 3’

TTTTTTTTTT – 5’

Molécula Alvo

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 31

 real-time PCR
Reverse Transcriptase PCR Técnicas
Biologia
Molecular

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 32

 real-time PCR
Reverse Transcriptase PCR Técnicas
Biologia
Molecular

VANTAGENS

 Permite fazer análise quantitativa

da expressão de mRNA.

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 33

 real-time PCR
Reverse Transcriptase PCR Técnicas
Biologia
Molecular

APLICAÇÕES

 Expressão mRNA viral

 Avaliação da replicação viral

DESVANTAGENS
 Todas as do PCR
 Contaminações

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

 real-time PCR
Real Time PCR Técnicas
Biologia
Molecular

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 35

 real-time PCR
Real Time PCR Técnicas
Biologia
Molecular

 PCR was traditionally limited to end-point analysis

using agarose gels
 Limitations of end-point PCR:
 Poor precision
 Low sensitivity
 Short dynamic range
 Low resolution
 Size-based discrimination
 Ethidium bromide for staining does not allow
for accurate quantitation
 Requires post-PCR processing

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 36

 real-time PCR
Real Time PCR Técnicas
Biologia
Molecular

 Monitora a fluorescência
emitida durante a reação de
PCR como um indicador da
produções de amplicons em
cada ciclo de PCR;

 Monitorização em tempo real;

 Detecção da amplificação nos

estádios precoces da reação –
maior precisão;

 Alvo: DNA ou RNA

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 37

 real-time PCR
Real Time PCR Técnicas
Biologia
Molecular

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 38

 real-time PCR
Real Time PCR Técnicas
Biologia
Molecular

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 39

 real-time PCR
Real Time PCR Técnicas Biologia
Molecular

SYBR Green I Sonda de Hibridação Sonda TaqMan

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 40

 real-time PCR
Real Time PCR Técnicas Biologia
Molecular

Exponential
If 100% efficiency – exact doubling of
products. Specific and precise

PCR phases in linear view

Linear
Plateau
High variability. Reaction components
are being consumed and PCR products
are starting to degrade.
[DNA] Linear

Plateau
End-point analysis. The reaction has
stopped and if left for long – Exponential Cycle #

degradation of PCR products.

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 41

 real-time PCR
Real Time PCR Técnicas
Biologia
Molecular

Baseline – The baseline phase contains

all the amplification that is below the
level of detection of the real time
instrument.
Threshold – where the threshold and
the amplification plot intersect defines
CT. Can be set manually/automatically
CT – (cycle threshold) the cycle number
where the fluorescence passes the
threshold
Rn – (Rn-baseline)
NTC – no template control
DRn is plotted against cycle numbers to
produce the amplification curves and
gives the CT value.

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 42

 real-time PCR
Real Time PCR Técnicas Biologia
Molecular

CT = threshold cycle

Fracção dos ciclos de

PCR a partir da qual é
detectado sinal

Quanto maior a quantidade de DNA, menor o valor de Ct

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 43

 real-time PCR
Real Time PCR Técnicas Biologia
Molecular

Aplicações
 Quantificação carga viral
 Monitoração carga viral
 Monitoração terapêutica

VANTAGENS
 Amplificação monitorizada em tempo real
 Ausência de processamento pós-PCR (baixo risco de contaminação)
 Requer pouca quantidade de amostra (DNA ou RNA)
 Rápido, específico, sensível e reprodutível
 Quantitativo
 Barato

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 44

 real-time PCR
Sequenciamento Técnicas Biologia
Molecular

 Usada para determinar a sequência de nucleotídeos

 Método de sequenciamento mais utilizado – método dideoxi

 Adição de dideoxinucleotideos que terminam a reação de polimerização

3’ OH – necessário para adição do nucleotídeo seguinte

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 45

 real-time PCR
Sequenciamento Técnicas
Biologia
Molecular

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 46

 real-time PCR
Sequenciamento Técnicas
Biologia
Molecular

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 47

 48


Técnicas de Hibridização
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
 real-time PCR
Técnicas de Hibridização Técnicas
Biologia
Molecular

 Alvo – DNA ou RNA

 Utilização de sondas
específicas

 Possibilidade de diferenciação
entre subtipos de vírus

 Técnicas
 Captura Híbrida
 Hibridização em tiras
 Southern Blotting
 CHIPS

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 49

 real-time PCR
Captura Híbrida Técnicas
Biologia
Molecular

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 50

 real-time PCR
Captura Híbrida TécnicasBiologia
Molecular

Principio da técnica
 Hibridização de Ácidos Nucleicos
 Amplificação sinal por Quimioluminescência
 Método semi-quantitativo

Método
 Hibridização amostras positivas com sondas específicas
 Complexo Sonda-Amostra é capturado por anticorpos de uma microplaca
 Reação com anticorpo secundário conjugado com FA
 Adição de reagente e detecção por quimioluminescência

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 51

 real-time PCR
Captura Híbrida Técnicas Biologia
Molecular

45 minutes
at 65ºC

60 minutes
at 65ºC

15 minutes
30 minutes
60 minutes
agitação

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 52

 Captura Híbrida
 5 Low-risk types: 6, 11, 42, 43, 46

 13 High-risk types: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59,
68

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 53

 CAPTURA HÍBRIDA

 Sensibilidade em microplaca: 1 pg/ml (equivalente a 0,1 cópia

de vírus por célula)
 » Diagnóstico Molecular de HPV

 Interpretação:

 – 1 a 50 pg/ml - carga viral baixa

 – 50 a 200 pg/ml - carga viral intermediária

 – acima de 200 pg/ml - carga viral alta

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 54

 Captura Híbrida
 A captura híbrida contém sondas gênicas de 70% dos tipos de
HPV de baixo risco e 99% dos oncogênicos;
 Em virtude da biologia viral, a comparação do resultado da
captura híbrida com o da citologia e anatomia patológica, só
tem valor quando o intervalo de tempo entre as coletas for
inferior a 30 dias
 Para aferir eficácia ao tratamento indica-se colher nova amostra
após 3 meses do término da terapêutica

Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 55