PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇAO

EM GESTÃO AMBIENTAL-UFES

Avaliação de Bioindicadores
de Qualidade de águas

Prof. Servio Tulio Cassini

Labsan - PPGEA-UFES -

Programa de Pós-Graduação em Engenharia Ambienta/UFES

 Microbiologia de Águas
 Tipos e Usos das Águas
 Legislação
 Metodologias
 Tubos Multiplos (NMP)
 Membrana Filtrante (MF)
 Substrato Cromogênico (SC)
 Exemplo de Biomonitoramento de ambiente costeiro (Vitoria, E.S.)
 Principais Tipos e Usos
das Águas
 Abastecimento Doméstico
 Irrigação
 Recreacional
 “Produto Comercial”
 Lançamentos
 “Reuso”
 DOENÇAS DE VEICULAÇÃO
HÍDRICA Pseudomonas
Patógeno Infecção Água
Aeromonas spp Infecções de feridas e doce/marinha
gastroenterites
Campylobacter spp Enteritis doce/marinha
Candida albicans Dermatites doce/marinha
Clostridium spp Botulismo, tétano, gangrena doce/marinha
gasosa, gastroenterites
Cryptosporidium spp Gastroenterites doce/marinha
Escherichia coli OSH11 Gastroenterites doce/marinha
Giardia spp Gastroenterites doce/marinha
Pseudomonas spp Dermatite folicular, otite doce/marinha
externa
Salmonella spp Febre entérica, gastroenterite doce/marinha
Shigella spp Disenteria bacilar doce/marinha
Staphylococcus spp. Infeção de tecidos, doce/marinha
bacteremia
Vibrio spp Cólera, infecções de feridas estuarina/marinha
Fonte: Efstratiou (2001)
Yersinia spp Gastroenterites doce/marinha
 OS BIOINDICADORES

Indicam a POSSIBILIDADE de ocorrência de

patógenos na amostra
Ocorrencia simultanea com patógenos com a
presença de fezes  esgotos domesticos
Muito caro e trabalhoso ( talvez impossível)
avaliar diretamente TODOS os patógenos nas
amostras de águas.
 Indicador Biológico Ideal
 Presente em todos os tipos de água
 Ocorrência e desaparecimento concomitante com
patogênicos
 Densidade populacional diretamente relacionada com o
grau de contaminação
 Maior sobrevida que a dos patogênicos
 Ausência em água potável
 Fácil detecção e recuperação laboratorial
 Não prejudicial à pessoas e animais
 Manipulação segura
 Bioindicadores
Utilizados
• Coliformes totais
• Coliformes Termotolerantes (fecais)
• Coliforme específico: Escherichia coli
• Estreptococcus fecais (Enterococcus)
• Pseudomonas aeruginosa
• ovos de helmintos
 “Coliformes”
• Bacilos Gram-negativos não esporulados
• Aeróbios ou Anaeróbios facultativos
• Fermentam a lactose com produção de gás (48
h a 35oC ou 44,5 oC)
• Desenvolvem colônias vermelhas com brilho
verde metálico (24 h a 35oC) em meio Endo
contendo Lactose
• Apresentam atividade de B-galactosidase
(enzima que desdobra a lactose ou substratos
análogos tais como o ONPG desenvolvendo cor
amarelada no meio)
 Grupo Coliforme
• Indicador referenciado na legislação
• Além da E. coli inclui os gêneros:
– Klebsiella
Coliformes
– Enterobacter “Ambientais”
– Citrobacter
 Coliformes
Termotolerantes
• XI - coliformes termotolerantes: bactérias gram-
negativas, em forma de bacilos, oxidase-negativas,
caracterizadas pela atividade da enzima -galactosidase.
• Podem crescer em meios contendo agentes tenso-
ativos e fermentar a lactose nas temperaturas de 44º -
45ºC, com produção de ácido, gás e aldeído.
• Além de estarem presentes em fezes humanas e de
animais homeotérmicos, ocorrem em solos, plantas ou
outras matrizes ambientais que não tenham sido
contaminados por material fecal;
• ANTIGAMENTE E ERROONEAMENTE
DENOMINADAS COLIFORMES FECAIS
O GRUPO COLIFORME

Bactérias Entéricas: (Gram + ou -) Ex:

Staphylococcus aureus, Bacteroides fragilis, e
Enterococcus faecalis

Enterobacteriaceae : (Gram -). Gêneros:

E.coli, Shigella, Salmonella, Enterobacter,
Klebsiella, Serratia, Proteus
Grupo Coliforme: coliformes totais
e fecais (termotolerantes)

Termotolerantes: E. coli, Klebsiella,

Enterobacter e Citrobacter.
E. coli
E.coli
Resumo: Enterobactérias e
Coliformes

Enterobactérias

Coliformes Totais ou
“Ambientais”

Coliformes fecais

Escherichia coli
 Enterococcus

Bioindicador referenciado na legislação

CONAMA 274/2000

Características:
• Cocos Gram (+) grupo Estreptococos fecais
•Intestino de Animais homeotermicos ---> poluição fecal
•> Tolerancia a ambientes marinhos
Legislação Qual. Águas Nova
Legislação

• CONAMA 20/86  357 17/03/2005

Dispõe sobre a classificação dos corpos de água e diretrizes ambientais
para o seu enquadramento, bem como estabelece as condições e padrões
de lançamento de efluentes, e dá outras providências.

• 274/2000
Dispõe sobre a qualidade das águas, em relação aos níveis estabelecidos para a
balneabilidade, de forma a assegurar as condições necessárias à recreação de
contato primário;

• MS 36/90 -------> 1469/2000

Especifica os requisitos de amostragem e analises de aguas de
abastecimento público

OMS 1993  Recomendações

 PADRÕES DE BALNEABILIDADE
RESOLUÇÃO CONAMA 274/2000

Categorias (NMP/100ml)
Parâmetro Excelente Muito Boa Satisfatória Imprópria
1 3 3 3 3*
CT 1,25.10 2,5 .10 5,0.10 > 5,0.10
2 2 3 3*
CF 2,5.10 5,0.10 1,0.10 > 2,5.10
2 2 2 3*
E. coli 2,0.10 4,0.10 8,0.10 > 2,0.10
2 2*
Enterococos 25 50 1,0.10 > 4,0.10
Legenda: as águas na categorias excelente, muito boa e satisfatória são assim consideradas
em 80% ou mais de um conjunto de amostras obtida em cinco semanas, no mesmo local.
* valor obtido na última amostragem
1 Padrão da Legislação CONAMA 20/86.
 LEGISLAÇÃO DE BALNEABILIDADE NO
BRASIL E NO MUNDO

País C. Fecais E. coli Enterococos

USA EPA (mar) 35
USA EPA (água doce) - 126 33
Canadá (água doce) - 200 -
Canadá (mar) - - 35
Venezuela 1000 200 -
(mandatório) 5000 400 -
França 200 500 -
Brasil (mar) 2500 2000 400
Brasil (água doce) 2500 2000 -
Fonte: Adaptado de Efstratiou apud WHO/ US EPA (1999).
Legenda: número de microrganismos/100ml.
 Cuidados na coleta
• Colher a amostra em recipiente
esterilizado
• Até 4/5 da capacidade do frasco
• Água com cloro: 0,1 ml de tiossulfato a
10%
• Água bruta que contenha metais
pesados: 0,3 ml EDTA a 15%
 METODOLOGIAS MAIS UTILIZADAS PARA
REALIZAÇÃO DOS TESTES MICROBIOLÓGICOS
 Tubos Múltiplos

 Membrana Filtrante

 Substrato Cromogênico
 Tubos Múltiplos (NMP)
(Procedimento p/ 5 ou 10 Tubos)

Inocular tubos com Caldo Lauril Triptose

24±2 hrs @35 ± 0.5º C

Presuntivo

Gás/ácido=Positivo Sem gás / ácido=Negativo

Incubar mais 24 hr (48±3 hr total)

Transfere p/ Caldo Verde Brilhante
Incubar 48 ±hrs/35 º C
Confirmativo
Gás/ Sem gás=Negativo
ácido
Gás=Positivo Sem gás=Negativo

Continua com ensaio completo

 Tubos Múltiplos - NMP

Fermentação
Caldo Lauril Triptose

Diagnóstico:
Coliforme
positivo para
Formação de 2 tubos
Gás
NMP: teste confirmativo

Confirmação: Fermentação com

Caldo Verde Brilhante Lactose

- + +

Gás
Metodologia da Membrana
Filtrante (MF)
Suportes de filtração de polissulfona, vidro e aço de 47 mm
manifold de PVC e bomba vácuo
 Como funciona a
membrana filtrante
Caldo m- Endo / Coliformes Totais
Típicas (Brilho metálico) Atípicas
Meio m-FC para detecção de
Coliformes fecais
 Metodologia com Substrato
Cromogênico / Fluorogênico
•• Baseia-se
Baseia-se na
na utilização
utilização dede substratos
substratos
análogos
análogos àà lactose
lactose (glicopiranosídeos)
(glicopiranosídeos)
processados
processados somente
somente por por Escherichia
Escherichia coli.
coli.
•• Exemplos:
Exemplos: ONPG:
ONPG: Orto Orto Nitrofenil
Nitrofenil
galactopiranosídeo
galactopiranosídeo ee MUG:MUG: Metil-
Metil-
Umbeliferone
Umbeliferone Galactopiranosídeo
Galactopiranosídeo
•• Ferramenta
Ferramenta poderosa
poderosa parapara indentificação
indentificação de
de
Escherichia
Escherichia coli
coli (teste
(teste confirmativo)
confirmativo)
Detecção
Detecção de
de Coliformes
Coliformes em
em Amostras
Amostras De
De Águas
Águas

Detecção de E. coli
em Agar Nutriente com MUG
 Teste P/A

Adição do meio com Incubação por 24 h. Resultados

substrato à amostra Incolor: Negativo;
Amarelo Coliforme total +;
Azul Coliforme E. coli +
 Teste Quantitativo
1 5
4 Mesmas placas
amarelas submetidas
a luz ultra-violeta
(UV)
Resultado Azul 
Ecoli
2 Se (-) e amarelo 
C. Total
Negativo amarelo e
positivo azul 
3 anomalo
(impossível)

Tabelas de NMP
Resultados em
6 numeros/100 ml
 Resultados de
Biomonitoramento
da Praia de Camburi
Vitoria - ES
Projeto Labsan-FACITEC 2000-2001
 Bioindicadcadores
Utilizados

Coliformes Totais
Coliformes Fecais
E. Coli
Enterococus
Candida (Levedura) --> areia
 MATERIAL & MÉTODOS:

ÁREA DE
ESTUDO: PRAIA
DE CAMBURI/ 1, 1A e 1B
VITÓRIA/ES. 2, 2A e 2B

9, 9A

Fonte: www.pmv.es.gov
 METODOLOGIAS

Análises bacteriológicas segundo APHA (1995):

 CF meio A1,
 CT e E.coli Colilert®,
 Enterococos Enterolert®,
 Candida meio BIGGY.

Análise de Candida com MF Cartelas do teste Colilert

 Médias Geométricas dos Bioindicadores
Coliformes Totais Coliformes Fecais
Verão Outono Inverno Primavera Verão Outono Inverno Primavera
1,E+06 1,E+06

NMP CF /100 ml ou
NMP CT/100 ml ou

100g de areia seca

100g de areia seca

1,E+05 1,E+05
1,E+04 1,E+04
1,E+03 1,E+03
1,E+02 1,E+02
1,E+01 1,E+01
1,E+00
1,E+00
1 1A 1B 2 2A 2B 9 9A 1 1A 1B 2 2A 2B 9 9A
Pontos de Coleta Pontos de Coleta

E.coli Enterococos
Verão Outono Inverno Primavera Verão Outono Inverno Primavera

NMP Enterococos /100ml

1,E+06 1,E+06
NMP E. coli /100ml ou

ou100g de areia seca

100g de areia seca

1,E+05 1,E+05
1,E+04 1,E+04
1,E+03 1,E+03
1,E+02 1,E+02
1,E+01 1,E+01
1,E+00 1,E+00
1 1A 1B 2 2A 2B 9 9A 1 1A 1B 2 2A 2B 9 9A
Pontos de Coleta Pontos de Coleta
 Enterococos/Verão Enterococos/Outono
Sem. 1 Sem. 2 Sem. 3 Sem. 4 Sem. 5 Média Sem. 1 Sem. 2 Sem. 3 Sem. 4 Sem. 5 Média
1,E+06 1,E+06
Enterococos/100ml ou

Enterococos/100ml ou
1,E+05
100g de areia seca

100g de areia seca

1,E+05
1,E+04 1,E+04
1,E+03 1,E+03
NMP

NMP
1,E+02 1,E+02
1,E+01 1,E+01
1,E+00 1,E+00
1 1A 1B 2 2A 2B 9 9A 1 1A 1B 2 2A 2B 9 9A
Pontos de Coleta Pontos de Coleta

Enterococos/Inverno Enterococos/Primavera
Sem. 1 Sem. 2 Sem. 3 Sem. 4 Sem. 5 Média Sem. 1 Sem. 2 Sem. 3 Sem. 4 Sem. 5 Média
1,E+06 1,E+06
Enterococos/100ml ou

Enterococos/100ml ou
1,E+05 1,E+05
100g de areia seca

100g de areia seca

1,E+04 1,E+04
1,E+03 1,E+03
NMP
NMP

1,E+02 1,E+02
1,E+01 1,E+01
1,E+00 1,E+00
1 1A 1B 2 2A 2B 9 9A 1 1A 1B 2 2A 2B 9 9A
Pontos de Coleta Pontos de Coleta
 COMPARAÇÃO ENTRE INDICADORES
Coliformes Totais Coliformes Fecais E.coli Enterococos
Pontos V O I P V O I P V O I P V O I P
1 I I I S I I S S I I S E I I I I
1A P P P P P P P P SP SP SP SP SP SP SP SP
1B P P P P P P P P SP SP SP SP SP SP SP SP
2 I I I MB I S S S I I I E I I I I
2A P P P P P P P P SP SP SP SP SP SP SP SP
2B P P P P P P P P SP SP SP SP SP SP SP SP
9 I I I I I I I I I I I I I I I I
9A P P P P P P P P SP SP SP SP SP SP SP SP

Amostragens realizadas na praia de Camburi durante as estações do ano em cinco semanas

consecutivas, classificação quanto as categorias de própria (na água: Excelente, Muito Boa
e Satisfatória) e impropria para água e areia de acordo com a Resolução CONAMA e
Limite Proposto em Portugal respectivamente.
Legenda: V(verão), O (outono), I (inverno), P (primavera); I (impróprio), P (próprio), E
(excelente), S (satisfatório), MB (muito boa)
 Candida
Ponto O I P
1A 1 1 3
1B 1 P 2
2A P P P
2B 1 P 1
9A 5 5 4
Amostragens na praia de Camburi durante as estações do ano, em cinco semanas
de monitoramento para a levedura do gênero Candida de acordo com o Limite
Proposto em Portugal.
Legenda: O (outono), I (inverno), P (primavera), P (próprio). Os números
representam a frequencia em que o ponto amostrado ficou impróprio em cada
estação do ano.
 Agradecimentos:

• UFES (CT-DHS)
• Laboratório de Saneamento CT-DHS
• Microbiologistas “tipo coliformes”
• e... Sua paciência

• M. Obrigado