Relatrio do projecto de Qumica Aplicada

Lfe|to da |nc|dnc|a de
rad|ao em prote|nas
reparadoras de DNA A
Lndonuc|ease III
C unA celular pode ser danlflcado por vrlos Llpos de agenLes
muLagenlcos que LanLo podem alLerar a sequncla de bases como a sua
esLruLura
Alguns desLes agenLes muLagenlcos provocam leses com base no
meLabollsmo oxldaLlvo
LxlsLe uma classe de enzlmas unA gllcosllases que lnLervm nesLe Llpo
de leses
LsLa classe dlvldese em unA gllcosllases monofunclonals e blfunclonals
1anLo umas como ouLras do lnlclo ao slsLema de reparao mals usado
nesLes Llpo de danos o slsLema 8L8 (8ose exclsoo tepolt%
2
Introduo

A primeira via de reparao do DNA, a via BER.

Figura 1. Esquema ilustrativo da via de reparao BER, evidenciando a
via monofuncional e bifuncional.
Introduo Lxc|so de bases

Figura 2. Estrutura tridimensional da

Endonuclease . Constituda por dois
domnios ( vermelho e verde), um
motivo de ligao ao DNA , FCL
(laranja) e um centro de 4Fe-4S (
amarelo e cinzento)
unA gllcosllase blfunclonal hn1P1 homloga
humana
ComposLa por 211 amlnocldos Lem um peso
molecular de 236kua e um ponLo lsoelecLrlco de
8
ConsLlLulda por dols domlnlos (a vermelho e
verde% um local de llgao ao unA o m oLlvo
lCL(laran[a% e um cenLro de le (amarelo e
clnzenLo%
C domlnlo verde e composLo por hellces e e
caLallLlcamenLe lnacLlvo C domlnlo a vermelho e
composLo por 6hellces e conLem Lambem um
moLlvo de llgao ao unA
C moLlvo lCL da endonuclease lll Lem um padro
dlsLlnLo de Lodas as ouLras gllcosllases Cx6Cx2
Cx3C
Introduo A Lndonuc|ease III
3
Figura 3. : Representao tridimensional dos centros 4Fe-4S.
Equilbrio entre o estado de oxidao (Fe4S4)
1+
e (Fe4S4)
2+
e entre
(Fe4S4)
2+
e (Fe4S4)
3+
LsLes cenLros apresenLam uma esLruLura cublca com os Lomos de lerro
e os Lomos de Lnxofre colocados nos verLlces
Cs cenLros de lerro esLo LlplcamenLe llgados a clsLelnas
Cuando a Lndonuclease lll no esL llgada ao unA o esLado de oxldao
do cenLro e 2+
ensase que o cenLro Lenha lmpacLo na acLlvldade da enzlma na sua
llgao ao unA e posslvelmenLe na sua esLruLura
Introduo Centros IerroLnxofre
6
Introduo Mode|o de ||gao
Figura 4: odelo da ligao da Endonuclease ao DNA,
Cuando a proLelna se llga ao unA o cenLro meLllco oxldase para le

+
ALraves dos efelLos de ressonncla com as bases do unA a carga negaLlva e
Lransferlda para uma Lndonuclease lll prxlma
C cenLro desLa reduzse e a proLelna desllgase do unA
aconLece em unA correcLamenLe emparelhado
Introduo Mode|o de ||gao
lonLes de radlao lonlzanLe Lm a capacldade de alLerar e modlflcar
slsLemas blolglcos nomeadamenLe unA e proLelnas
LsLas radlaes esLo llgadas ao meLabollsmo oxldaLlvo
odem orlglnar danos Lals como cross llnks (lnLra e lnLer moleculares%
hldrollzaes em cadelas de cldos nuclelcos e reaces de oxldao
reduo
Lxemplos de radlaes desLe Llpo ulLravloleLa 8alox radlao gama
neuLres eLc
7
Introduo kad|ao
8
b[ect|vo 1p|cos exper|menta|s
Estudo do efeito de radiaes ionizantes em protenas de
reparao do DNA.
lncldncla de radlao uvC em proLelnas Lndonuclease lll
duranLe vrlos lnLervalos de Lempo com o ob[ecLlvo de esLudar se
esLe Llpo de proLelnas sofre degradao com radlao lonlzanLe
nesLe caso os posslvels danos serlam perda de cenLro meLllco
alLeraes esLruLurals e desLrulo da cadela pollpepLldlca
ara Lal reallzaramse esLudos bloqulmlcos nomeadamenLe
anllses especLroscplcas uv/vls especLrofluorlmeLrlcas e
elecLroforeses uACL

kesu|tados ur|f|cao da Lndonuc|ease III

ResuItados finais do processo de purificao do extracto ceIuIar iniciaI
verlflcase uma grande quanLldade de Lndonuclease lll
em Lodas as fraces obLldas
Lscolheuse a fraco do poo 8
Anallsouse a fraco por especLrofoLomeLrla de uv/vls.
Figura 5. arcador de pesos moleculares (Low
olecular Weight, NZYtech, 2 Amostra
injectada na coluna; 3 e 4 Fraces obtidas
com a amostra do poo 1; 5 Amostra no
adsorvida na coluna; 6,7,8 e 9 Fraces
obtidas com a amostra do poo 5.
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kesu|tados ureza da amostra
%estes reaIizados para determinar se a amostra finaI tinha o grau de pureza
necessrio.
Calculouse o rclo A
20
/A
280
obLendose 02 C valor
da llLeraLura para esLe rclo e de 03
uLlllzouse esLa fraco nos ensalos segulnLes pols
possul o grau de pureza necessrlo
Figura 6: 'alor de absorvncia em
funo do comprimento de onda para a
fraco escolhida
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kesu|tados uant|f|cao
Calculouse uma concenLrao de lerro de
07 +/ 10 M
Calculouse uma concenLrao de proLelna de
771 +/ 0 M
Figura 7: Recta de calibrao para o clculo de
Ferro.
Figura 8 : Recta de calibrao para o clculo da
concentrao da amostra.
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kesu|tados kes|stnc|a trm|ca
%estes reaIizados para determinar a temperatura, quaI ocorre desnaturao da
protena
verlflcase que aos 60 C [ ocorreu desnaLurao proLelca
nos ensalos posLerlores para evlLar a desnaLurao valse manLer a LemperaLura
do slsLema abalxo dos 0 C
Figura 9: Espectro de absoro da
Endonuclease correspondente ao
ltimo tempo medido para cada
temperatura.
1
kesu|tados Lnsa|os de |rrad|ao
rradiou-se a amostra de EndonucIease , durante vrios intervaIos de tempo.
AnaIisaram-se todas as amostras por espectrofotometria UV/Vis
verlflcase um decresclmo da lnLensldade da banda com
mxlmo a 10nm a parLlr dos 1 mlnuLos de lrradlao
Figura 10: Espectros de
absorvncia para cada
amostra de protena
irradiada.
Lxc|tao a 280nm
Lxc|tao a 31Snm
1
kesu|tados Lnsa|os de |rrad|ao
AnIises espectrofIuorimtricas das amostras irradiadas.
Figura 11: Espectro de emisso das vrias
amostras irradiadas, com excitao a 280nm.
Figura 12: Espectro de emisso das vrias
amostras irradiadas, com excitao a
315nm.
Lxc|tao a 3S0nm
Comparao entre os va|ores a 3S0
e 420nm para os vr|os tempos
13
kesu|tados Lnsa|os de |rrad|ao
AnIises espectrofIuorimtricas das amostras irradiadas.
Figura 13: Espectro de emisso das vrias
amostras irradiadas, com excitao a 350nm.
Figura 14: 'alores de emisso a 350 e
420nm, para os vrios tempos de irradiao.
16
kesu|tados Lnsa|os de |rrad|ao
FinaIizaram-se as anIises ps-radiao com uma eIectroforese SDS-PAGE
verlflcase um esbaLlmenLo das bandas correspondenLes
Lndonuclease lll a parLlr dos 1 mlnuLos de lrradlao
Figura 15: el SDS-PAE para cada
amostra irradiada. 1 protena no
irradiada; 2 marcador de pesos
moleculares, 3 amostra irradiada 1
minuto; 4 amostra irradiada 6 minutos;
5 amostra irradiada 16 minutos; 6
amostra irradiada 31 minutos; 7
amostra irradiada 61 minutos; 8
amostra irradiada 91 minutos; 9
amostra irradiada 121 minutos..
17
kesu|tados Lnsa|os de |rrad|ao
ParaIeIamente aos ensaios com a EndonucIease , utiIizou-se DNA pIasmdico.
Cbservase que a parLlr dos 16 mlnuLos de lrradlao
comea a exlsLlr degradao do unA
Figura 16: Electroforese em
gel de agarose das amostras
de DNA. 1- Padro molcular
(NZYDNA Ladder ,
NZYTech) 2 amostra
irradiada 1 minuto, 3
amostra irradiada 6 minutos;
4 amostra irradiada 16
minutos; 5- amostra
irradiada 31 minutos; 6
amostra irradiada 61
minutos; 7 amostra
irradiada 91 minutos; 8
amostra irradiada 121
minutos.
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Conc|uses
8elaLlvamenLe Lndonuclease lll conclulmos que esLa lnlcla a sua degradao
posslvelmenLe a parLlr dos 1 mlnuLos de lrradlao
A parLlr desLe Lempo supese que exlsLa LanLo a perda do cenLro meLllco como a
formao de crossllnks (blLlroslnas%
e se conLlnuar a lrradlar aps esLe Lempo observase uma desLrulo da cadela
pollpepLldlca
Conclulse com base nesLes resulLados que o cenLro meLllco conLrlbul no s
para a acLlvldade da enzlma e para reaces de Lransferncla elecLrnlca ( aLraves
do unA% mas Lambem para a sua esLruLura Lerclrla
Lm relao ao unA plasmldlco esLe lnlcla a sua degradao aos 16 mlnuLos com
uma posslvel llnearlzao uma posslvel causa para esLe resulLado prendese com o
facLo de que a lmpada de uvC emlLe a 23nm mulLo prxlmo do valor mxlmo de
absorvncla do unA 260nm