JORDANA DOS SANTOS LILIAN CORREIA

As tecnologias de anlise molecular da variabilidade do DNA permitem determinar pontos de referncia nos cromossomos, chamados por terminologia tcnica de marcadores moleculares.

Marcadores Moleculares correspondem a todo e qualquer fentipo molecular oriundo de um gene expresso, como no caso de isoenzimas ou marcadores bioqumicos, ou de um segmento especfico de DNA (correspondente a regies expressas ou no do genoma).

A sequncia de nucleotdeos e a funo de um marcador molecular podem ser conhecidas ou no; Se o comportamento de um determinador marcador obedecer as leis de herana de Mendel, este definido adicionalmente como marcador gentico. Observao: o simples fato do marcador ser DNA, ou produto da transcrio e traduo de uma seqncia de DNA, no implica que este seja um marcador gentico.

Existem vrias tcnicas da biologia molecular para detectar polimorfismo gentico. Estas tcnicas possibilitam obter um nmero ilimitado de marcadores moleculares cobrindo todo o genoma do organismo. Tais marcadores podem ser usados para inmeras aplicaes, quer seja na gentica ou no melhoramento de plantas.

DNA recombinate e PCR (Reao de Polimerase em Cadeia) permitiram uma mudana no paradigma gentico bsico: da interferncia do gentipo a partir do fentipo, onde Mendel foi pioneiro, para a anlise gentica direta da variao na sequncia de DNA.

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Existem duas grandes classes bem desenvolvidas de marcadores moleculares: os identificados por hibridizao esto os marcadores RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism; Botstein et al., 1980) e minissatlites ou locos VNTR (Variable Number of TandemRepeats; Jeffreys et al., 1985). J aqueles revelados por amplificao incluem os marcadores do tipo: RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA; Williams et al., 1990); SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions); STS (Sequence Tagged Sites) (Paran & Michelmore, 1993); Microssatlite (Litt & Lutty, 1989); e AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism; Vos et al., 1995). A seguir descreveremos, sucintamente, os seguintes marcadores moleculares: AFLP, Microssatlites e RAPD.

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Apresenta capacidade de analisar , simultaneamente, diferentes regies do genoma. Alta reprodutibilidade; Repetibilidade e confiabilidade maiores que as apresentadas por marcadores do tipo RAPD e RFLP; Nmero virtualmente ilimitado de marcas que podem ser geradas; Nvel de deteco de polimorfismos inferior ao de outras tcnicas, como RFLP e microssatlites.Entretanto , a habilidade de analisar grande nmero de locos polimrficos simultaneamente, com uma nica combinao de primers e em um nico gel resulta em um alto valor informativo do AFLP. Grande uso para acessar diferenas genticas entre indivduos, populaes e espcies (estudos filogenticos e discriminao de variedades teste de DHE); Encontram-se distribudos ao longo de todo genoma; Aplicaes: monitoramento da herana de caractersticas agronmicas;diagnstico de doenas,;anlise de pedigree de diversidade gentica ; construo de mapas de ligao e clonagem de genes de interesse. Como principal desvantagem dos marcadores AFLP a dificuldade em identificar variantes allicos em cada loco especfico, o que faz com que este seja usado, quase exclusivamente como marcador dominante.

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Marcador molecular baseado em PCR; Primer curto (normalmente 10 nucleotdeos) e de sequncia arbitrria; Elimina a necessidade do conhecimento prvio dos fragmentos a serem amplificados; Possibilidade de encontrar vrias regies complementares sua seqncia, distribudas em diversos pontos do genoma, revelando muitas bandas no gel; Os fragmentos amplificados incluem desde DNA cpia nica at altamente repetitivos; As bases moleculares do polimorfismo podem ser mutaes de ponto, delees ou inseres nos stios de pareamento do primer; So marcadores dominantes, ou seja, no permitem diferenciar indivduos homozigotos dominantes de heterozigoto. A ausncia de banda no gel remete ao gentipo homozigoto recessivo; Em alguns casos pode ocorrer co-dominncia, ou seja, amplificao dos alelos de um indivduo heterozoigoto;

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uma tcnica simples; Permite rpida obteno de dados; Custo reduzido em relao a outras tcnicas; Aplica-se a qualquer tipo de organismo; Baixo contedo de informao gentica em cada loco (exceto co-dominantes); Baixa reprodutibilidade dos resultados; Demanda muito cuidado e experincia em procedimentos moleculares; A deteco dos produtos da amplificao feita em gel de agarose submetido a eletroforese e, posterior, revelao sob luz UV.

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Microssatlites so seqncias simples repetidas dispostas densamente no genoma de eucariotos; Consistem em um a seis nucleotdeos repetidos em tandem; Recebem a nomenclatura de SSR (Simple Sequence Repeats) ou STR (Short Tandem Repeats) As repeties de microssatlites podem ser: perfeitas (sem interrupo); imperfeitas; e compostas (duas ou mais classes de repetio dispostas adjacentes); Constituem eficiente ferramenta para estudo de genes eucariticos; Estes marcadores tm sido desenvolvidos em vrias espcies de plantas cultivadas; Apresentam reprodutibilidade e simplicidade tcnica;

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Requer pequena quantidade de DNA; Baixo custo; Grande poder de resoluo; Altos nveis de polimorfismo (uma das classes mais polimrficas disponveis atualmente); Aplicaes: mapeamento genmico; estudos de ligao, identificao de gentipos, proteo de variedades, uso e conservao de germoplasma, anlise de diversidade, anlise gnica e de locos quantitativos, entre outras; Restrio do primer a uma espcie especfica. Metodologias de desenvolvimento de microssatlites: Seleo de microssatlites em biblioteca genmica ; Seleo de microssatlites em biblioteca genmica enriquecida; e Anlise de seqncias de DNA presentes em Bancos de Dados; Marcadores baseados em microssatlites : MP-PCR Micro-primed PCR ); ISSR; RAMPs (Random Amplified Microssatellite Polymorphisms) ; RAHM (Random Amplified Hybridization Microssatellites) , SAMPL (Selective, amplification of microssatellite polymorphic loci).