PESQUISA

Processo fermentativo para PRODUO DE BEBIDA

Resumo A viabilidade tcnica de produzir de bebida alcolica a partir de pupunha (Bactris gasipaes Kunth), fruto amilceo da Regio Amaznica, foi investigada por fermentao semi-slida. A polpa do fruto foi caracterizada quimicamente, sendo exibido alto contedo amilceo (44,3%, em base mida). Aps a hidrlise enzimtica prvia do amido, com -amilase e glucoamilase comerciais, o meio foi inoculado com clulas de Saccharomyces cerevisiae (levedura de panificao) e o processo fermentativo monitorado em intervalos de 24 horas, para acompanhar a viabilidade celular, o consumo de substrato, a produo de etanol, a acidez total e o teor de carotenides totais. O alto rendimento em polpa amilcea (71,2%), as elevadas converses de hidrlise (90%) e eficincia de fermentao (93,5%), assim como a boa aceitabilidade do produto (80%), sugerem a aplicao da pupunha na produo de bebida alcolica fermentada, gerando oportunidades para novos desenvolvimentos econmicos na regio amaznica. Palavras chave: pupunha, composio qumica, -amilase, glucoamilase, fermentao, Saccharomyces cerevisiae, anlise sensorial. Introduo A pupunheira (Bactris gasipaes Kunth) uma palmeira domesticada pelos amerndios desde pocas pr-colombianas. Seu cultivo feito em toda a Amaznia e constitui-se em valiosa planta de subsistncia (Figura 1). Tem ampla distribuio, sendo encontrada por toda a Amaznia e Amrica Central a partir de Honduras (Figura 2). Seus frutos tm grande potencial econmico devido sua composio qumica, produtividade agrcola (13.500 ton/ano) e amplo consumo regional (Clement, 2000). A pupunha um fruto rico em minerais e pr-vitamina A e, dependendo da raa, em carboidratos ou lipdios (Arkoll & Aguiar, 1984). A partir da pupunha preparada a caiuma, bebida consumida pelos ndios em datas comemorativas. feita artesanalmente de diferentes modos, de acordo com a etnia. Algumas tribos mastigam a pupunha e a deixam fermentar, geralmente por at sete dias, e, dessa forma, a ptialina contida na saliva

Processo Fermentativo para Produo de Bebida Alcolica de Pupunha (Bactris gasipaes Kunth)

Llian Pantoja de Oliveira

Biloga, MSc Laboratrio de Bioqumica e Fisiologia Ps-colheita/ CPTA/INPA

Roberto Maeda

Engenheiro Agrnomo Laboratrio de Bioqumica e Fisiologia Ps-colheita/ CPTA/INPA

Jerusa de Souza Andrade

Engenheira Agrnoma, DSc Laboratrio de Bioqumica e Fisiologia Ps-colheita/CPTA/INPA

Nei Pereira Junior

nei@eq.ufrj.br Engenheiro Qumico, PhD Laboratrio de Desenvolvimento de Bioprocessos do Departamento de Engenharia Bioqumica da EQ/UFRJ

Figura 1. Pupunheira amaznica

Foto: C. R. Clement

Snia Maria da Silva Carvalho

Farmacutica, MSc Laboratrio de Micologia do Departamento de Parasitologia do ICB/UA.

sastolfi@fua.com.br Bilogo, DSc Laboratrio de Gentica do Centro de Apoio Multidisciplinar do ICB/UA. Fotos cedidas pelos autores

Spartaco Astolfi Filho

incorporada massa, e hidrolisa o amido, conseqentemente. Apesar do enorme potencial da pupunha na Regio para a produo e comercializao de bebidas, esse aspecto tem sido pouco explorado, pois a maioria dos produtos oriundos daquele fruto processada de forma artesanal. O presente trabalho teve como objetivo desenvolver a tecnologia para produzir uma bebida alcolica, por processo

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Figura 2. Distribuio geogrfica da pupunheira

fermentativo, utilizando-se a pupunha como matria-prima. Materiais e Mtodos Matria-prima e caracterizao Foram utilizados frutos da pupunheira no estdio maduro, pertencentes raa Solimes, colhidos em safra secundria e adquiridos no mercado Adolpho Lisboa, em Manaus. Os cachos foram pesados e, aps a despenca, os frutos foram selecionados quanto sanidade e maturao, avaliados em relao ao nmero, peso, dimetro longitudinal e transversal e peso do descarte (semente e casca) e lavados em gua corrente. Os frutos foram, ento, submetidos coco por 5 minutos em tacho de ao inoxidvel com capacidade para 100 litros, aquecido a vapor, com agitao mecnica. Aps a drenagem da gua e o

resfriamento, foram acondicionados em sacos plsticos de alta densidade e estocados a 10 C. Para a caracterizao centesimal e o preparo do meio de fermentao, os frutos foram descongelados e aps descascamento e retirada de semente, a polpa foi caracterizada (em triplicata), quanto s protenas solveis, pelo mtodo de Biureto (Harris & Angal, 1994) e carotenides totais, por espectrofotometria (Higby, 1962). Os lipdios (extrao com ter de petrleo em Soxhlet), fibra total (tratamento cido-bsico), umidade (65C) e cinzas (incinerao em mufla a 550 C) seguiram metodologias descritas pelas Normas Analticas do Instituto Adolfo Lutz (1985). O amido foi extrado e hidrolisado segundo Ranganna (1996) e a glicose liberada, quantificada pelo mtodo de Somogyi-Nelson (Southgate, 1976). Enzimas e Microrganismo A hidrlise do amido presente na pupunha foi realizada com as enzimas comerciais amilase e glucoamilase (NOVO Nordisk S/A) e a levedura Saccharomyces cerevisiae (fermento seco Fleischmann) foi empregada como agente do processo fermentativo. Preparo do Meio de Fermentao Analogamente caracterizao da matria-prima, a massa de fermentao foi preparada pelo descongelamento dos frutos, seguido de coco por 2,5 horas, resfriamento, despolpa, triturao e esterilizao em autoclave por 15 minutos, a 121 C. Para otimizao das condies de hidrlise, foram realizados testes preliminares, com diferentes propores de -amilase (70C) e glucoamilase (55 C) em banho termostatizado, por 30 minutos. Os graus de hidrlise foram avaliados mediante a quantificao dos acares redutores, pelo mtodo de Somogyi-Nelson (Southgate, 1976). A fim de avaliar a fermentabilidade do meio hidrolisado, inoculou-se o mesmo com clulas de levedura em fermentmetros (recipiente amplamente utilizado em indstria viti-vincola para se medir a atividade fermentativa de linhagens de leveduras), possibilitando o acompanhamento do processo por meio de pesagens sucessivas do conjunto, sendo a perda de peso observada, decor-

rente do desprendimento de CO2. As condies de hidrlise enzimtica, eleitas como timas, foram empregadas para o preparo do meio de fermentao e o teor de acar inicial, corrigido com a adio de xarope de sacarose estril para se obter a concentrao desejada de etanol na bebida. Processo Fermentativo A fermentao semi-slida foi conduzida por batelada simples com trs repeties, em cubas cilndricas de acrlico, geometricamente iguais, com capacidade nominal de 4,5 litros, a 29oC e o processo monitorado a intervalos de 24 horas. De cada cuba, amostras foram retiradas para determinaes analticas (triplicatas) das variveis de interesse do processo fermentativo. Determinaes Analticas Alm das anlises fsico-qumicas para a determinao de amido e carotenides, empregadas na caracterizao da matria-prima, foram ainda utilizadas as seguintes tcnicas para o acompanhamento do processo fermen-

Tabela 1. Composio qumica da pupunha (Bactris gasipaes Kunth) in natura, pertencente a raa Solimes Constituintes* Umidade (%) Protenas (%) Lipdios (%) Amido (%) Fibra Total (%) Cinza (%) Carotenide (mg/100g)
* base mida

in natura 46,1 0,4 1,3 0,1 5,9 0,4 44,3 0,3 0,7 0,1 0,7 0,2 2,5 0,3

Tabela 2. Anlises fsico-qumicas da bebida fermentada Constituintes PH Acidez (g/L) Acares redutores (g/L) Slidos solveis (Brix) Etanol (g/L) Carotenides (g/L) Mdia* 3,9 2,7 0,16 6,4 75,1 7,0

Figura 3. Pr-tratamento da matria prima

* Os valores representam mdia de triplicatas e os desvios no ultrapassaram 1,8 % das medidas realizadas
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tativo: avaliao da viabilidade celular, por contagem de clulas em Cmara de Neubauer, empregandose azul de metileno como corante vital (Alves e Morais, 1998); teor alcolico, aps destilao de amostras em fase aquosa e posterior medida, por densimetria (Normas Analticas do Instituto Adolfo Lutz, 1985); pH, por potenciometria; acidez, por titulometria com NaOH 0,01N; slidos solveis, por refratometria e acares redutores, pelo mtodo de Somogyi-Nelson (Southgate, 1976). Variveis de Resposta Os valores de extenso da hidrlise enzimtica do amido (EH), fator de converso de substrato consumido em etanol (YP/S), e a produtividade em etanol (QP) foram calculados de acordo com as seguintes expresses:
EH (%) = [(Ao Af)/Ao] x 100 YP/S = (P)/(-S) = (Pf Po)/(So Sf) [=] gP/gS QP = (Pf Po)/ tF [=] gP/L.h

o como matria prima para produo de bebidas alcolicas. De acordo com Clement (1987), h uma grande variabilidade em relao composio de pupunhas encontradas na regio Amaznica, havendo raas que produzem frutos pequenos, fibrosos, com elevados teores de lipdeos e baixos contedos de amido ou vice-versa. Hidrlise do Amido Para a hidrlise do amido, utilizaram-se as enzimas -amilase e glucoamilase, como descrito na seo de Materiais e Mtodos. Os resultados esto exibidos no grfico da Figura 4, onde se observa, inicialmente, a imprescindibilidade da -amilase para uma hidrlise mais eficiente do amido. As melhores quantidades de enzimas para o processo hidroltico foram atingidas com 10 L e 50 L de -amilase e glucoamilase, respectivamente, tendo sido essa proporo utilizada para o preparo do meio de fermentao. A extenso da hidrlise do amido presente na pupunha foi de, aproximadamente, 90 %. A alta eficincia da hidrlise foi tambm confirmada em experimento paralelo, conduzido em fermentmetro, onde se observou expressiva evoluo de CO2 (Figura 5). Apesar do curto tempo de fermentao (em torno de 4 horas), a alta concentrao de clulas e as condies de anaerobiose no fermentmetro, contriburam para que o etanol fosse produzido com aprecivel fator de converso do substrato consumido no produto (0,38 g/g), considerando-se ser esse um ensaio preliminar conduzido em condies de fermentao rpida (com inculo macio). Processo fermentativo O meio de fermentao submetido hidrlise prvia do amido foi adicionado de xarope de sacarose, nas cubas de fermentao, formando-se um sistema semi-slido de massa homognea e pastosa. A formao de bolhas de gs (CO2) no interior da massa foi observada cerca de trs horas aps a inoculao e tornou-se menos intensa aps 48 horas. A colorao alaranjada do meio permaneceu inalterada e a consistncia da massa tornou-se mais fluida. O teor de slidos solveis, compos-

Figura 4. Efeito das combinaes de -amilase (a) e glucoamilase (g) na hidrlise do amido de pupunha
caractersticas de sabor, aparncia, cor e aroma, pelo mtodo descrito por Monteiro (1984). Os resultados foram analisados estatisticamente, aplicando-se a anlise de varincia e teste de Tukey, com nvel de significncia de 5%. Resultados e Discusso Caractersticas da matria-prima Os cachos de pupunha pesavam entre 0,9 a 5,0 kg e continham de 25 a 150 frutos, com peso mdio de 36 g e dimetros longitudinal e transversal de 4,5 e 4 cm, respectivamente. O rendimento em polpa, considerado elevado, foi de 71,2% em relao ao fruto integral. A Tabela 1 mostra a composio da polpa in natura, considerando-se os principais componentes. O alto contedo de amido e o baixo teor de lipdeos dos frutos indicam sua utiliza-

Onde: A: amido; P: concentrao de etanol; S: concentrao de subtrato; tF: tempo de fermentao. Os ndices o e f representam as condies inicial e final, respectivamente. Preparo da Bebida e Anlises Sensoriais Aps sete dias de fermentao, procedeu-se decantao, filtrao, acondicionamento em garrafas de vidro de 1 litro, fechamento hermtico, pasteurizao por imerso das garrafas em gua a 85 C por dez minutos, resfriamento em banho de gua com gelo, e estocagem a, aproximadamente, 6 C. Ao final de 30 dias, a bebida foi avaliada quanto ao pH, acares redutores residuais (Somogyi-Nelson), slidos solveis, grau alcolico e carotenides totais (Higby, 1972). Foram realizados testes preliminares para se determinar o grau de doura ideal na bebida. Essas formulaes (0, 3, 6, 9 e 12% (p/v) de sacarose) foram submetidas anlise sensorial, utilizando-se escala hednica (Monteiro, 1984). A bebida com o grau de edulcorao eleito foi analisada sensorialmente por 35 pessoas no treinadas, avaliando-se as
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Figura 5. Evoluo de CO2 na fermentao do meio hidrolisado enzimaticamente

to em sua maioria por acares provenientes da hidrlise do amido e da adio do xarope, decresceu em funo do consumo de acares fermentveis. A produo mxima de etanol (12% v/v) foi atingida no perodo de 72 horas aps o incio da fermentao, diminuindo ligeiramente at o final do processo (Figura 6), sugerindo a possibilidade de reduo no tempo de fermentao, desde que essa estratgia no interfira nas caractersticas de sabor e aroma da bebida. Com 72 h de fermentao, o rendimento de substrato consumido em Figura 6. Perfil cintico da produo etanol foi de 0,49 g/g, corresponden- de etanol em meio de fermentao do a uma eficincia de fermentao com amido de pupunha hidrolisado de 95,5 %. A produtividade mxima foi alcanada no tempo de 24 horas, apresentando o valor de 2,6 g de etanol/L.h. O perfil de consumo de acares redutores totais (Figura 7) coadunase com o de produo de etanol e com a variao de slidos solveis (Figura 6). Observa-se que o maior consumo de acar ocorre nas primeiras 24 horas do processo, diminuindo, posteriormente devido s elevadas concentraes de etanol e a escassez de substrato. Figura 7. Cintica do consumo de O decrscimo do pH e, conseacares redutores totais (ART) na qentemente, o aumento da acidez fermentao alcolica de hidrolisado do meio de fermentao (Figura 8) de pupunha esto associados formao de cidos orgnicos (cidos succnico, ltico, actico e outros), como amplamente reportada na literatura (Ribreau-Gayon & Peynaud, 1966). importante ressaltar que a evoluo da acidez durante a fermentao influencia a estabilidade e a colorao de bebidas fermentadas (Rizzon et al,1998), assim como valores de pH entre 3 e 4 dificultam contaminaes bacterianas (Aquarone et al., 1986). Os carotenides totais mantiveram-se inalterados (4,7 mg/100g) durante todo o curso da fermenta- Figura 8. Variao da acidez do meio na fermentao alcolica de hidrolisado de o. A taxa de mortandande celular pupunha aumentou com o curso da fermentao, tornando-se mais acentuada aps seqncia ocorre a liberao de meta96 horas, devido alta concentrao de blitos importantes para o meio exteretanol no meio fermentado (12,2% v/ no, bem como a entrada de substnciv). Na fermentao alcolica, o princias, atravs da membrana, de forma no pal responsvel pela diminuio da seletiva (Duarte et al., 1996; Jones, viabilidade celular o seu prprio 1988; Pereira Jr., 1999). Isso resulta na produto, cuja ao txica reflete-se na perda da viabilidade celular (Figura 9). desorganizao da membrana citoplas importante ressaltar que o micrormtica, de composio fosfolipdica, ganismo agente do processo fermentaalterando sua integridade. Como contivo foi uma levedura de panificao,

que no era a mais adequada produo de etanol, tendo em vista que o processo industrial para a sua produo, a batelada alimentada, conduzida em condies de elevada aerao e baixas concentraes de glicdeos no meio, a fim de minimizar os clssicos fenmenos de represso catablica. Como conseqncia s condies impostas no presente trabalho, que visavam a produo de etanol por batelada simples com elevadas concentraes de glicdeos em sistema no aerado, a levedura apresentou bom desempenho no que tange atividade fermentativa, ainda que apresentasse elevadas taxas de mortandade, decorrentes do efeito deletrio de seu prprio produto. Caractersticas gerais da bebida A bebida fermentada apresentou sabor e aroma agradveis, aspecto lmpido e colorao amareloalaranjado (Figura 10). As caractersticas fsico-qumicas (Tabela 2) mostram que a concentrao de etanol (75,11 g/L) foi superior encontrada (11,83 g/L) por Sotero (1996), estudando a produo de caiuma de pupunha por fermentao espontnea. A maioria dos carotenides totais presentes na massa foi removida juntamente com os lipdios durante o processo de filtrao para obteno da bebida, o que seguramente est atrelado s caractersticas lipossolveis desses terpenides. O teor de acar na bebida foi bastante reduzido, decorrente do consumo praticamente total durante o processo de fermentao. Considerando no haver um grau de edulcorao definido, a escolha da proporo de acar efetuada atravs de anlise sensorial mostrou que a proporo de sacarose de maior preferncia foi de 9 %, com 85,7 % de aceitao. A fim de se verificar a aceitabilidade da bebida j edulcorada, procedeu-se a uma nova anlise sensorial cobrindo-se os requisitos aparncia, aroma, sabor e cor. Os resultados desse ensaio esto apresentados na Figura 11, na qual se registram graus satisfatrios, superiores a 3,5. Alguns provadores afirmaram que o aroma exalado pela bebida asseBiotecnologia Cincia & Desenvolvimento 53

Figura 9. Viabilidade celular de S. cerevisiae durante o processo de produo da bebida alcolica do hidrolisado de pupunha

de, e de um bom retorno de investimento de capital. O presente trabalho demonstra ser factvel produzir bebida alcolica de pupunha, fruto abundante na regio Amaznica e amplamente consumido pela populao do Norte brasileiro. O desenvolvimento dessa tecnologia exigiu hidrlise enzimtica prvia, tendo em vista a expressiva composio amilcea do fruto, seguida de processo fermentativo. A bebida resultante apresentou alto teor alcolico e excelentes propriedades organolpticas. Tais caractersticas sinalizam um futuro promissor para esse inexplorado mercado.

Figura 10. Bebida alcolica de pupunha

melha-se ao de mel e manga. De uma forma geral, a bebida obteve um bom nvel de aceitabilidade; em torno de 80%. Concluses O Brasil a maior reserva continental de solos agricultveis de potencial ainda no integralmente aproveitado. Mesmo assim o nosso pas o terceiro maior exportador mundial de alimentos. Sabe-se, ainda, que o mercado de bebidas convencionais responde por uma parcela significativa da economia brasileira, encontrando-se nesse segmento industrial as maiores empresas da rea de alimentos. No entanto, apesar de se constatar uma crescente demanda por distintos sabores de origem natural, a comercializao de novas bebidas constitui um mercado pouco explorado. Nesse contexto, a produo de bebidas fermentadas, oriunda de frutos tropicais da regio Amaznica, desponta como uma interessante alternativa para novos mercados por apresentar perspectivas de alta lucrativida54 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento

Figura 11. Diagrama grfico do teste classificatrio do perfil da bebida

Agradecimentos CAPES, pela concesso de bolsa de mestrado para a primeira autora e ao BASA (Banco da Amaznia S.A.), que acreditou em nossa proposta, aprovando um projeto que recentemente se iniciou no mbito do PROBEM/BIOAMAZNIA, para continuidade deste trabalho. Referncias Bibliogrficas ALVES, S. B. & MORAES, S. A. (1998). Quantificao de inculo de patgenos de insetos. In: ALVES, S. B. Controle Microbiano de Insetos. Ed. FEALQ, Piracicaba-SP, 765-774. AQUARONE. E; LIMA, U. A. L. & BORZANI, W. (1986). Alimentos e Bebidas Produzidos por Fermentao. Ed. Edgard Blcher Ltda, So Paulo-SP. v. 5, 243p. ARKCOLL. D.B. & AGUIAR, J.P.L.

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