SCIENTIA PLENA

www.scientiaplena.org.br

VOL. 5, NUM. 11

2009

Estudos bioqumicos da enzima bromelina do Ananas comosus (abacaxi)

A. Frana-Santos ; R. S. Alves ; N. S. Leite ; R. P. M. Fernandes
Laboratrio de Enzimologia Departamento de Fisiologia, Universidade Federal de Sergipe, 49100-000, So Cristvo-SE, Brasil alexanderfrostster@hotmail.com (Recebido em 30 de outubro de 2009; aceito em 30 de novembro de 2009)

O presente trabalho objetivou a determinao da atividade da enzima bromelina no abacaxi Ananas comosus cv. Prola em condies in vivo e in natura e a caracterizao bioqumica dessa enzima largamente utilizada nas indstrias farmacuticas e de alimentos. A atividade proteoltica foi determinada pela digesto do substrato casena usando o mtodo de Kunitz (1947). Maior atividade foi observada para a bromelina extrado do fruto do abacaxi quando comparada as folhas do abacaxizeiro cultivado in natura sob condio hidropnica. A variao da atividade proteoltica devido ao pH e temperatura foi determinada nos pHs entre 4,0 e 9,0, e nas temperaturas entre 20C e70C. A bromelina apresentou pH timo de ao 5,0 em tampo acetato de sdio e temperatura tima de 40C.
Palavras chave: caracterizao bioqumica, protease vegetal, abacaxi, Kunitz, cv. Prola

This study aimed to determine bromelain enzimatic activity of the enzyme pineapple Ananas comusus cv. Prola in both in vivo and in natura conditions and partial biochemical characterization of this enzyme that is widely used in pharmaceutical and food industries. The proteolytic activity was measured by digestion of casein by the Kunitz (1947) method. Higher activity was observed for bromelain extracted from pineapple fruits when compared to leaves of pineapple cultured in natura under hydroponic condition. The variation in proteolytic activity due to pH and temperature was determined at pHs between 4.0 to 9.0, and temperatures between 20C to 70C. Bromelain showed optimum pH of action 5.0 in sodium acetate buffer and optimum temperature of 40C.
Keywords: biochemical characterization, plant protease, pineapple, Kunitz, cv Prola

1. INTRODUO O abacaxi (Ananas comosus) uma espcie frutfera de grande importncia econmica e social cultivada em mais de 70 pases de clima tropical e subtropical. A participao brasileira de produtos de abacaxi no mercado externo ainda bastante reduzida, concentrando-se, basicamente, os seus envios para pases como Itlia, Alemanha e Pases Baixos [1]. Alm do A. comosus todas as outras espcies de Ananas so encontradas no Brasil, sendo este pas um dos principais centros de diversidade gentica [2]. As excelentes caractersticas qualitativas do fruto abacaxizeiro refletem na sua importncia scio-econmica [3]. O abacaxi a principal fonte da enzima proteoltica bromelina (EC 3.4.22.4) sendo este um nome genrico dado ao conjunto de enzimas proteolticas encontradas nos vegetais da famlia Bromeliaceae, da qual o abacaxi o mais conhecido. A bromelina encontrada no caule, folhas, razes e no fruto do abacaxi (A. comosus) e em todas as espcies da famlia Bromeliaceae. No entanto, sua produo ainda pequena comparada s necessidades do mercado, tornando-se um produto oneroso devido ao alto valor comercial, por no ser produzido no Brasil [4]. A bromelina tem diversos usos, todos baseados em sua atividade proteoltica. A sua importncia econmica est relacionada com a produo de frmacos e a sua utilizao na indstria alimentcia (na clarificao de cervejas, na fabricao de queijos, no amaciamento de carnes, no preparo de alimentos infantis e dietticos, entre outros), no tratamento de distrbios, digestivos, feridas e inflamaes, preparo de colgenos hidrolisados, nas indstrias txteis, para amaciamento de fibras e tambm na produo de detergentes [5]. A bromelina uma enzima proteoltica da classe das hidrolases. As proteases so hidrolases capazes de romper a ligao peptdica das protenas e peptdeos. A especificidade das proteases ampla e classificada de acordo com a constituio de seu stio ativo em trs grupos principais:
111101-1

A. Frana-Santos et al., Scientia Plena 5, 111101, 2009

serina protease, cido asprtico protease e cistena protease, sendo que a bromelina se enquadra neste ltimo grupo [6]. A enzima bromelina vem sendo amplamente caracterizada. A bromelina do fruto tem uma atividade proteoltica maior que a bromelina do talo em diversos substratos proticos, e sua atividade mxima em pH 8,0 e temperatura de 70C. A bromelina do talo apresentou atividade mxima a 60C e pH 7,0 [7]. A cultivar Prola uma das espcies mais comercializadas no Brasil. E apesar do abacaxizeiro ser amplamente cultivado em vrias regies do pas, trata-se de uma cultivar bastante exigente no que se refere quantidade de nutrientes vegetais produzidos. Esta pode apresentar um alto contedo da enzima bromelina, porm so poucos os estudos que comprovem e informem as caractersticas desta enzima para esta cultivar [8]. Grandes diferenas entre as quantidades extradas de nutrientes devem ser levadas em conta perante as condies variveis apresentadas por esta variedade no que diz respeito as formas de cultivo empregadas [9]. Um dos processos analisados e que proporciona a multiplicao de diferentes espcies para obter resultados satisfatrios o cultivo in natura. A tcnica de micropropagao pode ser utilizada como alternativa para a produo em grande escala de material vegetal de abacaxizeiro visando explorao comercial da enzima em questo. Porm, o cultivo in natura resultou em baixa atividade proteoltica quando comparado ao abacaxi cultivado in vivo. Por esse motivo o presente trabalho realizou estudos de caracterizao bioqumica da bromelina extrada do fruto do abacaxizeiro cv. Prola. 2. MATERIAL E MTODOS Para a anlise in natura da bromelina foram utilizadas 150 brotaes de abacaxizeiro cv. Prola, provenientes do terceiro subcultivo in natura, distribudos em delineamento inteiramente casualizado com cinco tratamentos com 15 repeties, sendo cada parcela experimental composta por duas brotaes. As brotaes com altura de 4cm, foram fixadas em placas de isopor com orifcios de 2cm de dimetro em espaamento de 5 x 3cm, em bandeja plstica com 42cm de comprimento x 26cm de largura x 6cm de altura, cada bandeja contendo 450 mL de soluo de gua, MS [10], MS, Hoagland [11], Hoagland e Fertilizante Foliar (NIFOL) correspondente ao seu tratamento. Aps um perodo de dois meses sob aerao com solues especficas, foram realizadas as anlises bioqumicas. Para a anlise in vivo foi utilizado o extrato bruto do fruto do abacaxi. Dois abacaxis cv. Prola foram comprados no Mercado Municipal de Aracaju e descascados para que toda a polpa fosse utilizada. Foi obtida uma massa total de 860g de polpa. Estas foram maceradas obtendo o suco que foi filtrado em uma camada de algodo. Aps essa filtragem, o volume obtido foi de 480mL. A determinao da concentrao de protenas totais foi realizada pelo Mtodo de Bradford utilizando uma curva padro de albumina do soro bovino (BSA) [12]. Para a determinao da atividade proteoltica da enzima, foi utilizado o mtodo da digesto da casena [13]. A soluo tamponada de casena foi preparada pela dissoluo de 1g de casena em aproximadamente 35ml de gua destilada e 5ml de hidrxido de sdio 1M sob constante agitao at que obteve-se a completa dissoluo da casena. Em seguida, foi adicionado tampo fosfato a 1M pH 7,5. Em um tubo de ensaio adicionou-se 5mL de casena e 0,2mL do extrato protico (suco do abacaxi e extrato de folhas) sob constante agitao. Em seguida, retirou-se uma alquota de 0,02mL do volume reacional (Branco). A esta alquota era adicionado 0,98mL de gua destilada e 1mL do reagente de Bradford [12], aps 5 min realizava-se a leitura da absorbncia em espectrofotmetro a 595nm. Aps 20 minutos a operao era repetida

A. Frana-Santos et al., Scientia Plena 5, 111101, 2009

Para realizao do clculo na determinao da atividade enzimtica, foi utilizada a seguinte equao:

AENZ =

(((Abs

inicial

Abs final ) C lin ) / C ang ) d Vtubo MM PD t1 V

(1)

Onde AENZ a atividade enzimtica [mol.min-1 .mL-1] ou [U.mL-1], d o fator de diluio (volume total/volume da alquota), MMPD a massa molar do substrato utilizado [g.mol-1], V o volume da amostra [mL], Vtubo o volume reacional [mL], Absinicial e Absfinal so as leituras inicial e final de absorbncia, t1 o tempo para degradao da protena [min] e clin e cang os coeficientes linear e angular da curva de calibrao do reagente de Bradford [12]. A atividade especfica, AEsp [mol.min-1 .mg-1] ou [U.mg-1], foi expressa como unidades de enzima por quantidade de protena total, Cproteina [mg.mL-1], utilizando a equao a seguir:

AEsp =

AENZ C protena

(2)

Para a caracterizao da enzima bromelina do fruto do abacaxi, inicialmente foi determinada a atividade proteoltica em diferentes tempos de incubao (5, 10, 20 e 30 min) de onde foram retiradas alquotas de 0,005; 0,01 e 0,02mL do volume reacional. A determinao da atividade da enzima em funo da temperatura foi realizada a partir da incubao da mistura reacional em banho-maria, por 20 minutos com variao de temperatura de 20C a 70C, com intervalos de 10C. Foi medida a atividade no tempo zero e aps 20 minutos, em cada temperatura. Para estudar o efeito de pH da bromelina foram utilizadas solues tampo de 50mM de acetato de sdio (pH 4,0; 5,0); fosfato de sdio (pH 6,0 e 7,0) e Tris-HCl (pH 8,0 e 9,0) [11]. O pH foi ajustado com NaOH 2N ou HCl 2N. A determinao da atividade enzimtica e a quantidade de protena total foram realizadas atravs do mtodo de digesto da casena [13] como descrito acima. 3. RESULTADOS E DISCUSSO A atividade da bromelina foi determinada pelo mtodo de digesto da casena no qual o mtodo de Bradford usado para quantificar as protenas. A utilizao deste mtodo possibilitou agilidade e praticidade nas anlises de quantificao das protenas, como tambm, nos ensaios bioqumicos de caracterizao da enzima. O limite de deteco da concentrao protica desse mtodo de 0 a 20g de protena. Ele se fundamenta na ligao da protena ao corante Coomassie brilhante blue G-250, ligao essa que causa a mudana na absorbncia mxima do corante de 495nm para 595nm. Este ensaio bastante reproduzvel, apresentando boa estabilidade de cor por cerca de 1 hora [12]. Para anlise dos resultados da atividade da bromelina em diferentes condies de cultivo hidropnico in natura foi utilizado o mtodo ANOVA do SISVAR, usando o teste de Tukey ao nvel de probabilidade de 5%, para avaliar estatisticamente os dados obtidos. O tratamento com fertilizante foliar apresentou maior atividade da enzima bromelina quando comparado aos tratamentos MS e Hoagland, porm no diferenciou estatisticamente dos tratamentos com gua e Hoagland. Os tratamentos MS e Hoagland no apresentaram diferena estatstica entre si (Figura 1).

A. Frana-Santos et al., Scientia Plena 5, 111101, 2009

Figura 1 Determinao da atividade especfica da bromelina cultivada in vitro em condies de cultivo hidropnico nos seguintes tratamentos: 1. gua; 2. MS; 3. Hoagland; 4. Hoagland; 5. Fertilizante foliar (NIFOL)

Devido observao de que a atividade proteoltica da bromelina do extrato das folhas do abacaxizeiro cultivado in natura era bastante baixa, a atividade da bromelina obtida do fruto do abacaxi foi determinada. Inicialmente foi construda uma curva padro para observao do curso da reao enzimtica relacionada ao tempo de incubao e ao volume da reao utilizada para determinar a atividade proteoltica. Nos tempos de digesto acima de 5 minutos a atividade da enzima decresce com o passar to tempo at entrar em estabilidade com o substrato. Acima de 10 minutos todos os volumes do extrato bruto protico apresentam-se em equilbrio (Figura 2).

Figura 2 Determinao da atividade proteoltica da bromelina do extrato bruto protico do fruto do abacaxizeiro por tempo

A temperatura de armazenamento ou de exposio de uma enzima tambm um fator de extrema importncia para a manuteno de sua atividade cataltica, j que o calor um agente desnaturante. Assim como o pH, a temperatura pode ser um fator de desnaturao protica e consequentemente de perda da atividade enzimtica. Baseando-se nesta possibilidade, a atividade proteoltica da enzima bromelina foi testada em diferentes temperaturas (Figura 3). Pode-se notar um decrscimo inicial da atividade enzimtica entre as temperaturas de 20C a 30C. Em seguida, houve uma alta taxa de atividade enzimtica, seguida de um decrscimo praticamente constante com a elevao da temperatura at 70C. A bromelina apresentou

A. Frana-Santos et al., Scientia Plena 5, 111101, 2009

temperatura tima de 40C, sendo que em 70C a enzima apresentou-se desnaturada. Estudos anteriores a esse relataram a temperatura tima para a bromelina de 60C sendo que alm desta, a enzima apresenta-se desnaturada [7, 15]. Neste trabalho notou-se que a enzima passou a se desnaturar aps a temperatura tima encontrada. Na temperatura de 20C pode ter acontecido um aumento na atividade enzimtica devido a outros complexos enzimticos tambm encontrados no extrato bruto protico desta cultivar.

Figura 3 Determinao da temperatura tima da atividade enzimtica da bromelina do extrato bruto protico do fruto do abacaxizeiro

A bromelina do suco do abacaxi (extrato bruto protico) apresentou pH timo de ao na faixa 5,0, no tampo acetato de sdio (Figura 4). Esse resultado difere de uma caracterizao da bromelina em que o pH timo encontrado foi 7,5 para o A. comosus [16]. Porm notou-se que nesta faixa de pH no houve uma elevao da atividade enzimtica. O aumento da atividade em pH 7,0 apresentado no experimento com a cv. Prola pode ser explicado pelo fato de que um complexo de enzimas com atividade proteoltica podem ser encontradas no extrato bruto no purificado [16]. A bromelina do fruto do abacaxi contm vrias proteases que diferem entre si na sua ao em diversos substratos, bem como na suscetibilidade em oxidar-se e reduzir-se, e especialmente no pH que elas hidrolisam mais rapidamente seus substratos. O pH timo de atividade influenciado pela natureza do substrato, pela concentrao e tipo de soluo tampo utilizada e tambm pela presena de agentes redutores. Para auxiliar na classificao dessas enzimas, as proteases so designadas pelo pH timo de atividade. Portanto, para determinadas proteases tambm presentes no extrato bruto podemos encontrar atividade em determinadas faixas de pH como demonstrado neste estudo.

Figura 4 Determinao do pH timo da bromelina do extrato bruto protico do fruto do abacaxizeiro utilizando solues tampo de 50mM de acetato de sdio (pH 4,0 e 5,0); fosfato de sdio (pH 6,0 e 7,0) e Tris-HCl (pH 8,0 e 9,0)

A. Frana-Santos et al., Scientia Plena 5, 111101, 2009

4. CONCLUSO A bromelina presente no extrato bruto protico do fruto do abacaxi cv. Prola apresentou pH timo de 5,0. Tambm foram observados outros picos de pH, talvez resultantes de outras enzimas proteolticas encontradas no extrato bruto. A temperatura tima de ao da bromelina presente no extrato bruto protico do fruto do abacaxizeiro foi de 40 C, chegando a desnaturarse em temperaturas acima desta. A bromelina extrada do fruto do abacaxi apresentou maior atividade proteoltica do que a extrada das folhas do abacaxizeiro cultivado in natura sob condio hidropnica.
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. ANURIO ESTATSTICO DA AGRICULTURA BRASILEIRA - AGRIANUAL 2006. So Paulo: FNP Consultoria e Comrcio/M & S Mendes & Scotoni, (2006). FERREIRA, F. R.; CABRAL,J. R. S. Melhoramento gentico do abacaxizeiro. Informe Agropecurio, Belo Horizonte, V.19, n.195, p.24-28, (1998). CARVALHO, V. D. de; BOTREL, N. Caracterstica da fruta de exportao. In: GORGATTI NETTO, A et al. Abacaxi para exportao: procedimentos de colheita e ps-colheita. Braslia: EMBRAPA/ SPI, (1996). p.7-27 (Srie Publicaes Tcnicas FRUPEX, 23). GONALVES, N. B. (Org.). Abacaxi. Ps-colheita. Embrapa agroindstria de Alimentos (Rio de Janeiro, RJ). Braslia: Embrapa Comunicao para Transferncia de Tecnologia, (2000). 45p. (Frutas do Brasil; 5). DRAETTA, I.S.; GIACOMELLI, E.J. Ocorrncia da bromelina e cultivares de abacaxizeiro. Colet. ITAL, v.23, n.1, p.44-55, Campinas, (1993). SANTOS, S.A. Efeito do tempo na composio fsico-qumica. Qumica e na atividade da bromelina do caule do abacaxizeiro Ananas comosus (L.) merr. cv. Prola armazenado em condies com e sem refrigerao. Lavras: ESAL, (1995) 47p. (Dissertao de mestrado em Cincia dos Alimentos). ROWAN, A. D.; BUTTLE D. J.; BARRET, A. J. The cysteine proteinases of the pineapple plant. Biochemical Journal, 266: 869-75 (1990). GRANADA, G.G.; ZAMBIAZI, R.C.; MENDONA, C.R.B. Abacaxi: produo, mercado e subprodutos. B. CEPPA, Curitiba, v.22, n.2, p. 405-422, jul./dez. (2004). PAULA, M.B.; MESQUITA, H.A.; NOGUEIRA, F.D. Nutrio e adubao do abacaxizeiro. Abacaxi: Tecnologia de Produo e Comercializao. EPAMIG, Informe Agropecurio, Belo Horizonte, v.19, n. 195, p. 33-39, (1998). MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantanum, V.15, P.473-497, (1962). HOAGLAND, D.R.; D.I. ARNON.The water-culture method for growing plants without soil. California Agricultural Experiment Station Circular 347:1-32 (1950). BRADFORD, M.M.A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.Analytical Biochemistry, 72: 248-254 (1976) KUNITZ, M. Crystalline trypsin inhibitor. II. General properties. Journal of general Physiology, v.30, p. 295-310 (1947). HALE, P.L.; GREER, P.K.; TRINH, C.T.; JAMES, C.L. Proteinase activity and stability of natural bromelain preparations. International Immunopharmacology, 5: 783793 (2005) SUH, H.J.; LEE, H.; CHO, H.Y.; YANG, H.C. Purification and characterization of bromelain isolated from pineapple. Han'guk Nonghwa Hakhoechi..35: 300-307 (1992) HARRACH, T.; ECKERT, K.; MAURER, H.R. Isolation and Characterization of Two Forms of an Acidic Bromelain Stem Proteinase. Journal of Protein Chemistry, 17: 350-361 (1998).