Centro de Cincias e Tecnologia Cursos de Engenharia Ambiental e Qumica

Prof. Dr. Carlos Alberto Alves da Silva Profa. Dra. Galba Maria de Campos Takaki

Recife 2011

ANLISE BACTERIOLGICA DE GUA Prof. Dr. Carlos Alberto Alves da Silva Profa. Dra. Galba Maria de Campos Takaki

OBJETIVO: Analisar bacteriologicamente de uma amostra de gua utilizando a tcnica dos tubos mltiplos de fermentao.

INTRODUO: Uma gua destinada ao consumo humano dever ser isenta de microrganismos considerados patognicos e de substncias qumicas prejudiciais ao organismo humano. A gua pode se apresentar sob a forma perfeitamente lmpida em sua aparncia, livre de sabores e odores peculiares, e no entanto, se apresentar contaminada microbiologicamente. A qualidade da gua s pode ser avaliada por meio de testes laboratoriais, qumicos e bacteriolgicos. A anlise qumica pode indicar a poluio de componentes qumicos, porm no consegue detectar pequenos graus de contaminao. Sendo, portanto, a pureza bacteriolgica que condiciona a potabilidade de uma gua. Devido a grande dificuldade de se ter resultados satisfatrios atravs das pesquisas de bactrias patognicas, a anlise bacteriolgica feita atravs da investigao de certas espcies bacterianas indicadoras de poluio: a Escherichia coli e organismos com ela relacionados, sendo denominados de coliformes, os estreptococos fecais (Streptococcus faecalis) e o Clostridium perfringens. Estas bactrias fazem parte da flora normal existente no intestino grosso do homem e dos animais, estando presentes na matria fecal. Assim a presena de qualquer uma dessas espcies bacterianas na gua, evidencia sinais de poluio fecal de origem humana ou animal na gua analisada. Se tais microrganismos esto presentes numa amostra de gua, para os agentes patognicos, encontrados igualmente, nas fezes.

Os coliformes como indicadores de poluio escolhidos mundialmente porque apresentam as vantagens:

tm sido seguintes

tm presena constante no intestino humano, em nmero muito elevado. cerca de bilhes destes germes so eliminados por uma pessoa no espao de 24 horas; so mais resistentes fora do habitat natural que as espcies enteropatognicas; so mais facilmente identificados em meios simples de laboratrio.

No laboratrio para se analisar bacteriologicamente uma gua pode-se utilizar o mtodo da membrana filtrante ou o mtodo dos tubos mltiplos de fermentao. Nossa prtica se deter na utilizao deste ltimo. O mtodo de fermentao em tubos mltiplos determina a presena e o nmero aproximado de coliformes, atravs da inoculao de uma srie de pores da amostra de gua em tubos com meios de cultura adequados para comprovar a presena de organismos coliformes. O exame compreende trs ensaios sucessivos: (1) o ensaio presuntivo, (2) o ensaio de confirmao (3) o ensaio completo ou diferencial.

Meios de Cultura

Caldo Lactosado Duplo Extrato de carne ................... 6 g/L Peptona ............................... 10 g/L Lactose ................................ 10 g/L pH = 6,9 7,0

Caldo Lactosado Simples Extrato de carne ................... 3 g/L Peptona ............................... 5 g/L Lactose ................................ 5 g/L pH = 6,9 7,0

Caldo Verde Brilhante Peptona .............................. 10 g/L Lactose ............................... 10 g/L Bile de boi desidratada .......... 20 g/L Verde brilhante .................... 0,0133 g/L pH = 7,2 7,4

* Pesar 40 g do meio desidratado Brilliant Green Bile Broth a 2% e acrescentar 1000 mL de gua destilada fria. Aquecer, agitando freqentemente at a completa dissoluo do meio, tomando cuidado para que no seja atingida a temperatura de ebulio. Distribuir em volumes de 10 mL em tubos de ensaio de 16 mm X 150 mm, tendo no seu interior tubos de Durham invertidos. Tamponar e esterelizar em autoclave a 121 oC, durante 15 minutos.

Meio E.C (Escherichia coli) Triptose ............................. 20 g/L Lactose .............................. 5,0 g/L Sais biliares ....................... 1,5 g/L Fosfato dipotssico ............. 4,0 g/L Fosfato monopotssico ........ 1,5 g/L Cloreto de sdio ................... 5,0 g/L pH = 6,9 7,0

* Pesar 40 g do meio desidratado E.C. Mdium e acrescentar 1000 mL de gua destilada fria. Aquecer, agitando freqentemente at a completa dissoluo do meio, tomando cuidado para que no seja atingida a temperatura de ebulio. Distribuir em volumes de 5 mL em tubos de ensaio de 12 mm X 120 mm, tendo no seu interior tubos de Durham invertidos. Tamponar e esterelizar em autoclave a 121 oC, durante 15 minutos.

gar Eosina Azul de Metileno (EMB) Peptona ................................... 10 g/L Lactose .................................... 10 g/L Fosfato dipotssico .................... 2 g/L Eosina ...................................... 0,4 g/L Azul de metileno ........................ 0.065 g/L Agar .......................................... 20 g/L

* Pesar 37,5 g do meio desidratado E.M.B. Agar e acrescentar 1000 mL de gua destilada fria. Aquecer, agitando freqentemente at a completa dissoluo do meio, tomando cuidado para que no seja atingida a temperatura de ebulio. Tamponar e esterelizar em autoclave a 121 oC, durante 15 minutos.

ENSAIO PRESUNTIVO 1a ETAPA - Inoculao para o Ensaio Presuntivo e Contagem Padro em Placas

a. Inoculao nos tubos Com uma pipeta de 10ml estril, inocular 10ml da amostra de gua em cada um dos 5 tubos de caldo lactosado duplo (CD). Com uma outra pipeta de 1ml estril, inocular 1ml da amostra de cada 5 tubos com caldo lactosado simples (CS1). Transferir com pipeta estril, 1 mL da amostra para um tubo de diluio com 9ml de gua estril ou gua tamponada estril; agitar bem. Inocular 1mL em cada um dos 5 tubos de caldo lactosado simples (CS2) restantes. Agitar cuidadosamente os tubos e incub-los a 35oC, durante 24/48 horas.

b. Contagem Padro de Colnias em Placas Transferir com pipeta estril, 1 mL da suspenso para um dos tubos de gua estril ou gua tamponada estril; agitar bem e deste tubo retirar 1mL e transferir para outro tubo com gua e assim sucessivamente sendo realizada uma srie de diluies 10-2, 10-3, 10-4. De cada tubo transferir para duas placas estreis, amostra de 1ml, depois adicionar a cada placa cerca de 15 mL de meio de Glicose-agar fundido e resfriado a 45oC. Agitar cuidadosamente, esperar solidificar e incub-las em aerobiose a 35oC, durante 24/48 horas. Observe o esquema 1 de operaes que conjuga o ensaio presuntivo e a contagem em placas simultaneamente.

FIGURA 1. Esquema de Inoculao do Ensaio Presuntivo e Contagem Padro em Placas

2a ETAPA - Resultado do Ensaio Presuntivo e da Contagem Padro em Placas e Inoculao para o Ensaio Confirmativo

a) Resultado do Ensaio Presuntivo Aps 24 horas de incubao, se houver formao de gs em qualquer quantidade, em qualquer tubo, o ensaio presuntivo positivo. Se no houver gs incubar por mais 24 horas na mesma temperatura. Aps 48 horas de incubao se no houver gs em qualquer tubo, o ensaio negativo e a anlise est encerrada quanto a coliformes. Caso seja observada a formao de gs, o ensaio presuntivo considerado positivo.

b) Resultado da Contagem Padro em Placas Examinar as placas e escolher para contagem as que tenham entre 30 e 300 colnias (evidentemente se a placa inoculada com 1 mL da amostra no diluda tiver um nmero inferior a 30 colnias, esse nmero registrado). Pode-se usar para auxiliar na contagem um aparelho especial munido de lupa, o Contador de colnias tipo Quebec. Se as placas forem originadas de qualquer diluio no se esquecer que o resultado ser: a mdia do nmero de colnias multiplicada pela diluio.

c) Inoculao para o Ensaio Confirmativo

c.1) Ensaio Confirmativo para Coliformes Totais De cada um dos tubos positivos usados do ensaio presuntivo transferir com ala estril, aps agitao, uma gota para um tubo com caldo verde brilhante lactose bile (VBLB), igualmente dotado de tubinhos de Durham. Assim sero usados tantos tubos de caldo verde brilhante quantos forem os tubos positivos do ensaio presuntivo. Incubar a 35oC durante 24-48 horas.

c.2) Ensaio Confirmativo para Coliformes Fecais De cada um dos tubos positivos usados do ensaio presuntivo transferir com ala estril, aps agitao, uma gota para um tubo

com caldo E.C., igualmente contendo de tubinhos de Durham. Assim sero usados tantos tubos de caldo E.C. quantos forem os tubos positivos do ensaio presuntivo. Incubar a 44,5oC em banho-maria durante 24 horas. Os tubos devem ser previamente aquecidos a 44,5oC e aps inoculao colocados imediatamente no banho-maria.

c.3) Ensaio Confirmativo em Meio Solidificado O ensaio confirmativo em meio solidificado dever ser realizado mediante a inoculao do em placas de Petri com meios diferencial especficos para coliformes (Eosina Azul de Metileno EMB; Endo, Mac Conkey ou outros). Incubar a 35oC durante 24-48 horas.

Maiores detalhes sobre esta tcnica esto no esquema apresentado na figura 2.

FIGURA 2- Esquema de Inoculao do Ensaio Confirmativo.

3a ETAPA - Resultados do Ensaio Confirmativo

a) Resultado do Ensaio em Meio Lquido de Verde-Brilhante Aps incubao durante 24-48 horas os tubos que apresentarem bolha de gs so aqueles em que ficou confirmada a presena de coliformes. Devem ser anotados todos os tubos positivos e recorrendo-se em seguida tabela estatstica de Hoskins que indica, o nmero mais provvel de coliformes existentes em 100mL da amostra. Este nmero constitui o NMP de coliformes totais.

b) Resultado do Ensaio em Meio Lquido de E.C. Aps incubao durante 24 horas os tubos de E.C. que apresentarem bolha de gs so aqueles em que ficou confirmada a presena de coliformes fecais. Devem ser anotados todos os tubos positivos e recorrendo-se em seguida tabela estatstica de Hoskins que indica, o nmero mais provvel de coliformes existentes em 100mL da amostra. Este nmero constitui o NMP de coliformes fecais.

c) Ensaio em Meio Slido Observar as placas para determinar se houve ou no crescimento de colnias tpicas de coliformes. O resultado do exame dever ser analisado da seguinte maneira: O no crescimento de colnias tpicas indica que o ensaio confirmativo negativo; O crescimento de colnias tpicas de coliformes indica que o teste para coliformes positivo.

Se o ensaio confirmativo for positivo as colnias tpicas escolhidas devem ser transferidas cada uma para dois tubos, um contendo meio de Agar-nutritivo (AN) e outro de caldo lactosado simples ou caldo lactosado duplo. 4a ETAPA: Inoculao para o Ensaio Completo ou Diferencial (IMViC) O ensaio completo ou diferencial utiliza reaes de caracterizao que so provas bioqumicas que se realizam para a

identificao dos microrganismos dentro do grupo dos coliformes. Estes testes so conhecidos pela sigla IMViC. Tcnica: Partindo-se da cultura de coliforme crescido em agar-nutritivo (AN) obtida a partir do ensaio anterior inocula-se: Com uma ala em crculo, um tubo de caldo triptonado, para o teste de Indol; Com uma ala em crculo, dois tubos com caldo glicosadofosfatado (meio de Clark Lubs), um para o testes de Vermelho de Metila e outro para o teste de Voges Proskauer; Com uma ala em agulha, um tubo com meio lquido de citrato de Koser para prova de utilizao de Citrato. Pode-se tambm usar um meio citratado solidificado, chamado de meio Citrato de Simons.

Aps o cultivo, todos os tubos so incubados a 35oC. Sendo o tempo especfico para cada teste.

FIGURA 3. diferencial

Esquema de inoculao para o ensaio completo ou

5a ETAPA: Resultados do Ensaio Completo ou Diferencial 1) Teste do Indol: aps incubao durante 18 a 24 horas, juntar cultura crescida 0,2 a 0,3mL do reagente de Kovacs. O aparecimento de um anel sobrenadante vermelho intenso indica a presena de indol Se a cor do reagente permanece inalterada indica que o teste negativo.

2) Teste de Vermelho de Metila: aps incubao da cultura em meio de caldo-glicosado-fosfatado por 4 a 5 dias, juntar 2 a 3 gotas do indicador vermelho de metila Cor vermelha indica teste positivo Cor amarela indica teste negativo

3) Teste de Voges Proskauer: aps 48 horas de incubao, retira-se com pipeta estril 1mL da cultura crescida para um outro tubo de ensaio; junta-se 0,6ml de soluo de -naftol e 0,2 mL de KOH a 40 %. Agita-se vigorosamente e deixa-se em repouso em estufa a 35oC. Observa-se a partir de 15 minutos at um mximo de 4 horas. O aparecimente de uma uma colorao cereja que se estende da superfcie para o fundo do tubo indica um teste Voges Proskauer positivo. O aparecimento de uma colorao acobreada ou mesmo vermelha indica teste negativo.

4) Teste de citrato: aps 72 a 96 horas de incubao em meio citratado, observa-se: Crescimento visvel (o meio fica turvo) - prova positiva Ausncia de crescimento (o meio permanece lmpido) - prova negativa

Observao: Quando o teste realizado em meio solidificado de Simons uma virada do indicador azul de bromotimol, de verde para azul indica: citrato positivo.

Com os resultados dos quatro testes anteriores pode-se determinar o gnero do coliforme isolado atravs da tabela 1, que fornece uma interpretao dos resultados das reaes do IMViC.

TABELA 1: Interpretao das reaes IMViC Microrganismo Eschericha coli Variedade I Variedade II Citrobacter freundii (Intermedirio) Variedade I Variedade II Enterobacter aerogenes Variedade I Variedade II Indol Vermelho de Metila + + Voges Proskauer Citrato

+ -

+ +

+ -

+ +

+ +

OBSERVAO: a prtica dever ser encerrada mediante a apresentao de um relatrio e um laudo bacteriolgico da gua analisada.

Expresso dos Resultados A densidade de coliformes expressa como NMP de coliformes / 100 mL. O NMP de coliformes obtido atravs de um quadro em que so dados os limites de confiana de 95%, para cada valor de NMP determinado. Para expresso de resultados necessria a composio de um cdigo onde so utilizados apenas resultados positivos correspondentes a 3 sries consecutivas, sendo que o primeiro algarismo escolhido para compor o cdigo ser o de menor volume da amostra (> diluio) em que todos os tubos apresentem resultados positivos, desde que tenham sido inoculados diluies subsequentes para totalizar os 3 algarismos para o cdigo. Encontra-se o cdigo no quadro e o NMP a ela correspondente, o valor final do NMP ser obtido atravs da aplicao da frmula. Valor do NMP correspondente ao cdigo x 10 . Maior volume inoculado selecionado para compor o cdigo
Tabela 1 -Quadro contendo os Cdigos com o Valor do NMP, para Clculo da Densidade de Bactrias de uma Amostra. Nmero de tubos com reao positiva, a partir de 5 tubos de 10 mL ndice de NMP (100 mL) Limites de Confiana de 95%

Inferior 0 1 2 3 4 5 < 2,2 2,2 5,1 9,2 16,0 16,0 1 0,1 0,5 1,6 3,3 8,0

Superior 6,0 12,6 19,2 29,4 52,9 Infinito

ndice de NMP e limites de confiana de 95%, quando so inoculadas 5 pores de 10 mL da amostra.

Tabela 2 -Quadro contendo os Cdigos com o Valor do NMP, para Clculo da Densidade de Bactrias de uma Amostra.

Nmero de tubos com reao positiva, a partir de 10 tubos de 10 mL

ndice de NMP (100 mL)

Limites de Confiana de 95%

Inferior 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 < 1,1 1,1 2,2 3,6 5,1 6,9 9,2 12,0 16,1 23,0 >23,0 0 0,03 0,26 0,69 1,3 2,1 3,1 4,3 5,9 8,1 13,5

Superior 3,0 5,9 8,1 10,6 13,4 16,8 21,1 27,1 36,8 59,5 Infinito

ndice de NMP e limites de confiana de 95%, quando so inoculadas 10 pores de 10 mL da amostra.

Tabela 3 Quadro contendo os Cdigos com o Valor do NMP, para Clculo da Densidade de Bactrias de uma Amostra.

Nmero de tubos com reao ndice de positiva quando so utilizados, em NMP sries de 5 tubos, inculos de 10 (100 mL) mL, 1,0 mL e 0,1 mL

Limites de Confiana de 95%

Inferior
0 0 0 0 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 0 0 1 2 0 0 1 1 2 0 0 1 1 2 3 0 0 1 1 2 2 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 2 <2 2 2 4 2 4 4 6 6 4 7 7 9 9 12 8 11 11 14 14 17 13 17 17 21 26 <1 <1 <1 <1 1 1 2 2 1 2 2 3 3 5 3 4 4 6 6 7 5 7 7 9 12

Superior
10 10 13 11 15 15 18 18 17 20 21 24 25 29 24 29 25 35 35 40 38 45 46 55 63

4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

2 2 3 3 4 0 0 0 1 1 2 2 2 3 3 3 3 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5

0 1 0 1 0 0 1 2 0 2 0 1 2 0 1 2 3 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 5

22 26 27 33 34 23 30 40 30 60 50 70 90 80 110 140 170 1307 170 220 280 350 240 300 500 900 1600 1600

9 12 12 15 16 9 10 20 10 30 20 30 40 30 40 60 80 50 70 100 120 160 100 100 200 300 600 -

56 65 67 77 80 86 110 140 120 180 170 210 250 250 300 360 410 390 480 580 690 820 940 1300 2000 2900 5300 -

ndice de NMP e limites de confiana de 95%, quando so utilizados inculos 10 mL, 1,0 mL e 0,1 mL da amostra

DESINFECO DE RESERVATRIO

1. Para executar esta limpeza, o reservatrio deve ser esvaziado completamente e retirado de seu interior todo material indesejvel (folhas, pedras, areia etc...). 2. O reservatrio deve ser lavado com gua e as paredes escovadas. O material resultante do escovamento deve ser retirado pela tubulao de descarga do reservatrio ou manualmente quando no existir tal tubulao. 3. Ao executar esta limpeza deve-se fechar as tubulaes de entrada e sada de gua do reservatrio, para evitar o entupimento das mesmas com o material que est sendo removido. Deve-se utilizar na limpeza materiais novos (rodos, estopas, vassouras...).

PROCEDIMENTO PARA A DESINFECO

Quantidade de desinfetante: Numa vasilha limpa, separe a quantidade do agente desinfetante a ser usado, levando em conta o volume do reservatrio. a) Hipoclorito de Sdio - 500mL ( litro) para cada 1.000 litros de gua (1m3). b) Hipoclorito de Clcio (cal clorada) 200g para cada 1.000 litros de gua (1m3). Neste caso em que o agente desinfetante slido deve-se dissolv-lo em uma quantidade de gua para separar o material insolvel.

MTODOS DE DESINFECO 1. Aps concluda a limpeza, o reservatrio dever ser enchido com gua da rede de distribuio. 2. A seguir, lanar no reservatrio a quantidade do desinfetante, devendo ser feita uma agitao para homogeneiz-lo na gua. 3. Espere no mnimo 4 horas para a desinfeo total do reservatrio e retire toda essa gua armazenada. Essa gua no dever ser utilizada em nenhuma hiptese.

4. Aps retirar toda soluo desinfetante do reservatrio, este dever ser enxaguado com gua limpa. 5. A partir da seu(s) reservatrio(s) estar (o) em condies sanitrias de armazenar gua.

Obs.: Recomenda-se antes de utilizar a gua do reservatrio, proceder exame bacteriolgico. Caso seja encontrado a presena de Coliformes, repetir o processo de desinfeco at a obteno de resultados considerados satisfatrios.

DEVE-SE PROCEDER A DESINFEO DO RESERVATRIO, SEMPRE QUE HOUVER OCORRNCIA DE QUALQUER POLUIO OU ANUALMENTE, PARA GARANTIR A PROTEO ADEQUADA SOB O PONTO DE VISTA SANITRIO.