Cromatografia

Lquida de Alta
Eficincia
Carla B. G. Bottoli
Instituto de Qumica
UNICAMP
Cromatografia Lquida de Alta Eficincia
(HPLC)
Utiliza-se colunas metlicas e FM pressurizada, obtida
com auxlio de bombas de alta presso, para permitir uma
vazo mais rpida da FM.
tambm conhecida como HPLC, ou de Alta Velocidade,
ou de Alta Presso ou de Alto Desempenho ou, ainda, de
Alta Performance. Do Ingls HPLC High Performance
Liquid Chromatography
uma tcnica cromatogrfica que utiliza como FM um
lquido e equipamentos sofisticados para separar os
componentes de uma amostra pela interao com a FE e
com a FM.
Cromatografia Lquida de Alta Eficincia
Vantagens
FE utilizada vrias vezes.
Versatilidade: nico requisito a solubilidade da amostra na FM.
Tempo reduzido de anlise.
Alta resoluo.
Boa para anlise qualitativa:
Parmetros para identificao: t
R
, espectro de absoro no UV (detector
de arranjo de diodos), espectro de massas
Bons resultados quantitativos: desvios inferiores a 5%.
Boa detectabilidade:
Absoro UV-Vis de varivel: 10
-10
g;
Fluorescncia: 10
-12
g.
Automao.
Cromatografia Lquida de Alta Eficincia
Desvantagens
Alto custo do equipamento.
Alto custo de manuteno do equipamento.
No existe um detector universal com boa detectabilidade e
baixo custo:
ndice de refrao: baixa detectabilidade (10
-6
g), pouco
estvel.
Espectrmetro de massas: ~ US$ 150.000
Experincia do operador.
Aplicabilidade de HPLC
Requer somente que a amostra seja solvel na fase mvel.
Frmacos
Pesticidas
Protenas
Alimentos
Aminocidos
Corantes
Vitaminas
Toxicologia
Cosmticos
Polmeros
Sistema de HPLC
Instrumentos Comerciais
Instrumentos Comerciais
Sistema de HPLC
Reservatrio para Fase Mvel
Bomba
Solvente
Filtro
Limpeza peridica do
filtro essencial !!!!
Filtro do Reservatrio:
Captar a FM e evitar que
partculas suspensas na FM
obstruam os capilares ou
contaminem a bomba.
Filtros de 10 a 40 m.
DEVE TER ALTO GRAU DE PUREZA.
As impurezas da fase mvel podem absorver e diminuir a
sensibilidade do detector.
Fase Mvel - Solventes
DISSOLVER A AMOSTRA SEM DECOMPOR SEUS COMPONENTES.
O solvente da amostra, normalmente, a prpria FM ou um dos seus
componentes.
TER POLARIDADE E VISCOSIDADE ADEQUADAS.
NO DEGRADAR A FASE ESTACIONRIA.
No utilizar fases mveis agressivas.
SER COMPATVEL COM O DETECTOR UTILIZADO.
GUA MONO-DESTILADA E DEIONIZADA
COMUM SO INADEQUADAS.
Contaminao de orgnicos volteis e de orgnicos da resina
Fase Mvel - gua
GUA DEVE SER GRAU HPLC .
Purificada com resinas de troca inica, carvo ativado,
filtros de membrana (livre de bactrias). Produzida no
momento de uso pois facilmente recontaminvel.
Degaseificao da Fase Mvel
Indispensvel para o bom funcionamento do sistema.
Garante:
Reprodutibilidade da vazo: retira ar dissolvido na FM e evita
bolhas na bomba;
Estabilidade na linha de base: bolhas no detector causam
instabilidade da linha de base;
Filtrao da Fase Mvel
Essencial.
Mtodos de Degaseificao
Ultra-Som:
Muito lento, pouco eficiente, requer agitao, em geral o pior mtodo quando
usado sozinho.
Degaseificador on-line:
Contnuo, remove o ar logo antes de entrar na bomba, investimento alto inicial
(melhor opo a longo prazo).
Vcuo + Ultra-Som
Rpido, eficiente, refazer de 12 em 12 horas.
Purga com Hlio:
Contnuo, hlio razoavelmente caro, leva a aumento de vazamentos, maior custo
operacional.
Sistema de HPLC
Bombas de Alta Presso
Tm por finalidade enviar um fluxo constante e
reprodutvel de FM para o sistema
cromatogrfico.
Requisitos:
1. Ser de material inerte;
2. Devem gerar altas presses: 0,01 a 35 MPa (para
anlises).
3. Versatilidade: permitir eluio por gradiente
Eluio
Gradiente:
Composio da fase mvel varia durante a eluio.
Utilizado na separao de misturas complexas com diferentes funes
qumicas.
o desenvolvimento da amostra no sistema cromatogrfico.
Isocrtica:
Mesma composio de fase mvel durante a eluio.
Exemplo: Hexano ou Metanol/gua 80:20 (v/v)
Tempo Fluxo % A % B Tempo Fluxo % A % B
Inicial 1.00 80 20
10 1.00 0 100
14 1.50 0 100
18 1.00 80 20
25 1.00 80 20
Exemplo:
Sistema de HPLC
Injetores Manuais
Posio LOAD Posio INJECT
Sobrecarga de Volume da
Amostra
Para aproveitar de todos o pratos que uma coluna
possui, no se deve injetar um volume maior que 1 % do
volume da coluna vazia.
V
mximo
( L) = (raio)
2
(comprimento)(0,01)
16 L 4,6 mm x 10 cm
18 L 3,9 mm x 15 cm
35 L 3,9 mm x 30 cm
140 L 7,8 mm x 30 cm
V
mximo
de injeo Dimenso da coluna
Sistema de HPLC
Colunas Cromatogrficas
Coluna de Guarda
Localizada entre o injetor e
a coluna de separao.
Colunas de 2 a 5 cm e d.i.
igual ao da coluna de
separao.
Mesma FE da coluna de
separao.
Protege a coluna de
separao, aumentando
seu tempo de vida.
5

c
m
Preparativa
d.i. > 10 mm
Convencional d.i. 2 - 5 mm
Microbore d.i. 1 ou 2 mm
Capilar d.i. 0,075 0,5 mm
Coluna de Separao
Coluna de Separao
1
5

c
m
Condicionamento da Coluna
Necessrio para que haja um perfeito equilbrio da FM e da FE.
Coluna nova: 4 8 horas.
Coluna parada h alguns dias: 2 horas.
Coluna de uso dirio: 15 minutos.
Coluna deve ser guardada
em solvente orgnico ou fase mvel
Partculas de Recheio
Porosas (3 a 10 m)
No Porosas (1-2 m)
Monolticas
Formada cilindricamente em forma de haste.
Partculas No Porosas
Separao de benzodiazepnicos
Condies:
Coluna: 3 cm x 4,6 mm d. i.
FE: ChromSphere UOP C18,
1,5 m (no-porosa)
FM: ACN: H
2
O (85:15 v/v)
Vazo: 3,5 mL min
-1
Temperatura: 35 C
Detector: UV, 254 nm
1: bromazepam, 2: nitrazepam, 3: clonazepam, 4: oxazepam, 5: flunitrazepam,
6: hidroxidiazepam, 7: nordazepam, 8: diazepam
Slica
O
Si
Si
O
Si
O
Si
O
Si
O
Si
O
Si
O
OH
OH
O
O
H
H
HO
O
O
O
O
O
O
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Silanis
Vicinais
Silanis
Geminais
Silanol
Isolado
Ligao
Siloxano
Ligao de
Hidrognio
Cromatografia Lquida com
Fase Ligada
FE:
Suporte (SiO
2
)
+
Lquido estacionrio
Vantagens:
Alta estabilidade qumica.
Liberdade de escolha da
FM, vazo e temperatura.
Eluio por gradiente.
Desvantagens:
Preparo (sntese) trabalhoso.
Menor recobrimento da
superfcie (apenas 50% dos
silanis)
Impedimento estreo.
Mecanismo duplo de reteno.
Restrio ao pH: 2< pH < 8.
Reao
Qumica
FE + apolar: FM + polar FE + polar: FM + apolar
Fases Estacionrias
Quimicamente Ligadas
FASE NORMAL
Amino NH
2
Diol (CH
2
OH)
2
Ciano CN
Nitro NO
2
FASE REVERSA
N-aquil C
18
C
8
C
4
Fenil
OH
OH
OH
OH
OH
Si
CH
3
R
CH
3
X
O
OH
O
OH
O
Si
CH
3
CH
3
Si
CH
3
CH
3
R
Si
CH
3
CH
3
R
R
R = C8, C18
X = Cl, OR
S
u
p
e
r
f

c
i
e

d
a

S

l
i
c
a
Agente sililante
monofuncional
Reao Siloxano
Efeito do Comprimento da
Cadeia na Reteno
(1)acetona, (2) p-metoxifenol, (3) fenol, (4) m-cresol, (5) 3,5-xilenol, (6) anisol, (7) fenilfenol
Fases Mveis
FASE NORMAL
Hexano
Diclorometano
FASE REVERSA
Metanol
Acetonitrila
Tetraidrofurano
Polaridade alterada com
gua ou tampo
Polaridade alterada com
isopropanol, acetato de etila,
tert-butilmetil ter
HPLC Fase Reversa
Vantagens:
Fases Mveis menos txicas e
de menor custo: modificador
orgnico + gua.
Boa estabilidade frente aos
vrios solventes.
Rpido equilbrio aps a troca
do solvente.
Compatvel com gradiente.
Anlises rpidas.
Vasto campo de aplicao.
Desvantagens:
Silanis Residuais:
Mecanismo duplo de
reteno.
Problema na separao de
compostos bsicos.
Intervalo de pH: 2<pH<8
Devido ao uso da slica.
Ajuste da Fora Cromatogrfica
Separao de lcool benzlico (1), fenol (2), 3,4-dimetoxiacetofenona (3),
benzona (4), benzoato de etila (5), tolueno (6), 2,6-dimetoxitolueno(7), o-metoxibifenila (8).
B refere-se ao solvente orgnico Acetonitrila
Baixa resoluo entre
os picos 2 e 3
Ajuste da Fora Cromatogrfica
Ajuste da Fora Cromatogrfica
Boa resoluo mas tempo
de anlise muito longo
Ajuste da Fora Cromatogrfica
com Gradiente
FN : compostos polares (anilinas substitudas, steres,
pesticidas, etc.)
FR :carboidratos
-NH
2
Amina
FN :comportamento semelhante slica
FR : seletividade diferente de C
8,
C
18
, ou fenil
-CN Ciano ou
Nitrila
Compostos moderadamente polares -C
6
H
5
Fenil
Solutos apolares ou moderadamente polares, cidos
graxos, glicerdeos, hidrocarbonetos aromticos
polinucleares, estres, vitaminas solveis, aminocidos,
frmacos, etc...
C
18
-Octadecil
Solutos pouco ou altamente polares (peptdeos
pequenos, protenas, esterides, nucleosdeos, frmacos
polares, etc... )
C
8
-Octil
Separao de Peptdeos e protenas C
4
-Butil
Aplicao de FEQL FE
Condies cromatogrficas:
Coluna (25 cm x 4,6 mm d. i.)
Fase estacionria: Spherisorb 5 m
Fase mvel: ter de petrleo acetona,
gradiente linear de 5 a 25 % acetona
em 30 minutos, 1 mL min
-1
Detector: UV-Vis 460 nm.
1 = -caroteno, 2 = criptocapsina
3 = criptoflavina, 4 = -criptoxantina
5 = anteraxantina, 6 = capsolutena,
7 = luteoxantina, 8 = zeaxantina,
9 = mutatoxantina, 10 = capsantina,11
= capsantina-5,6-epoxido,
12 = violaxantina, 13 = capsorubina,
14 = isomro capsorubina,
15 = neoxantina
Separao de carotenides da
pimenta vermelha
Condies cromatogrficas: coluna (25 cm x 4,6 mm) Zorbax cianopropila,
fase mvel: 1,2 mL min
-1
, gua-acetonitrila-cido actico-n-butilamina 600:400:2,5:1,5, v/v/v/v,
temperatura: 45 C, detector: UV, 254 nm.
M = metablitos da clomipramina, 1 = trimipramina (padro interno) 2 = metilclomipramina,
3 = clomipramina
Separao de Antidepressivos Tricclicos a Partir do Extrato de
Soro de um Paciente que Recebeu Clomipramina
Condies cromatogrficas: coluna (25 cm x 4 mm) LiChrosorb RP-8, 10 m,
Fase mvel: eluio por gradiente, 30 % acetonitrila em gua at 90 % de acetonitrila em
gua, 16 min, detector: UV 254 nm.
1 = bromural, 2 = carbromal, 3 = acetocarbromal, 4 = benzil mandelato
Separao de Tranquilizantes
Sistema de HPLC
Detectores
Dispositivos que examinam continuamente o
material eludo, gerando sinal quando da
passagem de substncias.
Idealmente:
cada substncia
separada aparece
como um PICO no
cromatograma.
Detectores
Absoro:
Fotomtrico: fixo.
Espectrofotomtrico: varivel.
Espectrofotomtrico por arranjo de diodos.
ndice de Refrao
Fluorescncia
Espalhamento de Luz
Espectrometria de Massas
Dicrosmo Circular
Eletroqumico
70 % de anlises publicadas utilizam HPLC com detectores UV/Vis
Espectrofotom Espectrofotom trico por Arranjo de Diodos trico por Arranjo de Diodos
ESPECTROS TRIDIMENSIONAIS
Detectores: Absoro
DETERMINAO DA PUREZA DO PICO
Espectrofotom Espectrofotom trico por Arranjo de Diodos trico por Arranjo de Diodos
Comparar os espectros
de absorvncia do
composto obtidos no
incio, mximo e fim
do pico.
Detectores: Absoro
Dicas do que no fazer
em HPLC!
Lavar um sistema com tampo usando orgnico puro: precipitao.
Injetar amostras que podem precipitar na fase mvel: testar miscibilidade.
Usar HCl, H
2
SO
4
ou CCl
3
degradado em sistema de ao inox: corroso
do sistema.
Deixar a bomba trabalhar seca: danificao dos selos.
Usar fita de Teflon para vedar conexes: sem efeito e pode causar
entupimento.
Deixar o sistema parado com fase mvel contendo tampo ou cidos/bases
fortes: cristalizao = danificao dos selos da bomba, injetor, entupimento
do detector.
PERDER A PACINCIA!!!!
Referncias
CAROL H. COLLINS, GILBERTO L. BRAGA, PIERINA S. BONATO (coordenadores),
Fundamentos de Cromatografia, Editora da Unicamp, Campinas, 2006.
L.R. SNYDER, J. J. KIRKLAND, J. L. GLAJCH, Practical HPLC Method Development, 2 ed.,
John Wiley & Sons, 1997.
V.R. MEYER, Practical High-Performance Liquid Chromatography, 4
o
ed., John Wiley & Sons,
2004.
D. A. SKOOG, F. J. HOLLER, T. A. NIEMAN, Princpios de Anlise Instrumental, 5 ed.,
Bookman, 2002.
F.R. de AQUINO NETO, D.S.S. NUNES, Cromatografia Princpios Bsicos e Tcnicas Afins,
Intercincia, Rio de Janeiro, RJ, 2003.
D. C. HARRIS. Anlise Qumica Quantitativa, LTC, Rio de Janeiro, 2005.