Prof. Valmir F.

Juliano

QUI624
INTRODUO AOS MTODOS CROMATOGRFICOS

Classificao dos mtodos analticos CLSSICOS E INSTRUMENTAIS Chamados de mtodos de via mida Baseados em propriedades fsicas (qumicas em alguns casos )

Gravimetria

Volumetria

Eletroanaltico

Cromatogrfico

Espectromtrico

Propriedades eltricas

Propriedades pticas

Propriedades mistas*

*Separao: interaes fsico-qumicas.

Identificao/quantificao: propriedades pticas ou eltricas.

Cromatografia
Histrico Mikhail (Michael, Mikhael) Semenovich Tswett (1903), botnico russo: Separao de misturas de pigmentos vegetais em colunas recheadas com adsorventes slidos e ter de solventes variados.
petrleo

mistura de pigmentos
CaCO3

pigmentos separados

1906 Cromatografia = chroma [cor] + graphe [escrever] (grego)

Cromatografia
Definio - Princpio Bsico

Cromatografia um mtodo fsico-qumico de separao de misturas, identificao e quantificao de seus componentes.

A separao depende da interao dos componentes da mistura com a fase mvel e com a fase estacionria.
A interao dos componentes da mistura com estas duas fases influenciada por diferentes foras intermoleculares, incluindo inica, dipolar, apolar, e especficos efeitos de afinidade e solubilidade.

A identificao se d mediante a comparao da interao de padres com as fases estacionrias. A quantificao feita tambm pela comparao com padres de concentraes conhecidas, atravs de curvas analticas.

Cromatografia
Classificao das tcnicas cromatogrficas

De acordo com o sistema cromatogrfico

Em Coluna Cromatografia Lquida Cromatografia Gasosa Cromatografia Supercrtica Planar Centrfuga (Chromatotron) Cromatografia em Camada Delgada (CCD) Cromatografia em Papel (CP)

Cromatografia
Classificao das tcnicas cromatogrficas

De acordo com a fase mvel

Utilizao de Gs Cromatografia Gasosa (CG) Cromatografia Gasosa de Alta Resoluo (CGAR) Utilizao de Lquido Cromatografia Lquida Clssica (CLC) Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE) Utilizao de Gs Pressurizado Cromatografia Supercrtica (CSC)

Cromatografia
Classificao das tcnicas cromatogrficas

De acordo com a Fase Estacionria

Lquida Slida Quimicamente Ligadas De acordo com o modo de separao

Por Adsoro Por Partio Por Troca Inica Por Afinidade

Cromatografia
Classificao das tcnicas cromatogrficas
Tcnica
Planar Coluna

FM

Lquido

Gs

Lquido

FE

Lq

Sl

Lq

Sl

Lq

Sl

Troca Inica

Afinidade

Fase Ligada

Excluso

Tipo de cromato- CP CCD CGL CGS grafia

CLL CLS

CTI

CB

CLFL

CE

Cromatografia
Analogia O processo cromatogrfico pode ser comparado a um grupo de abelhas e moscas sobrevoando uma certa regio. Ao passarem por uma flor, espera-se algum efeito sobre as moscas e abelhas.

Fase estacionria

Analitos

Cromatografia
Analogia

Para uma mesma mistura, a simples troca da fase estacionria pode ser suficiente para alterar completamente a ordem de eluio de componentes da mistura.

Fase estacionria

Analitos

Cromatografia
Princpio Bsico Separao de misturas por interao diferencial dos seus componentes com uma FASE ESTACIONRIA (lquido ou slido) e uma FASE MVEL (lquido ou gs).

Cromatografia
Cromatografia em papel - CP
A mais simples de todas. Pode-se at fazer em casa!
Fase estacionria lquida suportada na celulose.

Fase mvel

Separao

A cromatografia em papel (CP) uma tcnica de partio, utiliza dois lquidos (lquido-lquido) sendo um fixado em um suporte slido (papel de filtro). Um bom exemplo a separao da tinta verde. Com o processo de cromatografia possvel verificar que a cor verde uma mistura de tintura azul e amarela.

Cromatografia
Cromatografia em papel - CP
A mais simples de todas. Pode-se at fazer em casa!

Desenvolvida por Consden, Gordon e Martin em 1944, bem simples e utiliza pequena quantidade de amostra. Aplica-se na separao e identificao de compostos polares hidrossolveis.

Cromatografia de Camada Delgada - CCD

Teve incio em 1938 com os trabalhos de Izailov e Shraiber, mas comeou a ser largamente utilizada na ddaca de 1960. O processo de separao est fundamentado, principalmente, no fenmeno de adsoro. Entretanto com fases estacionrias tratadas pode ocorrer tambm por partio ou troca inica.

Cromatografia

Cromatografia de Camada Delgada - CCD Termos e parmetros tcnicos

Cromatografia

Smancha Rf Ssolvente

s c

a Rfa s
b Rfb s
c Rfc s

Cromatografia de Camada Delgada - CCD

Cromatografia

FASES ESTACIONRIAS
Slica (SiO2) Alumina (Al2O3) Celulose Poliamida

Ativao de 30 a 60 min de 105 a 110 oC

Ativao de 10 min a 105 oC

Cromatografia de Camada Delgada - CCD

Cromatografia

ANLISE QUALITATIVA
- Comparao com valores de Rf tabelados - Comparao com padro eludo em conjunto - Extrao e aplicao de mtodos instrumentais

Cromatografia de Camada Delgada - CCD

Cromatografia

Concluses:
Amostra no contm a espcie B

Amostra pode conter a espcie A

Para se certificar da presena, eluir em outros solventes

Amostra

A B

Aps Eluio

Cromatografia de Camada Delgada - CCD

Cromatografia

Cromatografia Bi-dimensional

Solvente 1

Solvente 2

Cromatografia
Cromatografia planar

Chromatotron uma cromatografia de camada fina preparativa acelerada centrifugamente. Pode substituir pequenas colunas e HPLC.

Cromatografia em Coluna

Cromatografia

Cromatografia em Coluna

Cromatografia

PROCESSOS DE SEPARAO
Excluso Partio

Adsoro Afinidade

Troca Inica

Cromatografia em Coluna

Cromatografia
ADSORO

- Fase Mvel Lq. ou Gs - Fase Estacionria Slida

Processos de Adsoro/Dessoro Ligaes de hidrognio; Foras de Van der Waals

Cromatografia em Coluna

Cromatografia

Diferena entre Absoro e Adsoro

Cromatografia em Coluna

Cromatografia
ADSORO

Fase Estacionria Slida: Polar

Aumento da Atividade -CO2H > -OH > -NH2 > -SH > -CHO > -C=O > -CO2R > -OCH3 > -CH=CH-

Cromatografia em Coluna A funo das fases mveis na cromatografia por adsoro tem sentido amplo:
a) Funo solvente
b) Funo eluente
Solubilizar os componentes Ter baixo ponto de ebulio Conduzir os componentes da mistura pela coluna Remover ou dessorver estes componentes do adsorvente (FE)

Cromatografia

SOLVENTES: Polaridade em Ordem Crescente

Hexano < ter de Petrleo < Ciclohexano < Tetracloreto de Carbono < Benzeno < Tolueno <

Diclorometano < Clorofrmio < ter Etlico <

Acetato de Etila < Acetona < Etanol < Metanol < cido Actico

Cromatografia em Coluna

Cromatografia
ADSORO

Usos: a) Laboratrios de qumica orgnica separar e purificar reagentes e materiais obtidos em sntese. b) Laboratrios de produtos naturais escala preparativa e analtica. c) Laboratrios de anlises clnicas separao de esterides de urina ou de sangue, etc.

Cromatografia em Coluna

Cromatografia
PARTIO

Fase Mvel Gasosa Fase Estacionria Lquida

Processos de Solubilidade
O processo de partio intrafacial e a volta de cada

componente para a fase mvel

depende da sua volatilidade.

Cromatografia em Coluna

Cromatografia
PARTIO

Fase Mvel Lquida Fase Estacionria Lquida

Processos de Solubilidade
O processo de partio intrafacial e a volta de cada

componente para a fase mvel

depende da sua solubilidade.

Cromatografia em Coluna
Por volta de 1935 comearam a ser fabricadas resinas de troca inica orgnicas, muito eficientes, passando a constituir um meio qumico de extraordinrio valor em processos analticos.

Cromatografia
TROCA INICA

Fase Mvel Lquida

Fase Estacionria Slida
Processos de Troca Inica Adsoro reversvel e diferencial dos ons da fase mvel pelo grupo trocador da matriz

Cromatografia em Coluna

Cromatografia
TROCA INICA

Fluxo da FM

FE altamente carregada
Maior Interao ons de alta carga

Resinas Catinicas e Aninicas

ons de menor tamanho

A diferena de afinidade entre os ons da FM pode ser controlada por pH e fora inica

Cromatografia em Coluna

Cromatografia

O ajuste do pH proporciona a separao das duas protenas

Cromatografia em Coluna

Cromatografia
EXCLUSO

Fase Mvel Lquida Fase Estacionria em Gel

Enquanto as partculas menores penetram nas cavidades, as maiores vo sendo eludas contornando as estruturas moleculares da FE.

Cromatografia em Coluna

Cromatografia
EXCLUSO

A propriedade que distingue a cromatografia de excluso, introduzida por volta de 1960, de outros tipos de cromatografia que o recheio (FE) um gel no carregado constitudo de macromolculas que tm ligaes cruzadas, com afinidade pelos solventes, mas que neles so insolveis.

- Separao de tamanhos especficos - Separao de polmeros e protenas - Determinao de Massa Molar

Cromatografia em Coluna

Cromatografia
EXCLUSO

-Inrcia Qumica: -Estabilidade:

Caractersticas desejveis para os Gis

No pode haver uma interao qumica entre a matriz e o soluto.

O gel deve suportar uso contnuo quanto mantido em condies brandas de temperatura e pH.

-Baixo teor de ons:

Grupos carregados interferem no processo de separao.

Cromatografia em Coluna

Cromatografia
EXCLUSO

Fluxo da FM

Tipos de Gis
Dextrano (Sephadex) Poliacrilamida gar e Agarose

Cromatografia em Coluna

Cromatografia
AFINIDADE

Fase Mvel Lquida Fase Estacionria Slida Propriedades

Biolgicas e
Funcionais

Cromatografia
Teoria Bsica SOLUTO Sem importncia na CG, mas com grande importncia na CLAE

FASE MVEL

FASE ESTACIONRIA

Cromatografia
Teoria Bsica
Coluna cromatogrfica: srie de estgios independentes onde acontece o equilbrio entre o analito dissolvido (sorvido) na fase estacionria e na fase mvel:

Ocorre um quase-equilbrio entre o analito sorvido na FE e dissolvido na FM.

KC

AFE AFM

Afinidade pela FE

[A]FE

MENOR RETENO !!!

KC = Constante de Distribuio
[A]FE = concentrao do analito na FE [A]FM = concentrao do analito na FM

Volatilidade

[A]FM

Cromatografia
Quantificao da eficincia
Supondo a coluna cromatogrfica como uma srie de estgios separados onde ocorre o equilbrio entre o analito, a FE e a FM:

O nmero de pratos tericos de uma coluna (N) pode ser calculado por:

Cada estgio de equilbrio chamado de PRATO TERICO

tR wb

Coluna mais eficiente

Cromatografia
Quantificao da eficincia ALTURA EQUIVALENTE A UM PRATO TERICO (H)
Valores tpicos de H e N:
dC 0,10 0,25 0,32 0,32 0,32 0,32 0,53 0,53 2,16 2,16 df 0,25 0,25 0,32 0,50 1,00 5,00 1,00 5,00 10% 5% H 0,081 0,156 0,200 0,228 0,294 0,435 0,426 0,683 0,549 0,500 N 370370 192308 150000 131579 102041 68966 70423 43924 3643 4000

Tamanho de cada estgio de equilbrio

(L = comprimento da coluna)
Capilares, L = 30 m
dc = dimetro da coluna em mm df = espessura da fase estacionria em mm

Empacotadas, L = 2 m

Valores de H para colunas capilares e empacotadas so prximos, mas como L para capilares MUITO maior tipicamente elas so mais eficientes

Cromatografia
Cromatografia em fase gasosa
Fase estacionria

Deteco

Fase mvel

Separao

Cromatografia
Cromatografia em fase gasosa
Injetor: submetido temperatura controlada
Fase mvel: gs inerte

Detector: submetido temperatura controlada

Coluna: contendo a fase estacionria est submetida temperaturas controladas

Cromatografia Gasosa
Aplicabilidade
Quais misturas podem ser separadas por CG ?
para uma substncia qualquer poder ser arrastada por um fluxo de um gs ela deve dissolver-se, pelo menos parcialmente, nesse gs.

Misturas cujos constituintes sejam VOLTEIS (=evaporveis)

DE FORMA GERAL: CG aplicvel para separao e anlise de misturas cujos constituintes tenham PONTOS DE EBULIO de at 300oC e que sejam termicamente estveis.

Cromatografia Gasosa
Requisitos - Gs de arraste (FM)
INERTE: No deve reagir com a amostra, nem com a fase estacionria ou superfcies do instrumento.

PURO: Deve ser isento de impurezas que possam degradar a fase estacionria.

Impurezas tpicas em gases e seus efeitos:

H2O, O2 hidrocarbonetos

oxida / hidrolisa algumas FE incompatveis com DCE rudo no sinal de DIC

Cromatografia Gasosa
Requisitos - Gs de arraste (FM)
CUSTO: Gases de altssima pureza podem ser muito caros.
CUSTO

A = 99,995 % (4.5)
B = 99,999 % (5.0) C = 99,9999 % (6.0)

PUREZA

COMPATVEL COM DETECTOR: Cada detector demanda um gs de arraste especfico para melhor funcionamento.
Seleo de Gases de Arraste em Funo do Detector:
DCT DIC DCE He , H2 N2 , H2 N2 (SS), Ar + 5% CH4

Cromatografia Gasosa
Injetor
Os dispositivos para injeo (INJETORES ou VAPORIZADORES) devem prover meios de introduo INSTANTNEA da amostra na coluna cromatogrfica
t = 0

Injeo instantnea:
t = x

t = 0

Injeo lenta:
t = x

Cromatografia Gasosa
Injetor on column
1
2 3 4 1 - Septo (silicone) 2 - Alimentao de gs de arraste) 3 - Bloco metlico aquecido 4 - Ponta da coluna cromatogrfica

Cromatografia Gasosa
Injetor on column
1 - Ponta da agulha da microsseringa introduzida no incio da coluna. 2 - Amostra injetada e vaporizada instantaneamente no incio da coluna. 3 - Plug de vapor de amostra forado pelo gs de arraste a fluir pela coluna.

Cromatografia Gasosa
Parmetros de injeo
TEMPERATURA DO INJETOR: Deve ser suficientemente elevada para que a amostra vaporize-se imediatamente, mas sem decomposio.

Regra Geral: Tinj = 50oC acima da temperatura de ebulio do

componente menos voltil.

VOLUME INJETADO: Depende do tipo de coluna e do estado fsico da amostra.

Slidos: convencionalmente se dissolve em um solvente adequado e injeta-se a soluo
COLUNA

Amostras Lquidas
0,2 mL ... 20 mL

Amostras Gasosas
0,1 mL ... 50 mL

empacotada = 3,2 mm (1/4) capilar = 0,25 mm

0,01 mL ... 3 mL

1 mL ... 100 mL

Cromatografia Gasosa
Microsseringas para injeo
LQUIDOS: Capacidades tpicas: 1 mL, 5 mL e 10 mL
mbolo agulha (inox 316)

Microsseringa de 10 m L:
corpo (pirex) corpo agulha

Microsseringa de 1 m L (seo ampliada):

guia mbolo (fio de ao soldado ao guia)

Cromatografia Gasosa
Colunas
EMPACOTADA = 3 a 6 mm L = 0,5 m a 5 m

Recheada com slido pulverizado (FE slida ou FE lquida depositada sobre as partculas do recheio)
CAPILAR = 0,1 a 0,5 mm L = 5 m a 100 m

Paredes internas recobertas com um filme fino (frao de mm) de FE lquida ou slida

Cromatografia Gasosa
Temperatura da coluna
Alm da interao com a FE, o tempo que um analito demora para percorrer a coluna depende de sua PRESSO DE VAPOR (p0). Estrutura qumica do analito

p0 = f

Temperatura da coluna

Temperatura da coluna

Presso de vapor

Velocidade de migrao

ANALITO ELUI MAIS RAPIDAMENTE (MENOR RETENO)

Cromatografia Gasosa
Temperatura da coluna
AUMENTO DA TEMPERATURA DA COLUNA

CONTROLE CONFIVEL DA TEMPERATURA DA COLUNA ESSENCIAL PARA OBTER BOA SEPARAO EM CG

Cromatografia Gasosa
Programao linear de temperatura
Misturas complexas (constituintes com volatilidades muito diferentes) separadas ISOTERMICAMENTE:
TCOL BAIXA: TCOL ALTA:

- Componentes mais volteis so separados - Componentes menos volteis demoram a eluir, saindo como picos mal definidos

- Componentes mais volteis no so separados - Componentes menos volteis eluem mais rapidamente

Cromatografia Gasosa
Programao linear de temperatura
A temperatura do forno pode ser variada linearmente durante a separao:
TEMPERATURA
TFIM

R
TINI

tINI

TEMPO

tFIM

Consegue-se boa separao dos componentes da amostra em menor tempo

TINI - Temperatura Inicial TFIM - Temperatura Final tINI - Tempo Isotrmico Inicial tFIM - Tempo Final do Programa R - Velocidade de Aquecimento

Cromatografia Gasosa

Programao linear de temperatura

a) Isotrmico a 45 C; b) isotrmico a 145 C; c) programado de 30 C a 180 C

Cromatografia Gasosa
Programao linear de temperatura
Possveis problemas associados PLT:
VARIAES DE VAZO DO GS DE ARRASTE: A

viscosidade de um gs aumenta com a temperatura.

viscosidade

vazo

DERIVA (DRIFT) NA LINHA DE BASE: Devido ao

aumento de volatilizao de FE lquida

Cromatografia Gasosa
Fase Estacionria
REGRA GERAL: a FE deve ter caractersticas tanto quanto possvel prximas das dos solutos a serem separados (polar, apolar, aromtico ...)

FE SELETIVA (ideal): Deve interagir diferencialmente com os componentes da amostra.

FE Seletiva: separao adequada dos constituintes da amostra

FE pouco Seletiva: m resoluo mesmo com coluna de boa eficincia

Cromatografia Gasosa
Fase estacionria slida
O fenmeno fsico-qumico responsvel pela interao analito + FE slida a ADSORO
A adsoro ocorre na interface entre o gs de arraste e a FE slida

Slidos com grandes reas superficiais (partculas finas, poros) ADSORO

Solutos polares
Slidos com grande nmero de stios ativos (hidroxilas, pares de eltrons...)

Cromatografia Gasosa
Fase estacionria lquida
O fenmeno fsico-qumico responsvel pela interao analito + FE lquida a ABSORO
A absoro ocorre no interior do filme de FE lquida (fenmeno INTRAfacial) Filmes espessos de FE lquida Grande superfcie lquida exposta ao gs de arraste Interao forte entre a FE lquida e o analito (grande solubilidade)

ABSORO

Cromatografia Gasosa
Fase estacionria quirais
As propriedades fsico-qumicas dos ismeros ticos so MUITO SIMILARES FE convencionais no interagem diferencialmente com os ismeros ticos.

PRODUTOS BIOLGICOS - Distino

entre produtos de origem sinttica e natural (natural = normalmente substncias oticamente puras; sinttico = muitas vezes so misturas racmicas).

FRMACOS - Em

muitos frmacos apenas um dos ismeros ticos tm atividade farmacolgica.

Cromatografia Gasosa
Detectores
Dispositivos que examinam continuamente o material eludo, gerando sinal quando da passagem de substncias que no o gs de arraste.

Caractersticas ideais: 1. Alta sensibilidade: 10-8 a 10-15 g de soluto/s. 2. Boa estabilidade e reprodutibilidade. 3. Resposta linear para solutos que se estenda por vrias ordens de grandeza. 4. Faixa de temperatura desde a ambiente at pelo menos 400 C. 5. Tempo de resposta curto e independente da vazo. 6. Alta confiabilidade e facilidade de uso. 7. Similaridade de resposta para todos os solutos. 8. No destrutivo.

Cromatografia Gasosa
Detectores
REGISTRO DE SINAL
ANALGICO Registradores XY DIGITAL Integradores Computadores

Idealmente: cada substncia separada aparece como um PICO no cromatograma.

Grfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMA

Cromatografia Gasosa
Detectores
DCT DCE DNP

Geram sinal para qualquer substncia eluda.

UNIVERSAIS:

Detectam apenas substncias com determinada propriedade fsico-qumica.

SELETIVOS:

Detectam substncias que possuam determinado elemento ou grupo funcional em suas estruturas

ESPECFICOS:

Cromatografia Gasosa
Detectores - Funcionamento
DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TRMICA (DCT OU TCD): Variao da condutividade trmica do gs de arraste.

DETECTOR POR IONIZAO EM CHAMA (DIC OU FID):

ons gerados durante a queima dos eluatos em uma chama de H2 + ar.

DETECTOR POR CAPTURA DE ELTRONS (DCE OU ECD):

Supresso de corrente causada pela absoro de eltrons por eluatos altamente eletroflicos.

DETECTOR TERMOINICOS (DNP OU NPD): Modificao do DIC. Os eluatos queimados na chama H2 + ar passam por

uma superfcie de silicato de rubdio onde se formam ons de molculas com N e P.

Cromatografia Gasosa
Detectores Limites de deteco
DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TRMICA (DCT OU TCD): Universal. Observa-se para qualquer substncia eluda. Sensibilidade: 0,4 a 1 ng com linearidade at dezenas de mg (104). DETECTOR POR IONIZAO EM CHAMA (DIC OU FID): Quase-universal. Detecta qualquer substncia que contenha ligaes C-H. No responde a gases nobres, H2, O2, N2, CX4, SiX4 (X=halognio), CO, CO2, CS2, H2O, NO, N2O, NO2, NH3. Sensibilidade: 10 a 100 pg com linearidade at mg (107 108). DETECTOR POR CAPTURA DE ELTRONS (DCE OU ECD): Seletivo. Responde muito bem a halogenetos orgnicos, aldedos conjugados, nitrilas, nitratos e organometlicos. Sensibilidade: 0,01 a 1 pg com linearidade at ng. (104) DETECTOR TERMOINICO (DNP OU NPD): Especfico. Responde a compostos orgnicos com N e P. Sensibilidade: 0,1 a 1 pg (P) e 0,4 a 10 pg (N) com linearidade at ng. (103 - 105)

Cromatografia Gasosa
Detectores Espectrometria de massas
CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Especfico. Um dos detectores mais poderosos para a cromatografia gasosa o espectrmetro de massas. Observa-se para qualquer substncia eluda um sinal, mesmo que complexo, no espectrmetro de massa. seletivo ou especfico quando monitora-se um fragmento de determinada razo m/z.

Deteco

TIC
Universal Similar a DCT

SIM
Seletivo Maior Sensibilidade

Cromatografia Gasosa
Detectores Espectrometria de massas
CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Especfico.

Em cada posio do cromatograma tem-se um espectro de massa.

CONTAGENS

CONTAGENS

Cromatograma de ons totais: TIM ou TIC

MASSA / CARGA

TEMPO

Cromatografia Gasosa
Detectores Espectrometria de massas
CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Especfico.

Em cada posio do cromatograma tem-se o sinal somente da m/z selecionada. Oferece a vantagem de registrar somente o sinal do constituinte de interesse, sendo cego para os demais.

CONTAGENS

Cromatograma de ons selecionados: SIM

MASSA / CARGA

CONTAGENS

TEMPO

Cromatografia Gasosa
Detectores Espectrometria de massas
CG-EM (GC-MS): Interface CG-EM.
Cmara de Ionizao

CG

EM

Coluna Capilar

Vcuo
Separador Molecular O gs de arraste leve (He) difunde mais rapidamente que o analito e tende a ser drenado para o vcuo.

Interface Capilar Direta Com colunas capilares a vazo baixa de gs de arraste pode ser drenada pelo sistema de vcuo.

Cromatografia Gasosa
Anlise qualitativa
O parmetro diretamente mensurvel de reteno de um analito o

TEMPO DE RETENO AJUSTADO, tR: tR

tR = tR - tM
SINAL

tR = Tempo de Reteno (tempo decorrido entre a injeo e o pice do pico cromatogrfico) tM = Tempo de Reteno do Composto No-Retido (tempo mnimo para um composto que no interaja com a FE atravesse a coluna)

tM

TEMPO

tR = Tempo de Reteno Ajustado (tempo mdio que as molculas do analito passam sorvidas na FE)

Cromatografia Gasosa
Anlise qualitativa
Coluna HP-Innowax (PEG altamente polar): 30 m x 0,25 mm x 0,25 mm Detector FID: 250 C Injetor com diviso de fluxo 1:25: 250 C Volume injetado: 1 mL

Mistura de benzeno, n-propanona, n-propanol, n-butanol, isobutanol e n-pentanol.

Como se explica esta ordem de eluio?

1. A n-propanona elui primeiro devido sua maior volatilidade. 2. O benzeno em segundo devido sua natureza apolar (menor e). 3. Para os demais compostos, cujas diferenas de polaridade no so elevadas, a volatilidade se torna o principal parmetro que define a ordem de eluio.

Cromatografia Gasosa
Anlise quantitativa
O parmetro diretamente relacionado quantidade de analito :

Altura da banda cromatogrfica: no recomendado, pois a banda necessita ser perfeitamente simtrica. rea da banda cromatogrfica.

SINAL

rea

Altura

TEMPO

Cromatografia Gasosa
Anlise quantitativa

amostra

rea

Concentrao

tempo

Cromatografia Gasosa
Anlise quantitativa
A partir de certo ponto o sinal no aumenta mais linearmente

REA

O fim da zona de linearidade pode ser detectado quando a razo (rea / Massa) diverge em mais de 5 % da inclinao da reta na regio linear:

REA / MASSA

MASSA

1,05 S

0,95 S MASSA

Cromatografia Gasosa
Anlise quantitativa
rea Concentrao Adicionada
tempo

concentrao na amostra
amostra

Cromatografia Lquida
Cromatografia em fase lquida

Cromatografia Lquida - CLAE

Aplicabilidade
Quais misturas podem ser separadas por CLAE ?
para uma substncia qualquer poder ser arrastada por um lquido ela deve dissolver-se nesse lquido.

Lquidos e slidos, inicos ou covalentes com massa molar de 32 at 4000000.

DE FORMA GERAL: CL aplicvel para separao e anlise de misturas cujos constituintes sejam solveis na FM. No h limitao de volatilidade ou de estabilidade trmica.

Cromatografia Lquida
Aumento de polaridade

Insolvel em gua Apolar

Solvel em gua Inico

Tipos e Aplicaes da Lquida

Massa molecular
102

Polar no inico
Partio

Cromatografia

Adsoro
103

Partio em fase reversa

Partio em fase normal

Troca inica

104 Permeao em gel

105

Excluso

Filtrao em gel

106

Cromatografia Lquida
Componentes tpicos - CLAE

Cromatografia Lquida
Esquema de um equipamento para CLAE

Cromatografia Lquida
Requisitos dos sistemas de bombeamento
1 Gerao de presses at 6.000 psi 2 Sada com ausncia de pulsos

3- Velocidades de fluxo de 0,1 a 10 mL/min

4 Controle e reprodutibilidade de fluxo de 0,5% ou melhor 5 Componentes resistentes corroso

Bomba recproca (tambm so chamadas de bombas de pisto ou de diafragma)

Cromatografia Lquida
Sistemas de injeo de amostras

Suportam presses de at 7.000 psi Volumes tpicos: 5 a 500 mL

Microamostragem: 0,5 a 5 mL

Cromatografia Lquida
Fase mvel para CLAE
Solvente puros ou misturas de solventes de acordo com a polaridade requerida na separao. Eluio isocrtica:
Quando a separao feita utilizando um nico solvente de composio constante. So utilizados dois ou trs sistemas de solventes que diferem bastante entre si em polaridade. Depois que a eluio comea, a razo entre os solventes variada de modo programado, de forma contnua ou em passos.

Eluio com gradiente:

A eluio com gradiente produz efeitos similares aos produzidos pela programao de temperatura na CG.

Cromatografia Lquida
Eluio com gradiente
Coluna C18, 5 mm, fase reversa Detector fluorescncia: excit. 334 nm emis. 425 nm

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Colunas para CLAE
As colunas geralmente so construdas de ao inox, embora tubos de vidro com paredes resistentes sejam encontrados ocasionalmente. No entanto, estes ltimos so restritos a presses mais baixas do que 600 psi. Existem comercialmente centenas de colunas empacotadas, diferindo entre si no tamanho e na fase estacionria. Preos variam de 200 a 500 dlares.

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Colunas para CLAE
Remoo de material particulado

Pr-coluna

Contaminantes do solvente Contaminantes da amostra Saturar a FM com a FE

Aumenta a vida til da coluna

COLUNAS TPICAS Material: ao inox Comprimento: 10 a 30 cm

Dimetro: 4 a 10 mm
FE: Partculas de 5 a 10 mm Eficincia: 40 mil a 60 mil pratos/metro

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Separao isocrtica de alta velocidade
Coluna de alta velocidade e alta eficincia
- 4 cm de comprimento - 0,4 cm d.i. - FE: spherisorb 3 mm

100.000 pratos/metro

FM: 4,1% EtAc em n-Hexano

1 p-xileno 2- anisol 3- acetato de benzila

4- dioctil-ftalato
5- dipentil-ftalato 6- dibutil-ftalato

7- dipropil-ftalato
8- dietil-ftalato

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Fase estacionria para CLAE
Basicamente so dois tipos de FE: Pelicular: Consiste de leitos de polmero ou vidro no-poroso, esfrico, com dimetros tpicos da ordem de 30 a 40 mm, recoberto com uma camada fina e porosa de: Slica Alumina Resina de poliestireno-divinil-benzeno Resina trocadora de ons Partcula porosa: Consiste de micropartculas porosas com dimetros de 3 a 10 mm. As partculas so constitudas dos mesmos materiais do recobrimento pelicular.

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As caractersticas desejveis para os detectores para CLAE no so diferentes daquelas para CG. Existem dois tipos de detectores:
Propriedades universais (ndice de refrao, densidade ou constante dieltrica). Propriedades do soluto (absorbncia, fluorescncia, etc).

Detectores

Caractersticas ideais:

1.Alta sensibilidade: 10-8 a 10-15 g de soluto/s. 2.Boa estabilidade e reprodutibilidade. 3.Resposta linear para solutos que se estenda por vrias ordens de grandeza. 4.Tempo de resposta curto e independente da vazo. 5.Alta confiabilidade e facilidade de uso. 6.Similaridade de resposta para todos os solutos. 7.No destrutivo. 8.Volume interno mnimo e compatvel com a vazo e com a presso.

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Detectores
Absorbncia
UV/Vis S: 10-9 g/mL FL: 105 IV

Fluorescncia S: 10-9 a 10-12 g/mL FL: 103 ndice de refrao (universal)

S: 10-7 g/mL FL: 104

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Detectores
Eletroqumicos: existem vrios tipos disponveis atualmente. Embora no sejam to explorados quanto os detectores pticos, eles apresentam algumas vantagens como alta sensibilidade, simplicidade e ampla aplicabilidade.
Amperomtricos Coulomtricos Condutomtricos S: 10-8 g/mL FL: 104 Polarogrficos S: 10-12 g/mL FL: 106

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Detectores
Espectrometria de massa - universal
Assim como na CG-EM, o acoplamento de um espectrmetro de massa potencializa a tcnica de separao e quantificao Um grande problema o descompasso entre os volumes relativamente grandes de solventes na CL e os requisitos de vcuo na EM. Interface CL-EM

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Detectores
Espectrometria de massa
CONTAGENS

TIC

SIM
CONTAGENS

CONTAGENS

MASSA / CARGA

CONTAGENS

MASSA / CARGA

TEMPO TEMPO

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Tipos de CLAE

Ao contrrio da CG, onde a FM se comporta como um gs ideal e no contribui para o processo de separao, a FM lquida da CLAE interage tanto quanto a FE com os componentes da amostra.
Isto torna o desenvolvimento dos mtodos em CLAE um tanto mais complexo que na CG.

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Tipos de CLAE
PARTIO: lquido-lquido e fase ligada. A diferena entre elas consiste em como a FE mantida nas partculas do suporte do empacotamento Adsoro e ligao qumica. Dois tipos podem ser distinguidos: Fase normal e Fase reversa. Fase normal: FE de natureza fortemente polar (ex. gua) FM apolar (ex. hexano ou ter isoproplico) O componente menos polar eludo primeiro por ser o mais solvel na fase mvel. Fase reversa: FE de natureza apolar (ex. hidrocarbonetos) FM polar (ex. gua, metanol ou acetonitrila) O componente mais polar aparece primeiro e o aumento da polaridade da fase mvel aumenta o tempo de eluio.

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Tipos de CLAE
provvel que de toda a CLAE esteja baseada na fase reversa ligada, onde o grupo R do siloxano nesses recobrimentos uma cadeia C8 (n-octil) ou C18 (n-octadecil)

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Campo
Farmacutico Bioqumico Produtos alimentcios Produtos qumicos Poluentes Qumica forense Clnica mdica

Tipos de CLAE Misturas tpicas

Antibiticos, sedativos, esterides, analgsicos Aminocidos, protenas, carboidratos, lipdios Adoantes artificiais, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos Aromticos condensados, surfactantes, propelentes, corantes industriais Pesticidas, herbicidas, fenis, PCB (bifenilas policloradas) Drogas txicas, venenos, lcool no sangue, narcticos cidos de blis, metablitos de drogas, extratos de urina, estrgenos

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Tipos de CLAE
ADSORO: lquido-slido. FE slica ou alumina. a forma clssica da CL introduzida no incio do sculo 20. Sofreu adaptaes e tornou-se o mais importante dos mtodos de HPLC. TROCA INICA: lquido-slido. FE resina com capacidade de troca inica. EXCLUSO: lquido-gel. FE gel. Um material polimrico, hidrofbicos ou hidroflicos, com muitas ligaes cruzadas, so capazes de promover a separao de acordo com os tamanhos das molculas EXCLUSO DE TAMANHO. Se o material reticulado for uma resina de troca inica, tem-se a cromatografia de EXCLUSO DE ONS.

Cromatografia

Para refletir e responder: Duas substncias diferentes com a mesma concentrao apresentaro a mesma rea sob suas bandas cromatogrficas?
Para um mesmo analito, a rea ou altura aumentam com o aumento da concentrao. A rea sob a banda cromatogrfica de duas substncias diferentes depender da resposta do detector para aquele tipo de substncia, independentemente do tipo de detector utilizado.

Cromatografia

Para refletir e responder: A CG pode ser usada indistintamente para qualquer tipo de analito? A CL til quando a CG no pode ser usada. Quais so os casos em que isto ocorre?

FIM