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Revista Analytica

Abril/Maio 2008

N34
TRANSFERNCIA DE MTODO HPLC PARA
U-HPLC DE MAIOR RESOLUO E RAPIDEZ
RESUMO
A necessidade de analisar um nmero crescente de amostras em um pequeno intervalo
de tempo vem impulsionando desenvolvimentos tecnolgicos na rea de instrumenta-
o analtica para laboratrio. Colunas preenchidas com partculas de tamanho peque-
no (sub-2 m) foram desenvolvidas para aplicao em anlises de HPLC. O emprego
de partculas pequenas nas separaes cromatogrficas resulta em maior eficincia, o
que possibilita a reduo dos tempos de anlise.
Este trabalho apresenta uma metodologia simples para transferir as condies croma-
togrficas de uma anlise convencional de HPLC, para uma anlise rpida de U-HPLC
(Ultra High Performance Liquid Chromatography), levando em conta o tamanho da
partcula, o dimetro interno da coluna e seu comprimento. A anlise por HPLC do
ibuprofeno e substncias relacionadas, segundo a Farmacopia Europia, foi transferida
para U-HPLC, com o objetivo de reduzir o tempo de anlise e manter a resoluo cro-
matogrfica. Foi alcanada uma reduo de oito vezes no tempo de anlise, enquanto
que a resoluo crtica entre um par de impurezas foi mantida e o consumo de solvente
foi reduzido em quatorze vezes.
Palavras-chave: U-HPLC, cromatografa a lquido de ultra-alto desempenho, converso de
mtodo, tamanho de partcula sub-2-micra, ibuprofeno
SUMMARY
The needs to analyze an increasingly number of samples in a short time period have
been stimulating technological developments in the analytical instrumentation area.
Columns packed with sub-2-micron particles have been developed to be used in HPLC
analysis. Small particles provide very high efficiencies which enable very fast run ti-
mes.
This paper presents a practical guideline on scaling down separations by taking into
account particle size, column ID, and column length. The European Pharmacopoeia
(EP) HPLC method for ibuprofen and related substances was transferred to U-HPLC
to reduce analysis time while maintaining chromatographic integrity. The analysis time
was reduced by eight fold, resolution of a critical pair of impurities is maintained and
solvent consumption was reduced by fourteen fold.
Keywords: u-hplc method conversion, ultra high performance liquid chromatography, sub-
2-micron particle size, ibuprofen
Luisa Pereira*
Thermo Fisher Scientifc, Run-
corn, UK
*Correspondncia:
Nova Analtica Imp. Exp. Ltda.
R. Assungui, 432
CEP: 04131-000
So Paulo. SP
Fone: (11) 2162-8080
Fax: (11) 2162-8081
E-mail:
analitica@novanalitica.com.br
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INTRODUO
A cromatografa a lquido de alto desempenho (HPLC)
tem-se afrmado nas ltimas dcadas como uma tcnica alta-
mente vantajosa na quantifcao de diversos compostos, em
diferentes matrizes. Compostos de alta ou baixa massa mole-
cular, polmeros ou biopolmeros (protenas) podem ser ana-
lisados por HPLC, devido ao grande nmero de combinaes
possveis entre a fase mvel e a fase estacionria. Entretanto,
os tempos das anlises por HPLC convencional normalmente
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so superiores a 10 min. Colunas empacotadas com partculas
de dimetro sub-2 m oferecem vantagens sobre as colunas
tradicionais com partculas de 3 e 5 m, como menor tempo
de anlise, maior resoluo e maior capacidade de picos (1).
Conforme j demonstrado por Knox e outros autores
(2-5), partculas pequenas induzem um aumento da efcin-
cia, da velocidade tima da fase mvel e da transferncia de
massa. Assim, separaes efcientes podem ser alcanadas em
menores tempos de anlise, quando so empregadas colunas
com partculas de dimetro sub-2 m. As partculas sub-2 m
podem ser empregadas com duas fnalidades: realizar anlises
rpidas e ultra-rpidas, uma vez que uma boa efcincia pode
ser mantida, mesmo com colunas curtas e alta velocidade li-
near da fase mvel, e resolues mais altas podem ser alcan-
adas com colunas mais longas e velocidade da fase mvel
prxima aos valores timos.
A transferncia de um mtodo com coluna convencio-
nal para coluna com partculas de dimetro sub-2 m pode
levar em conta as diferentes necessidades analticas. Se as di-
menses da coluna so mantidas e somente o tamanho da
partcula reduzido, melhorias na efcincia, na resoluo e
na capacidade de picos so obtidas. Se alm da reduo no
tamanho da partcula, as dimenses da coluna tambm forem
reduzidas, o tempo de anlise tambm ser menor. Em am-
bos os casos, a vazo, o perfl do gradiente e o volume de
amostra injetado devem ser ajustados adequadamente.
Este trabalho apresenta orientaes prticas de como
transferir um mtodo de HPLC convencional para HPLC com
partculas sub-2 m, levando em conta o tamanho da partcu-
la, o dimetro interno da coluna e o comprimento da coluna.
A amostra empregada para demonstrar o procedimento de
transferncia de mtodo foi ibuprofeno e seis impurezas. Ibu-
profeno um frmaco do grupo dos antiinfamatrios no es-
terides, utilizado como analgsico e antitrmico. O mtodo
HPLC de anlise do ibuprofeno, com coluna de 150x4,6 mm,
5 m, foi adaptado a partir do mtodo ofcial da Farmacopia
Europia, e rotinas de clculos simplifcadas foram emprega-
das para transferir as condies convencionais para colunas
de 100x2,1 mm e 50x2,1 mm, empacotadas com partculas de
1,9 m. Tambm apresentada neste trabalho uma otimiza-
o do mtodo, para alcanar menores tempos de anlise.
PARTE EXPERIMENTAL
Colunas empregadas
Coluna I: Hypersil GOLD de 150x4,6 mm, 5 m;
Coluna II: Hypersil GOLD de 100x2,1 mm, 1,9 m;
Coluna III: Hypersil GOLD de 50x2,1 mm, 1,9 m
(Thermo Scientifc).
O sistema de HPLC rpida (U-HPLC) empregado foi o
Accela High Speed LC (Thermo Scientifc).
Mtodo original

Transferncia de mtodo
Para transferir o mtodo para a coluna de geometria
menor, empacotada com partculas de 1,9 m (colunas II e
III) e garantir a equivalncia cromatogrfica, necessrio
diminuir proporcionalmente a vazo, o volume injetado e
o gradiente:
Etapa 1. Ajuste da vazo (a velocidade linear deve ser
mantida a mesma nos dois mtodos, o original e o novo):
F
1
= vazo original (mL/min)
F
2
= nova vazo (mL/min)
d
c1
= dimetro interno da coluna original (mm)
d
c2
= novo dimetro interno da coluna (mm)
d
p1
= tamanho da partcula (m)
d
p2
= novo tamanho da partcula (m)
Etapa 2. Ajuste do volume de injeo
V
i1
= volume original de injeo (L)
V
i2
= novo volume de injeo (L)
d
c1
= dimetro interno da coluna original (mm)
d
c2
= novo dimetro interno da coluna (mm)
L
1
= comprimento original da coluna (mm)
L
2
= novo comprimento da coluna (mm)
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Coluna 150x4,6 mm, 5 m
Fase mvel
A: 0,05% H
3
PO
4
em H
2
O / ACN
(66:34) B: ACN
Gradiente
0 a 25 min 0% B, 55 min 85% B,
85% B por 15 min
Vazo 1 mL/min
Volume
injetado
10 L
Temperatura 30C
Deteco UV em 214 nm
Amostra
(Ibuprofeno e impurezas):
1. Impureza K; 2. Impureza D; 3.
Impureza C; 4. Ibuprofeno;
5. Impureza A; 6. Impureza B;
7. Impureza E.
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Etapa 3. Ajuste do perfl do gradiente
O mtodo original (coluna 150x4,6 mm, 5 m) tem
trs segmentos, um isocrtico com 100% de A por 25
min, seguido por um gradiente linear at 85% de B du-
rante 30 min e um segmento final isocrtico de 15 min
com 85% de B. Para transferir estas condies para as
colunas II e III, necessrio calcular a razo entre o
volume de fase mvel e o volume da coluna em cada
segmento do mtodo original:
Clculo do volume de fase mvel, a partir da vazo e da
durao de cada segmento:
Para o segmento 1
Volume de fase mvel = vazo x durao do segmento
Volume de fase mvel = 1 mL/min x 25 min = 25 mL
Clculo do volume da coluna do mtodo original.
Vc = 0,68 x x r
2
x L

onde: Vc = volume da coluna em mL
L = comprimento da coluna (cm)
r = raio da coluna (cm)
valor 0,68 = fator que corrige o volume da coluna,
levando em conta seu volume morto (void volume)
Vc
1
= 0,68 x 3,14 x 0,23 x 15 = 1,7 mL
Clculo da razo (R) entre os volumes de Fase mvel
e da coluna
R = 25 mL / 1,7 mL = 14,7
No mtodo com coluna 100x2,1 mm, 1,9 m , os segmen-
tos precisam ter a mesma razo R para manter a integridade
cromatogrfca:
A partir da razo R (calculada acima) e do volume da co-
luna 100x2,1 mm, o volume de fase mvel em cada segmento
da U-HPLC deve ser calculado:
Para o segmento 1
Volume de fase mvel = R x volume da coluna
100x2,1 mm
Volume de fase mvel = 14,7 x 0,23 mL
Volume de fase mvel = 3,38 mL
A partir do volume de fase mvel em cada segmento e da
vazo (calculado na etapa 1), a durao de cada segmento da
U-HPLC deve ser calculada em unidade de tempo.
Para o segmento 1
Durao do segmento = Volume de Fase mvel / vazo
Durao do segmento = 3,38 mL / 0,55 mL/min = 6,1 min
A Tabela 1 apresenta os clculos de transferncia do mtodo
original com coluna de 150x4,6 mm, 5 m, para os mtodos rpi-
dos com colunas de 100x2,1 mm, 1,9 m e 50x2,1 mm, 1,9 m.
Com o emprego de colunas pequenas e gradientes rpidos, o
volume morto (dwell volume) passa a ser bastante signifcativo e
a afetar o tempo gasto para o gradiente alcanar o topo da colu-
na. No considerar o volume morto na transferncia de mtodo
com gradiente pode resultar em discrepncia na composio da
fase mvel, o que pode levar a diferenas na seletividade, princi-
palmente para os picos com tempos de reteno menores. Um
calculador automtico, disponvel no endereo eletrnico http://
www.hplctransfer.com, calcula automaticamente um ajuste de
tempo para o perodo isocrtico inicial do novo mtodo.
RESULTADOS
O perfil cromatogrfico do mtodo original e dos m-
todos de U-HPLC rpida, ajustados proporcionalmente
para as colunas menores e empacotadas com partculas de
Mtodo original
Coluna I: 150 x 4,6 mm, 5 m
Vazo: 1 mL/min
Volume da coluna: 1,7 mL
Volume injetado: 10 L
U-HPLC
Coluna II: 100 x 2,1 mm, 1,9 m
Vazo: 0,55 mL/min
Volume da coluna: 0,23 mL
Volume injetado: 1,4 L
U-HPLC
Coluna III: 50 x 2,1 mm, 1,9 m
Vazo: 0,55 mL/min
Volume da coluna: 0,12 mL
Volume injetado: 0,7 L
Razo:
Volume
FM/Volume
coluna
%B
Volume
de Fase
Mvel
(mL)
Tempo de
Gradiente
(min)
Volume
de Fase
Mvel
(mL)
Tempo de
Gradiente
(min)
%B
Volume
de Fase
Mvel
(mL)
Tempo de
Gradiente
(min)
%B
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
14,7 0 25 25 3,5 6,1 0 1,8 3,2 0
32,4 85 55 55 7,8 14,1 85 3,9 7,1 85
41,2 85 70 70 9,9 17,9 85 4,9 8,9 85
Tabela 1. Condies cromatogrfcas para transferncia do mtodo HPLC para U-HPLC. Os parmetros nas colunas verdes so mantidos constantes
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Figura 1. Cromatogramas obtidos com o mtodo HPLC original e com os mtodos transferidos proporcionalmente para U-HPLC. Comparao entre os
tempos de anlise, resoluo USP e presso
1,9 m esto apresentados na Figura 1. A resoluo (USP)
entre os picos 5 e 6 foi aumentada de 1,6 no mtodo
HPLC, para 2,8 no mtodo de U-HPLC rpida com coluna
100x2,1 mm, 1,9 m. Quando o mtodo foi transferido
para a coluna de 50x2,1 mm, 1,9 m, a resoluo entre os
picos 5 e 6 foi mantida, enquanto que o tempo de anlise
foi reduzido por aproximadamente sete vezes. Os dados
de repetibilidade esto apresentados na Tabela 2.
A economia de tempo e de solvente que pode ser al-
canada pela transferncia de um mtodo HPLC para U-
HPLC est ilustrada na Tabela 3. Redues de oito vezes
no tempo de anlise e de 14 vezes no consumo de sol-
Tempo de Reteno (min) rea do pico
Pico Mdia RSD % RSD Mdia RSD % RSD
1 0,526 0,0006 0,116 311247 6001 1,93
2 1,275 0,0004 0,030 366600 8037 2,19
3 2,829 0,0010 0,035 763573 14055 1,84
4 5,098 0,0011 0,021 643375 10063 1,56
5 5,266 0,0011 0,020 383064 8240 2,15
6 5,358 0,0007 0,014 761428 12686 1,67
7 6,499 0,0026 0,039 457633 8570 1,87
Tabela 2. Dados de repetibilidade para 10 injees com o mtodo U-HPLC, na coluna 50x2,1 mm x 1,9 m
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vente foram observadas nas anlises apresentadas neste
trabalho.
O mtodo com a coluna de 50x2,1 mm, 1,9 m foi
otimizado quanto ao tempo de anlise, pelo aumento da
vazo para 1 mL/min, reduo do perodo isocrtico no
incio da anlise e gradiente mais rpido (Figura 2).
CONCLUSO
O mtodo HPLC da Farmacopia Europia para ibu-
profeno e substncias relacionadas foi transferido com
sucesso para U-HPLC no sistema Accela com colunas
Hypersil GOLD de dimetro de partcula 1.9 m.
A transferncia do mtodo foi realizada pela reduo
proporcional da vazo, do volume injetado e do tempo de
gradiente.
O tempo de anlise foi reduzido quatro vezes, com uma
melhoria de 75% na resoluo de um par de impurezas com
separao crtica. Com o emprego de uma coluna ainda mais
curta, o tempo de anlise foi reduzido em oito vezes, com
resoluo constante entre o mesmo par de impurezas.
O mtodo U-HPLC apresentou boa repetibilidade dos
tempos de reteno (% RSD <0,2) e das reas dos picos
(% RSD <2,2). Uma economia considervel de solvente,
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Artigo traduzido por Silvana Pisani (silvana.pisani@novanalitica.com.br) e Fernando Lins (fernando.lins@novanalitica.com.br)
Coluna Hypersil GOLD 1,9 m, 502,1 mm
Fase Mvel
A: 0,05% H
3
PO
4
em
H
2
O / ACN (66:34) B: ACN
Gradiente
Tempo (min) % B
0 0
0,5 0
3 85
Vazo 1,0 mL/min
Volume injetado 0,7 L
Temperatura 30C
Deteco
UV em 214 nm
(0.1 s rise time; 20 Hz).
Figura 2. Anlise mais rpida, em menos de trs minutos. Vazo de 1 mL/min e gradiente otimizado
HPLC U-HPLC U-HPLC
Durao do cromatograma (min) 70 18 9
Durao do cromatograma + re-equilbrio (min) 87 22 11
Economia de tempo - 4 vezes 8 vezes
Solvente gasto por anlise (mL) 87 12 6
Economia de solvente - 7 vezes 14 vezes
Tabela 3. Economia de tempo e de solvente com o mtodo U-HPLC
de at quatorze vezes, tambm foi observada com o m-
todo U-HPLC.
Uma otimizao ulterior do mtodo U-HPLC possibi-
litou a separao do ibuprofeno e de seis impurezas, em
menos de trs minutos.
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R e f e r n c i a s
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