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ETEC PREFEITO ALBERTO FERES

CURSO TCNICO EM QUMICA


MICROBIOLOGIA



Prof. Erika Renato
3 E. T. Q. Turma B



COLIFORMES TOTAIS NA GUA


Data: 04/05/2010
Grupo: Jessica n 19
Luan n 23
Maira n 25
Richard n 29




ARARAS SP

2010

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SUMRIO:

Capa ...................................................................................................................................................................... 1
Sumrio ............................................................................................................................................................... 2

PARTE I TESTE PRESUNTIVO ................................................................................................................ 3
Objetivo
Procedimento
Resultados
Discusso
Concluso

PARTE II TESTE CONFIRMATIVO ....................................................................................................... .. 4
Introduo
Objetivo ............................................................................................................................................. 5
Procedimento
Resultados
Concluso ............................................................................................................................................... 6

PARTE III CONFIRMAO DE COLIFORMES FECAIS .................................................................. 6
Introduo
Objetivo
Procedimento ....................................................................................................................................... 7
Resultados
Concluso ............................................................................................................................................. 8
Referncias Bibliogrficas
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PARTE I TESTE PRESUNTIVO

OBJETIVO:

O teste presuntivo dos coliformes tem como caracterstica e objetivo principal detectar a
presena de coliformes na gua. Nesse procedimento, usamos o caldo lauryl triptose, cuja
concentrao inicial do meio em cada tubo depende do volume das amostras.

A pesquisa de coliformes baseada nas caractersticas do grupo bastonete que produzem
cidos e gs a partir da lactose, fazendo com que seja identificada ou no a presena de coliformes,
devido a presena de gs no tubo de Duran aps 24 horas na estufa bacteriolgica 35 C.

PROCEDIMENTO:

Preparar o meio de cultura (caldo lauryl triptose), utilizando 2,5 g para 70 ml de H2O d. Aps
preparar o caldo em um erlenmeyer de 250 ml, leve-o ao microondas por 30 segundos, tomando
sempre cuidado para que no ocorra desnaturao protica do caldo. Depois que o caldo atingir
temperatura ambiente, verifique e corrija o pH prximo de 7,0 (neutro).

Para incio de nossa pesquisa de coliformes, vamos utilizar 5 tubos de ensaio e mais 5 tubos de
Duran (um tubo de Duran para cada tubo de ensaio). Colocamos o tubo de Duran com a boca para
baixo dentro do tubo de ensaio.

Pipetamos com a pipeta volumtrica 10 ml do caldo e colocamos nos tubos de ensaio, estando
cientes de que no pode haver ar no tubo de Duran, e sim o caldo lauryl triptose, depois disso, tampe o
tubo de ensaio com algodo para que possa ir autoclave. Prepare as pipetas de 10 ml enrolando-as
com jornal e organizando-as na autoclave juntamente com o caldo preparado e pipetado dentro dos
tubos de ensaio.

Depois de esperar o tempo necessrio para a autoclave esterilizar o material a ser trabalhado,
cada grupo trabalhar com uma quantidade da gua coletada ser analisada, nesse caso 10 ml (mas as
anlises devem ser feitas com 20 ml, 10 ml, 1 ml e 0,1 ml para obter o nmero mais provvel de
coliformes levando em considerao a presena de coliformes em determinada quantidade de tubos,
considerando a concentrao). Com o material esterilizado, bancada limpa com lcool etlico 70%,
usando devidamente os EPIs (mscara, luvas, culos de segurana, jaleco etc.) e bico de Bunsen
ligado, vamos comear a preparar o nosso teste presuntivo.

Trabalhando sempre com o material perto do fogo, pipete do copo de Bquer 10 ml da amostra
de gua; passe a pipeta prxima ao fogo; e coloque no tubo de ensaio que j contm o caldo; feche o
tubo; agite-o levemente e guarde-o na estante para tubo de ensaio. Faa o mesmo procedimento nos
outros tubos de ensaio.

Aps a preparao dos tubos de ensaio, higienize a estufa bacteriolgica com lcool etlico 70%,
coloque os tubos de ensaio na estufa 35 C durante 24 horas. Aps esse tempo, faa a leitura dos
tubos, onde encontrar gs dentro do tubo de Duran significa que aquela amostra contm coliformes.
Observe a imagem abaixo com gs no tubo de Duran, resultado positivo para coliformes. Os tubos que
aps 24 horas no deram positivos para coliformes devem ser reincubados durante mais 24 para
fazer uma nova leitura e uma segunda confirmao dos resultados.




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RESULTADOS:

Na leitura, podemos considerar que os tubos de 10 ml, 1 ml e 0,1 ml deram o resultado positivo
para coliformes. Com isso, utilizamos os resultados para saber o Nmero mais Provvel (NMP) de
coliformes em 100 ml de gua, seguindo a tabela de NMP de coliformes, ou estimando pela frmula de
Thomas:

NMP/100 ml = Nmero de tubos positivos . 100 .
ml de tubos negativos . ml de todos os tubos

Os resultados obtidos so:

10 ml 1 ml 0,1 ml
5 + 5 + 0 + NMP = 240 coliformes
5 + 0 + 0 + NMP = 23 coliformes

Comparando os resultados, podemos observar uma grande diferena de coliformes nas
anlises. Isso pode ocorrer por determinados erros, onde so chamados de Erros Determinados, ou
seja, erros que podem ser corrigidos; entre eles podemos citar a contaminao do meio, erro na
tcnica ou at mesmo erro na manipulao ou coleta da amostra.

Porm, os resultados encontrados podem nos mostrar que existem sim coliformes na gua
atravs do teste presuntivo. Agora ser necessrio o teste confirmativo, para confirmar a presena de
coliformes na gua em estudo.

DISCUSSO:

Segue abaixo a tabela de NMP (Nmero mais provvel de coliformes), onde foram encontrados
os nossos resultados:

Nmero de tubos positivos NMP por 100 ml Limite de confiana de 95%
10 ml 1 ml 0,1 ml 100 ml Inferior Superior
5 0 0 23 7 70
5 5 0 240 68 750

CONCLUSO:

Com o teste presuntivo de coliformes, conseguimos observar que realmente existem coliformes
na gua. Porm, no podemos afirmar que esses coliformes so fecais. Com resultado positivo na
deteco de coliformes na gua coletada, vamos para o teste confirmativo para saber se essa gua em
estudo tem a presena de coliformes j que o caldo lauryl triptose no tem o objetivo de inibir o
crescimento de bactrias entricas.

PARTE II TESTE CONFIRMATIVO

INTRODUO:

O grupo de bactrias determinado coliformes totais so aquelas que no causam doenas, visto
que habitam o intestino de animais mamferos inclusive o homem.

As bactrias do grupo coliforme so consideradas os principais indicadores de contaminao
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fecal. O grupo coliforme formado por um nmero de bactrias que inclui os generos Klebsiella,
Escherichia, Serratia, Erwenia e Enterobactria. Todas as bactrias coliformes so gran-negativas
manchadas, de hastes no esporuladas que esto associadas com as fezes de animais de sangue
quente e com o solo. As bactrias coliformes fecais reproduzem-se ativamente a 44,5oC e so capazes
de fermentar o acar.

O uso da bactria coliforme fecal para indicar poluio sanitria mostra-se mais significativo
que o uso da bactria coliforme "total", porque as bactrias fecais esto restritas ao trato intestinal de
animais de sangue quente. A determinao da concentrao dos coliformes assume importncia como
parmetro indicador da possibilidade da existncia de microorganismos patognicos, responsveis
pela transmisso de doenas de veiculao hdrica, tais como febre tifide, febre paratifide, desistiria
bacilar e clera.
OBJETIVO:

O objetivo desse teste confirmativo ter a certeza de que existem coliformes na gua em
estudo, j que o caldo lactosado bile verde brilhante, tem como objetivo de inibir o crescimento e
desenvolvimento de bactrias, porm conservando e selecionando desta forma os coliformes.

PROCEDIMENTO:

Aps a leitura do teste presuntivo, prepare o caldo lactosado bile verde brilhante, pesando 8 g
do meio de cultura e diluindo-o. Corrigir o pH para 7,2 (neutro). Coloque durante 30 segundos no
microondas tomando extremo cuidado para que no derrame o caldo causando uma desnaturao
protica.

Coloque o caldo na autoclave, juntamente com os tubos que deram positivos para a presena
de coliformes no teste presuntivo. Aguarde a esterilizao. Higienize a bancada para que no ocorra
contaminao do meio.

Depois do material esterilizado, procure trabalhar sempre prximo ao fogo. Com a ala de
platina, transfira uma alquota de cada tubo positivo do teste presuntivo para os novos tubos de
ensaio com tubos de Durham com o novo caldo que determinar os coliformes presentes na gua em
estudo.

Incubar os novos tubos com o caldo lactosado bile verde brilhante para o teste confirmativo na
estufa bacteriolgica, durante 48 horas a 35 C. Depois, fazer a leitura como positivos os tubos de
Durham com gs, usando a tabela NMP de coliformes para obteno do resultado de coliformes em
100 ml, ou estimar utilizando a frmula de Thomas.

RESULTADOS:

Os resultados do teste confirmativo esto selecionados abaixo:

10 ml 1 ml Total de tubos
5 + 5 + 10 NMP = 240 coliformes por 100 ml
5 + 0 + 5 NMP = 23 coliformes por 100 ml
OBSERVAO: Nesta anlise, no foram utilizado os tubos de 0,1 ml, pois do teste presuntivo todos
deram negativo para coliformes, e para a confirmao, foram utilizados somente tubos que haviam
obtido o resultado positivo para coliformes no teste anterior.

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Tubo de Durham com resultado positivo para
coliformes.

Resultado positivo para coliformes encontrando
nos tubos de Durham presena de gs (setas).

Com relao anlise do teste presuntivo e do comparativo, podemos observar que o nmero
de coliformes no se alterou. Mas devemos levar em conta que esses so resultados provveis que
podem ter um limite de confiana de 95%. Devemos lembrar tambm que alguns erros do teste
presuntivo ou confirmativo, podem ter ocasionado um resultado ainda menos preciso.

CONCLUSO:

Neste teste confirmativo, conseguimos identificar coliformes na gua em estudo na mesma
quantidade de coliformes por 100 ml no teste presuntivo. Porm, devemos levar em conta o Erro
Determinado que pode ser gerados por vrios fatores citados na primeira parte desse mesmo
relatrio.

PARTE III CONFIRMAO DE COLIFORMES FECAIS

INTRODUO:

Um outro grupo de bactrias freqentemente relacionado gua o grupo dos coliformes. Os
coliformes fecais vivem no intestino dos animais como bois, porcos, cachorros, gatos, homens etc, sem
lhes causar prejuzos. Eles so adquiridos quando penetram pela pele ou quando so ingeridos
juntamente com a gua ou alimentos contaminados e so constantemente liberados em grande
quantidade, junto com as fezes.

Quando se faz a anlise da gua e se encontra contaminao por coliformes fecais significa que
naquele local houve descarga de esgoto em perodo recente, o que aumenta a probabilidade de haver
ali ovos e larvas de parasitas intestinais, visto que, estas formas tambm podem ser eliminadas com as
fezes.

Desse modo, a presena de coliformes fecais, que so mais facilmente detectveis em exames
de rotina de laboratrio do que as formas parasitrias, indica que a gua no deve ser utilizada,
porque h um risco aumentado de contaminao.

OBJETIVO:

necessrio distinguir os coliformes fecais dos demais coliformes. Os coliformes fecais tem
como ambiente natural locais com temperaturas elevadas, portanto, na estufa bacteriolgica eles
sero capazes de crescer a 44,5 C. Nesse teste, iremos avaliar o nmero de coliformes fecais.


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PROCEDIMENTO:
Preparar o caldo Escherichia coli (EC), diluindo-o. Corrigir o pH para 6,9 (cido-neutro).
Aquecer no microondas durante 30 segundos tomando cuidado para que no ocorra desnaturao
protica. Leve-o para a autoclave juntamente com os outros materiais necessrio para esterilizao.
Trabalhando sempre perto do fogo, transfira com a ajuda de uma ala de platina, uma pequena poro
de cada tubo positivo para os tubos contendo o caldo EC com os tubinhos de Durham.
Incubar durante 24 na temperatura 44,5 C. Fazer a leitura identificando como positivo os
tubos de gs. Utilize a tabela de NMP de coliformes para saber a quantidade mais prxima de
coliformes em 100 ml, ou estimar pela frmula de Thomas.

RESULTADOS:
Os 10 tubos de 10 ml e os 5 tubos de 1 ml deram resultados positivos para coliformes fecais. Os
valores esto representados na tabela abaixo:

10 ml 1 ml Total de tubos
5 + 5 + 10 NMP = 240 coliformes fecais por 100 ml
5 + - 5 NMP = 23 coliformes fecais por 100 ml

DISCUSSO:
Art. 4. Para os fins a que se destina esta Norma, so adotadas as seguintes definies:
VI - coliformes totais (bactrias do grupo coliforme) bacilos gram-negativos, aerbios ou
anaerbios facultativos, no formadores de esporos, oxidase-negativos, capazes de desenvolver na
presena de sais biliares ou agentes tensoativos que fermentam a lactose com produo de cido, gs
e aldedo a 35,0 0,5C em 24-48 horas, e que podem apresentar atividade da enzima -galactosidase.
A maioria das bactrias do grupo coliforme pertence aos gneros Escherichia, Citrobacter, Klebsiella
e Enterobacter, embora vrios outros gneros e espcies pertenam ao grupo;
VII - coliformes termotolerantes subgrupo das bactrias do grupo coliforme que fermentam a
lactose a 44,5 0,2C em 24 horas; tendo como principal representante a Escherichia coli, de origem
exclusivamente fecal;
Art.11. A gua potvel deve estar em conformidade com o padro microbiolgico conforme
tabela 1, a seguir:

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CONCLUSO:

Na identificao de coliformes fecais, podemos concluir que todos os coliformes cada 100 ml
so coliformes fecais, tendo no primeiro resultado 240 coliformes fecais/100 ml e no segundo
resultado 23 coliformes fecais/100 ml.

Talvez durante a manipulao dos caldos e das amostras, podem ter ocorrido algum tipo de
contaminao microbiolgica. Conseguimos ento identificar a presena de diferentes coliformes no
teste presuntivo e confirmatrio; no teste de coliformes fecais, conseguimos concluir que todos os
coliformes encontrados desde o inicio da anlise eram coliformes fecais.

Como mostra o Art. 11. da portaria 518/2004 Ministrio da Sade, em nenhum momento
pode existir presena de coliformes fecais na gua, desde a sada do tratamento at a distribuio da
gua, ou seja, essa gua no faz parte da classe 1 de gua, prpria para consumo humano. Podemos
tambm abranger esses resultados pela turbidez e quantidade de coliformes na gua.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS:

Ministrio da Sade. Portaria 518/2004.
<http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/portaria_518_2004.pdf>
Acesso: 30 de Maio de 2010.

UNESP
<http://www.ibb.unesp.br/departamentos/Educacao/Trabalhos/obichoquemedeu/bacteria_coliform
es_fecais.htm>
Acesso: 30 de Maio de 2010.

Laboratrio de Ensino de Cincias e Tecnologia da USP
< http://www.darwin.futuro.usp.br/site/ecologia/quadroteorico/c_coliformes.htm>
Acesso: 30 de Maio de 2010.