uff

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

INSTITUTO DE BIOLOGIA
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR
GCM


ROTEIRO DE AULAS PRTICAS












1
PRTICA N
o
1 TITULAO DE AMINOCIDOS E ESTUDO DO EFEITO-TAMPO

1. Introduo
1.1. Aminocidos estrutura e propriedades
Em qumica, um aminocido qualquer
molcula que contm simultaneamente grupos
funcionais amina e cido carboxlico. Em bioqumica,
este termo usado como termo curto e geral para se
referir aos aminocidos alfa: aqueles em que as funes
amino (NH
3
+
) e carboxila (COO
-
) esto ligadas ao
mesmo carbono, conforme a frmula indicada na Figura
1:






Figura 1 Frmula geral dos aminocidos

Como se pode observar, ambos os grupos esto
ligados ao carbono central, ao qual est tambm ligado
um grupamento lateral varivel, denominado R. A
estrutura dos aminocidos d origem a dois ismeros
opticamente ativos, isto , capazes de promover a
rotao do plano da luz polarizada (Figura 2).











Figura 2 Isomeria dos aminocidos

Esses ismeros so denominados enantimeros,
so quirais (do grego kiros, que significa mo). So
imagens especulares que no podem ser sobrepostas. A
designao L ou D foi proposta por Emil Fischer, em
1891, com base na caracterizao das formas L e D do
gliceraldedo, conforme mostrado na Figura 3:
















Figura 3 Relao entre as formas L e D do
Gliceraldedo e da Alanina.
Historicamente, as designaes L e D foram
usadas como abreviaes dos adjetivos levorrotatrio
(provoca a rotao da luz para a esquerda) e
dextrorrotatrio (provoca a rotao da luz para a
direita), respectivamente. Entretanto, sabe-se que nem
todos os L-aminocidos so levorrotatrios. Todos os
aminocidos das protenas naturais tm a configurao
L, porque as protenas so sintetizadas por enzimas que
reconhecem e inserem apenas L-aminocidos nas
cadeias peptdicas. Apenas alguns poucos peptdeos de
HO
O O
-
NH
3
+
R
R H
3
N
+
O O
-
OH
Espelho
Imagem
(D-aminocido)
Imagem refletida
(L-aminocido)
NH
3
+
COO
-
H HO
CH
2
OH
CHO CHO
HO H
CH
3
H H
CH
3
COO
-
H
3
N
+
CH
2
OH
L-Gliceraldedo D-Gliceraldedo
L-Alanina D-Alanina
NH
3
+
COO
-
R C
H
+

2
bactrias possuem aminocidos na forma D (ex.: cido
D-glutmico). Todos os 20 aminocidos que compem a
estrutura das protenas so -aminocidos, mas existem
aminocidos em que os grupos amino e carboxlico no
esto ligados ao mesmo carbono; alguns desses
aminocidos so importantes precursores de algumas
substncias (ex.: -alanina, precursora do cido
pantotnico) e possuem papis celulares especficos
(ex.: o cido -aminobutrico ou GABA, um
neurotransmissor).
A presena dos grupos amina e carboxila
propicia aos -aminocidos um carter anfotrico em
soluo aquosa, ou seja, um comportamento tanto de
cido como de base (Cabe aqui ressaltar um ponto
importante: no h substncias cidas ou bsicas em
absoluto. Esses termos so conceitos; uma substncia s
cida ou bsica em relao a outra substncia). Em
valores de pH 6,0 7,0, os aminocidos existem
predominantemente na forma dipolar inica, cuja
representao aquela mostrada na Figura 1. Esta forma
denominada zwitterion (do alemo on hbrido). Em
faixas extremas de pH, por outro lado, eles se
apresentaro como espcies inicas diferentes (Figura
4):






Figura 4 Espcies inicas dos aminocidos
em valores extremos de pH.
Portanto, os aminocidos possuem no mnimo
dois grupos (pois o R tambm pode ser ionizvel) que
podem sofrer protonaes e desprotonaes e essas
reaes dependero do pH da soluo em que os
aminocidos se encontram (Figura 5):












Figura 5 Reaes de protonao e
desprotonao dos aminocidos em valores extremos de
pH.
Pode-se estudar a dissociao dos prtons de
um aminocido em soluo realizando-se uma curva de
titulao e observando-se a variao do pH do meio
com o auxlio de um medidor de pH (ou pHmetro). A
titulao de um aminocido consiste na remoo gradual
de prtons atravs da adio de uma base (como
NaOH) e a curva de titulao corresponde ao grfico
dos valores de pH da soluo em funo do volume de
base adicionado. Essa curva revela os pK
a
s (que so
formas de expresso das constantes de dissociao K
a
)
dos grupos ionizveis do aminocido (lembre-se que
pK
a
= -log K
a
). medida que a base adicionada, a
curva passa apresentar estgios distintos, que dependem
da concetrao de cada uma das formas doadoras de
prtons, como mostra a Figura 6:






Figura 6 Reaes de dissociao de prtons
de um -aminocido simples monocarboxlico.
C COOH
H
R
NH
3
+
C COOH
H
R
NH
3
+
C COO
-
H
R
NH
2
C COO
-
H
R
NH
2
Em pH 1 Em pH 11
NH
3
COO
-
R
H
+
C
H
+ +
H
C R
COOH
NH
3
H
+ -
+
+
-
H
+
NH
2
COOH
R C
H
+
H
C
H
+
R COO
-
NH
3
Em pH = 1
Em pH = 11
pK
1
pK
2

Adio de base
1 2 3
NH
3
COO
-
R
H
+
C
H
+
+
H
C R
COOH
NH
3
NH
2
COO
-
R C
H
H
+

3
Assim, para um -aminocido simples
monocarboxlico, observaremos trs pontos de inflexo
na curva: A) um ponto no qual o pH igual ao valor do
pK do grupo carboxlico, onde esto presentes
quantidades equimolares das formas A (carga lquida =
+1) e B (carga lquida = 0); B) um ponto no qual o valor
de pH corresponde ao ponto isoeltrico (pI) do
aminocido, onde a forma B est principalmente
presente; e C) um ponto no qual o pH igual ao valor
do pK do grupo amino, onde esto presentes
quantidades equimolares das formas B e C (carga
lquida = -1). Portanto, cada aminocido apresentar
uma curva especfica, j que esta depende das interaes
intramoleculares que o compem. Alm disso, alguns
aminocidos apresentaro mais de 2 valores de pK, uma
vez que possuem mais um grupo ionizvel no seu
grupamento R.

1.1. O medidor de pH
Em linhas gerais, o medidor de pH um
aparelho capaz de converter a diferena de potencial (ou
seja, um potencimetro) detectada pelo eletrodo em
uma escala de pH. O eletrodo de vidro combinado (ver
Figura 7) um eletrodo compacto no qual o eletrodo de
vidro acha-se envolvido pelo eletrodo de referncia de
Ag/AgCl (em alguns equipamentos esses eletrodos
podem ser encontrados em separado). O eletrodo de
vidro consiste de um tubo de vidro com um bulbo na
extremidade inferior, feito de vidro especial (constitudo
de xido de silcio). Nele est contida uma soluo de
Ag/AgCl em soluo de HCl 0,1 M. A superfcie do
bulbo revestida de ons Na
+
que, quando em contato
com os ons hidrognio, so substitudos por prtons
que permanecem em equilbrio em cada lado da parede
de vidro:
Si ONa + H
2
O Si OH + NaOH
Quando o eletrodo imerso numa soluo que
se deseja investigar, formam-se potenciais de
membrana e a condutividade eltrica feita
principalmente pelos ons Na
+
. A diferena de potencial
estabelecida comparada com o eletrodo de referncia
(Ag/AgCl ou Hg/HgCl2) que envolve o eletrodo de
vidro e entra em contato com a amostra atravs de uma
juno cermica onde se forma uma ponte salina.







Figura 7 Eletrodo
de vidro combinado.





O medidor de pH possui um boto para ajuste
da temperatura (j que esta influencia no equilbrio
qumico dos tampes), um para calibrao (com soluo
em pH neutro - 7,0) e outro para valores de pH extremos
(normalmente 4 ou 10), que normalmente chamado de
boto de ajuste de assimetria e permite correes de
desvios da curva do potencial do eletrodo. Alm disso,
alguns aparelhos possuem um boto para selecionar o
tipo de leitura que se deseja realizar em mV ou pH.
Para a calibrao do medidor, utiliza-se sempre
solues-padro disponveis comercialmente.

1.2. Solues-tampo

As substncias consideradas cidos ou bases
fortes so aquelas que tendem a se dissociar totalmente
quando em soluo, diminuindo ou aumentando o pH do
meio, respectivamente. Assim, o pH de uma soluo 0,1

4
M de HCl praticamente 1,0 (pH = -log [0,1]),
enquanto o pH de uma soluo 0,1 N de NaOH
praticamente 13,0 (pOH = -log [0,1] e pH = 14 - 1). O
pH dos fluidos biolgicos mantm-se mais ou menos
constantes em valores prximos de 7,0 devido
presena de um grande nmero de substncias capazes
de captar ou liberar prtons. Nas clulas e nos fluidos
biolgicos predominam cidos e bases fracos, que no
so completamente ionizveis em soluo (alguns
dissociam-se menos que 1 %). Sendo assim, a relao
entre pH e o grau de dissociao de um cido fraco no
direta como nos cidos fortes. No entanto, ela pode ser
analisada atravs da equao de Henderson-Hasselbach.
Considere a reao de dissociao de um cido
fraco em soluo aquosa:
HA H
+
+ A
-

Aplicando a lei de ao de massas temos:


Onde Ka a constante de equilbrio da reao.
Rearranjando a equao temos:

Logo:



Chegamos finalmente equao de Henderson-
Hasselbach:



A equao mostra que o pH de qualquer
soluo aquosa que contenha uma quantidade
significativa de um cido fraco depender da proporo
(E NO DA QUANTIDADE ABSOLUTA) das formas
dissociadas e no dissociadas do cido e do pK
a
deste
mesmo cido. Se H
+
ou OH
-
forem adicionados a uma
soluo contendo uma proporo adequada destas
formas, a razo [base]/[cido] ser alterada ao consumir
esses [H
+
] ou [OH
-
], sem variar o pH do meio e,
claro, mantendo-se inalterada a constante de
dissociao, K
a

Assim, o TAMPONAMENTO DE UMA
SOLUO a capacidade desta em resistir a variaes
de pH. Substncias cuja presena na soluo so
responsveis por este efeito so conhecidas como
TAMPES. O fenmeno do tamponamento um dos
fatores que possibilitou o surgimento da vida. Em
organismos vivos o pH dos diferentes ambientes
mantido estvel, mesmo aps a adio de cidos ou
bases. Em laboratrios pode-se preparar uma soluo
tampo utilizando-se uma base fraca ou um cido fraco
(ex.: cido actico) e sua base conjugada na forma de
um sal (ex.: acetato de sdio). Em pesquisa cientfica os
tampes so essenciais para a manuteno do pH em
uma grande variedade de procedimentos, por exemplo,
cultura de clulas e tecidos, medida de atividade
enzimtica, purificao de protenas, etc... Normalmente
utiliza-se um tampo para manuteno de um valor de
pH que se encontre uma unidade acima ou abaixo de seu
valor de pK, pois dentro desta faixa o seu efeito
tamponante muito mais eficiente (como exemplo,
verifique as inflexes da curva de titulao dos
aminocidos nesta aula prtica).

2. Objetivos

Determinar os valores de pK das solues de
aminocidos (Glicina e cido glutmico) atravs de
titulao;
Construir as curvas de titulao para cada um dos
aminocidos;
Manusear e compreender o funcionamento de um
medidor de pH.
K
a
= [H
+
] [A
-
]
[HA]
K
a
= [H
+
] [A
-
]
[HA]
1 = 1 x [A
-
]
[H
+
] K
a
[HA]
1 = 1 x [A
-
]
[H
+
] K
a
[HA]
log 1 = log 1 + log [A
-
]
[H
+
] K
a
[HA]
log 1 = log 1 + log [A
-
]
[H
+
] K
a
[HA]
pH = pK
a
+ log [A
-
]
[HA]
pH = pK
a
+ log [A
-
]
[HA]

5
Estudar o efeito tamponante de misturas contendo
propores e concentraes diferentes de um cido
fraco e sua base conjugada.

3. Reagentes
Solues de Glicina e cido Glutmico 0,02 M
(pH 1);
Soluo de NaOH 0,5 N.
Soluo de HCl 1 M.
Solues-padro para calibrao do medidor de
pH.
Soluo de cido actico 0,2 M
Soluo de acetato de sdio 0,2 M.

4. Procedimentos

4.1. Procedimentos gerais de ajuste do medidor de
pH
Ligar o aparelho;
Retirar o eletrodo do recipiente contendo soluo de
KCl 3M e lav-lo com gua destilada.
Imergir o eletrodo na soluo-padro de pH 7 e
calibrar o aparelho no boto adequado.
Retirar o eletrodo da soluo e repetir o
procedimento de ajuste, agora para a soluo-padro
de pH 4,0, no boto adequado.
Lembrar de sempre colocar o aparelho em stand
by quando eletrodo no estiver imerso em uma
soluo.

4.2. Procedimentos para titulao dos aminocidos
Em um bcher colocar 40 mL de glicina ou cido
glutmico.
Mergulhar uma barra magntica na soluo e
posicionar o bcher sobre a placa agitadora.
Inserir o eletrodo limpo e calibrado na soluo, de
modo que a juno cermica fique submersa
(cuidado para o bulbo no esbarrar na barra
magntica).
Sob agitao, titular com NaOH 0,5 N, adicionando
0,2 mL por vez e anotando o pH aps cada adio
(adicionar o NaOH diretamente soluo, sem
esbarrar no eletrodo ou na parede interna do bcher).
Construir o grfico de pH da soluo versus volume
de NaOH adicionado.

4.3. Procedimentos para estudo da capacidade
tamponante
Em quatro bcheres, adicionar os volumes indicados
das solues de cido actico, acetato de sdio e
gua:

Bcher
cido
actico
Acetato de
sdio
H
2
O
1 20 mL 20 mL --
2 10 mL 10 mL 20 mL
3 25 mL 15 mL --
4 15 mL 25 mL --

Repetir os procedimentos descritos acima para
titulao de cada uma das solues, mas desta vez
adicionar 5 x 0,5 mL de NaOH 0,5 N. Anotar o valor
de pH a cada adio.
Construir o grfico de pH das solues versus
volume de NaOH adicionado.

5. Questes para discusso
1) Em relao prtica realizada:
a) Quais os valores de pK e pI da glicina e do cido
glutmico?
b) Por que a curva de titulao do cido glutmico
diferente da curva da glicina?
c) Calcule o pH terico das solues 1, 2, 3 e 4, sabendo
que o K
a
do cido actico 1,74 10
-5
.


6
2) Voc pode utilizar um aminocido para fazer uma
soluo-tampo? Por qu?
3) Como a concentrao de um tampo afeta a sua
capacidade tamponante?
4) Um tampo mantm constante o pH de um meio
indefinidamente?
5) Calcule o grau de dissociao inicial do cido actico
0,2 M. (Dica: considerando que a [H
+
] igual
concentrao de ons acetato, podemos reescrever a
reao de dissociao da seguinte forma: 0,2 y = y y.
Sendo assim a expresso de equilbrio pode ser:


o que gera uma equao do segundo grau que
pode ser resolvida!).




6) Quais sero as concentraes de cido actico e
acetato de sdio necessrias para fazer um tampo de
pH 5,1 com a soma cido actico + acetato = 0,2 M?

7) Num laboratrio hospitalar uma amostra de 10 mL de
suco gstrico, obtida vrias horas aps uma refeio, foi
titulada com NaOH 0,1N at neutralidade; foram
necessrios 7,3 mL. Como o estmago no continha
nem alimento nem bebida, pode-se assumir que no
havia tampes presentes. Qual o pH do suco gstrico?



















K
a
= y
2
0,2 - y

7
PRTICA No 2 - FUNDAMENTOS DE FOTOMETRIA E ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORO

1. Princpios gerais
O termo espectro foi utilizado inicialmente por
Newton, quando este descobriu que a luz branca, ao
atravessar um prisma, dividida em vrias cores.
Atualmente, sabe-se que o espectro visvel apenas uma
pequena parte do espectro eletromagntico. A luz ,
portanto, definida como uma forma de energia
eletromagntica, formada por ondas que apresentam
comprimentos diferentes. O comprimento de onda ( )
medido em nm onde 1,0 nm equivale a 10
-9
m. A tabela
abaixo mostra as regies do espectro em relao ao
comprimento de onda:
REGIO: ( ) EM nm:
Raios X 0,1-100
Ultravioleta 100-400
Visvel 400-800
Infravermelho 800-5000
Microonda 5000-30000

A cor dos objetos devida a duas causas:
reflexo e absoro. Assim, um papel transparente,
vermelho, recebe todos os da luz branca, mas reflete e
transmite somente o vermelho, sendo o restante
absorvido. Quando um objeto da cor branca, todos os
so refletidos, se negro, porque, praticamente,
todos os so absorvidos. No entanto, existe uma cor
(ou ) que mais absorvida, a qual corresponde
chamada cor complementar. Se uma soluo absorve na
faixa de 435-480 nm, que corresponde radiao azul, a
sua cor (cor complementar) ser o amarelo; a sensao
visual do amarelo ser dada pelo conjunto de todos os
outros componentes da luz branca, que no foram
absorvidos. A tabela abaixo mostra as cores de cada
intervalo de radiao da faixa do visvel e as suas
respectivas cores complementares:

A capacidade que as diversas substncias
qumicas tm de absorverem luz em determinados
comprimentos de onda pode ser utilizada para a sua
determinao quantitativa e qualitativa, uma vez que o
espectro de absoro caracterstico para uma
determinada substncia e a quantidade de absoro
(intensidade) dependente da concentrao do
composto.
A intensidade da radiao transmitida por uma
soluo pode ser determinada em aparelho (fotmetro),
que dever ser constitudo de: uma fonte luminosa, um
seletor de (filtro ou prisma), um compartimento para a
amostra, uma clula fotoeltrica (ou fototubo) e um
sistema para amplificao e medida do sinal (corrente
eltrica) proveniente da clula fotoeltrica (medidor de
potencial eltrico = potencimetro). Pode-se selecionar
o comprimento de onda que incidir sobre a soluo
usando-se um monocromador (prisma ou retculo de
difrao) ou um filtro ptico (vidro colorido ou quartzo,
que transmite uma determinada faixa de na regio do
ultravioleta, UV). Se o aparelho dispe de filtro ptico,
denominado fotmetro ou fotocolormetro e se dispe
de prisma ou retculo denominado de
espectrofotmetro. Este ltimo muito til, pois pode
selecionar faixas de comprimentos de onda
extremamente estreitas, nas regies do UV, visvel e
infravermelho (IV).
INTERVALO
(nm)
COR
ABSORVIDA
COR
COMPLEMENTAR
380-435 violeta Verde-amarelada
435-480 azul amarela
480-490 azul esverdeada alaranjada
490-500 verde azulada vermelha
500-560 verde prpura
560-580 Verde- amarelada violeta
580-595 amarelada azul
595-650 alaranjada Azul-esverdeada
650-780 vermelha verde-azulada

8
A fotometria de absoro, portanto, presta-se
tanto para a medida da concentrao de compostos
naturalmente corados, como daqueles incolores, mas
passveis de adquirirem cor mediante o emprego de
certos reativos, bem como de compostos incolores que
absorvem UV ou IV. Esta metodologia, por conseguinte,
tem largo emprego na qumica analtica quantitativa.
Alguns poucos exemplos: na determinao de atividade
enzimtica ou nas dosagens de compostos orgnicos em
fluidos biolgicos, como glicose, uria, protenas, etc.,
em que se dosa um produto colorido, obtido por meio de
uma reao qumica, ou um produto incolor que absorva
na regio do UV ou do IV. Ensaios imunolgicos
quantitativos (como o ELISA: Enzyme-Linke
ImmunoadSorbent Assay) tambm usam a fotometria.

1.1. Leis da fotometria
O princpio bsico da fotometria baseado no
fato de que: partculas dispersas ou dissolvidas em uma
soluo interferem seletivamente com um raio de luz
que passa atravs desta soluo. Esta interferncia
depende dos seguintes fatores:
a) cor do composto ou do tipo de ligao qumica
presente;
b) tamanho da partcula;
c) transparncia da soluo;
d) combinao dos fatores acima.
Deste modo, as partculas podem absorver e
transmitir parte do espectro, dependendo da sua
concentrao, da sua natureza qumica e/ou da sua cor.
Se pudermos medir o total de luz que incide (I
o
) sobre a
soluo de uma determinada substncia e o total da luz
transmitida (I
t
), podemos avaliar o quanto a substncia
absorveu (absorvncia: A) O esquema abaixo mostra
como funciona um fotmetro ou um espectrofotmetro:
A seguinte formulao pode ser feita:
Transmisso = I
t
/ I
o
(luz transmitida / luz incidente).
Observe que o termo transmisso tem aplicao
limitada, uma vez que, a I
t
I
0
menos a luz que
absorvida no s pela substncia que se deseja medir,
mas tambm pelo solvente, pelo material da cubeta e por
outras substncias a existentes. Assim, I
t
a luz
transmitida aps as absores pela substncia de
interesse mais os interferentes. Para corrigir tal efeito,
admite-se It =1 (100% de Transmitncia) a luz
transmitida aps I
0
atravessar a cubeta contendo uma
soluo denominada branco. Este branco contm todos
os componentes do meio, exceto a substncia a ser
medida. No escuro, bloqueada a passagem de luz para o
fototubo (fotoclula), a Transmitncia = 0, ou seja, no
h luz transmitida a ser medida.
Na prtica, a transmitncia (T), que medida
em uma escala de 0 (no escuro) a 100% (com o branco
na passagem da luz), pouco utilizada, pois
substituda pelo valor de densidade ptica (D.O.) ou
absorvncia (A), termo mais aceito atualmente, que
corresponde ao logaritmo do inverso da transmitncia:
A = log 1/T
A absorvncia , desta forma, medida em uma
escala de 0 (log 1/1) a infinito (log 1/0).

A relao da A
com a concentrao da substncia pode ser
compreendida pelas Leis de Lambert-Beer: a
absorvncia de uma soluo proporcional
concentrao da substncia na soluo e distncia
percorrida pelo feixe luminoso que atravessa a soluo
(caminho ptico): A = . l.c,
onde: = coeficiente extino molar, que constante
para cada substncia, e definido como a absovncia (A)
de uma soluo l molar da substncia em um
determinado comprimento de onda ( ), numa cubeta de
caminho ptico l = l cm (largura da cubeta) e c =
concentrao da soluo.
Observe, portanto, que a absorvncia uma
funo linear da concentrao. Assim, para uma mesma
substncia, considerando-se o caminho ptico constante,
a A diretamente proporcional concentrao desta

9
substncia. No entanto, as Leis de LambertBeer nem
sem pre so obedecidas. Algumas desobedincias so
conhecidas e atribudas a fatores como: mudana na
natureza do soluto, valores muitos altos ou muitos
baixos das concentraes das solues, etc. Tambm as
presenas de cidos, bases e sais na soluo podem
contribuir para essas desobedincias, por estarem mais
completamente dissociados, medida que aumenta a
diluio, visto que absoro da luz pelos ons diferente
daquela apresentada pelas molculas no ionizadas. Para
se evitar discrepncias das Leis de Lambert-Beer, deve-
se trabalhar com solues mais diludas e construir,
previamente, uma curva padro, em que so usadas
concentraes conhecidas (e crescentes) da substncia
em anlise, e verificar as absorvncias no comprimento
de onda indicado e na cubeta de caminho ptico
adequado. Desta forma, teremos os limites de
concentrao nos quais a soluo obedece s Leis de
Lambert-Beer, ou seja, onde h linearidade. Com o
emprego da curva padro, podemos, tambm,
determinar a concentrao de uma soluo problema. O
comprimento de onda ( ) usado para a obteno da
curva padro obtido pela preparao do espectro de
absoro da substncia em estudo e , normalmente, o
onde a absorvncia para a substncia apresenta o valor
mximo.

2. Objetivos
Determinar o espectro de absoro de uma soluo
de Azul de Bromofenol em pH neutro e em pH
cido;
Caracterizar o comprimento de onda ( ) onde ocorre
absoro mxima;
Construir uma curva padro do Azul de Bromofenol.
3. Reagentes
Soluo de Azul de Bromofenol 1 mg /100 mL em
meio levemente cido (amarelo) e Soluo de Azul
de Bromofenol 1 mg /100 mL (azul/violeta).

4. Procedimentos
4.1. Procedimentos gerais de ajuste do fotmetro
Ligar o aparelho;
Selecionar o comprimento de onda adequado.
Ajustar o zero de transmitncia;
Introduzir a cubeta com o branco (gua destilada) e
ajustar a 100% de transmitncia, no boto
correspondente;
Repetir os ajustes acima.
Obteno do espectro de absoro:
Ajustar o comprimento de onda inicialmente em 400
nm;
Ajustar o 100% de transmitncia com o branco. Isto
coincide com o 0 de absovncia;
Colocar a cubeta com a soluo de Azul de
Bromofenol em meio cido concentrao de 1
mg/100 mL;
Ler a absorvncia e registr-la;
Ajustar o a 430 nm, repetir o ajuste do branco,
recolocar a soluo de Azul de Bromofenol e ler,
novamente, a absorvncia correspondente a este ;
Repetir estas operaes para os seguintes valores de
: 450, 470 e 490;
O mesmo ser feito para o Azul de Bromofenol em
pH neutro. Sendo os comprimentos de onda
analisados, respectivamente: 500, 530, 550, 570 e
590.
Fazer o grfico dos espectros de absoro do Azul
de Bromofenol em papel milimetrado, relacionando
absorvncia (ordenada) contra (abcissa);
Determinar o de absorvancia mxima.

10
Azul de Bromofenol
(pH<3)
Azul de Bromofenol
(pH>4,6)
A A
410

430

450

470

490

510

530

550

570

590


Dados:
1) Espectofotmetro: TUNER, modelo 330
2) Soluo: Azul de bromofenol em meio cido
(1mg/100ml) e Azul de bromofenol em pH neutro
(1mg/100ml).
3) : comprimento de onda.
4) A: absorvncia.

4.2. Curva padro Obteno
1) Fazer diluio seriada:
Utilizar 6 tubos de ensaio e enumer-los.
Adicionar 4ml de H
2
O em cada tubo.
Colocar 4ml de Azul de Bromofenol no tubo 1e
agitar.
Retirar 4ml da soluo do tubo 1 e adicionar no
tubo 2. Repetir em todos os tubos.
No tubo 6 retirar 4ml e descartar.
Cada tubo estar, desta forma, diludo em 2x com
relao ao anterior.

2) Preparar solues de Azul de bromofenol nas
concentraes citadas na tabela abaixo:




Concentrao de
Azul de
Bromofenol
(mg/100ml)
Absorvncia
(pH<3)
Absorvncia
(pH>4,6)
0,50 (
1
/
2
)
0,25 (
1
/
4
)
0,125 (
1
/
8
)
0,0625 (
1
/
16
)
0,03125 (
1
/
32
)
0,015625 (
1
/
64
)

Ler as absorvncias das diferentes solues de Azul
de Bromofenol (no ideal) e registr-las;
Construir, em papel milimetrado, a curva padro
(absorvncias na ordenada e concentraes na
abscissa), considerando os pontos zero de absoro e
de concentrao.

5. Questes para discusso
5.1- Explique porque o Azul de Bromofenol apresenta
coloraes diferentes com a mudana no pH da soluo.
5.2- Voc dispe dos filtros azul, verde, vermelho e
amarelo de um fotmetro. Qual deles voc usar, para que
uma soluo de cor vermelha tenha uma absoro (contra o
branco) o mais prximo de zero possvel?
5.3- Avalie, nas condies experimentais acima, se o Azul
de Bromofenol segue, estritamente, as Leis de Lambert-
Beer, admitindo que nada interferiu em seu procedimento.
5.4- Explique por que no se deve usar cubetas de vidro
para leituras na regio do ultravioleta.

6. Questes complementares
6.1 Voc pesou l, 2 e 3 mg de Azul de Bromofenol e
dissolveu cada uma quantidade em 50 mL. As absovncias
destas solues, em 430nm, foram, respectivamente, 0,2,
0,4 e 0,6. A abosvncia de uma soluo desconhecida do
sal foi 0,3. Calcule a sua concentrao, em mg/100mL.
6.2 Para a dosagem da glicose do sangue de um paciente,
a amostra foi diluda em 10 vezes (no processo de
desproteinizao). 1mL do desproteinizado e 2mL de cada

11
um dos padres de glicose (P) de 10, 20 e 30mg/100mL
foram processados para a dosagem da glicose, sendo o
volume final, em todos os tubos, ajustados para 5mL. Aps
as leituras espectrofotomtricas em comprimento de onda
adequado, as absorvncias obtidas foram:
Amostra...................... ...0,180
P-10 mg/100mL............. 0,150
P-20 mg/100mL..............0,298
P-30 mg/100mL..............0,400.
Qual a concentrao da glicose no sangue do paciente?
6.3 - O coeficiente de extino molar ( ) de uma substncia
de peso molecular 200 14,5. Uma soluo desta
substncia apresentou , numa cubeta de caminho ptico de
2 cm, a absorvncia de 0,800. Qual a concentrao (em
mg/L) da substncia nesta soluo?

Papel milimetrado:


12
PRTICA N
o
3 - ESTUDO FSICO-QUMICO DAS PROTENAS

1. Introduo
As protenas, excluindo a gua, so os
compostos qumicos mais abundantes nos organismos,
com extrema versatilidade de conformaes e funes.
O estudo de aspectos importantes da bioqumica nos
leva, invariavelmente, ao estudo de protenas. Portanto,
torna-se importante a existncia de mtodos adequados
de purificao e quantificao destes compostos. A
purificao e caracterizao de uma protena baseiam-se
em suas caractersticas fsico-qumicas. Por serem
formadas por aminocidos e considerando-se que os
aminocidos aromticos absorvem luz na regio
ultravioleta, as protenas, em geral, podem ser
detectadas atravs da absoro de luz a 280 nm. No
entanto, a deteco de protenas em materiais biolgicos
envolve reaes especficas com determinados reativos,
os quais originam substncias coloridas que absorvem
luz na regio visvel, permitindo a sua quantificao.
Dentre os mtodos utilizados, situa-se o mtodo do
biureto, que baseado na reao do sulfato de cobre em
meio alcalino (reativo do biureto) com protenas e
peptdeos (no mnimo tripeptdeos). O nome do mtodo
provm do fato de que a uria aquecida a 180
o
C dar
reao positiva com desprendimento de amnia:
NH
3
NH
2
N
H
H
H
H
N
NH
2
NH
2
BIURETO
0 C
0 C
0 C
N
NH2
N
H
0 C

URIA
Quando a substncia contm duas ou mais
ligaes peptdicas, produz uma cor azul-violeta com o
reativo de biureto. Esta cor desenvolvida devida a um
complexo entre o on cprico e duas cadeias peptdicas
adjacentes:
NH
C O
R CH
H R C
O C
HN
0 C
NH
C R H
C O
NH
CH R
Cu
+2

Dependendo dos aminocidos que fazem parte
das protenas (estrutura primria), podem-se ter
diferenas fisico-qumicas individuais entre protenas
numa mistura, as quais podem ser utilizadas para a
separao e purificao destes compostos. Por exemplo,
mtodos cromatogrficos podem ser baseados em
diferenas no peso molecular e/ou carga eltrica.
As protenas so macromolculas coloidais,
possuem uma camada de solvatao ou hidratao. Ao
seu redor interagem molculas de gua, que permitem a
sua solubilidade. Diversas substncias, entre elas os sais
inorgnicos ((NH
4
)
2
SO
4
, Na
2
SO
4
e outros) podem
alterar a camada de solvatao de protenas, aumentando
(salting-in) ou diminuindo (salting-out) a
solubilidade.
As protenas possuem estruturas espaciais bem
definidas que, segundo o nvel de complexidade, podem
ser caracterizadas como estruturas secundria, terciria e
quaternria. A funo biolgica est associada
estrutura espacial, que, por sua vez, depende da
estrutura primria (a simples disposio dos
aminocidos na cadeia polipeptdica). Certos agentes
podem alterar a conformao espacial original das
protenas, sem que ocorra alterao da estrutura
primria, modificando, desta forma, algumas de suas
propriedades biolgicas. Este efeito, chamado de
desnaturao, pode ser produzido pelo aumento da

13
temperatura do meio, alterao do pH ou pela adio de
solventes orgnicos. A alterao da estrutura primria
das protenas (quebra das ligaes peptdicas) ocorre
por tratamento quente (100
o
C) em presena de cido
ou base forte ou atravs de adio de enzimas
proteolticas. Determinados agentes podem ser usados
na precipitao de protenas, o que til na
desproteinizao de materiais biolgicos, como o
sangue: nions de cidos complexos (tricloroactico,
tnico, fosfotngstico) formam sais insolveis onde a
protena funciona como ction; metais pesados (cobre,
zinco, prata, mercrio) em meio alcalino formam
precipitados onde a protena atua como nion.
Os aminocidos componentes de uma protena
podem ser genericamente caracterizados se, aps sua
hidrlise, efetuarmos a reao da ninhidrina. A
ninhidrina (hidrato de tricetoidrindeno) reage com
aminocidos produzindo cor prpura. uma reao
inespecfica quanto identidade do aminocido, sendo a
reao dependente da presena de grupos amina livres.
O aminocido prolina, na verdade um iminocido, ao
reagir com a ninhidrina produz colorao amarela.

2. Objetivos
Realizar reao especfica para deteco de
protenas (reao do Biureto);
Realizar reao especfica de deteco de
aminocidos (reao com a ninhidrina);
Verificar a alterao de solubilidade de protenas em
presena de solues salinas e solventes orgnicos;
Verificar a ao de agentes desnaturantes;
Observar a separao cromatogrfica (cromatografia
de excluso molecular) de substncias de pesos
moleculares diferentes.

3. Reagentes
Reagente do Biureto: CuSO
4
em soluo alcalina.
Soluo diluda de protenas.
Soluo concentrada de protenas.
Soluo de ninhidrina 0,1g% (P/V).
Soluo de aminocidos.
cido tricloroactico (TCA ) 10% (P/V).
Soluo saturada de sulfato de amnio (NH
4
)
2
SO
4
.
Soluo tampo de fosfato de sdio 0,2 M, pH 7,0.
Etanol gelado.
Resina Sephadex G-25 (faixa de separao PM
1000-5000 D).
Soluo contendo compostos de diferentes pesos
moleculares (azul de dextran: 2.000.000 D, vitamina
B
12
: 1355 D em tampo pH 7,0, contendo sacarose).

4. Procedimentos
Enumerar 12 tubos de ensaio

4.1. Reao do Biureto:
Tubo 1 (tubo branco): colocar: 1 mL do reativo do
Biureto + 0,5 mL de gua destilada;
Tubo 2: colocar: 1 mL do reativo do Biureto + 0,5
mL da soluo diluda de protenas;
Tubo 3: colocar: 1 mL do reativo do Biureto + 0,5
mL da soluo de aminocidos;
Comparar o desenvolvimento de cor nos tubos.

4.2. Reao da ninhidrina:
Aquecer gua 100
o
C
Tubo 4 (tubo branco): colocar 2 mL da soluo de
ninhidrina + 0,5 mL de gua destilada;
Tubo 5: colocar 2 mL da soluo de ninhidrina + 0,5
mL da soluo diluda de protenas;
Tubo 6: colocar 2 mL da soluo de ninhidrina + 0,5
mL da soluo de aminocidos;
Ferver os tubos de ensaio 4, 5 e 6 por 5 minutos;
Comparar o desenvolvimento de cor nos tubos.

4.4. Precipitao cida:

14
Tubo 7 (tubo de centrfuga): colocar 1 mL de TCA
10% (P/V). + 1 mL da soluo diluda de protenas;
Agitar e observar;
Centrifugar (por 10 minutos), separando as fraes
sobrenadante e precipitado;
Colocar 0,5ml do sobrenadante no Tubo 8;
Adicionar 1mL do reativo do biureto ao Tubo 8;
Adicionar tampo ao precipitado do Tubo 7. Agitar;
Comparar os resultados.

4.5. Efeito da adio de sais:
Tubo 9: Colocar 2 mL da soluo diluda de
protenas + 2 mL da soluo saturada de sulfato de
amnio. Agitar. Centrifugar 3000rpm por 10
minutos, separar as fraes sobrenadante e
precipitado;
Colocar o sobrenadante no tubo 10. Adicionar igual
volume de TCA 10% (P/V)., agitar e centrifugar
novamente. Se aparecer algum precipitado, tentar
dissolv-lo com 1 mL de tampo;
Adicionar 1 mL de tampo ao precipitado do tubo 10
e agitar. Verificar o que acontece.

4.6. Efeito da adio de solventes orgnicos:
Tubo 11: colocar 1mL da soluo de protenas +
2mL de etanol gelado (lentamente at o
aparecimento de uma ligeira turvao).

4.7. Cromatografia em peneira molecular:
Montagem da coluna: numa coluna de vidro (aprox. 30
x 1,5 cm), colocar o gel suspenso em tampo pH 7,0,
deixando a extremidade inferior da coluna aberta, at
que o gel se acame. Cuidado para no deixar secar o gel,
adicionando sempre tampo, at que o gel esteja
equilibrado e acamado.
Aplicao da amostra: aplicar 1mL da amostra sobre a
superfcie da coluna, que dever estar com cerca de 2
cm de tampo sobre o gel. Como a amostra est mais
densa, devido presena da sacarose, esta se depositar
sobre o gel.
Continuar adicionando o tampo e acompanhar o
fracionamento dos componentes da amostra, anotando
os resultados.

5. Questes para discusso:
5.1- Explique o que ocorreu em cada etapa executada.
5.2- Pelos resultados obtidos no item 4.5, podemos
afirmar que a soluo de sulfato de amnio saturado
precipita todas as protenas? Por qu? Como podemos
saber se esta precipitao reversvel ou no?
5.3.- Pelos resultados obtidos no item 4.6, podemos
afirmar que o etanol gelado precipita todas as protenas?
Por qu? Como poderamos comprovar isto? O
precipitado obtido (aps centrifugao) seria
redissolvido em tampo? Por qu?
5.4 - Qual foi a ordem de eluio das amostras na coluna
(item 4.7)? Por qu?

6 - Exerccios complementares:
6.1- Voc dispe num laboratrio de dois frascos
idnticos, porm, no rotulados. Um deles contm
soluo de aminocidos e, o outro, contm uma soluo
de protenas. Qual seria o seu procedimento para
identificar as duas solues e rotular os frascos?

6.2- Descrever um mtodo que permita separar a
protena n
o
6 de uma mistura que contenha seis
protenas, sabendo-se que: a) as protenas de n
o
1, 3 e 5
precipitam pelo sulfato de amnio a 40% de saturao;
b) as protenas de n
o
1, 2, 4 e 6 precipitam pelo etanol
gelado; c) as protenas de n
o
1, 3, 5 e 6 precipitam pelo
sulfato de amnio a 75% de saturao; d) os pontos
isoeltricos das protenas 1 e 3 so iguais a 6,5 ; o da
protena 2 7,2; o das protenas 4 e 6 se igualam a 6,3 e
o da protena 5 6,8.


15
6.3- Num extrato biolgico existem hormnios proticos
e isoenzimas, que devem ser isolados da maneira mais
pura possvel para uso posterior. Voc dispe de sulfato
de amnio, TCA, etanol, resinas cromatogrficas,
equipamentos cromatogrficos e de eletroforese. Que
mtodos voc poderia utilizar? Explique o seu princpio
e como execut-lo. Que mtodos no poderiam ser
utilizados?

6.4- Uma soluo a 1% de hormnio anti-diurtico
(nonapeptdio) foi submetida aos tratamentos abaixo
com os seguintes resultados: a) reao fortemente
positiva para o biureto e fracamente positiva para
ninhidrina; b) a adio de cido forte gelado e posterior
neutralizao do pH, no alteraram os resultados do
item anterior; c) Com a adio de cido forte quente
(100
o
C por 2 h) e posterior resfriamento e neutralizao
do pH , a reao da ninhidrina foi positiva (fortemente
positiva). Interprete e explique estes resultados.

16
PRTICA N
o
4 - CINTICA ENZIMTICA

1. Introduo
Enzimas so catalisadores biolgicos: aceleram a
velocidade das reaes qumicas, diminuindo a energia
de ativao. Possuem, em geral, estrutura protica,
sendo que foram descritas algumas molculas de RNA
com atividade cataltica. As enzimas no alteram a
constante de equilbrio nem a variao de energia livre
das reaes, sendo regeneradas, sob a forma original, ao
final da catlise. As molculas reagentes so
denominadas substratos (S) e produtos (P) so formados
ao final. As enzimas so, geralmente, bastante
especficas com relao aos substratos, formando um
complexo com estes durante a catlise:
E + ++ + S ES E + ++ + P
Algumas teorias procuram explicar esta
especificidade: 1- teoria de Fischer (chave-fechadura)
, onde enzima e substrato seriam complementares; 2-
teoria de Koshland do encaixe induzido, ou seja, o
substrato durante a catlise se encaixa na enzima; 3-
teoria que prope o perfeito encaixe no estado de
transio, estado onde a barreira energtica (energia de
ativao) foi vencida.
Diversos so os fatores que influenciam a
velocidade de uma reao enzimtica. Por terem
estrutura protica, alteraes no pH, na temperatura, na
fora inica do meio reacional podem modific-las (s
vezes, at a estrutura dos substratos alterada),
modificando, assim, a velocidade das reaes. Como
esperado, a concentrao de substrato e de enzima no
meio reacional so determinantes para a velocidade
reacional.
A velocidade de uma reao catalisada pode ser
determinada, em instantes iniciais, atravs da
determinao do produto formado por unidade de tempo
(caso mais comum) ou atravs da mensurao do
substrato consumido por unidade de tempo. O produto
formado pode ser medido diretamente atravs de alguma
propriedade fsico-qumica caracterstica, ou ento fazer
uma reao qumica com este produto produzindo um
outro que possua propriedades apropriadas para medida.
Uma propriedade freqentemente usada para tal fim a
capacidade do produto a ser quantificado de absorver
determinados comprimentos de onda de radiaes
luminosas (o que no deve, em princpio, acontecer com
qualquer outra substncia encontrada no meio
reacional), aplicando-se os princpios da fotometria.
Os ensaios de atividade enzimtica
desenvolvidos na aula prtica sero realizados com a
enzima FOSFATASE, presente no extrato aquoso da
batata inglesa. No ensaio, a enzima catalisar a reao
de desfosforilao do para-nitrofenil fosfato, resultando
na formao de um composto de cor amarelada em meio
alcalino, o para-nitrofenol. Portanto, a atividade
enzimtica ser detectada pelo aparecimento da
colorao amarela no meio reacional.

2. Objetivos
Avaliar o efeito de alguns fatores que interferem na atividade enzimtica, tais como, o tempo de reao, a
concentrao de substrato e a concentrao de enzima.

17
3. Reagentes
Uma batata inglesa mdia (cerca de 110g).
Substrato: para-nitrofenilfosfato de sdio 1mM
(soluo fresca).
NaOH 0,02N.
Liquidificador.

4. Preparo de frao com atividade de fosfatase
alcalina
Descascar a batata;
Homogeneizar a batata descascada em 200mL de
gua, usando um liquidificador;
Filtrar o homogeneizado em algodo.
IMPORTANTE: O homogeneizado deve ser usado
no prazo mximo de 30 minutos.

5. Procedimentos
Enumerar os tubos de ensaio que seu grupo vai usar;
Colocar sempre os reagentes na mesma ordem em
todos os tubos;
O HOMOGENEIZADO DEVER SER
ADICIONADA SEMPRE POR LTIMO.
Aps adicionar o homogeneizado, agite a mistura
suavemente;
A incubao ser realizada temperatura ambiente.

5.1. INFLUNCIA DO TEMPO DE REAO
TUBO
SUBSTRATO
(mL)
GUA
(mL)
HOMOGENEIZADO
(mL)
Tempo aps a adio de 2mL de
NaOH 0,02N (min)
1 3,0 2,0 0,5* 0
2 3,0 2,0 0,5 2
3 3,0 2,0 0,5 5
4 3,0 2,0 0,5 10
5 3,0 2,0 0,5 20
6 3,0 2,0 0,5 30

*Adicionar 2mL de NaOH 0,02N antes da adio do homogeneizado (SOMENTE NO TUBO 1)
Observe a cor desenvolvida em todos os tubos.
Anote os resultados.

5.2. INFLUNCIA DA CONCENTRAO DA ENZIMA
TUBO SUBSTRATO (mL)
GUA
(mL)
HOMOGENEIZADO
(mL)
7 3,0 1,0 0,0
8 3,0 0,9 0,1
9 3,0 0,5 0,5
10 3,0 0,0 1,0

Aps 5 minutos de reao, adicione 2mL de NaOH 0,02N em cada tubo.
Observe a cor desenvolvida nos tubos (7-10). Anote os resultados.




18
5.3. INFLUNCIA DA CONCENTRAO DO SUBSTRATO. (curva [ [[ [S] ]] ] x velocidade da reao)

Aps 10 minutos de reao, adicione 2mL de NaOH 0,02N em cada tubo.
Observe a cor desenvolvida nos tubos (11-16). Anote os resultados.

6. Questes para discusso:
6.1- Por que a enzima (homogeneizado) s deve ser
adicionada por ltimo?
6.2- Como so fixadas as condies de dosagem de uma
determinada enzima em condies timas?
6.3- Explique os resultados de cada item.

7. Exerccios complementares
7.1- A variao da velocidade de reao de uma enzima
em funo de sua concentrao foi analisada em 5 tubos
conforme o indicado na tabela abaixo. Cada tubo
recebeu 0,8 mL de uma soluo de substrato 0,01mM. A
enzima usada (E) estava contida num homogeneizado
heptico a 10g% e na tabela abaixo esto indicados os
volumes deste homogeneizado adicionado a cada tubo.
O volume final em cada tubo foi o mesmo, ajustado com
tampo apropriado. Ao final de 30 minutos de reao a
quantidade de produto formado foi igual em todos os
tubos, exceto no tubo 5 que foi mantido a 0
o
C durante
toda a experincia. Com estas informaes, discuta:
a) o fato de ter sido obtida a mesma quantidade de
produto nos quatro primeiros tubos;
b) sem alterar o tempo de reao, como seria possvel
aumentar a quantidade de produto formado nesses
quatro tubos?
c) o que teria acontecido no tubo 5?






7.2 - Ao estudar-se in vitro a cintica da reao onde a
formao do produto P (fumarato), a partir do substrato
S (succinato) catalisada pela enzima E (succinato
desidrogenase) verificou-se que:
I) no sendo possvel obter-se a enzima pura, usou-se,
sempre, um mesmo volume do mesmo extrato celular;
II) a quantidade de substrato inicial estava em ligeiro
excesso; III) o pH tinha sido previamente estudado e
escolheu-se aquele que proporcionava o mximo de
atividade enzimtica; IV) a formao de produto cresceu
entre o instante zero (incio da reao) at 20 minutos da
reao; V) a partir do 20
o
minuto de incubao, a
velocidade de reao medida pela quantidade de
produto formado por minuto, diminuiu.
VI) todas as observaes acima foram obtidas em
temperatura tima de reao.
Pede-se: discutir os fatores, dentre aqueles
analisados, que poderiam acarretar a diminuio da
velocidade a partir do 20
o
minuto de incubao.
TUBO
SUBSTRATO
M
SUBSTRATO
(mL)
GUA
(mL)
HOMOGENEIZADO (mL)
11 0,0 0,0 5,0 0,5
12 54,5 0,3 4,7 0,5
13 163,0 0,9 4,1 0,5
14 272,0 1,5 3,5 0,5
15 545,0 3,0 2,0 0,5
16 909,0 5,0 0,0 0,5
TUBO ENZIMA
(mL)
1 0,2
2 0,4
3 0,6
4 0,8
5 0,8

19
PRTICA N
o
5 URINLISE

1. Introduo
Os rins desempenham suas funes mais
importantes ao filtrarem o plasma sangneo e
removerem as substncias do filtrado em quantidades
variveis, dependendo das necessidades do corpo. Alm
disso, eles depuram as substncias indesejveis do
filtrado (e, portanto, do sangue), ao excret-las na urina,
enquanto devolvem ao sangue as substncias
indispensveis ao metabolismo. A intensidade de
excreo de diferentes substncias na urina representa a
soma de trs processos renais: filtrao glomerular,
reabsoro de substncias dos tbulos renais para o
sangue e secreo de substncias do sangue para os
tbulos renais.
A urina normal essencialmente composta de
gua, tem colorao varivel entre o incolor e o amarelo
(dependente da dieta, atividades fsicas e principalmente
da ingesto de gua), e carreia substncias de excreo,
resultantes do metabolismo do organismo. Todo sangue,
ao passar pelos rins, filtrado ou depurado, eliminando
seus catablitos, que so veiculados pela gua.
Entretanto, podem aparecer na urina elementos
anormais, como: albumina, glicose e altas quantidades
de corpos cetnicos, sais e pigmentos biliares
(urobilinognio e urobilina). A anlise da urina fornece
valiosas informaes no diagnstico de doenas renais,
das vias urinrias, do trato genital e at de doenas
sistmicas.
Esta prtica refere-se a dois dos exames de rotina
de urina, atravs dos quais possvel observar o
metabolismo anormal envolvendo algumas substncias
como a glicose e os corpos cetnicos.
Em condies normais, no aparece glicose na
urina em quantidade detectvel pelos reagentes
convencionais, visto que, praticamente, toda a glicose
filtrada reabsorvida pelos rins. Entretanto, quando a
carga filtrada excede a capacidade de reabsoro da
glicose, a sua excreo urinria se d em nvel
detectvel. Um grande aumento da concentrao
plasmtica de glicose, capaz de elevar a carga de
filtrao renal acima de 320 mg/minuto, ocasiona a
excreo do excesso de glicose na urina. A glicose
plasmtica no indivduo sadio quase nunca fica elevada
o suficiente para causar a sua excreo pela urina. A
glicosria (presena de glicose na urina) pode estar
relacionada a vrias causas, como, por exemplo: fatores
endcrinos, hepticos, neurolgicos e alimentares. No
diabetes mellitus no-controlado, o nvel plasmtico de
glicose pode atingir valores elevados, com conseqente
excreo urinria desta ose. A presena de glicose na
urina pode ser evidenciada atravs da reduo alcalina
pelo cobre. Portanto, utiliza-se para a pesquisa de
glicose na urina o reagente de Benedict, que consiste de
uma soluo de sulfato de cobre em um meio alcalino.
Os chamados corpos cetnicos (acetoacetato,
cido -hidroxibutrico e acetona), quando presentes em
nveis elevados na urina, indicam um quadro de jejum
severo e prolongado ou diabetes mellitus no tratado.
Em condies normais, o cido acetoactico e o cido
-hidroxibutrico que entram na corrente sangnea so
transportados, to rapidamente, para os tecidos, que suas
concentraes plasmticas, combinadas, raramente se
elevam acima de 3 mg/dL. Os corpos cetnicos so
liberados do fgado e transportados at as clulas.
Todavia, as clulas so limitadas, quanto quantidade
de corpos cetnicos que podem oxidar, devido a vrias
razes, dentre as quais pode-se destacar a quantidade de
oxaloacetato que necessrio para iniciar a oxidao de
Acetil-CoA no ciclo do cido ctrico. Os corpos
cetnicos no sangue e na urina podem atingir nveis

20
extraordinariamente altos, provocando uma condio
conhecida como: cetonemia e cetonria,
respectivamente. A pesquisa de corpos cetnicos na
urina realizada atravs do reagente de Imbert. Este
reativo de uma soluo de nitroprussiato de sdio em
cido actico glacial.

2. Objetivo

Analisar amostras de urina, quanto presena ou
ausncia de glicose e de corpos cetnicos.

3. Reagentes
8,5 mL de urina.
2,5 mL de Reativo de Benedict ( CuSO
4
; citrato de
sdio e Na
2
CO
3
).
1 mL de Reativo de Imbert ( nitroprussiato de sdio
e cido actico glacial).
3 mL de NH
4
OH 10% (p/v).

4. Procedimentos

4.1. Pesquisa de Glicose

colocar 2,5 ml do Reativo de Benedict em um tubo
de ensaio;
depositar 4 gotas de urina lmpida;
misturar e levar ao banho-maria at entrar em
ebulio;
deixar esfriar espontaneamente (aproximadamente
15 minutos);
observar a colorao do lquido.

RESULTADOS
cor inalterada (azul) negativo
verde-azulado ou verde traos
verde (qualquer tom) com
precipitado amarelo
positivo +
castanho ou marrom positivo ++
vermelho tijolo positivo +++


4.2. Pesquisa de Corpos Cetnicos
colocar 8 ml de urina em um tubo de ensaio;
adicionar 12 gotas do Reativo de Imbert e misturar;
inclinar o tubo e com o auxlio de uma pipeta, deixar
escorrer pelas paredes do tubo aproximadamente 3
ml de NH
4
OH 10%, lentamente, de tal maneira que
os dois lquidos no se misturem;
observar a superfcie de contato entre os dois
lquidos.



5- Questes para Discusso

5.1- Comente (sucintamente) a participao dos
hormnios: adrenalina, cortisol, glucagon e insulina no
controle da glicemia, envolvendo as vias metablicas e
os seus mecanismos de ao.
5.2- Por que em condies de jejum severo e
prolongado ou o diabete melito no compensado pode
acarretar uma cetonemia e conseqente cetonria?
5.3- Conceitue e diferencie (metabolicamente):
diabetes insipidus e diabetes mellitus e diabetes
renallis.




RESULTADOS
Nenhuma alterao ocorrida negativo

Presena de um anel violeta positivo


21
PRTICA N
o
6 - ISOLAMENTO DE DNA DE CLULAS DE CEBOLA


1. Introduo
Nos organismos eucariontes e procariontes a
informao gentica est localizada nas molculas de
cido desoxirribonuclico (DNA), que so polmeros de
nucleotdeos, nos quais o acar a desoxirribose. O
DNA est localizado principalmente no ncleo dos
eucariontes, associado com protenas (principalmente
histonas) e dentro de organelas como mitocndrias e
cloroplastos.
Os mtodos utilizados para a deteco e
dosagem do DNA celular nuclear de eucariontes (pois o
de cloroplastos e mitocndrias no em geral, detectado
pelas tcnicas rotineiras) implicam no rompimento das
membranas citoplasmtica e nuclear. Neste experimento,
o rompimento das membranas plasmtica e nuclear ser
realizado com o tratamento do detergente aninico
duodecil sulfato de sdio (SDS). Os tratamentos com
detergentes, inicos ou no, so largamente utilizados na
solubilizao de protenas e lipdeos de membrana.
Nestes processos de solubilizao por detergentes, so
formadas micelas, que consistem de protenas, lipdios e
detergentes. O tratamento das clulas com uma
concentrao relativamente alta de SDS resulta no
rompimento das membranas celulares com a
conseqente liberao das nucleoprotenas. A atividade
da enzima digestiva (DNAase) ser inibida pela ao do
EDTA em meio alcalino que altera pH e quela os ons
divalentes necessrios ao da DNAase. A adio de
etanol sobre a fase aquosa, contendo os cidos nuclicos
dissolvidos, resultar na precipitao destes, uma vez
que o etanol diminui a constante dieltrica da gua,
promovendo uma menor solubilizao das molculas de
DNA.
Nas tcnicas de biologia molecular, o DNA
deve estar livre de protenas, para isto, estas devem ser
extradas. Normalmente, esse procedimento realizado
utilizando-se uma soluo de clorofrmio/lcool
isoamlico, que desnatura as protenas e, aps
centrifugao, estas so retiradas da soluo de DNA.

2. Objetivo
Isolar DNA de clulas de cebola.

3. Material
Cebola.
Soluo salina-EDTA:
NaCl 0,15 M
EDTA 0,1 M (pH=8,0).
SDS 2% (P/V).
Etanol absoluto 95%.
Soluo Tris-EDTA (TE)*
10 mM Tris.Cl, 1 mM EDTA - pH 7,5.
Obs:
*Esta soluo mantm a fora inica, dissolvendo o
DNA, alm de quelar ons divalentes, necessrios para a
ao da DNase.

4. Procedimentos
Cortar 5 g de cebola (fatia fina e bem picotada);
Colocar a cebola picada em um tubo Falcon de 15
mL;
Adicionar 2.5 mL de soluo salina EDTA;
Adicionar 1.0 mL de SDS 2%;
Macerar a cebola com ajuda de um basto de vidro
durante 5 minutos;
Filtrar a soluo com gaze para retirar os fragmentos
de cebola;
Colocar o filtrado em um tubo de vidro;
Adicionar, lentamente, com pipeta, 4 mL de lcool
etlico 95% de modo que os dois lquidos no se

22
misturem. Notar que na interface, forma-se um
material insolvel filamentoso, o DNA;
Introduzir um basto at a regio de interface.
Imprimir-lhe um movimento circular e verificar que
o material filamentoso ir aderir ao mesmo;
Retirar o basto e dissolver o precipitado a ele
aderido em 2 mL da soluo de Tris-EDTA.

Desproteinizao (No realizada durante a aula
prtica):
Aps a dissoluo do DNA, adicione igual volume
(2 mL) da mistura de clorofrmio:lcool isoamlico
24:1 (V/V), e agite vigorosamente por 30 minutos;
Centrifugue a emulso resultante a 3000 rpm durante
10 minutos;
A emulso ser separada em 3 camadas;

A camada superior (aquosa) contm os dois tipos de
cidos nuclicos (DNA e RNA) que devem
coletados para posterior utilizao.

5. Questes para discusso:
5.1 - Qual a funo da soluo de SDS?

5.2 - Ao romper a clula e, tambm, suas organelas, pela
tcnica descrita acima, o DNA no seria degradado por
enzimas lisossomais?



SOLUO DE
DNA