Fundamentos de Extrao

de DNA e RNA

MSc. Ana Liedke

Importncia
Uso de DNA para estudos de natureza variada:
diagnstico (sensvel e especfico);
medicina (estudo do cncer; identificao doenas);
processos evolutivos (filogenias, estudos populacionais);
genoma
investigaes de percia, paternidade...
Uso de RNA para estudos de natureza variada:
Transcrio Reversa do RNA (cDNA);
Anlises de expresso gnica
Northern, RT-PCR, construo de bibliotecas de cDNA

Organismos
bactrias, fungos, vrus, tecidos vegetais e tecidos animais

Organismos
bactrias, fungos, vrus, tecidos vegetais e tecidos animais

A extrao e a purificao de cidos nuclicos uma etapa fundamental para

se obter alta eficincia de amplificao nos protocolos que usam a reao em
cadeia da polimerase (PCR).

Tipos de DNA
Eucariontes (ncleo individualizado)
DNA nuclear;
DNA mitocondrial;
DNA cloroplasto;

Tipos de DNA
Eucariontes (ncleo individualizado)
DNA nuclear;
DNA mitocondrial;
DNA cloroplasto;

Tipos de DNA
Procariontes (sem ncleo)
DNA circular;
DNA plasmidial;

Fator adicional: parede celular

Extrao de DNA/RNA

Extrao de DNA/RNA
Passos principais:
lise das membranas plasmticas e nucleares;
degradao protenas;
purificao do DNA/RNA.

Para cada tipo de amostra,

vrios protocolos
podem ser testados,
adaptados e otimizados, de
maneira a se conseguir
DNA de boa qualidade.

Extrao de DNA/RNA
Passos principais:
lise das membranas plasmticas e nucleares;
solubilizadas por agentes que rompam associaes
hidrofbicas e destruam a bicamada lipdica.

detergentes

Extrao de DNA/RNA
Passos principais:
lise das membranas plasmticas e nucleares;
solubilizadas por agentes que rompam associaes
hidrofbicas e destruam a bicamada lipdica.

detergentes

micelas

Extrao de DNA/RNA
Passos principais:
lise + degradao protenas;

detergentes

Proteinase k

Extrao de DNA/RNA
Passos principais:
lise + degradao protenas;

A Proteinase K foi
descoberta em 1974, no
fungo Tritirachium album;
capaz de digerir a
queratina (Keratin), da o
nome Proteinase K.

detergentes

Proteinase k

Rapidamente inativa as
nucleases, que degradam
o DNA e RNA

Extrao de DNA/RNA
Passos principais:
lise + degradao protenas;

Digesto em
banho-maria com
temperatura
prxima a 50C

detergentes

Proteinase k

O tempo de incubao pode variar. Importante que a amostra se apresente

totalmente digerida

Extrao de DNA/RNA

Fenol: desnaturao das protenas de maneira eficiente, remove

as partes orgnicas
Aviso: O fenol um produto altamente txico, irritante para a pele e
mucosas

Fenol:Clorofrmio:lcool isoamlico (25:24:1): eficiente para

desproteinizar e sua ao se fundamenta na propriedade
hidrfoba das protenas que apresentam afinidade por solventes
orgnicos. IAA reduz espuma, deixa parte orgnica mais densa.
Clorofrmio: retira resduos de fenol

Extrao de DNA/RNA
Passos principais:
purificao do DNA/RNA (eliminao de resduos orgnicos)

Uso de lcool para a precipitao

formao do Pellet

A molcula de DNA no solvel em lcool e, desta maneira, tende a

formar um aglomerado de molculas quando em meio alcolico.

Notas - Extrao de RNA

A principal preocupao na extrao de RNA consiste na sua
degradao por ribonucleases (RNAses), que so enzimas extremamente
resistentes a vrios tratamentos, inclusive trmicos (fervura,
autoclavagem etc.);
DEPC (dietilpirocarbonato): diminuir a contaminao com RNAses das
solues, equipamentos, vidrarias e reagentes;
Bons cuidados: pipetas, vidraria, luvas...
Extrao usa: TRIZOL consiste num reagente pronto para o uso no
isolamento de RNA total de clulas e tecidos;
DNAse;
O RNA total livre de contaminaes por DNA ou protenas.

Quantificao DNA/RNA
Espectrofotmetro

Qualidade da extrao

Determinao da quantidade de
DNA/RNA extrado

260 e 280 nm

nucleotdeos podem ser detectados por espectrofotometria

a um comprimento de onda de 260 nm
280 nm para estimar a contaminao com
protenas

razo 260/280 = 1,7 e 1,9 amostra de DNA com pureza adequada

Um valor inferior indica contaminao com protenas e um valor superior indica
contaminao com RNA.

Conservao da amostra
Amostras de tecidos (p.ex. animais) devem ser colocadas em lcool
absoluto imediatamente aps a coleta, e trocado aps 24h.
Amostras de partes vegetais devem ser lavadas e secadas com slica.
Para todas amostras congeladas em estoque, prefervel o
fracionamento em pequenas alquotas para que o material no sofra
descongelamentos sucessivos, que poderiam contribuir para a oxidao
do tecido e para a degradao do DNA.
O manuseio dessas amostras deve ser feito preferencialmente com o
uso de luvas, para que uma parte dos cidos nuclicos no sejam
degradados

Material Necessrio

Para executar os protocolos de extrao de DNA, necessrio que o laboratrio

tenha os equipamentos bsicos, o material plstico e todas as solues utilizadas nos
procedimentos. O material mnimo necessrio o seguinte:
a) Centrfuga com rotor para vrios tipos de tubos
b) Capelas de exausto.
c) Banho-maria com termostato ou com termmetro para aferio da temperatura.
d) Microtubos de polipropileno.
e) Micropipetas automticas para volumes diversos (com ponteiras).

Fundamentos de Eletroforese
Agarose (AGE) e
Poliacrilamida (PAGE)

MSc. Ana Liedke

Eletroforese
um mtodo simples e muito eficiente para separar, para identificar e
para purificar fragmentos de DNA, RNA e de protenas.
Ela consiste na separao de molculas ionizadas de acordo com sua
carga eltrica e seu peso molecular.
Molculas com carga negativa migram para o plo positivo (nodo) e
molculas com carga positiva migram para o plo negativo (ctodo).
A migrao das cargas quando so submetidas a uma diferena de
potencial chamada de eletroforese.

Eletroforese
Existem dois modelos bsicos de eletroforese:
Gel de agarose

+
AGE

Eletroforese
Existem dois modelos bsicos de eletroforese:
Gel de agarose
Gel de poliacrilamida

+
AGE

PAGE

Eletroforese
Existem dois modelos bsicos de eletroforese:
Gel de agarose
Gel de poliacrilamida

+
AGE

PAGE

Fonte

Eletroforese

Plo -

Plo +

Equipamento - Agarose
gar-gar (gar ou agarose)
um hidrocolide componente da parede celular, extrado de
diversas algas marinhas vermelhas da classe Rodophyta;
insolvel em gua fria
dissolve em gua quente (absorve uma quantidade de gua de
cerca de vinte vezes o seu prprio peso) formando um gel noabsorvvel, no-fermentvel e com importante caracterstica de ser
atxico.
Concentraes de 0,5 2,5%
Diludos no tampo TBE ou TAE.
(Tris-borato-EDTA ou Tris-acetato-EDTA)

Fatores que afetam a migrao de

fragmentos de DNA em gis de agarose
Tamanho do DNA
Diferentes tamanhos de molculas, diferentes taxas
de migrao no gel de agarose
Concentrao da agarose
Conformao do DNA

Fatores que afetam a migrao de

fragmentos de DNA em gis de agarose
Tamanho do DNA

Concentrao da agarose
Conformao do DNA

Fatores que afetam a migrao de

fragmentos de DNA em gis de agarose
Tamanho do DNA

Concentrao da agarose
Conformao do DNA
em formas ou conformao do DNA,

a migrao velocidades
DNA superenrolado
DNA linear

mais lento
mais rpida

Equipamento - Agarose
Despeja na forma
com o pente
Agarose

Cuba com Tampo

TBE ou TAE

tampo

aquece

Equipamento
DNA

marcador migrao

(Glicerol, Ficol, Blue Juice, Azul de bromofenol)

aumentar a densidade da amostra (faz afundar
no poo)
adicionar cor s amostras
Permite acompanhar a corrida

(+)

marcador de tamanho molecular

(Low mass, High e Ultra
High...)
DNA com fragmentos
de tamanho conhecido

Equipamento
DNA

marcador migrao
(Glicerol, Ficol, Blue Juice, Azul de bromofenol)
aumentar a densidade da amostra (faz afundar
no poo)
adicionar cor s amostras
Permite acompanhar a corrida

(+)

marcador de tamanho molecular

(Low mass, High e Ultra High...)

Depois de migrar o suficiente.....

Colorao com brometo de Etdio (EtBr) (0,0001%).

Transiluminador (caixa de luz UV)

Brometo de Etdio
AVISO: Danoso se for engolido ou absorvido pela pele. Prejudicial se for inalado. Causa irritao pele, olhos e trato respiratrio.

Intercala entre as fitas de cidos nuclicos

Fluorescente na luz ultravioleta

Equipamento - Poliacrilamida
Utilizado tanto para Protenas quanto para DNA/RNA
Composto por Acrilamida e Bis-Acrilamida
AVISO: Perigoso!!! Danoso se for engolido,inalado ou
absorvido pela pele. Causa irritao da pele, olhos e trato respiratrio. Pode afetar o sistema nervoso central.

Concentraes diferentes quanto mais acrilamida, menores os poros

Protenas: a carga e a forma devem ser excludas, com adio de SDS

(dodecilssulfato de sdio) que possui carga negativa
converte protenas em estrutura linear

Equipamento - Poliacrilamida
Colorao com:

Brometo de Etdio (EtBr),

prata (sensibilidade maior: menos amostra no gel e
anlise de amostra diluda)
SYBR Green (menos mutagnico)

Coomassie Blue
se liga inespecificamente a praticamente
todas as protenas.
menos sensvel que corar com a prata
mas efetivo tambm, alm de ser fcil de
corar

Fotodocumentao
Transluminador
Caixa acoplada mquina fotogrfica
Computador

AGE

Fcil preparo, no-txico.

menor capacidade de resoluo,
porm apresenta maior extenso
de separao. Longos
fragmentos de DNA (50-20.000
bp)

PAGE

mais difcil de ser preparado e muito

txico quando em p ou em soluo.
tem maior capacidade de resoluo e
mais efetivo para separar pequenos
fragmentos de DNA (5-500 bp pares
de base).
podem ser separados fragmentos
com tamanho de apenas uma base
de diferena.
tambm usados para separao de
protenas