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Apostila A - Patologia

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PATOLOGIA GERAL

INTRODUÇÃO Patologia é o ramo da ciência médica que estuda as alterações morfológicas e fisiológicas dos estados de saúde. Quando essas alterações não são compensadas podemos dizer que um indivíduo está doente. Etimologicamente, o termo "patologia" origina-se do grego ("pathos" = sofrimento, doença; "logia" = estudo). Conceitualmente, podemos posicionar a doença como sendo uma alteração de forma e de função não compensada de uma célula, de um orgão, de um sistema, de um indivíduo, de uma população e, finalmente, de uma sociedade. Já um "estado de saúde" é definido pela OMS (Organização Mundial de Saúde) como sendo "o bem-estar físico, mental e social do homem". A ciência Patologia atualmente ramifica-se em diversas subáreas; PATOLOGIA GERAL por restringir-se ao estudo dos mecanismos gerais envolvidos na determinação de um estado patológico, portanto, de doença, não se preocupando com as características peculiares de cada entidade em particular. O objetivo é transmitir a filosofia do processo patológico, descrevendo as características que definem o mecanismo de transição de um estado de saúde para um estado de doença e PATOLOGIA ESPECIAL que estuda as patologias nos diferentes aparelhos e sistemas orgânicos. Com esse intuito, o programa de Patologia Geral engloba os tópicos de Degeneração, Infiltração, Alterações circulatórias, Pigmentação patológica, Necrose, Inflamação e processos reparativos, Processos proliferativos e neoplásicos (distúrbios de crescimento e desenvolvimento). Previamente a qualquer explanação sobre períodos ou personalidades saúde e doença são aqui empregados para designar estados funcionais, cuja especulação está diretamente ligada ao estudo dos elementos primários constituintes dos seres vivos. Isso quer dizer que narrar sobre Patologia e sua história implica ao menos se considerar a origem desses indivíduos, ainda que sob a forma de informação simplesmente ilustrativa. É claro que abordar sobre a geração, o desenvolvimento e o crescimento dos seres vivos é uma tarefa complexa; relacionar o surgimento da vida com a própria origem do Universo é duplamente difícil. Indiscutivelmente esse assunto recai em dúvidas e colocações que ainda se encontram em níveis de suposições, o que leva a se considerar algumas teorias vigentes. Dever-se-ia reservar um capítulo a parte para esse tipo de discussão, talvez sob forma de texto introdutório em explanações sobre a evolução natural, seja ela científica ou religiosa, a semelhança do que se observa em obras que citam a teoria do Big Bang ou mesmo nos livros da Sagrada Escritura. A idéia desta explanação, porém, é tentar relacionar o processo de formação dos seres vivos com as diferentes fases de evolução do pensamento filosófico sobre Patologia, culminando com a conceituação atual, sem contudo manter o caráter de retrocesso temporal, inerente a qualquer narração histórica, mas sim, acentuar a sutileza da contemporaneidade que existe em cada uma das fases. Em suma, a tentativa aqui apresentada é resgatar os conceitos

2 antigamente difundidos e reuni-los em um esquema comum de aprendizado dos fenômenos patológicos. Baseando-se nessa linha de abordagem, o mesmo se faria com as diferentes fases de aprendizado do aluno, intituladas por nós como sendo, agora, a sua história. Isso se traduziria, em termos práticos, no retorno do aluno às matérias básicas, como Histologia, Fisiologia, Anatomia e outras. Assim, explicar a origem dos indivíduos por intermédio da abordagem dos seus elementos químicos constituintes representaria, nesse momento, reintroduzir ao estudante o raciocínio sobre Biologia, Bioquímica, Histologia; a Microbiologia seria avivada quando na abordagem da descoberta da célula e da formação dos primeiros seres unicelulares, que por sua vez envolveria tópicos de Fisiologia, e assim por diante. É por intermédio dessa interrupção das diretrizes temporais que acreditamos conseguir transmitir o conceito sobre a origem da doença como um desequilíbrio da contínua transformação do ser. De acordo com a teoria celular, a célula é formada por uma membrana, um citoplasma e um núcleo, que originam uma estrutura viva capaz de controlar seus níveis energéticos, mantendo-os em equilíbrio com o meio extracelular. As membranas são formadas pela combinação de moléculas básicas do tipo lipoproteínas e fosfolipídeos; a polimerização dos nucleotídios origina o núcleo, mais precisamente o DNA e o RNA, responsáveis pelo controle das reações moleculares internas à membrana ou nela realizadas. O DNA e o RNA formam o código genético e são as estruturas informacionais e controladoras da manutenção dos níveis energéticos internos, traduzida principalmente pela biossíntese de proteínas. O citoplasma, por fim, é composto predominantemente por proteínas imersas em um meio aquoso, originando uma espécie de "gel" no qual se processam inúmeras reações químicas e o transporte de moléculas. No citoplasma estão imersas as organelas, compartimentos delimitados por membranas mais simples, com funções específicas de respiração, síntese energética e transporte. Cada uma das partes da célula - organelas, núcleo, membrana e citoplasma - é constituída pelas macromoléculas já descritas. Imaginando a combinação desses elementos em unidades cada vez mais crescentes em complexidade, pode-se "viajar" da estrutura simples de uma bactéria (membrana e DNA) ou de um vírus (cápsula protéica e DNA) até às diferentes células dos vários sistemas estruturais do ser humano. Cada célula tem a propriedade de adquirir características e funções peculiares. A união de células com características comuns é denominada de tecido. O tecido, pois, é composto predominantemente por células e pela substância intercelular. Formada pelas mesmas moléculas primárias que compõem a célula, a substância intercelular é responsável pela arquitetura básica na qual a célula se apóia. É na substância intercelular que se processam as comunicações célula a célula, aspecto biológico muito estudado atualmente na Patologia Moderna. Conhecida a célula e o ambiente na qual ela realiza suas funções, podemos nesse momento dissertar sobre como, durante a História, os estudiosos de Patologia abordavam esse assunto, considerado atualmente como extremamente multidisciplinar.

3 HISTÓRIA DA PATOLOGIA EM FASES Didaticamente, a Patologia tem sua história dividida em fases. Estas nada mais são do que a descrição dos conceitos utilizados para explicar a origem dos estados de doença vigentes em um determinado intervalo de tempo e segundo a corrente filosófica predominante.  Fase Pré-Humoral (Não Anatômico) [Idade Antiga até 400 AC] O mecanismo da origem das doenças era explicado, nessa fase, pelo desequilíbrio de humores. Os humores eram considerados os líquidos do corpo, em particular, a água, o sangue e a linfa. Os deuses tinham o poder de controlar esse desequilíbrio, bem como de restituir a normalidade do organismo. Essa visão mítica de doença foi criada principalmente pela civilização antiga grega. As moléstias eram consideradas como conseqüentes do desagrado dos deuses ou pela fúria dos espíritos maléficos. Nesta época a medicina era empírica, confundia-se com a religião, a feitiçaria, magia e a superstição, sendo exercida principalmente pelos sacerdotes e pelos feiticeiros. Este conceito teista ainda perdura entre os povos primitivos atuais. Para se protegerem dos espíritos maléficos utilizavam-se de amuletos. No código de Hamurabi (2000 AC) trata-se dos honorários médicos e inclusive a sua responsabilidade. Para os gregos, o deus da medicina era Asclépio (Esculápio para os romanos), filho de Apolo representado pela imagem de um homem de barba, segurando um bordão erroscado por uma serpente.  Fase Humoral (Não Anatômico) [Hipócrates - 400 AC] Esta fase caracteriza-se pela compreensão das moléstias como alterações que provocam os humores. Os sintomas são relacionados com as lesões. Hipócrates, filho de um médico nascido na ilha de Cós em 460 AC transformou a medicina em uma ciência e arte. Hipócrates de Cós é considerado o pai da medicina tendo em vista suas contribuições principalmente pelo juramento médico. A medicina hipocrática era baseada nos humores: sangue (sanguíneo), bile amarela (bilioso), bile negra (melancólico) e fleugma (fleugmático). Saúde ocorria quando os quatro humores estavam em equilíbrio (eucrasia) Doença era a discrasia. Em Roma, Cornélius Celsus estabeleceu as bases da inflamação. Na Europa Medieval com o advento das cruzadas a medicina retorna ao ocidente, tornando-se os monges, médicos que dedicaram-se a copiar e fazer traduções de manuscritos antigos.  Período Anatômico • Fase Orgânica (séc. XV - XVI) Nessa época, há o predomínio da observação dos orgãos do corpo, feita principalmente às custas das atividades de necrópsia ou de autópsia (estudo do cadáver). Jean Fernel rompeu com os conceitos antigos e passou a classificar as moléstias em gerais (aquelas de localização inderminada – febre) e especiais (com localização definida). No renascimento Leonardo da Vinci deixou inúmeros desenhos de anatomia. Andréas Vesalius de Bruxelas publicou “De Humanis Corporis Fabrica” demonstra a verdadeira anatomia humana relacionando a forma com a função. No século XVII, Willian Harvey e Malpighi desvendam a circulação sanguínea. Morgagni em 1761 escreveu a origem e a causa das doenças, gerando os principais fundamentos da patologia. • Fase Tecidual (séc. XVI-XVIII)

4 A Fase Tecidual enfatiza a estrutura e a organização dos tecidos. É nesse período que se iniciam os primeiros estudos sobre as alterações morfológicas teciduais e suas relações com os desequilíbrios funcionais. É com o advento do microscópio melhorado por Robert Hooke que descreve as celas existentes na cortiça que depois deram o nome à célula. Marcelo Malpighi funda a anatomia macroscópica com as observações das estruturas macroscópicas. • A Fase Celular (séc.XIX) Com o predomínio da visão morfológica, somada à aplicação do microscópio óptico às pesquisas médicas, segue-se a Fase Celular, período considerado "inicial à Patologia Moderna". A preocupação com o estudo da célula, principalmente de suas alterações morfológicas e funcionais, é determinante na busca da origem de todo processo mórbido. Após a proclamação da teoria celular por Scheiden & Schwann, Virchow lançou as bases da Patologia Celular. Nesta fase as doenças são decorrentes de alterações celulares e desta forma podem ser explicadas. • A Fase Ultracelular (séc. XX) A Fase Ultracelular é a fase atual do pensamento conceitual sobre Patologia, envolvendo conceitos sobre biologia molecular e sobre as organelas celulares. Os avanços bioquímicos e a microscopia eletrônica facilitam o desenvolvimento dessa linha de estudo. Com o advento da microscopia eletrônica pode-se ver que a estrutura celular era muito mais complexa do que se pensava. Sendo a preocupação dos estudos em Patologia centrada em explicações moleculares, retornamos ao início da História da Patologia, em que se dissertou sobre a gênese celular por intermédio de teorias sobre as principais "moléculas da vida". HISTOTÉCNICA

Os métodos para obtenção de preparados histológicos para estudo a través do microscópio ótico é conhecida como Histotécnica. A técnica histológica engloba uma série de procedimentos que veremos a seguir: Primeiro há necessidade de obter-se a amostra de tecido que pode ser de duas formas: - Necropsia: obtenção de tecido de indivíduo morto. - Biópsia: (do grego: bios=vida, psia=ver). Significa exame ou obtenção de tecido através de punção, incisão, excisão, “punch”, pinça sacabocado, raspado, trepanação, etc. Uma vez retirado o tecido, este é enviado ao laboratório para processamento. a) FIXAÇÂO: dura cerca de 12 horas dependendo do tamanho do material e do fixador. Normalmente utiliza-se de solução de formol a 10% ou formoldeído a 5%. Objetiva fixar as proteínas através de enlaces, mantendo a estrutura celular e inativa enzimas com a finalidade de evitar a autólise. b) DESIDRATAÇÃO: dura cerca de 6 a 12 horas. É utilizado álcool etílico em concentrações crescentes (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 96%)

5 terminando com álcool absoluto. O fixador é eliminado bem como a água no histo-processador, substituindo-os por álcool. CLAREAMENTO ou DIAFANIZAÇÃO: dura de 1 a 6 horas, a diafanização é a substituição do álcool por benzina ou xilol, que serão solventes da parafina. Lembre-se que o álcool e o xilol dissolvem também os ácidos graxos e as gorduras que serão nesta fase removidos das células. INCLUSÃO EM PARAFINA: dura de 30 minutos a 6 horas, a peça é colocada em parafina fundida em estufa a 60ºC, e o xilol é substituído por parafina. CONFECÇÃO DO BLOCO: uma vez substituído o xilol por parafina, deixa-se descançar para a secagem do bloco. MICROTOMIA: é o corte do material no micrótomo elétrico ou manual, com o fim de obter cortes finos do bloco de parafina. Na microscopia ótica de luz utiliza-se cortes com a espessura de 3 a 10 um. Para se estudar lipídios ou quando se busca um exame antecipado, pode-se fazer a biópsia de congelação já que o material congelado pode ser cortado pois encontra-se endurecido. COLORAÇÃO: o tecido preparado é transparente. Para que se possa vizualizar as estruturas celulares há a necessidade de coloração do material. Os principais corantes utilizados são a hematoxilina e a eosina. MONTAGEM DA LÂMINA: após a coloração é colocado bálsamo do Canadá e a lamínula sobre a região que manterá esta lâmina. O bálsamo do Canadá evita a oxidação do material.

c)

d) e) f)

g) h)

FUNDAMENTOS QUIMICOS DA COLORAÇÃO Os corantes dividem-se em três classes: • • • Corantes que diferenciam os componentes ácidos e básicos. Corantes especializados que distiguem os componentes fibrosos. Sais metálicos que precipoitam nos tecidos e formam depósitos metálicos.

A eosina é um corante (róseo), acido, que se liga às partes básicas das celulas – citoplasma – (acidófilas). A hematoxilina (azulada), é um corante básico que se liga às partes acidas da célula – núcleo – (basófilo). COLORAÇÕES ACIDAS Fucsína ácida (roxo) Azul de anilina (azul) Eosina (roxo) Laranja G (laranja) COLORAÇÕES BÁSICAS Verde de Metileno (verde) Azul de Metileno (azul) Pironina (roxo) Azul de toluídina (azul)

Metacromasia: é o fenômeno em que o corante sofre variação de cores de acordo com o componente tecidual. (ex.: azul de toluidina).

6 Tricrômio de Mallory: é um corante especial que utiliza-se da mistura de vários corantes, e deste modo cora os tecidos conforme a afinidade existente pela estrutura. CORANTES E REAÇÕES HISTOLÓGICAS COMUNS REATIVO RESULTADO HEMATOXILINA Azul => Núcleo e regiões acidas do citoplasma EOSINA Rosa => Regiões básicas do citoplasma TRICROMIO DE MASSON Azul escuro => Núcleo. Roxo => músculo. Azul claro => colágeno. CORANTE DE ORCEÍNA Pardo => Fibras elásticas. CORANTE DE WEIGERT Azul => Fibras elésticas. TINTURAS ARGÊNTICAS Negro => Fibras reticulares. HEMATOXILINA FÉRRICA Negro => músculos estriados. ÁCIDO PERIÓDICO DE SCHIFF Magenta => moléculas de lipídios. CORANTES DE WRIGTH E GIEMSA Rosa => hemácias. Púrpura => núcleos dos leucócitos. Azul => Citoplasma dos monócitos. Houve, no decorrer dos diferentes períodos citados, um direcionamento das observações humanas para um mundo cada vez mais microscópico, culminando com a fase atual. O pensamento filosófico sobre Patologia engloba, pois, escalas dimensionais extremamente variáveis, desde o átomo até o homem como um todo, podendo-se estender essa escala até mesmo para sociedade. Pretende-se, assim, no decorrer desta apostila, apontar, sempre que pertinente, os diferentes conceitos envolvidos em algumas dimensões determinadas, o que se traduz pela abordagem das diferentes ciências relacionadas em cada fase histórica.

CÉLULA NORMAL
As numerosas investigações iniciadas no princípio do século XIX por Mirbel, 1802, seguidas entre outros por Lamark, 1809, Dutrochet, 1824, - e finalmente por Schleiden, 1838, e Schwann, 1839, levaram ao postulado da "teoria celular", a qual estabelece que todos os seres vivos, animais ou plantas são compostos de células e seus produtos. Tal teoria causou grande efeito em todos os campos da investigação biológica, tendo em seguida se estabelecido que toda célula é formada pela divisão de outra célula. Mais tarde, com o desenvolvimento da bioquímica, foi possível mostrar que existem semelhanças fundamentais na composição química e atividades metabólicas de todas as células. Reconheceu-se facilmente que a função de um organismo como um todo é o resultado do somatório das atividades e interação das unidades celulares. A teoria celular foi logo aplicada à patologia por Virchow. O contínuo aprimoramento do material óptico e outros equipamentos de laboratório permitiu o desenvolvimento de técnicas cada vez melhores para se

7 conhecer e entender a morfologia e o funcionamento da célula. O século passado foi importante por ser o período das descobertas de estruturas celulares fundamentais como o núcleo (Brown, 1831), os cromossomas (Waldeyer, 1888), as mitocôndrias (Altmann, 1894, Benda 1897), o aparelho de Golgi (Golgi, 1898), etc., assim como pela descrição dos fenômenos da mitose, fertilização e segmentação celular. No início deste século, as atenções foram voltadas para a célula viva, culminando com o desenvolvimento da técnica de cultura de tecido. A microcirurgia (micromanipulação) foi outra técnica que permitiu não apenas o isolamento de uma única célula em cultura, como possibilitou operações intracelulares chegando-se a uma infinidade de dados sobre a fisiologia celular. A convergência da citologia com a bioquímica levou ao desenvolvimento da citoquímica, que permite a localização de diferentes compostos celulares in loco. A partir de meados deste século, outro grande avanço foi o uso do microscópio eletrônico, o qual continua a ser utilizado atualmente, inclusive combinado com citoquímica. O conhecimento da organização da célula é de importância fundamental porque praticamente todas as transformações físico-químicas acontecem no nível da arquitetura da célula. A descoberta de que, na molécula de proteína, a seqüência exata dos aminoácidos e o arranjo tridimensional da cadeia polipeptídica têm relação direta com um segmento do DNA da célula que a sintetizou é um exemplo do avanço dos conhecimentos em nível celular e que levaram ao aparecimento da biologia molecular. Esta proporciona informações a vários campos, entre eles à Patologia, através da descrição das doenças moleculares. Concluindo, podemos dizer que, sem perder a visão da célula como a unidade morfológica e funcional dentro do organismo, devemos estar preparados para estudar fenômenos biológicos em todos os níveis e usar todos os métodos, técnicas e conceitos de outras ciências. MORFOLOGIA E METABOLISMO CELULAR O exame de uma célula viva é baseado principalmente nas diferenças dos índices de refração dos diferentes componentes celulares. Às vezes, o uso de corantes vitais facilita essa visualização. Entretanto, as mais importantes observações morfológicas são feitas em células fixadas e coradas com os diversos fixadores e corantes. A célula eucarionte é caracterizada pela presença de uma membrana que segrega o material genético, dividindo-a em dois componentes principais: o núcleo e o citoplasma. Este último é limitado pela membrana plasmática, que possui muitas diferenciações. O citoplasma é subdividido em compartimentos e subcompartimentos por numerosas membranas intracelulares formando o chamado sistema vacuolar, cujas principais porções são o retículo endoplasmático (rugoso e liso), o envoltório nuclear (carioteca), e o complexo de Golgi; aparecem ainda, como organelas separadas por membranas, as vesículas de secreção, os lisossomas, as mitocôndrias, etc. O citoplasma fundamental ou matriz permanece fora desse sistema e contém ribossomas livres, microtúbulos, microfilamentos, proteínas solúveis, etc. A MEMBRANA PLASMÁTICA As características individuais de cada célula são mantidas por uma membrana a membrana plasmática, que, além de definir o tamanho da célula, mantém as diferenças existentes entre seu interior e o meio externo. Assim, ela se com-

8 porta como um filtro altamente seletivo, controlando a entrada e saída de substâncias. Ela também atua como receptora de estímulos externos, permitindo que a célula responda aos mesmos. A membrana plasmática e todas as demais membranas celulares apresentam estrutura geral comum: são formadas pelo arranjo de moléculas de lipídeos e proteínas mantidas juntas por ligações não-covalentes. Vejamos primeiro as características dessas moléculas e em seguida como elas se arranjam para formar a estrutura de membrana. Lipídeos: são moléculas anfipáticas, isto é, têm uma extremidade hidrofílica e outra hidrofóbica; são insolúveis em água, mas solúveis em solventes orgânicos. Os lipídeos das membranas são chamados também de lipídeos compostos porque após hidrólise liberam outros compostos além do glicerol e dos ácidos graxos. Estes últimos têm longas cadeias de hidrocarboneto; elas podem ser saturadas (ligações simples entre os carbonos) ou insaturadas (com ligações duplas) e representam a cauda hidrofóbica da molécula. São os seguintes os principais lipídeos das membranas: a. Fosfoglícerídeos (glicerolfosfatídeos ou fosfolipídeos): esses lipídeos possuem apenas dois ácidos graxos ligados por ligação éster a uma molécula de glicerol. O terceiro grupo hidroxila do glicerol é esterificado a ácido fosfórico. Tal molécula constitui o mais simples dos fosfoglicerídeos e é denominado ácido fosfatídico. Entretanto, ao ácido fosfórico freqüentemente se liga um álcool que pode ser a colina, etanolamina, inositol, serina, etc., constituindo esse conjunto a "cabeça" hidrofílica da molécula. Dependendo, portanto, do radical ligado ao fosfato, o fosfoglicerídeo será denominado, por exemplo: fosfatidilcolina (lecitina), fosfatidiletanolamina (cefalina), fosfatidilinositol, fosfatidilserina, etc. Em geral, uma das moléculas de ácido graxo é insaturada e a outra é saturada; cada dupla ligação provoca um pequeno dobramento na cauda hidrofóbica. b. Glicolipídeos e esfíngolipídeos: nesses lipídeos o glicerol é substituído por um aminoálcool de cadeia longa, a esfingosina, que se liga, através do seu grupo amina, a um longo ácido graxo, saturado ou monoinsaturado, formando um ceramídeo (cauda apoIar). Ao grupo hidroxila deste, pode juntar-se fosforiletanolamina ou fosforilcolina, formando a "cabeça" polar da molécula. Tais lipídeos são as esfingomielinas. Se a cabeça polar for constituída de uma ou mais moléculas de açúcar, a molécula será um glicoesfingolipídeo; este é, portanto, caracterizado pelos tipos e quantidades de moléculas de açúcar. Pode ser um glicolipídeo neutro se seu grupo polar for constituído de um ou mais açúcares neutros (sem carga); um exemplo é o galactocerebrosídeo – o mais simples deles com apenas uma galactose como grupo polar. Quando o grupo polar de açúcar apresenta uma carga negativa, o glicolipídeo é ácido; exemplo deles são os gangliosídeos que contêm um ou mais resíduos de ácido siálico. c. Colesterol: possui uma porção rígida formada pelo núcleo peridrociclopentanofenantreno, cujo carbono 17 possui uma cadeia alifática ramificada de oito átomos de carbono; ambos formam a porção hidrofóbica da molécula, sendo a porção hidrofílica constituída por uma hidroxila presa ao carbono 3. Desde 1926 existe a afirmativa de que a camada de lipídeo da membrana é dupla. Em meio aquoso, os lipídeos espontaneamente formam bicamadas

9 expondo seus pólos hidrófilos para o meio aquoso e as caudas hidrofóbicas voltadas para o interior. Na membrana, eles se arranjam de maneira contínua, constituindo sua estrutura básica com cerca de 5mm de espessura. As diferenças no comprimento e saturação dessas caudas influenciam a capacidade dessas moléculas de se ajustarem umas com as outras, afetando assim a fluidez da membrana. A bicamada lipídica é assimétrica, isto é, a distribuição de suas diferentes moléculas se faz de maneira não uniforme nas duas camadas. Assim, os glicolipídeos são encontrados apenas na camada externa, expondo seus grupos de açúcar na superfície celular. A maioria dessas moléculas são receptoras de moléculas sinalizadoras para o funcionamento normal das células, enquanto outras recebem sinais, por exemplo, de toxinas externas. A análise dos lipídeos da .membrana de eritrócitos humanos mostra que, enquanto as esfingomielinas e lecitinas predominam na camada ou face externa, as cefalinas e fosfatidilserinas predominam na face citoplasmática. d. Proteínas: Embora a estrutura básica da membrana plasmática seja dada pela bicamada lipídica, as proteínas representam seu principal componente apresentando várias funções: algumas servem para transportar moléculas específicas para dentro ou para fora da célula; outras são enzimas catalisadoras de reações que acontecem no nível da membrana; podem ser receptoras e transdutoras de sinais químicos do meio; outras têm papel estrutural, seja para ligar a membrana ao citoesqueleto ou às células adjacentes. As proteínas periféricas ligam-se indiretamente à membrana interagindo com as proteínas integrais ou diretamente por interação com a "cabeça" polar dos lipídeos. Elas podem estar tanto na face citoplasmática (exemplo: espectrina, actina) como na face externa (proteínas do glicocálix). Verifica-se que também as proteínas são distribuídas as simetricamente na membrana plasmática. A proporção de proteínas e lipídeos na membrana plasmática é, em geral, de 60% e 40%, respectivamente, havendo menores ou maiores variações conforme o tipo celular; por exemplo, na membrana de mielina, que tem a função primordial de isolar os axônios das células nervosas, a proteína representa de 20% a 23%. A membrana plasmática dos eritrócitos é a melhor caracterizada entre as membranas das células dos mamíferos, embora por suas peculiaridades conhecidas não seja a melhor representante desse organismo. Suas proteínas estão mais ou menos uniformemente distribuídas, sem formar grandes zonas de especialização. O citoesqueleto dessas células forma uma rede fibrilar contínua logo abaixo da face citoplasmática da membrana, ligando-se a ela através de vários pontos; essa estrutura confere à membrana sua grande resistência e flexibilidade. Diferentemente, a maioria das células de mamíferos tem um citoesqueleto que cruza o citoplasma e se ancora à membrana em alguns pontos apenas. Por outro lado, enquanto os eritrócitos são células livres que flutuam em um líquido, a maioria das células dos mamíferos se organiza para formar tecidos sólidos. Para desempenhar suas funções, as células agregadas, seja em epitélios simples, seja em outro tipo de arranjo, devem apresentar as membranas plasmáticas organizadas em pelo menos duas regiões distintas, cada uma especializada em tarefas muito diferentes. Tais células são ditas "polarizadas". Exemplos clássicos são as células acinosas do pâncreas e a

10 maioria das células epiteliais que revestem interna e externamente o corpo. As células acinosas do pâncreas sintetizam enzimas (amilases, proteases, ribonucleases, etc.) que degradam macromoléculas dos alimentos contidos no intestino. Tais enzimas ficam estocadas como precursores inativos em vesículas limitadas por membrana, sob a membrana plasmática apical que limita o lúmen do ácino. As vesículas secretaras fundem-se única e exclusivamente com essa porção da membrana plasmática, assegurando, assim, a liberação das enzimas digestivas para a luz do ácino que se continua por outros duetos até o dueto maior, que desemboca no duodeno. O resto da superfície celular é chamada de membrana basolateral e inclui as faces laterais e basal da célula. Nutrientes vindos pelo sangue chegam às células por essa porção de membrana. Elas também possuem receptores dos hormônios que disparam a secreção das enzimas digestivas; hormônios esses que são liberados no sangue pelo estômago e intestino, na presença de alimentos. Além do mais, para manterem-se unidas, absorver substâncias, transportar fluidos, secretar e desempenhar outros processos fisiológicos, as células apresentam modificações em suas membranas. ESPECIALIZAÇÓES DA MEMBRANA APICAL 1. Microvilosidades - especialmente desenvolvidas nas células epiteliais que revestem o intestino e nas que revestem os túbulos renais. São o resultado de prolongamentos citoplasmáticos muito delgados, homogêneos, recobertos pela membrana plasmática, representando um aumento efetivo da superfície de absorção celular. Em células epiteliais intestinais, no centro dessas microvilosidades existem feixes de microfilamentos de actina que se ancoram às proteínas da face citoplasmática da membrana microvilar e se intersectam com uma rede de filamentos existente no citoplasma logo abaixo das microvilosidades. Esses microfilamentos dão rigidez às microvilosidades e permitem seu movimento para frente e para trás. Outras células como as hepáticas, epiteliais da bexiga, do útero, etc. possuem também essas modificações, embora em menor número. 2. Estereocilios - assemelham-se às microvilosidades, sendo apenas mais longos, tortuosos e ramificados. Não possuem características morfológicas ou fisiológicas para serem comparados aos cílios. São encontrados em algumas células epiteliais que revestem os ductos do aparelho genital masculino. ESPECIALIZAÇÕES NAS SUPERFÍCIES LATERAIS DAS CÉLULAS EPITELIAIS 1. Interdigitações - formadas por saliências e reentrâncias nas faces laterais entre células vizinhas, permitindo o seu encaixe e constituindo uma maneira de aumentar a adesão entre as células; essas continuam separadas por um espaço de cerca de 20mm e revestidas pelo cimento composto pelo glicocálix. 2. Zônula de oclusão (também chamada de "zônula occludens" ou tight junction) - aparece logo abaixo dos ápices das células, principalmente daquelas que formam epitélios de absorção seletiva, como por exemplo as intestinais. É sabido que tais células epiteliais absorvem seletivamente, através de proteínas carreadoras confinadas em suas superfícies apicais, os nutrientes que se encontram na luz do órgão; uma vez nos citoplasmas, esses nutrientes passam, por difusão facilitada, através das superfícies basolaterais, para o fluido extracelular que permeia o tecido conjuntivo subjacente, e deste para os

11 vasos sanguíneos. Esse mesmo epitélio deve impedir que moléculas absorvidas tão seletivamente voltem para a luz intestinal pelos espaços intercelulares. A zônula de oclusão tem aí, portanto, duas funções bem distintas: primeiro, impede que as proteínas da superfície apical das células migrem para as superfícies basolaterais, o que permite a manutenção das funções específicas de cada domínio. Segundo, impede que pelo espaço intercelular, moléculas que já foram absorvidas seletivamente voltem para a luz ou mesmo que moléculas solúveis em água passem, sem seleção, da luz para o tecido conjuntivo subjacente. Embora não esteja completamente clara a estrutura molecular dessa zônula de oclusão, imagens de criofratura ao microscópio eletrônico mostram uma rede de fitas que se "anastomosam" e que circundam completamente a superfície apical de cada célula da bainha epitelial. Cortes ao microscópio eletrônico de transmissão mostram uma série de conexões pontuais entre as hemicamadas externas das membranas plasmáticas de duas células vizinhas. Pensa-se que as fitas são compostas de proteínas transmembranas específicas em cada uma das membranas que se avizinham, as quais se unem diretamente uma com outra a fim de tornar ocluso o espaço intercelular. Embora todas as zônulas de oclusão sejam impermeáveis a macromoléculas, elas possuem permeabilidade variável a pequenas moléculas. Elas são, por exemplo, 10.000 vezes mais permeáveis aos íons no epitélio do intestino delgado que naquele que reveste a bexiga urinária. A capacidade de impedir a passagem de íons entre os espaços intercelulares aumenta em função logarítmica com o aumento do número de fitas na rede, já que cada fita atua com uma barreira independente. O Ca2+ extracelular é importante na manutenção da integridade dessa estrutura. Elas já aparecem nos embriões na fase de duas células, o que demonstra serem essenciais para o desenvolvimento. 3. Desmossomas (chamados também de macula adherens ou desmossoma em botão) são pontos de contato intercelular que prendem as células de vários tecidos, principalmente aqueles que estão sujeitos a fortes estresses mecânicos, como o músculo cardíaco, epitélio da pele, do colo do útero. Sua estrutura é melhor observada ao microscópio eletrônico e seus constituintes foram recentemente purificados e muitas de suas proteínas principais já estão identificadas. Na região do desmossoma as membranas de cada célula vizinha aparecem paralelas e separadas por um espaço de 30mm a 50mm. No lado citoplasmático de cada célula adjacente existe uma placa elétron-densa constituída de material protéico, cuja proteína principal é chamada de desmoplaquina. Essas placas são conectadas aos respectivos citoplasmas, por filamentos intermediários que formam uma verdadeira rede, ligando-se a vários desmossomas. O tipo de filamento intermediário aí presente depende do tipo celular: nas células epiteliais são de queratina, nas células musculares cardíacas são filamentos de desmina, em muitas células de origem mesenquimal são filamentos de vimentina. Nessa região ainda, oligoproteínas transmembrânicas especiais, chamadas glicoproteínas de ligação, se prendem à placa de desmoplaquina por um lado e reagem entre si através de seus domínios extracelulares, mantendo assim juntas as membranas plasmáticas adjacentes. Essas glicoproteínas de ligação pertencem à família das caderinas e são as desmogleínas e desmocolinas. A importância do papel dos desmossomas é verificada em uma forma de doença de pele, o pênfigo, na qual o indivíduo produz anticorpos contra essas

12 glicoproteínas de ligação acarretando o rompimento dos desmossomas entre as células epiteliais, causando o aparecimento de bolhas na pele como resultado do vazamento de líquido tissular para o epitélio afrouxado. Vale notar que esses anticorpos rompem somente desmossomas na pele, o que indica que os de outros tecidos devem ser bioquimicamente diferentes. As células da superfície basal dos epitélios se prendem fortemente à lâmina basal, através dos hemidesmossomas. Morfologicamente, eles se parecem com os desmossomas, mas são química e funcionalmente diferentes. Enquanto nos desmossomas os filamentos intermediários fazem ligamentos laterais com as placas protéicas, nos hemidesmossomas eles penetram suas extremidades nas mesmas. As glicoproteínas transmembrânicas de ligação pertencem à família das integrinas e se prendem por um lado à placa protéica e, por outro, às lamininas - proteínas de matriz extracelular. 4. Zônula de adesão (também desmossoma em cinto ou zônula adherens) encontrada logo abaixo da zônula de oclusão em bainhas epiteliais, rodeando toda superfície das células adjacentes. Nessa zônula não aparece placa de adesão; dentro de cada célula corre um feixe de filamentos contráteis (actina e miosina) paralelo à membrana plasmática e à qual se prendem através de um complexo de proteínas intracelulares, entre elas, as vinculinas, que se ligam às proteínas transmembrânicas de ligação; estas são da família das caderinas, dependentes de Ca2+. Os feixes de actina, portanto, acabam formando uma rede transcelular, que se acredita ter um papel fundamental na morfogênese animal por exemplo, as dobras das bainhas epiteliais para formar tubos e outras estruturas correIa tas durante o desenvolvimento. 5. Junções comunicantes (também nexos ou gap junction) - encontradas com freqüência em células epiteliais de revestimento, glandulares, musculares lisas, cardíacas e nervosas. Quando aceitamos o conceito de que a célula é a unidade básica de todo ser vivo, não podemos esquecer que os organismos pluricelulares são feitos de populações de células que interagem entre si. Tal interação é essencial para a coordenação das atividades celulares, tais como a propagação de sinais para o crescimento e diferenciação, coisas indispensáveis para o desenvolvimento do organismo. Essa interação é em grande parte feita pelas junções comunicantes. Ao microscópio eletrônico, dependendo do corte, a região dos nexos se assemelha às uniões estreitas. As técnicas da criofratura ajudaram a entender sua estrutura. Em seu nível, as membranas são separadas por 2mm apenas e apresentam conjuntos de tubos protéicos paralelos que atravessam ambas as membranas de duas células vizinhas; esses tubos apresentam poros ou canais da ordem de lmm, o que permite a passagem de moléculas de mais de mil daltons. Eles são formados pelo arranjo de seis moléculas de proteínas transmembrânicas de cada célula justaposta, chamadas conexinas. A permeabilidade desses canais é regulada pela Ca2+; normalmente o nível de cálcio no interior da célula é baixo e a permeabilidade desses canais é alta; se a concentração intracelular de cálcio aumenta, os nexos se fecham. O controle interno do nível de cálcio é feito pelas mitocôndrias, que seqüestram o cálcio em excesso. Em qualquer tecido lesado aumenta o cálcio intracelular e os nexos das células vizinhas se fecham para não perder seus nutrientes; em seguida entram em mitose até restabelecer o tecido. Além de íons, foi verificado que o AMP cíclico, conhecido como o segundo mensageiro celular, açúcares, vitaminas e outros metabólitos, também passam pelos nexos. Portanto, essa

13 conexão entre as células não é apenas elétrica, mas também metabólica. Outro achado importante foi o de que certas células cancerosas não mostram essa conexão intercelular e, portanto, são incapazes de se comunicar com as células normais; pensa-se que essas células têm um defeito genético que interrompe a passagem entre elas, de moléculas que controlam o crescimento. A produção de heterocárions pela fusão de células tumorais com normais tem mostrado que nesses heterocárions se estabelecem as conexões ausentes nas primeiras. Esses e outros experimentos sugerem que conexão e desconexão poderiam ser determinados geneticamente. É também apontado o possível papel regulador no crescimento e diferenciação celular de pequenas moléculas, provavelmente nucleotídeos que passariam pelos nexos. Esses agentes não podem ser transferidos para as células cancerosas que perdem tal comunicação intercelular. Isso mostra que em muitas células, como na sociedade, a troca de informações é essencial para manter a saúde normal. 6. Cobertura celular - Recebe o nome de glicocálix a cobertura de oligossacarídeos que constitui as cadeias laterais dos glicolipídeos e glicoproteínas da face externa da membrana plasmática e de glicoproteínas adsorvidas. Em geral, aparece como uma camada de 10mm a 20mm de espessura, em contato direto com a superfície externa da membrana plasmática. A espessura, resistência e durabilidade da cobertura varia de célula para célula. Por exemplo, a do epitélio intestinal resiste a vigorosos ataques mecânicos e químicos, enquanto em outras células é lábil, desaparecendo após lavagem ou exposição a enzimas. Como as glicoproteínas da membrana que fazem parte do glicocálix são sintetizadas no nível do retículo rugoso, passando pelo Golgi para completar a parte glicídica, o glicocálix pode ser considerado como o produto da secreção da célula que é incorporado à superfície celular e sofre contínua renovação. O CITOPLASMA Vista ao microscópio óptico, a região do citoplasma apresenta-se uniformemente corada, em geral por corantes ácidos; em algumas células, entretanto, dependendo da quantidade de substâncias basófilas, o aspecto será diferente. Ao microscópio eletrônico observa-se um mundo de estruturas filamentares, corpusculares, vacuolares que se entremeiam e que desempenham as mais diversas funções. Comecemos analisando o sistema de membranas do citoplasma. Esse é também chamado de Sistema Vacuolar e compreende o envelope nuclear, o retículo endoplasmático rugoso (RER) , o retículo endoplasmático liso (REL) e o aparelho de Golgi. As membranas desse Sistema, embora tenham a mesma estrutura e composição química básica da membrana plasmática, apresentam variações na qualidade e quantidade de suas moléculas, dependendo da função que a organela desempenha. ENVELOPE NUCLEAR (CARIOTECA) É composto de duas membranas: a interna contém proteínas específicas que servem como sítios de ligação para os filamentos intermediários, que se entrelaçam formando uma placa denominada lâmina, local onde se prende a cromatina; a externa, separada da primeira por um espaço denominado cisterna ou espaço perinuclear, exibe ribossomas em sua face voltada para o citoplasma. Ambas fazem contato na região dos poros. Tais poros representam aberturas de forma octogonal com orifícios de 60mm de diâmetro. Contudo,

14 eles não estão completamente abertos, apresentando um tampão cilíndrico de material protéico. A carioteca regula a troca entre o núcleo e o citoplasma através dos poros, que permitem a passagem de algumas moléculas, sejam elas de baixo ou alto peso molecular. É possível detectar por microscopia eletrônica a passagem de grandes partículas, tais como subunidades ribossômicas, RNA mensageiro, etc., enquanto medidas do potencial de membranas, com auxílio de microeletrodos, sugerem que a carioteca representa uma barreira à difusão de pequenos íons como K+, Na+ ou Cl-. RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO RUGOSO (RER) É muito desenvolvido em células comprometidas na síntese de proteínas de exportação. Ao microscópio óptico aparece como basófilo, devido à presença dos ribossomas. Ao microscópio eletrônico aparece como cisternas achatadas, paralelas, onde os ribossomas são vistos aderidos à sua superfície externa; estes estão presentes como polissomas mantidos juntos pelo RNA mensageiro. Os ribossomas estão sempre ligados à membrana do retículo pela sua subunidade maior. Essa ligação é complexa, envolve interações eletrostáticas que podem ser quebradas em meios com alta concentração de sal. Os ribossomas são levados ao retículo quando estão carregando uma cadeia polipeptídica em crescimento que traz a seqüência inicial conhecida como sinal; esse indica que a proteína deverá ser segregada na luz do retículo; essa seqüência sinal é bloqueada por uma partícula citoplasmática denominada "partícula reconhecedora do sinal" (PRS) que, por sua vez, é reconhecida por uma proteína que faz parte da membrana do retículo e é denominada receptor da PRS. Após a ligação desse complexo, a PRS se desprende e a síntese da proteína, que estava bloqueada, continua, com a cadeia polipeptídica crescendo dentro da luz do retículo. Em células que produzem grandes quantidades de proteínas de exportação, como as pancreáticas, o RER é muito desenvolvido, ocupando as porções basal e laterais da célula. Nos hepatócitos, ele aparece como grupos de cisternas entremeadas com regiões de retículo liso. RETÍCULO ENDOPlASMÁTICO LISO (REL) Aparece ao microscópio eletrônico como uma rede tubular, sem ribossomas aderidos. A maioria das células contém muito pouco REL. Em todas as células, uma pequena região do retículo endoplasmático é parcialmente rugosa e parcialmente lisa; essa região é chamada de elementos transicionais, pois é aí que brotam vesículas contendo proteínas e lipídeos recém-sintetizados e que serão transportadas para o aparelho de Golgi. Dependendo da especialização da célula, entretanto, o REL pode ser bem desenvolvido e ter diferentes funções, como por exemplo: a. Metabolismo de lipídeos - células que sintetizam hormônios esteróides, a partir de colesterol, como as células de Leydig e as de córtex da supra-renal, têm o REL bastante desenvolvido, a fim de abrigar as enzimas necessárias para fazer o colesterol e modifica-Io para formar o hormônio. Como algumas enzimas envolvidas na esteroidogênese encontram-se dentro das mitocôndrias, elas são vistas nessas células em número apreciável junto ao REL. b. DesÍntoxÍcação - o hepatócito é um bom exemplo onde o REL, além de produzir a porção lipídica das lipoproteínas que ele exporta, também possui as enzimas que catalisam uma série de reações de desintoxicação. Drogas terapêuticas, inseticidas, hidrocarbonetos policíclicos e alguns produtos naturais do metabolismo são freqüentemente solúveis em lipídeos e insolúveis em água e,

15 portanto, poderiam acumular-se continuamente em células gordurosas e nas membranas lipídicas. Porém, a célula animal encontrou uma maneira para excretá-Ios, chamada de desintoxicação, que é um sistema que funciona por solubilização. O processo é feito através de uma seqüência de reações catalisadas por uma família de enzimas denominadas citocromo P450, ligadas ao REL e que torna finalmente tais produtos suficientemente solúveis em água para poderem deixar a célula e serem excretados pela urina. Quando grandes quantidades de certos compostos como, por exemplo, o fenobarbital entram na circulação, o fígado sintetiza também uma grande quantidade de enzimas para desintoxicação, aumentando, conseqüentemente, as membranas do REL. Uma vez que a droga desapareça, o REL é degradado nos autofagossomas até que sua quantidade volte ao normal. O uso contínuo dessas drogas mantém o REL e suas enzimas aumentadas, o que faz com que sejam necessárias doses cada vez maiores das drogas para que elas possam fazer o efeito inicial. c. Controle de Ca2+ citoplasmático - o REL dos músculos é especial e recebe o nome de retículo sarcoplasmático. Ele contém uma proteína em sua membrana, a Ca2+ ATPase que bombeia Ca2+ do citosol para o interior do retículo; a liberação de Ca2+ da luz do retículo e seu subseqüente seqüestro do citosol são necessários para a rápida contração e relaxamento das miofibrilas durante cada ciclo da contração muscular. COMPLEXO DE GOLGI (APARELHO DE GOLGI) Embora descrito desde 1898 pelo italiano Camilo Golgi, após utilização de métodos de impregnação dos tecidos pela prata, o reconhecimento de sua existência foi motivo de grande controvérsia entre os pesquisadores durante décadas. Somente após as observações feitas ao microscópio eletrônico, a presença desse característico sistema de membranas foi definitivamente comprovada. É formado por pilhas de quatro a seis cisternas achatadas e vesículas associadas e, dependendo da célula, esse conjunto aparece em número e localizações variadas. Em plantas superiores e algas, ele aparece às centenas ou milhares, espalhados ao acaso pelos citoplasmas. Em células polarizadas, como as acinares do pâncreas, e as caliciformes do intestino, o Complexo de Golgi ocupa a porção entre o núcleo e o pólo apical por onde a célula libera sua secreção. Em células não-polarizadas, eles são muito menos desenvolvidos e podem aparecer rodeando o núcleo, como nos neurônios ou espalhados em vários pontos do citoplasma, como nos hepatócitos. Embora haja variações na localização, tamanho e desenvolvimento, de acordo com o tipo celular ou o próprio estado fisiológico da célula, o Complexo de Golgi tem características morfológicas únicas que permitem sua diferenciação. Ao microscópio eletrônico, apresenta as já referidas pilhas de cisternas, em geral curvas, dando ao conjunto um aspecto de cálice mais ou menos aberto. A face convexa desse conjunto é também denominada face cis (ou de entrada), enquanto que a face côncava pode também ser denominada face trans (ou de saída). Vizinho à face cis do Complexo de Golgi, o RE perde os ribossomas e libera vesículas que se associam a essa região recebendo o nome de elementos transicionais. Outras vesículas aparecem ao longo das bordas dilatadas de cada cisterna. Admite-se que essas vesículas transportam proteínas e lipídeos para dentro e para fora de Golgi, assim como entre suas cisternas; muitas vesículas são cobertas por um tipo especial de proteína, a clatrina. Na

16 face trans aparece um retículo tubular distendido conhecido como rede trans Golgi (cuja sigla,TGN, vem do inglês Trans Golgi Network). Resumidamente, pode-se dizer que a principal função do Golgi é processar as proteínas sintetizadas no RER, removendo e/ou adicionando diferentes grupamentos às mesmas; empacotá-las em vesícula dando-Ihes o direcionamento final. Os passos de processamento são organizados. Cada cisterna é um compartimento distinto com seu próprio conjunto de enzimas; as proteínas são modificadas na medida em que passam de um compartimento para outro. Brotando do RE, os elementos de transição trazem as proteínas para os primeiros compartimentos do Golgi (face Cis). Em seguida, elas passam para o compartimento mediano - constituído pelas cisternas centrais do Complexo para, finalmente, chegar ao compartimento trans. Desse, elas vão para o TGN, onde são segregadas em diferentes vesículas e de onde seguem para seu destino final: a membrana plasmática, os lisossomas ou as vesículas secretórias. O mecanismo de transferência de proteínas e lipídeos de uma cisterna para outra ainda não está bem esclarecido, porém pensa-se que essa transferência seja feita pelas vesículas cobertas que brotam das bordas das cisternas mantendo o tráfego de uma cisterna para outra. As glicoproteínas que irão fazer parte da membrana plasmática ou dos lisossomas ou ainda de outras secreções exócrinas sofrem a primeira glicosilação ainda na luz do RER, na forma de um oligossacarídeo, que vai sendo "quebrado" à medida que a proteína avança pelo retículo em direção ao Golgi. As modificações finais da molécula ocorrem no Golgi. Tais modificações consistem de quebras das moléculas, adições de outros radicais de açúcar ou de sulfato, etc., e que são efetivadas por enzimas estrategicamente localizadas, como proteases, galactosil transferases, e sulfotransferases, respectivamente. A falha dessas enzimas pode resultar em um glicocálix alterado, ou em lisossomas e outras secreções deficientes. É amplamente conhecido que muitas enzimas são primeiramente sintetizadas como precursores biologicamente inativos; a ativação acontece mais tarde e em geral consiste na remoção de uma porção da cadeia polipeptídica. Essa remoção pode ocorrer em diferentes locais, por exemplo: os grãos de zimogêneo secretados pelo pâncreas são ativados extracelularmente, isto é, após a liberação de secreção. Por outro lado, vários hormônios péptides são produzidos como pró-hormônios que são, então, ativados intracelularmente por "enzimas de conversão" (isto é, proteolíticas) provavelmente presentes no Golgi. Exemplos de tais pró-proteínas são: pró-albuminas, pró-paratireóide hormônio, pró-glucagon, pró-gastrina, e o caso melhor conhecido é o da próinsulina. A insulina, produzida pelas células beta das ilhotas pancreáticas, contém duas cadeias ligadas por duas pontes de S-S: uma cadeia A, com 21 aminoácidos, e uma B com 30 aminoácidos. Porém, o RNA mensageiro para sua produção contém informação para fazer uma cadeia polipeptídica com 330 aminoácidos. A tradução desse RNA mensageiro resulta na pré-pró-insulina, que contém, além dos segmentos peptídicos correspondentes ao "sinal" e à cauda, comuns a todos os transcritos para exportação, um segmento "C" que fica entre os segmentos A e B. A tradução de mensageiro é feita no retículo endoplasmático rugoso; a cadeia traduzida sofre a primeira quebra logo que é segregada no lúmen do retículo,

17 perdendo a região referente ao sinal. Assim, como pró-insulina, contendo o traduzido correspondente às regiões A, C e B, a cadeia chega ao Golgi; nele uma "enzima de conversão" quebra a cadeia peptídica C e as cadeias A e B se ligam por duas pontes de -S-S, transformando-se no hormônio ativo dentro de um grão de secreção. LISOSSOMAS O conceito de lisossoma surgiu após a técnica de fracionamento celular pela qual diferentes componentes puderam ser isolados. Entre eles De Duve encontrou um grupo de partículas que continham alto conteúdo de fosfatase ácida, além de outras enzimas hidrolíticas. Por causa dessas propriedades enzimáticas o autor, em 1955, denominou-os lisossomas. Hoje, sabe-se que os lisossomas possuem dezenas de hidrolases capazes de digerir a maioria das substâncias biológicas. São encontradas em todas as células de eucariotos. Bactérias não possuem lisossomas, mas o "espaço periplasmático" às vezes encontrado entre a membrana plasmática e a parede celular pode desempenhar um papel semelhante ao dos lisossomas. Uma importante propriedade do lisossoma é a sua estabilidade nas células vivas. Sua membrana é especial, pois possui proteínas transportadoras que permitem a saída de macromoléculas resultantes da digestão para o citoplasma, de onde poderão deixar a célula ou ser reaproveitadas. Ela contém também bomba de H+ que, com a quebra de ATp, bombeia H+ para o interior do lisos soma mantendo seu pH ao redor de 5, enquanto o do citoplasma está ao redor de 7,2. As enzimas lisossomais são ativas em pH baixo, o que impede sua ação contra o conteúdo citoplasmático. A membrana do lisossoma também possui muitas proteínas altamente glicosiladas, que devem protegê-Ia das proteases contidas no lúmen. Os lisossomas só podem ser vistos ao microscópio eletrônico onde mostram forma e tamanho variáveis. Entretanto, são facilmente identificados pela histoquímica. A heterogeneidade das formas apresentadas pelos lisossomas reflete a grande variedade de funções digestivas mediadas pelas suas enzimas e que inclui digestão intra e extracelular, digestão de microrganismos, nutrição celular (por exemplo o aproveitamento do colesterol endocitado nas partículas de lipoproteínas de baixa densidade). É do trans-Golgi (TGN) que brotam as vesículas que darão origem aos lisossomas; elas têm enzimas e membranas espeeializadas. As enzimas são sintetizadas no RER e transportadas através do Golgi; na porção eis desse aparelho, elas recebem oligossarídeos, que são processados fosforilando um resíduo de manose. Ao chegar ao TGN, tais proteínas estão, portanto, marcadas pela manose-6 fosfato (M-6P). As membranas do Golgi nessa região apresentam proteínas receptaras de M-6P que se ligam às enzimas marcadas; dessa forma, brotam vesículas cobertas cheias de enzimas hidrolíticas. Até há pouco tempo, essas vesículas eram chamadas de lisossomas primários, distinguindo-as dos chamados lisossomas secundários, que apresentavam material sendo digerido. Trabalhos recentes têm mostrado que existe um compartimento membranoso denominado endossoma, formado por túbulos e vesículas, que se estende da periferia celular até a região perinuclear, estando muitas vezes muito próximo porém separado - do Complexo de Golgi. O interior desse compartimento é ácido (pH entre 6 e 5), tanto mais ácido quanto mais interno esteja o endossoma. Moléculas endocitadas se fundem com o endossoma periférico,

18 em seguida passam para o endossoma perinuclear. Porções das membranas desses endossomas contendo os receptores voltam à membrana plasmática na forma de vesículas. As vesículas contendo enzimas lisossomais liberadas pela TGN são inicialmente encaminhadas para um compartimento especial prélisossoma localizado próximo do endossoma perinuclear. Esses dois tipos (endossoma perinuclear e vesículas com enzimas lisossomais) se fundem formando o endolisossoma. Tal processo é concomitante ao constante reaproveitamento da membrana e à crescente acidificação convertendo o compartimento em lisossoma. No conceito atual, portanto, o lisossoma contém material endocitado em digestão. Quando o endolisossoma se funde a um fagossoma (vesícula com material fagocitado), torna-se o fagolisossoma; quando se funde a um autofagossoma (vesÍcula com material da própria célula), forma-se o autofagolisossoma. Todos os três tipos fazem a digestão intracelular. Na digestão intracelular, seja de material ingerido, seja por autofagia, as proteínas são quebradas até formar dipeptídeos que passam facilmente pela membrana e são depois separados em aminoácidos; já os carboidratos são hidrolisados a monossacarídeos, que são liberados. Entretanto, dissacarídeos como a celobiose, inulina ou dextran não são digeridos e permanecem dentro do lisossoma. O dissacarídeo mantido dentro do lisossoma pode fazer aumentar sua pressão osmótica, provocando entrada de água e tornando a célula intensamente vacuolizada. Durante o processo de desenvolvimento do organismo, o lisossoma tem papel importante, como na ecdise dos insetos ou na remodelação dos tecidos com a remoção de células inteiras ou mesmo de material extracelular. Em órgãos que sofrem regressão durante a embriogênese, como os duetos de Wolf nos embriões das fêmeas e os duetos de Muller nos machos, há considerável aumento de enzimas lisossômicas. Alguns tecidos que sofrem regressão após um período de atividade podem fazê-Io por ação de lisossomas. Por exemplo, o útero humano após o parto pesa cerca de 2kg e, em poucos dias, volta ao seu peso normal de 50 gramas. Durante esse período existe uma grande infiltração de células fagocitárias, que digerem todos os debris celulares e partes do endométrio. A autofagia é proeminente nas glândulas mamárias após a lactação, assim como no útero durante o ciclo menstrual. Dissemos anteriormente que as enzimas lisossomais também fazem a digestão extracelular. Um exemplo desse último é o que fazem os osteoclastos, células multinucleares que aparecem durante a reabsorção óssea. Ao que tudo indica, essas células liberam vesículas lisossomais cujas enzimas atacam a parte orgânica da matriz óssea. Esse processo é ativado pelo hormônio da paratiróide e pela vitamina "N”. Um excesso de vitamina "N” pode causar fraturas espontâneas em animais. Outro exemplo do envolvimento lisossomal é na produção final dos hormônios da tiróide [tetraiodotironina (T 4) e triiodotironina (T3)]. O pré-hormônio tiroglobulina fica estocado dentro do folículo tiróideo; pinocitado de volta pelas células, sofre a ação das enzimas lisossômicas, que quebram a molécula liberando T3 e T4. Estes saem da célula para a corrente sanguínea. Quando qualquer célula produz mais grânulos de secreção de que o fisiologicamente necessário, estes são "quebrados" pelos lisossomas e tal mecanismo autofágico recebe o nome de crinofagia. Todos os leucócitos dos vertebrados contêm grânulos de natureza lisossomal. Os monócitos têm poucos lisossomas, mas quando eles penetram no tecido e

19 se modelam em macrófagos produzem muitos lisossomas. O acrossoma do espermatozóide pode ser considerado um lisossoma especial. Na verdade, ele contém protease e hialuronidase, além de muita fosfatase ácida. Foi verificado em ouriço do mar que, no momento da fertilização, através de receptores específicos de sua membrana, o espermatozóide se liga à camada gelatinosa da zona pelúcida que envolve o óvulo. A ligação ativa a exocitose da vesícula acrossomal liberando as enzimas; estas digerem a camada gelatinosa e a camada vitelina que encobrem a membrana plasmática do óvulo, permitindo que, com auxílio do citoesqueleto, a membrana do espermatozóide se funda à do óvulo. Os lisossomas são de importância particular na medicina porque estão envolvidos em muitas doenças e síndromes. Poderemos exemplificar algumas. Em certas condições patológicas, tais como artrite reumatóide, silicose e asbestose (produzidas pela inalação de partículas de sílica ou asbestos), ou gota (na qual cristais de urato se acumulam nas articulações), existe liberação de enzimas lisossômicas dos macrófagos nos tecidos e, conseqüentemente, inflamação que pode levar a um aumento da síntese do colágeno, causando fibrose. Liberação aguda de enzimas lisossômicas ocorre em estados de anoxia, acidose e chock, e as enzimas podem ser encontradas no sangue. Um exemplo comum é a liberação dessas enzimas após o infarto do miocárdio. Em relação a todas essas doenças, é importante lembrar a natureza da membrana lisossômica. Ela pode tornar-se lábil por ação de muitas substâncias, tais como todas as vitaminas lipossolúveis (A, K, D e E) e pelos hormônios sexuais esteróides. Por outro lado, a cortisona, hidrocortisona e outras drogas de ação antiinflamatória tendem a estabilizar as membranas lisossômicas. Existem doenças congênitas, cuja principal alteração consiste no acúmulo, dentro das células, de substâncias como o glicogênio ou vários glicolipídeos. São chamadas "doenças de depósito", e o erro é causado por uma mutação que afeta enzimas lisossômicas envolvidas no catabolismo. Atualmente, são descritas dezenas de doenças congênitas envolvendo lisossomas, quase todas relacionadas ao acúmulo de glicolipídeos ou mucopolissacarídeos. PEROXISSOMAS Também chamados de microcorpos, foram descritos pela primeira vez em 1954, em túbulo renal de camundongo, como corpos arredondados, separados do citoplasma por uma membrana simples e possuindo granulações finas. Em 1956, foram descritos em hepatócitos, onde chamaram a atenção pela presença de um "core" mais elétron-denso, na forma de cristal. Diferem dos lisossomas por não possuírem fosfatase ácida, não englobarem substâncias provenientes da fagocitose e pinocitose e por darem reações enzimáticas diferentes. Possuem as enzimas catalase, urato oxidase, D-aminoácido oxidase. A membrana que os envolve é mais fina que a dos lisossomas e é permeável às pequenas moléculas. As proteínas contidas em seu lúmen e as de sua membrana são codificadas pelos genes nucleares e sintetizadas no nível dos ribossomas livres no cito sol. A catalase, que é a mais estudada de todas, é uma proteína tetramérica contendo um grupo heme; os monômeros são internalizados no lúmen do peroxissoma, onde se associam ao heme. Quando o peroxissoma chega a um determinado tamanho, sofre fissão, dando origem a dois menores.

20 Até 1974, os peroxissomas só haviam sido descritos no rim e no fígado. Entretanto, naquele ano, foram descritos em miocárdio de camundongo e em vários outros tipos de músculos. Hoje se sabe que todas as células contêm peroxis somas. A denominação de peroxissoma éjustificada porque eles contêm uma ou mais enzimas que usam oxigênio molecular para remover átomos de hidrogênio de substratos orgânicos específicos, produzindo água oxigenada, conforme a reação: RH2 + O2 ® R + H2O2 A catalase decompõe a H2O2, oxidando uma grande variedade de substrato (incluindo fenóis, ácido fórmico, formoldeído e álcool), conforme a reação: H2O2 + R' H2 ® R' + 2H2O2 Esse tipo de reação oxidativa é importante nas células do fígado e rim, onde os peroxissomas desintoxicam várias moléculas que entram na corrente sanguínea. Quase a metade do álcool que uma pessoa ingere é oxidado a acetoaldeído dessa forma. A catalase também converte a água oxigenada, que é formada em várias reações químicas, em água e oxigênio conforme a reação: 2 H2O2 ® 2H2O2 + O2 Além de conter diferentes enzimas, os peroxissomas se adaptam às condições celulares. Experimentos mostram que leveduras crescendo em meio com açúcar têm peroxissomas pequenos; se colocadas para crescer em meio com metanol, os peroxissomas tornam-se grandes para oxidar o álcool; se colocadas em meio com ácidos graxos também os peroxissomas crescem e quebram os ácidos graxos a acetilcoenzima A. A proliferação de peroxissomas foi verificada, em ratos, após a administração de drogas hipolipidêmicas. Por outro lado, experimentos mostraram que a injeção de catalase liofilizada reduzia o nível de colesterol no sangue e prevenia a aterosclerose aórtica em coelhos alimentados com colesterol. Na maioria dos mamíferos e, provavelmente, dos eucariotos em geral, o peroxissoma é o principal local de degradação de ácidos graxos. Na verdade, essa é a única organela onde ácidos graxos de cadeias muito longas (contendo mais de 20 CH2) são degradados. Ácidos graxos contendo entre 10 e 20 CH2 são quebrados tanto nas mitocôndrias como nos peroxissomas. Esse processo, nas mitocôndrias, ocorre acoplado com a produção de ATP em uma cadeia transportadora de elétrons, os quais são para ela transferidos via FADHz após liberados pela oxidação do ácido graxo. Os peroxissomas não possuem cadeia transportadora de elétrons e, por isso, os elétrons liberados durante a oxidação dos ácidos graxos são usados para produzir H2O2 e a energia liberada é convertida em calor. A uratooxidase está relacionada com o metabolismo das purinas. De Duve sugeriu sua possível participação na gliconeogênese. MITOCÔNDRIAS São organelas presentes no citoplasma de células eucariontes. Elas proporcionam um sistema de transdução de energia, pelo qual a energia química contida nos alimentos é convertida a moléculas com ligações de fosfato de alta energia (trifosfato de adenosina - ATP). Elas podem ser vistas

21 em células vivas principalmente usando-se o corante vital Verde Janus. Sua morfologia, porém, é melhor estudada após fixação. Em geral, têm a forma de bastão com diâmetro médio de 0,5 μm e comprimento de 7μm. Tudo isso é muito variável e depende da célula e da espécie animal. Como o tamanho, o número também é variável: estima-se que um hepatócito contém entre 1.000 a 1.600 mitocôndrias, enquanto alguns ovócitos têm 300.000. Sua distribuição está relacionada à sua função como fornecedora de energia à célula. Sua orientação pode ser influenciada pela organização da matriz e do sistema vacuolar. Apresentam movimentos e mostram mudanças na forma e volume. Ao microscópio eletrônico, pode-se observar que elas apresentam dois compartimentos - o interno, que contém a matriz mitocondrial, e é limitado por uma unidade de membrana interna que se projeta para o interior formando as cristas mitocondriais; e o externo, chamado câmara externa, localizado entre a membrana interna e a membrana externa. Técnicas especiais de tratamento e coloração negativa mostram que a membrana externa é lisa, enquanto que na interna existem partículas com cerca de 8,5 μm de diâmetro presas a ela por um pedúnculo; são as partículas elementares, conhecidas pela designação de F1. A forma e disposição das cristas variam em diferentes células e seu número está relacionado à atividade oxidativa da mitocôndria. Na substância fundamental da matriz, além das várias enzimas e substratos relacionados com o ciclo do ácido cítrico (ciclo de Krebs), existem DNA, ribossomas e, em algumas, podem-se observar grânulos maiores e elétrondensos, tidos como depósitos de cálcio seqüestrados do citoplasma pelas mitocôndrias. Há tempos vários autores vêm observando que a disposição dos lipídeos na célula pode estar relacionada à atividade mitocondrial. Em células pancreáticas e hepáticas, por exemplo, após curto período de jejum, a mitocôndria entra em contato com gotas lipídicas. As imagens ao microscópio eletrônico sugerem um processo ativo do aproveitamento do lipídeo sob ação de oxidase de ácidos graxos presentes na mitocôndria. As mitocôndrias são os mais sensíveis indicadores de injúria celular. Embora elas possam ser rapidamente alteradas pela ação de vários agentes, essas alterações são reversíveis, dentro de certos limites. Quando chegam a um ponto crítico, entretanto, tornam-se irreversíveis. De que maneira essa organela é capaz de aproveitar a energia química contida nas ligações covalentes das macromoléculas alimentares e convertê-Ias em ATP? Sabe-se que enquanto essas moléculas energéticas estiverem altamente ordenadas elas não liberam energia. Assim, uma molécula de glicose (que é a principal fonte de energia da célula, seguida pela gordura e pela proteína) para liberar energia aproveitável pela célula (na forma de ATP) deve ser quebrada até COz e Hp. O primeiro passo de liberação de energia a partir da glicose acontece no citoplasma sem a necessidade da presença de oxigênio. O processo é chamado de glicólise anaeróbica e pode ser resumido pela equação: Glicose + Pi + 2 ADP ® 2 Lactato + 2 ATP Em condições aeróbicas, o resultado final é o seguinte: Glicose + Pi + 2 ADP ® 2 Piruvato + (NADH2) + 2 ATP

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O piruvato, uma molécula com três carbonos, entra na mitocôndria e, ao reagir com a coenzima A transforma-se em acetilcoenzima A. Na matriz da mitocôndria, a acetil-CoA, sempre por ação enzimática, libera a CoA e seu radical acetil condensa-se com o ácido cítrico, que segue numa série de reações químicas mediadas por desidrogenases e descarboxilases, dando diferentes substâncias, culminando novamente com a produção de ácido cítrico. Tais reações recebem o nome de "ciclo de Krebs" ou "ciclo do ácido cítrico". A cada volta que esse ciclo completa, ele utiliza o produto da quebra de meia molécula de glicose, liberando dois COz' dois NADHz (nicotinamida adenina dinucleotídeo), um FADHz (flavina adenina dinucleotídeo). Tais coenzimas reduzidas (NADHz e FADHz) precisam se oxidar para poder continuar como receptores de outros hidrogênios liberados pelo ciclo de Krebs. Então eles vão entrar no próximo passo a caminho da quebra final da glicose, o qual acontece no nível das cristas mitocondriais e é denominado de "fosforilação oxidativa", que consiste no transporte, em cadeia, de elétrons até o oxigênio, formando água e a concomitante fosforilação do ADP à ATP. O sistema de transporte de elétrons quase sempre se inicia com o NADHz e segue de maneira vetorial a outros transportadores como FMN (flavina mononucleotídeo) FAD, coenzima Q, uma série de citocromos, finalizando com o Oz. O sistema de fosforilação é representado pelas partículas elementares, um complexo multipeptídico com uma porção FI voltada para a matriz que funciona como ATP sintetase; uma porção Fo localizada no centro da membrana, altamente hidrofóbica, que representa a porção que transporta próton; e uma porção que conecta essas duas e contém o fator de acoplamento. Sabese, portanto, que ao mesmo tempo em que os elétrons do hidrogênio são transportados de uma maneira vetorial até seu último aceptor, que é o oxigênio para formar a água, há também a liberação de moléculas de ATP. Qual a natureza química desse acoplamento? Existem várias hipóteses e a mais aceita atualmente é a quimiosmótica. De acordo com ela, o ATP é formado no nível da partícula elementar, sob a influência de um campo vetorial gerado pela transferência de elétrons através de cadeia respiratória. Explicando melhor, existem na cadeia respiratória transportadores de todo o átomo de hidrogênio, isto é, próton e elétron, enquanto outros apenas transportam elétrons; os prótons excedentes são "empurrados" para fora da membrana, acumulando-se na câmara externa. A membrana da crista é considerada impermeável a íons; corno conseqüência, forma-se um gradiente de prótons na câmara externa (força próton-motriz), criando um potencial de membrana, além de urna diferença de pH entre a matriz e a câmara externa. Esse potencial eletroquímico gerado funciona corno urna força propulsora tentando "bombear" os prótons de volta para a matriz. Na porção Fo da partícula elementar deve haver um canal que permite a aproximação dos íons H+ ao sítio ativo F1, o qual, modificado, promove a fosforilação do ADP para ATP. Existem drogas capazes de "desacoplar" a fosforilação da cadeia transportadora de elétrons. Desde a Primeira Guerra Mundial foram descobertos os efeitos tóxicos dos nitrofenóis em indivíduos que trabalhavam com explosivos. Só 30 anos mais tarde descobriu-se a ação do 2,4 dinitrofenol corno "desacoplador" da fosforilação. Outro desacoplador é o hormônio tiroxina. Corno eles agem? Ao que tudo indica, agem tornando a membrana interna das mitocôndrias (cristas) permeáveis aos íons. Sendo assim, não há

23 formação de um gradiente de íons H+ na câmara externa, que podem voltar facilmente para a matriz e vice-versa, não havendo a formação do potencial eletroquímico. Sem esse potencial não há ativação das partículas elementares, que não poderão fosforilar o ADP à ATP. O transporte de elétrons continua, e a energia usada para "empurrar" os pró tons de hidrogênio para a câmara externa é liberada na forma de calor. Explica-se, assim, a intolerância ao calor que se observa no hipertiroidismo. Além da produção de ATp, a mitocôndria está envolvida com outros processos metabólicos da célula. Por exemplo, na produção dos hormônios sexuais, ela é passagem obrigatória de um dos seus passos. Em resumo, no citoplasma no nível do REL, acontece urna série de reações que começa com a condensação de 3 moléculas de acetil-CoA, terminando com a produção de colesterol. O colesterol penetra na matriz mitocondrial e aí, após hidroxilação e quebra da cadeia lateral, transforma-se em pregnenolona, que volta ao citoplasma, transformando-se em progesterona. CITOESQUELETO As formas das células, incluindo a infinita variedade de sua superfície, são determinadas por espécies de "andaimes" de fibras e tubos que se cruzam no citoplasma formando o citoesqueleto. Na verdade, a figura celular que se vêem uma lâmina preparada é apenas "um momento" do que é constantemente mudado. As células mudam suas formas constantemente. Mudam seus conteúdos, geram correntes citoplasmáticas, provocam movimentos saltatórios de alguns grânulos, dobram membranas, movimentam-se, modificam o tamanho contraindo-se e distendendo-se, passam por pequenas aberturas, englobam substâncias, etc. Qual seria o papel do citoesqueleto em todo esse frenesi de movimentos? O citoesqueleto não é uma rede rígida. Na verdade, não é nem mesmo uma rede articulada como se pode imaginar. É um arranjo versátil e complexo de elementos estruturais, sendo apenas alguns verdadeiramente fixos. A maioria tem a capacidade de rapidamente se desarranjar em pequenas unidades e se rearranjar em estruturas de formas diferentes, explicando, assim, as mudanças de que a célula é capaz. Toda essa maquinaria é feita de proteínas de vários tipos. O microscópio eletrônico não consegue mostrar a beleza do citoesqueleto. Apenas dá idéia dos elementos que dele fazem parte. Basicamente, três tipos de fibras formam a rede do citoesqueleto: aquelas com 7mm a 9mm de diâmetro, que constituem os microfilamentos; aquelas com cerca de 10mm de diâmetro que constituem os filamentos intermediários e os que apresentam um diâmetro de cerca de 24mm, tendo um lúmem de 7mm, que constituem os microtúbulos. Os microfilamentos e os microtúbulos estão envolvidos com os movimentos celulares enquanto que os filamentos intermediários escoram o interior celular. A actina é o microfilamento melhor conhecido, e exerce papel em muitos tipos de movimentos, desde migração celular até transporte intracitoplasmático. O microfilamento de actina é formado pela polimerização de monômeros de actina (actina G) em dois filamentos enrolados (actina F). Tanto a polimerização de G actina como a despolimerização de F-actina são processos importantes que caracterizam as propriedades dessa proteína; a concentração iônica do meio dado pelo Mg2+, K+ ou Na+ é importante nesse processo. A polimerização é acompanhada de hidrólise de ATP, o qual está sempre ligada à G-actina. As extremidades da F-actina são diferentes: uma é chamada de (+)

24 e se alonga de 5 a 10 vezes mais rapidamente que a outra extremidade, chamada de (-). Seis tipos de actina já foram isolados: três tipos de alfa-actina encontradas nas diferentes células musculares, beta-actina e gama-actina encontradas em outros tipos celulares. Os filamentos de actina podem se arranjar paralelamente, formando feixes, ou se cruzar em ângulos retos, formando redes. Um típico arranjo em feixes é observado nas células musculares esqueléticas e cardíacas. Formando rede são observadas logo abaixo da membrana plasmática em arranjo bidimensional semelhante a teias, e mais interiormente em arranjo tridimensional, dando ao citoplasma a propriedade de um gel. Para formar feixes ou redes, os filamentos de actina são presos entre si por proteínas especiais, chamadas proteínas de ligação. Feixes ou redes também sempre são conectadas por proteínas de ligação às respectivas membranas plasmáticas. São exemplos mais comuns de proteínas de ligação de microfilamentos, a vilina (encontrada nas microvilosidades), a distrofina (no músculo), a alfa-actina (em filipódeos e placas de adesão), a espectrina, etc. Esse arranjo de ligação acaba prendendo a célula ao extracelular. Por exemplo, em células musculares, glicoproteínas transmembrânicas se ligam a filamentos de actina, através da distrofina, pelo lado citoplasmático e pelo pólo oposto se ligam às lamininas da matriz extracelular. A actina pode também ligar-se diretamente às glicoproteínas transmembrânicas. Em resumo, os filamentos de actina podem formar redes que sustentam a membrana plasmática e organizam o citoplasma e a sua capacidade de polimerizar e despolimerizar é aproveitada pela célula para gerar algumas formas de movimento, como o amebóide. Porém, a actina é incapaz de realizar sozinha alguns tipos de movimentos celulares. Portanto, ela interage com outro tipo de proteína chamada miosina. A miosina é uma ATPase que se movimenta ao longo da actina. Ela é uma enzima mecanoquímica, isto é, converte a energia química em mecânica e por isso é também chamada de proteína motora. Então, nos movimentos gerados por esses elementos, a mio sina é o motor, os filamentos de actina são os trilhos e o ATp, o combustível. Estudos da seqüência de DNA mostraram mais de 10 classes de genes para miosina. Entretanto, três são os mais conhecidos: miosina I, II e V. A estrutura molecular de todas mostra uma "cabeça", onde se encontra o sítio de ligação com ATP e com a actina, sendo o local de geração de força; um "pescoço", que regula a atividade da "cabeça" ligando-se à calmodulina ou outra proteína reguladora semelhante; uma "cauda" que contém sítios de ligação que determinam se a molécula vai se ligar à membrana plasmática ou a outras caudas para formar um filamento grosso. A miosina I tem uma cabeça e uma cauda (monomérica); nesta, tem sítio de ligação para a membrana plasmática à qual se prende; pela cabeça ela se prende à actina. A mio sina II e V são diméricas. Como a mio sina I, a miosina V se relaciona à membrana plasmática e ao transporte de vesícuIas de secreção. A mio sina II se polimeriza em filamentos grossos observados nas células musculares estriadas. Esses filamentos têm organização bipolar (as cabeças estão colocadas em ambas extremidades e separadas por uma zona composta só de caudas que se interagem). Nas células musculares estriadas, os filamentos de actina e de miosina estão arranjados de maneira definida e estável no citoplasma, para que possam promover a contração muscular. A contração das células musculares lisas e das mioepiteliais também é feita pela interação da actina e miosina, só que a

25 organização desses filamentos nessas células não segue os padrões apresentados nas células musculares estriadas. Esse sistema actina-miosina promove outros tipos de movimentos em outras células não-musculares. Por exemplo, ao final da divisão celular aparece abaixo da membrana plasmática, na porção central da célula, um anel contráctil constituído de filamentos de actina e miosina; ele promove a contração do citoplasma nessa região, levando à separação das duas células-filhas. Na verdade, são inúmeros os movimentos promovidos pelo sistema actinamiosina, como os movimentos amebóides, deslocamento de organelas no citoplasma, etc. Os filamentos intermediários são encontrados em quase todos os eucariotos, mas ainda não foram vistos em fungos e outros organismos inferiores. Sua função primordial é estrutural, reforçando as células e estruturando-as em tecidos. Algumas características distinguem-os dos demais filamentos de citoesqueleto: são extremamente estáveis, pois a grande maioria continua polimerizada após extração com detergentes e altas concentrações de sais; suas subunidades são filamentos em alfa-hélice que se agregam como cordões, com seqüências e pesos moleculares diferentes; suas subunidades não se ligam a nucleotídeos e, portanto, não requerem a hidrólise de ATP na polimerização. A heterogeneidade de seus monômeros origina diferentes filamentos, os quais foram classificados em cinco tipos. Como tipos I e 11 são classificadas as queratinas ácidas e básicas, respectivamente. São obrigatoriamente heteropolímeros contendo uma mistura de polipeptídeos ácidos e básicos. São encontrados tipicamente em células epiteliais, em geral associados aos desmossomas e hemidesmossomas. Podem também ser divididos em dois grupos: aqueles específicos para endurecer os tecidos epiteliais e que dão origem às unhas, cabelos, bicos, penas, lãs e aqueles denominados de citoqueratinas, encontrados nos epitélios que revestem cavidades internas do corpo. Como filamento do tipo III são classificadas a vimentina, desmina, a proteína ácida da glia e a periferina. Filamento de vimentina é encontrado em células de origem mesenquimal, incluindo fibroblastos, células endoteliais de vasos sanguíneos e leucócitos. Está freqüentemente associado a microtúbulos e a distribuição de ambos nas células se superpõe. Filamento de desmina é encontrado em células musculares; nas estriadas, envolve o disco Z, fazendo conexões entre os vizinhos ou com a membrana plasmática adjacente, concluindo por alinhar o disco Z de células vizinhas. A proteína ácida de glia forma os filamentos gliais em alguns tipos de células da glia (astrócitos e algumas células de Schwann). Filamento de periferina é encontrado em neurônio do sistema nervoso periférico e pouco se sabe ainda sobre ele. Como filamentos do tipo IV são classificados aqueles encontrados com os principais elementos de citoesqueleto dos axônios e dendritos e, conseqüentemente, denominados de neurofilamentos. Existem três classes de neurofilamentos: os de baixo, os de médio e os de alto peso molecular. Também se associam aos microtúbulos: são responsáveis pelo crescimento do diâmetro de um axônio. Assim, a velocidade da transmissão do impulso depende do número de neurofilamentos. Os filamentos tipo V compreendem as lâminas, encontradas exclusivamente no núcleo. Elas formam uma rede com os filamentos organizados em ângulo reto

26 na superfície interna da membrana nuclear. Essa rede recebe o nome de lâmina nuclear; durante a divisão celular (no final da prófase) as lâminas são fosforiladas e se desarranjam formando dímeros entre elas ou ligando-se às proteínas dos poros da carioteca, para tornar a se arranjar no final da anáfase e início da telófase. Como os demais filamentos, os intermediários também têm proteínas associadas a eles. Um possível papel para elas seria o de ligar os filamentos intermediários aos microfilamentos e aos microtúbulos. Já foi verificado em preparações de axônios por criofratura, numerosas conexões filamentosas ligando microtúbulos e filamentos intermediários. Finalmente, os filamentos intermediários são importantes para se fazer diagnóstico diferencial de tumores, se de origem epitelial ou mesenquimal ou neuronal. A célula tumoral pode perder sua morfologia original, mas não perde algumas de suas características diferenciais, inclusive seus filamentos intermediários. Anticorpos marcados podem revelar a presença de filamentos específicos; por exemplo, a presença de queratina em carcinoma de mama e gastrointestinal e a ausência de vimentina mostra que eles são derivados de células epiteliais e não do estroma mesenquimal. Como os tumores de origem epitelial e mesenquimal são sensíveis a diferentes drogas, essa diferenciação é importante para o correto tratamento. A célula tem outro sistema de citoesqueleto feito por microtúbulos. Ao microscópio eletrônico, aparecem como cilindros longos e finos com cerca de 24mm de diâmetro. Quimicamente, são constituídos por proteínas globulares com capacidade infinita de polimerização linear. Na verdade, são duas tubulinas, alfa e beta, muito semelhantes. Elas se associam em dímeros, os quais se associam linearmente formando protofilamentos. Esses, por sua vez, se associam lateralmente de modo a formar um cilindro, quando exatamente treze protofilamentos estão ligados lado a lado. Os microtúbulos podem ser observados tratando-se as células com anticorpos antitubulinas fluorescentes. Na célula em interfase são vistos em maior densidade ao redor do núcleo e daí irradiando para a periferia. Eles irradiam a partir de um centro organizador, localizado ao lado do núcleo, denominado centrossoma (ou centro celular). O centros soma (menos nas células vegetais superiores e fungos) contém um par de centríolos rodeados por um material amorfo. Como os microfilamentos, o microtúbulo possui um pólo menos H e um mais (+). Experimentos demonstraram que a vida média de um microtúbulo de fibroblasto em cultura é curta - menos de 10 minutos. Assim, o centro organizador produz continuamente novos microtúbulos, com seu pólo (-) ancorado no material amorfo do centro organizador. A capacidade de se polimerizar e despolimerizar é uma propriedade intrínseca dos microtúbulos e é necessária para que a célula desempenhe suas funções. Durante a divisão celular, a rede de microtúbulos se rearranja, formando o fuso mitótico, com seus pólos (-) ancorados em cada um dos dois centros organizadores formados, também denominados de pólos celulares. Da mesma forma que acontece com os microfilamentos, os microtúbulos possuem outras proteínas a eles associados, e são conhecidas na literatura pela sigla MAPs (mjcrotubuleassociated protejns). A maioria delas é chamada de MAPs de montagem, que ligam os microtúbuIas entre si e às outras estruturas no citosol, como microfilamentos e filamentos intermediários. Outro tipo são as chamadas proteínas mataras, sendo a cinesina e a dineína as mais

27 conhecidas. Elas utilizam os microtúbulos como trilhos para transportar vesículas de secreção, mitocôndrias e outras organelas menores; a cinesina movimenta-se em direção ao pólo (+) e a dineína em direção ao pólo (-). Esses movimentos são particularmente notáveis nos axônios neuronais, onde observa-se transporte em ambas direções: transporte anterógrado, que leva grãos de secreção formados no corpo celular até as junções sinápticas; e o transporte retrógrado, trazendo substâncias em direção ao corpo celular, substâncias essas principalmente constituídas de membranas "velhas", vindas da região das sinapses com destino aos lisos somas para serem degradadas. Microtúbulos também são responsáveis pelos movimentos dos grãos de pigmentos em células especiais chamadas melanóforos. Estes são encontrados na pele de muitos vertebrados, nas escamas de peixes, etc. As mudanças de cor apresentadas por vários animais são o resultado da movimentação dos seus pigmentos ao longo dos microtúbulos, servindo para ajustá-los ao meio, a fim de obter proteção contra predadores. A dinâmica de organização e desorganização dos microtúbulos citoplasmáticos pode ser afetada por temperatura, pressão e drogas como a colchicina, vimblastina e taxol, todas extraídas de plantas. A colchicina em altas doses despolimeriza os microtúbulos. Já as baixas doses inibem sua dinâmica por ligar-se aos dímeros de tubulina, que dessa maneira se prendem ao pólo em crescimento, impedindo tanto sua polimerização como a despolimerização. O mesmo foi verificado com as demais drogas que, embora agindo da mesma maneira, têm outros sítios de ligação com as tubulinas. Por essas propriedades, essas drogas vêm sendo usadas no controle de várias doenças, principalmente dos tumores, onde há multiplicação constante de células (o uso destas drogas bloqueia o crescimento celular). O taxol tem sido usado especificamente para controlar tumores ovarianos. Além desses microtúbulos lábeis, que atuam em vários processos de movimentação celular, existe outro sistema de microtúbulos mais estáveis. Estes formam estruturas como os cílios e flagelos. CíHos - são protrusões recobertas pela membrana plasmática, vibráteis, que aparecem em grande número, dispostos paralelamente, em células livres ou em superfícies epiteliais. Flagelos - são semelhantes aos cílios, porém maiores e em geral únicos em uma célula. Com poucas variações, cílios e flagelos têm estrutura semelhante, que compreende: o axonema, o corpo basal e raiz cHiar. O axonema que se projeta do citoplasma é o elemento móvel e a estrutura microtubular básica dos cílios e flagelos. É revestido pela membrana plasmática e rodeado pela matriz ciliar, que nada mais é que um prolongamento citoplasmático. Apresenta nove pares de microtúbulos na periferia e um par central. Nos pares periféricos, um microtúbulo é denominado subfibrila A e outro subfibrila B. Estes se distinguem porque a subfibrila A apresenta dois "braços" orientados na mesma direção, chamados dineína, constituídos pela proteína do mesmo nome e que é uma ATPase. A interação entre a tubulina e a dineína promove a movimentação dos cílios e flagelos. Além dessa, existe outra proteína, a nexina, que liga essas duplas. Cada subfibrila A é ligada por outra proteína à bainha que reveste a dupla central de microtúbulos. O corpo basal tem a mesma estrutura dos centríolos. O centríolo é outra formação tubular que aparece no citoplasma, em geral próximo ao núcleo, aberto em ambos os lados, onde os microtúbulos periféricos são triplos e não existe par central. O corpo basal se relaciona com

28 fibras que se aprofundam no citoplasma e constituem a raiz ciliar. O NÚCLEO Em 1831, Brown descreveu uma estrutura constante no interior das células e chamou-a de núcleo. De acordo com a presença ou ausência do núcleo, promoveu-se a classificação das células em procariontes (sem núcleo definido) e eucariontes (com núcleo definido, isto é, o material nuclear contido por uma membrana, a carioteca). Por volta de 1871, o médico suíço Friedrich Miescher analisou quimicamente o conteúdo de núcleos isolados de células mortas em pus de curativos hospitalares e encontrou uma substância que continha fósforo, denominando-a nucleína. Após Fleming ter verificado que o núcleo era corado pelos corantes básicos, o seu conteúdo foi denominado cromatina. Em 1888, Waldeyer usou a palavra cromossomo para descrever as estruturas em forma de bastão que apareciam no núcleo antes da sua divisão, enfatizando sua continuidade com a cromatina do núcleo interfásico. A função de tão importante estrutura, entretanto, só foi entendida em meados do nosso século. Nem mesmo as descobertas de Mendel em 1885 e os enunciados de seus "princípios" foram correlacionados com as de Miescher, Fleming e Waldeyer. Hoje, todos sabem que a função do núcleo é a de transmitir informações. Ele o faz nos dois momentos do ciclo celular: a) na mitose, quando transmite para as células-filhas toda a "bagagem" ou "material hereditário" que possuem na cromatina, através dos cromossomos; b) na interfase, quando a cromatina transcreve os diferentes tipos de RNAs, os quais, no citoplasma, irão conjuntamente e por um intrincado processo produzir as diferentes proteínas específicas daquela célula ou daquele organismo. É importante que o patologista conheça as características de um núcleo interfásico, pois estas irão ajudá-Io a entender os possíveis estados fisiológicos das células. Um núcleo interfásico apresenta duas estruturas fundamentais: carioteca e cromatina. Uma terceira pode ser visível, dependendo do estado fisiológico da célula: o nucléolo. A forma do núcleo se adapta à pressão do ambiente, podendo ser esférico (se em uma célula isodiamétrica, ocupando em geral o centro celular); cilíndrico (se em uma célula prismática, ocupando em geral a porção basal de célula), comprimido contra a membrana, como nas células gordurosas; irregulares, multilobados como em alguns leucócitos. De forma regrada, aparece em número de um por célula, havendo exceções, tais como no fígado, onde 5% das células são binucleares, ou nos músculos estriados dos vertebrados, onde as células são multinucleadas. Ao microscópio óptico, como resultado de seu alto conteúdo de substâncias ácidas (ácidos nucléicos), pode ser visto corado por corantes básicos; exibe a reação de Feulgem positiva que identifica o DNA, um de seus principais componentes. O DNA, o principal constituinte genético da célula, leva informação de uma maneira codificada e não está livre, mas "complexado" com proteínas básicas (histonas), formando a estrutura denominada cromatina. Pouco ou nada podese ver de tal estrutura mediante a microscopia óptica, a não ser que ela esteja mais ou menos condensada. Ao estado de mais condensada deuse o nome de heterocromatina, e ao estado menos

29 condensado ou disperso foi dado o nome de eucromatina. As regiões heterocromáticas às vezes tendem a se agregar, formando os cromocentros. Os cortes finos ao microscópio eletrônico (M.E.) também pouco ajudam para o conhecimento da estrutura da cromatina. Neles, a cromatina aparece como massas de fibras densas dobradas com cerca de lOmm de diâmetro. Elas podem estar distribuídas uniformemente no interior do núcleo, ou em regiões mais ou menos empacotadas. A cromatina, quando condensada, se arranja em geral na periferia do núcleo. A análise bioquímica da cromatina isolada mostrou que ela tem aspecto viscoso e contém DNA, RNA, proteínas básicas (histonas) e proteínas ácidas (não-histonas). O conteúdo das proteínas ácidas e do RNA é variável entre os diferentes preparados, mas histona e DNA estão sempre presentes na razão de 1:1. As proteínas ácidas são muito heterogêneas, variando nos diferentes tecidos; entre elas estão incluídas RNA e DNA polimerases, e outras. Por outro lado, há apenas cinco tipos de histonas. Por serem básicas, ligam-se fortemente ao DNA, que é um ácido. As histonas H2A, H2B, H3 e H4 são muito semelhantes em diferentes espécies; elas estão presentes em quantidades equimolares, duas de cada, a cada 200 pares de bases de DNA. A histona H1 não se conserva entre espécies, e é tecidoespecífica. Está presente apenas uma vez a cada 200 pares de bases, estando mais frouxamente ligada ao DNA. A cromatina, observada ao M.E., não em cortes, após ser dissociada e "espalhada" sobre o suporte, mostra um aspecto de fio cheio de contas, as quais têm cerca de 10mm de diâmetro. Essas contas são chamadas nucleossomas e representam, segundo R.D. Kornberg, um "core" formado por oito moléculas de histonas 2(H2A); 2(H2B); 2(H3); 2(H4), rodeadas pela dupla hélice do DNA. Essa figura de rosário seria resultado de um artefato de técnica pela perda da histona H1 durante a preparação. Esta estaria entre os dois nucleossomas e promoveria, em estado normal, a aproximação dos mesmos, dando ao filamento de cromatina a espessura homogênea de 10mm. Tal filamento representa a forma mais descondensada da cromatina, hábil para transcrever, no núcleo interfásico. A cromatina pode sofrer outros tipos de dobramentos, tornando difícil sua transcrição, formando o que conhecemos como heterocromatina. Nas células interfásicas das fêmeas das espécies, cuja determinação do sexo é XX, XY, existe sempre uma heterocromatina chamada de facultativa. Ela representa a inativação de um dos cromossomos X, para compensar a dose genética dos machos da mesma espécie. Assim, nas células das fêmeas, sempre um cromos soma X está inativo. Porém, a condensação da cromatina pode ser feita de outra forma, quando a célula vai entrar em divisão. Ela chega a dobrar-se cerca de cinco a 10 mil vezes formando os cromossomos. Portanto, no núcleo interfásico, o grau de condensação da cromatina é um indicador da atividade celular. Assim, quando ela está bastante descondensada, o núcleo aparece claro com poucos pontos mais corados e recebe o nome de núcleo frouxo. Isso significa que tal cromatina estátranscrevendo muitos RNAs para a síntese protéica. Um dos RNAs, o ribossômico, é transcrito em regiões especiais da cromatina, denominadas "organizadoras de nucléolo". O nucléolo nada mais é do que o acúmulo de RNA ribossômico, que vai sofrer maturação e tornar-se complexo com proteínas para formar os ribossomos. Estes, por sua vez, irão ao citoplasma efetuar a síntese de proteínas.

30 É por isso que dissemos anteriormente que o nucléolo é uma estrutura que pode ou não ser observada no núcleo. Se este está frouxo em grande atividade transcricional, certamente mostrará também um ou mais nucléolos. Se, entretanto, estiver pouco ativo por razões fisiológicas ou patológicas, mostrará a cromatina condensada, sem nucléolo ou outra estruturação; assim, tomará muito corante, recebendo o nome de núcleo condensado. Os conceitos de Saúde e Doença invariavelmente referem-se aos termos "morfostase" e "homeostase". A MORFOSTASE e a HOMEOSTASE referemse, respectivamente, ao equilíbrio da forma e da função. Portanto, pode-se dizer que: "Saúde é a manutenção da morfostase e homeostase". Nos estados de saúde, as reações energéticas do organismo ocorrem respeitando padrões de tempo, de local e de intensidade que indicam estados de normalidade dessas reações. As reações que obedecem esses padrões de normalidade são denominadas Reações Homólogas. As reações homólogas são assim chamadas por serem comuns a todos os indivíduos de uma determinada espécie, podendo-se determinar, com isso, suas formas e funções normais. Já o termo "doença" pode ser compreendido como se segue: "A doença é resultado da ação de uma agressão que leva a uma alteração não compensada da homeostase e ou da morfostase."

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