Biotecnologia Microbiana

Produo de Bioplsticos por Culturas Microbianas

Mistas
Lusa S. Seram, Paulo C. Lemos, Maria A.M. Reis
CQFB/REQUIMTE, Chemistry Department, FCT/UNL, Quinta da Torre, 2829-516 Caparica Portugal
Instituto de Tecnologia Qumica e Biolgica (ITQB), UNL, 2870-156 Oeiras, Portugal
amr@dq.fct.unl.pt

1 Introduo
Os plsticos convencionais, produzidos a partir de derivados de petrleo,
originam enormes problemas de
contaminao ambiental por no
serem biodegradveis, persistindo
como contaminantes durante longos
perodos de tempo. Tem havido uma
grande pesquisa no sentido de desenvolver polmeros biodegradveis com
propriedades idnticas s dos plsticos
convencionais, de modo a poderem
substituir estes ltimos em aplicaes
semelhantes.
Existem no mercado diversos plsticos
biodegradveis tais como polihidroxialcanoatos (PHAs), polilactato
(PLA) e poliglicolatos (PGA). Os
PHAs so termoplsticos e possuem
propriedades fsicas e qumicas muito semelhantes s do polipropileno,
o que os torna possveis candidatos
progressivamente mais aplicveis na
sua substituio.
O grande obstculo substituio do
polipropileno por PHAs tem sido de
natureza econmica. De facto, o preo
dos PHAs cerca de nove vezes superior ao do polipropileno ( 9/kg para o
PHB contra 1/kg para o polipropileno) (Biby, 2002).

alternativa interessante s culturas

puras. A seleco de culturas mistas
com elevada capacidade de acumulao de PHAs ocorre naturalmente em
resultado das condies de operao
do reactor e, consequentemente, no
h necessidade de esterilizao do
sistema. Por outro lado, a utilizao
de culturas mistas facilita o uso de
substratos complexos obtidos a partir
de resduos orgnicos, dado que a
populao microbiana se adapta continuamente mudana de substrato.
Assim, a possibilidade de produo de
PHAs por culturas microbianas mistas
pode reduzir substancialmente o custo
destes biopolmeros e, consequentemente, torn-los economicamente
mais competitivos com o polipropileno. O preo dos PHAs produzidos por
culturas mistas pode, de facto, baixar
para cerca de metade do preo dos
produzidos por culturas puras, devido
essencialmente reduo do custo dos
substratos e dos custos de investimento (Meesters, 1998).

2- Caractersticas e Aplicaes dos PHAs

Os PHAs existem no citoplasma da
clula sob a forma de grnulos (0.2
a 0.5 m de dimetro) rodeados por
uma membrana (Sudesh et al., 2000)
(Figura 1). Os grnulos uorescentes
de PHAs podem ser observados por
microscopia de epiuorescncia
usando corantes lipoflicos tais como
o Azul de Nilo (Figura 4).
A frmula qumica geral dos PHAs
est representada na Figura 2. Foram
identicados mais de 100 monmeros
diferentes como constituintes dos
PHAs em vrias bactrias. O polihidroxibutirato (PHB), constitudo por
monmeros de 3-hidroxibutirato,
o PHA mais bem caracterizado e o
acumulado com maior frequncia
por bactrias (Madigan et al., 2000).
Outros PHAs frequentemente acumulados por bactrias incluem o
polihidroxivalerato (PHV), polihidroximetilvalerato (PMHV) e o

A razo principal do elevado custo

dos PHAs decorre do facto de actualmente serem produzidos por culturas
microbianas puras e substratos caros
(glucose e cido propinico), o que
resulta em custos elevados de investimento e de produo (necessidade
de um maior controlo da operao e
de equipamento auxiliar para esterilizao).
O uso de culturas mistas para produo de PHAs pode constituir uma
Figura 1 Grnulos de PHB acumulados por Azotobacter vinelandii UWD (Page et al., 1995)

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trias pode atingir 80 % do seu peso
celular (Kim et al. 1994).

Figura 2 Frmula qumica geral dos PHAs (Lee, 1996)

polihidroximetilbutirato
(PMHB).
A sua presena e proporo relativa
dependem do tipo de substrato usado
pelo microrganismo.
Se forem usadas misturas de substratos, os microrganismos podem
sintetizar co-polmeros, compostos
por diferentes monmeros. O copolmero constitudo por monmeros
de 3-hidroxibutirato e de 3-hidroxivalerato (3 HB-co-3HV) produzido
industrialmente por uma cultura pura
de Ralstonia eutropha, usando como
substratos cido propinico e glucose. A formao de um co-polmero
contendo unidades de 3HB e 3HV
altera as propriedades do material,
conduzindo a uma diminuio da
cristalinidade e da temperatura de
fuso, obtendo-se um polmero
menos rgido e mais resistente, que
proporciona melhores condies de
processamento. Consequentemente, as
propriedades do co-polmero podem
ser denidas variando a composio
relativa dos cidos orgnicos presentes
no meio de cultura.
O peso molecular dos PHAs produzidos industrialmente por culturas
puras varia entre 1.7 x 105 e 4.5 x 106.
Os PHAs mais comuns so polmeros
semicristalinos. O grau de cristalinidade depende da composio do
polmero: sendo 60-80% para o PHB
e decrescendo para 30-40% para o copolmero cujo contedo em unidades

HV de 30% (mol/mol).
As aplicaes mais gerais dos PHAs
incluem lmes para embalagens e
plsticos convencionais. Dado que os
PHAs so biocompatveis, so usados
em aplicaes mdicas e farmacuticas (os de sutura cirrgica, implantes
sseos, frmacos de libertao lenta,
etc.). Na agricultura, os PHAs so
usados em produtos de libertao de
reguladores de crescimento de plantas
ou de pesticidas.

3- Microbiologia
Os PHAs so sintetizados por um
grande nmero de bactrias Gram
negativas e Gram positivas pertencentes pelo menos a 75 gneros diferentes.
Alguns exemplos de culturas puras
usadas industrialmente para produzir
PHAs incluiem a Ralstonia eutropha,
Alcaligenes latus, Azotobacter vinelandii e diversas espcies de Pseudomonas.
Os PHAs podem ser ecientemente
produzidos por microrganismos
geneticamente modicados, como
por exemplo a Echerichia coli recombinante.
A produo de PHAs por estas bactrias ocorre, na maioria dos casos, em
situaes em que um nutriente, que
no a fonte de carbono, limitante
para o crescimento. A quantidade de
polmero acumulado por estas bac-

Para alm de culturas puras microbianas, as culturas mistas tem sido referenciadas como produtoras de PHAs.
A acumulao de PHAs por culturas
mistas particularmente importante
em populaes microbianas presentes
em estaes de tratamento de euentes que experimentam condies
transientes de disponibilidade de
carbono e/ou oxignio. Exemplos de
microrganismos que sintetizam PHAs
em condies transientes de oxignio
so as Bactrias Acumuladoras de Fsforo (PAOs Polyphosphate Accumulating Organisms), responsveis pela
remoo de concentraes elevadas
de fsforo de euentes. Nas estaes
de tratamento biolgico de euentes
contaminados com fsforo, a biomassa recircula continuamente entre
ambientes anaerbios e aerbios, o que
estimula a sntese de reservas intracelulares. A acumulao de reservas
intracelulares, nomeadamente PHAs,
tem um papel muito importante no
metabolismo destes microrganismos.
Nestes sistemas ocorre um outro
grupo de microrganismos designado
Bactrias Acumuladoras de Glicognio (GAOs-Glycogen Accumulating
Organisms) que sintetizam PHAs
mas no acumulam fsforo (Liu et al.,
1996). A quantidade de biopolmero
acumulado por PAOs e GAOs relativamente baixa, no ultrapassando
20% do peso celular, o que limita a sua
utilizao para a produo industrial
de PHAs.
A produo de PHAs por culturas
mistas aerbias especialmente elevada quando estas so submetidas a condies transientes de disponibilidade
de carbono. As condies transientes
de excesso e falta de substrato causam
respostas dinmicas no metabolismo
celular. Sob estas condies dinmicas,
o crescimento torna-se desequilibrado (unbalanced), i.e. o substrato
consumido sem ocorrer um aumento
correspondente de todos os componentes celulares (sem sntese de
biomassa activa) (Beccari et al., 1998).
Neste caso, o substrato armazenado
no interior da clula sob a forma de
PHAs. A produo de PHAs por culBoletim de Biotecnologia

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turas expostas a condies dinmicas
de disponibilidade de carbono, pode
atingir valores superiores a 60% do
peso celular (Reis et al., 2003). No
existe, at ao momento, uma identicao microbiolgica dos grupos ou
grupo de bactrias pertencentes a este
fnotipo.
Algumas plantas produtoras de cereais, tais como o girassol e a soja, conseguem sintetizar PHAs. Contudo, o
rendimento de produo (4% do peso
da planta) muito inferior ao produzido por bactrias, o que, actualmente,
reduz a viabilidade de produo de
PHAs por esta via.
Este artigo aborda a produo de
PHAs por culturas mistas sujeitas a
condies dinmicas de disponibilidade de carbono.

4 Processo de Produo
de PHAs por culturas
mistas em Condies
Transientes de Adio de
Carbono
4.1- Mecanismo de produo de
PHAs
Quando uma cultura microbiana
experimenta um aumento brusco na
concentrao de substrato disponvel,
aps um perodo de limitao do
crescimento, podem ocorrer dois tipos
de adaptao, que dependem essencialmente da natureza do substrato,
da cultura microbiana e das condies
de operao (Daiger e Grady, 1982):
a biomassa pode adaptar-se s novas
condies aumentando o crescimento
celular (crescimento como resposta)
ou rapidamente acumular o substrato
sob a forma de reservas intracelulares
(acumulao como resposta). A acumulao de reservas a resposta mais
rpida porque requer uma menor
adaptao siolgica dos microrganismos. Nestas condies, h um
desacoplamento entre o consumo de
substrato e o crescimento, ocorrendo
acumulao de reservas intracelulares. O fenmeno de acumulao de
reservas intracelulares geralmente
dominante (cerca de 70%) sobre o

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Figura 3 Pers de concentraes e da velocidade especica de crescimento num processo com

culturas mistas submetidas a condies dinmicas de adio de carbono.

crescimento. Se o tempo de exposio

ao substrato se prolongar de tal modo
que ocorra adaptao siolgica, o
crescimento celular torna-se o processo dominante.
O mecanismo de acumulao de
reservas polimricas quando os
microrganismos so sujeitos a condies transientes de carbono (perodos
curtos de excesso de carbono alternados com perodos longos de limitao
de carbono externo) foi proposto por
Majone et al. (1999):
- Aps um perodo prolongado de
limitao de carbono (fome), os
microrganismos, quando expostos
a elevadas concentraes de carbono (fartura), transformam a
maior parte do substrato em reservas polimricas internas e o restante em crescimento celular (Figura
3). Aps a exausto do substrato
externo, as reservas internas so
usadas para crescimento e manuteno celular. Neste perodo de
limitao de carbono, a velocidade
especca de crescimento atinge
valores muito baixos, o que obriga
o microrganismo a uma adaptao
siolgica na fase seguinte quando
confrontado com um excesso de
carbono disponvel, resultando
preferencialmente num mecanismo de acumulao de reservas em
detrimento do crescimento celular.
Nestas condies, e contrariamente ao que acontece com as PAOs e

GAOs, a acumulao de reservas

intracelulares a partir do substrato
externo e o crescimento, ocorrem
em simultneo.
Neste tipo de sistemas dinmicos,
os microrganismos que possuem a
capacidade de acumular substrato
sob a forma de reservas intracelulares podem sobreviver durante a fase
de ausncia de carbono externo e,
portanto, tm uma vantagem competitiva sobre os microrganismos que no
possuem esta capacidade, tornado-se
dominantes.
A Figura 4 representa os grnulos de
PHB corados no incio e no m da fase
de fartura para uma cultura mista
sujeita a ciclos de fome e fartura.
4.2-Metabolismo
No existe ainda nenhum modelo
metablico para o processo de produo de PHAs por culturas aerbias
sujeitas a condies dinmicas de
adio de carbono, mas provavelmente no ser muito diferente do que
conhecido para culturas puras que
acumulam PHAs (Figura 5). O composto intermedirio chave na sntese
e degradao de PHAs o acetil-CoA.
Enquanto existe substrato externo forma-se acetil-CoA, que parcialmente
desviado para a produo de PHAs
e para crescimento, atravs do ciclo
dos cidos tricarboxlicos (TCA). Na
sntese de PHB so condensadas duas

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(a)

(b)

Figura 4 Grnulos de PHAs observados por microscopia de epiuorescncia aps colorao com Azul de Nilo.(a) incio da fase de fartura ; (b)
m da fase de fartura

molculas de acetil-CoA para formar

acetoacetil-CoA, sendo esta reaco
catalisada pela enzima 3- Cetotiolase.
A sntese de PHB prossegue pela aco
das enzimas NADPH redutase e PHB
sintetase. Aps a exausto do substrato
externo, o PHB degradado, produzindo-se acetil-CoA que usado para
crescimento e manuteno celular
(ciclo a tracejado na Figura 5).
4.3 Optimizao do processo
Um dos factores que tem limitado a
produo de PHAs por culturas mistas tem sido o baixo rendimento de
produo quando comparado com o
obtido por culturas puras, nomeadamente por Ralstonia eutropha, usada
na produo Industrial de PHAs (Kim
et al., 1994). De facto, enquanto este
microrganismo capaz de acumular
cerca de 80% (massa de PHA por
massa celular), o valor referido na
literatura para culturas mistas no
ultrapassa 60% (Reis et al., 2003).
Este valor mximo de acumulao
de PHAs foi obtido com culturas de
lamas activadas, sujeitas a condies
transientes de adio de substrato
(Fome e Fartura) descritas anteriormente. Dever notar-se, contudo, que
o interesse pela produo de PHAs
por culturas mistas tem tido como
principal objectivo estudar os mecanismos de acumulao de reservas
intracelulares e no a sua optimizao
com vista produo industrial, pelo
que de esperar que, manipulando os

parmetros de operao do processo, o

rendimento de produo de PHAs por
culturas mistas possa atingir valores
superiores aos descritos na literatura.
A optimizao da produo de PHAs
tem de passar necessariamente pela
seleco da congurao de reactor e
das condies de operao que conduzam obteno de rendimentos e
produtividades elevadas. A congurao de reactor mais usada para estudar
a produo de PHAs por culturas
mistas, usando o processo de Fome
e Fartura, o reactor descontnuo

sequencial (SBR). O SBR operado

em ciclos de cerca de 12 a 24 horas. A
adio de substrato feita por pulso,
sendo consumido em cerca de 1 a 2
horas, seguindo-se um perodo de
cerca de 10 a 22 horas de ausncia
de carbono externo (Dircks et al.,
2001, Seram et al., 2002). Os SBRs
so reactores ideais para seleccionar
populaes microbianas com elevada
capacidade de acumulao de PHAs,
porque a biomassa cresce em condies transientes. Este tipo de reactor
fcil de controlar e altamente

Figura 5 Metabolismo de sntese e degradao de PHB por diversos microrganismos (modicado a partir de Sudesh et al., 2000).

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Figura 6 Efeito da concentrao de substrato na produtividade especica (qp), no rendimento

de produo de PHB (Yp/s) e no contedo em PHB na biomassa (%HB).

exvel, permitindo a alterao rpida

dos ciclos de operao (durao da
alimentao e extenso do ciclo).
4.3.1- Efeito da concentrao de
substrato
O efeito da concentrao de substrato
na quantidade de polmero produzida
foi estudado usando acetato como
substrato e um SBR operado com
ciclos de 12 horas. O acetato foi adicionado num nico pulso, sendo consumido entre 1-4 horas, dependendo
da concentrao usada, seguindo-se
um perodo de 8 a 11 horas de ausncia de carbono. Os resultados obtidos
para as diferentes concentraes de
acetato esto representados na Figura
6. Verica-se que o contedo em PHB
na biomassa aumenta com a concentrao de substrato, atingindo 67% do
peso celular. No entanto, a produtividade especca em polmero atinge o
mximo (0.75 mmmol C/mmol X.h)
para 90mmol C/l e decresce acentuadamente para a concentrao de substrato de 180mmol C/l. Este decrscimo
originado pela inibio da sntese de
PHB para elevadas concentraes de
substrato. A razo entre a quantidade
de polmero produzido e de substrato
consumido (Yp/s), independente da
concentrao de substrato usada, atingindo um valor mdio de 0.72 Cmmol
HB/Cmmol HAc.

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interessante notar que as produtividades especcas (0.41-0.75 Cmmol

HB/Cmmmol X.h) obtidas por
culturas mistas sujeitas a condies
transientes de adio de carbono,
so cerca de uma ordem de grandeza
superiores s obtidas (0.013 Cmmol
HB/Cmmmol X.h) por culturas puras
usadas industrialmente (Kim et al.,
1994). Do ponto de vista da optimizao do processo, esta caracterstica das
culturas mistas muito importante,
por permitir obter elevadas produtividades com concentraes celulares
baixas.
4.3.2- Estratgia de operao do
Reactor
Uma forma de garantir a produo
de elevadas quantidades de polmero,
minimizando a inibio por substrato,
ser adicionar o substrato de forma
semi-contnua (fed-batch) ou contnua. No ltimo caso o substrato,
correspondente ao mximo anterior
(180mmol C/l), adicionado continuamente durante a fase de fartura,
seguindo-se um perodo de fome. No
primeiro caso, a mesma quantidade de
substrato distribuda por trs pulsos
sequenciais, seguindo-se igualmente
um perodo de fome.
Os resultados obtidos para os dois
tipos de estratgia de alimentao
do reactor esto representados na

Figura 7. A alimentao em contnuo

(Figura 7a) resultou numa diminuio
na produtividade do reactor (0.30
Cmmol HB/Cmmmol X.h) e no
contedo em polmero nas clulas
(56%), relativamente situao em
que a mesma quantidade de substrato
(180mmol C/l) tinha sido adicionada
num pulso (Figura 6). Este resultado
pode ser explicado pelo facto de no
sistema alimentado em contnuo, o
substrato dentro do reactor ter sido
limitante para o processo de acumulao de PHB. Pelo contrrio, quando
a mesma quantidade de substrato foi
adicionada em trs pulsos (Figura
7b), a produtividade (0.80 Cmmol
HB/Cmmmol X.h) e a quantidade de
polmero acumulado (78.5%) aumentaram signicativamente em relao
s experincias em que o substrato
foi adicionado num nico pulso e em
contnuo. O contedo em PHB nas
clulas (78.5%) idntico ao obtido
por culturas puras (80%), o que torna
o processo de Fome e Fartura extremamente atractivo para a produo
industrial de PHAs.
A adio de 4 pulsos de carbono no
originou qualquer aumento na acumulao de PHB, podendo armar-se
que as clulas atingiram a mxima
capacidade de acumulao de polmero para 180mmol C/l, distribudo em
trs pulsos.

5-Concluses
Manipulando os parmetros de operao do reactor, a quantidade de PHB
obtida por culturas mistas pode atingir valores semelhantes aos obtidos
por culturas puras.
Embora este estudo tenha sido efectuado com cido actico, experincias
realizadas com outro tipo de substratos, tais como cido propinico e cido
butrico, revelaram que os cidos orgnicos volteis so excelentes substratos
para a produo de PHAs por culturas
mistas. Tendo em conta este aspecto,
pode-se concluir que a produo de
PHAs por culturas mistas abre novas
perspectivas utilizao e valorizao
de resduos industriais que possuam
na sua composio compostos orgni-

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(a)

(b)

Figura 7 Produo de PHB para dois tipos de adio de substrato: (a)- alimentao em contnuo; (b) alimentao por pulsos. ( - velocidade
de adio de acetato (a) e concentrao de acetato (b), - % de PHB, - OUR (velocidade especca de consumo de oxignio (oxygen uptake rate),
-concentrao de amnia).

cos fermentveis (ex. soro de leite, rescaldo de melao) ou fermentados (ex.

cidos orgnicos). No primeiro caso
o processo deve incluir uma etapa de
fermentao a montante do processo
de produo de biopolmero.
No caso de se desenvolverem condies que tornem o processo de produo de PHAs por culturas mistas e
resduos industriais economicamente
vivel, num futuro prximo esta
tecnologia permitiria reduzir de forma
signicativa a utilizao de plsticos
no biodegradveis e a necessidade de
tratamento do tipo de resduos industriais referidos, resolvendo um duplo
problema ambiental.

Agradecimentos
Este projecto (POCTI/35675/BIO/2000)
foi nanciado pela Fundao para a Cincia e Tecnologia (FCT). Lusa S. Seram e
Paulo C. Lemos agradecem FCT pelas
bolsas PRAXIS XXI BD/18287/98 e BPD/
20197/99, respectivamente.

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