Estrutura dos Ácidos Nucléicos

Moléculas com informações para a síntese
DNA e RNA
Replicação – Transcrição – Tradução
Introdução à Biologia Molecular
Alexandre Havt
Estrutura dos Ácidos Nucléicos – DNA e RNA
Estrutura dos Ácidos Nucléicos – DNA e RNA
de proteínas

DNA – armazém ou biblioteca celular
 Contém informações para a construção
das células e tecidos
 Duplicação dos genes garante a
perpetuação das espécies

Transcrição – síntese de RNA
 RNA mensageiro (mRNA)
 RNA transportador (tRNA)
 RNA ribossômico (rRNA)
Watson e Crick

Tradução – síntese de proteínas a partir das
informações dos RNAs

Descoberta da estrutura do DNA em 1953
Estrutura dos Ácidos Nucléicos – DNA e RNA
Estrutura dos Ácidos Nucléicos - DNA
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 Estrutura dos Ácidos Nucléicos - RNA RNA mensageiro - mRNA

RNA ribossômico - rRNA RNA transportador - tRNA

Ribossomos
 Procariotos
 Citoplasma
Função
 Mitocôndrias Eucariotos  Transportar aminoácidos para

Procariotos a síntese protéica
 3 tipos de moléculas de rRNA  Assegurar a incorporação dos
• 16S + 21 proteínas – 30S mesmos na posição correta
• 23S 70S
+34 proteínas – 50S • anticódon
• 5S

Citoplasma de eucariotos
Células com pelo menos 20 tRNA
 4 tipos de moléculas de rRNA
Pequenas moléculas
• 18S + 33 proteínas – 40S  80 nucleotídeos
• 5S 80S
• 28S +50 proteínas – 60S
 4S
• 5,8S

Mitocondriais
 55S
• Propriedades similares ao das
bactérias

Regras da Síntese dos Ácidos Nucléicos e Regras da Síntese dos Ácidos Nucléicos e
Proteínas Proteínas

Formados por blocos monoméricos

 RNA e DNA
• 5 Nucleotídeos
 Proteínas
• 20 aminoácidos

Monômeros adicionados 1 por vez

Cadeia de formação tem ponto de partida específico com
crescimento unidirecional para um terminal fixo
 Direção 5´ - 3´

Produto primário é frequentemente modificado

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 Replicação do DNA

Duplicação do material genético para a divisão celular
 Replicação é semiconservativa
• Uma fita parental e uma nova fita sintetizada

Forquilha de replicação
 Helicases - Separação das duplas fitas

Replicação do DNA  Proteínas protegem DNA de fita simples e evitam reaproximação

 Primase – síntese de iniciador
 Topoisomerase
• Desenrolam supertorção
 Ligases – união dos fragmentos de Okasaki
 DNA polimerases
• α - associação com primase para formação do iniciador
• δ - polimerização das fitas líder e lenta
• γ - polimerização DNA mitocondrial
• β ε κ η ζ ι - polimerases de reparo

Replicação do DNA Eucariótico

Síntese de RNA
Transcrição

Síntese de RNA Transcrição – Síntese de RNA

RNA polimerases devem reconhecer
 O ponto de início da transcrição
 Qual das fitas deve ser usada como molde – transcrita

Região promotora do DNA
 Controla a ligação da RNA polimerase
 Identifica o ponto de início da transcrição
 Controla a frequência da transcrição
• Sequências regulatórias no promotor
• Sequências perto do promotor Interagem com proteínas que estabilizam
• Reforçadores a ligação RNA-polimerase ao promotor

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 Transcrição Processamento do mRNA Eucariótico

Síntese dos rRNAs Eucarióticos Síntese dos tRNAs Eucarióticos

Síntese Protéica - Tradução

Ocorre nos ribossomos – rRNA

Direcionado pela sequência dos códons
Síntese de proteínas de mRNA

Tradução
Cada tRNA traz um aminoácido

específico ao seu anticódon
 Aminoacil-tRNA

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 Código Genético
Primeira base Segunda base Terceira base
Formação do aminoacil-tRNA
(5’) U C A G (3’)
U Phe Ser Tyr Cys U
Aminoacil-tRNA
Phe Ser Try Cys C
 tRNA ligado covalentemente a um
Leu Ser Parada Parada A
aminoácido na terminação 3’
Leu Ser Parada Trp G
 Cada aminoácido com seu tRNA
C Leu Pro His Arg U
• Alanil-tRNAala
Leu Pro His Arg C
Leu Pro Gln Arg A • Metionil-tRNAi met
Leu Pro Gln Arg G
20 Aminoacil-tRNA-sintetases
A Ile Thr Asn Ser U  Processo dependente de ATP
Ile Thr Asn Ser C
 Ocorre em 2 passos
Ile Thr Lys Arg A
Met Thr Lys Arg G • Formação do complexo:
 enzima/aminoacil-AMP e pirofosfato
G Val Ala Asp Gly U
• Transferência do aminoácido ativo
Val Ala Asp Gly C
 Hidroxila do carbono 2 ou 3 da ribose
Val Ala Glu Gly A
Val Ala Glu Gly G  Nucleotídeo de adenina (CCA)

Processo da Tradução Iniciação

Envolvimento de 3 passos
 Iniciação
 Alongamento
 Terminação

Alongamento – Ligação Peptídica – Translocação Terminação

Códons de parada
 Inexistência de tRNA com anticódons que possam parear com
• UAA
• UGA
• UAG

Fatores de liberação unem-se ao ribossomo
 Hidrólise da ligação peptidiltransferase
• Cadeia peptídica
• tRNA
 Peptídeo sintetizado é liberado
 Dissociação das subunidades do ribossomo
• Liberação do mRNA

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 Polissomos Técnicas de Biologia Molecular

Ligação de vários ribossomos ao mRNA

Reação de Polimerase em Cadeia – PCR
 Função - Multiplicação de trecho específico de DNA
 Cada ribossomo cobre 80 nucleotídeos de mRNA • Problema – análise de ácidos nucleicos
 Baixa quantidade de ácidos nucléicos nos tecidos Karis Mulis
 Aproximadamente um ribossomo a cada 100 nucleotídeos
 Primers
 Taq – DNA polimerase (Thermus aquaticus)
• Enzima termoestável em temperatura até 117 °C
• Temperatura ótima 72 °C
 Início – vários banhos maria com diferentes temperaturas
 1987 – publicação do artigo de Mulis na Methods in
Enzymology
 1989 – primeiro termociclador
 1994 – Nobel em química para Karis Mulis

Técnicas de Biologia Molecular

Técnicas de Biologia Molecular

Fundamentos do PCR
 Desnaturação das cadeias de DNA à 94 °C
 Anelamento dos primers (de acordo com a TM de cada primer)
Vídeo da reação de PCR
 Extensão – incorporação dos nucleotídeos pela enzima Taq á 72 °C

Reagentes essenciais
 Taq – em solução de Tris-HCL (pH 8,0), 0,1 mM EDTA, 1mM
DTT, 50% glicerol
 Tampão – 200 mM Tris-HCL (pH 8,4), 500 mM KCl
 Cloreto de magnésio – cofator para ação da enzima
 Desoxinucleotídios (ATP, TTP, CTP, GTP) – mistura de [ ]’s
iguais
 Primers específicos à sequência que se deseja amplificar

Técnicas de Biologia Molecular CGTCATGCTTAGCCGTTCCGGCTGCAGCTTAAAAAAAAAAAAA mRNA

ACGTCGAATTTTTTTTTTTTT cDNA

Fundamentos da Transcriptase Reversa CGTCATGCTTAGCCGTTCCGGCTGCAGCTTAAAAAAAAAAAAA mRNA

 Vírus de RNA tipo VI GCAAGGCCGACGTCGAATTTTTTTTTTTTT cDNA

CGTCATGCTTAGCCGTTCCGGCTGCAGCTTAAAAAAAAAAAAA mRNA
• Enzima transcriptase reversa
GCAGTACGAATCGGCAAGGCCGACGTCGAATTTTTTTTTTTTT cDNA
• Genoma de RNA orienta a formação de uma molécula de DNA
 AMV - Vírus da Mieloblastose aviária
RNAse I
 M-MuL-V (Moloney Murine Leukemia Virus)

 Importante ferramenta para o estudo da expressão gênica a partir do CGTCATGCTTAGCCGTTCCGGCTGCAGCTTAAAAAAAAAAAAA mRNA

mRNA GCAGTACGAATCGGCAAGGCCGACGTCGAATTTTTTTTTTTTT cDNA

 Síntese de uma fita de DNA complementar de fita simples (cDNA)

PCR
 Sequências de cDNA específico podem ser amplificados por PCR

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 Isolamento de RNA por TRIZOL
Técnicas de Biologia Molecular

Fenol + Isotiocianato de guanidine
 Membranas celulares e nucleares destruídas

Isolamento de RNA
 Manutenção da integridade do RNA
 Imprescindível uso de luvas e amostras no gelo quando possível –  Maceração da amostra com TRIZOL
evitar RNAse

Clorofórmio – separação em 3 fases
 Qualquer amostra tecidual, cultura de células - (100mg)  RNA – sobrenadante
 DNA – camada intermediária
 Método muito utilizado Reagente TRIZOL
 Protéinas – camada inferior

Precipitação com Isopropanol

Lavagem com Etanol 75%

Leitura em espectrofotômetro
 260nm – quantidade ( A260 x fator de diluição x 0,04 = [ ug/uL])
 Razão 260nm/280nm – qualidade do RNA ( ≅ 2,00)

Análise por Eletroforese

Amostra 100 mg
+ • Centrifugar 12.000 g
Homogeneizar
1 mL de TRIZOL
• Remover sobrenadante
transparente para novo
tubo
• Acrescentar 500 uL de
isopropanol
• Incubar RT °C 10 min
• Centrifugar 12.000 g p/
15 min à 2 – 8 °C
• Descartar sobrenadante
 Vórtex por 15 sec.
 Incubar RT °C p/ 2-3
min
 Centrifugar 12.000 g p/
15 min
• Acrescentar 3x 1mL de
etanol 75%
• Centrifugar 3x a 7.500 g
por 5 minutos à 2 – 8 °C
10 min. 2- 8 °C

Principio básico
 O DNA tem carga negativa
 Aplicando uma voltagem as moléculas de DNA migrariam para o
• Remover catodo
sobrenadante p/ novo
tubo  Malha de gel de agarose permite o deslocamento do DNA separando-
• Acrescentar 200 uL
de clorofórmio o por tamanho
• Moléculas menores migram mais rápido
• Moléculas maiores migram mais lento
• Descartar 3° sobrenadante
 A distância percorrida é comparada à distância de uma molécula de
• Evaporar etanol
•Solubilizar pellet com tamanho conhecido
ddH2O autoclavada
•Leitura espectrofotômetro

Análise por Eletroforese

Principio básico
 Agarose – polissacarídeo é aquecido para dissolver em tampão
eletrolítico
• Tris-Acetato-EDTA – TAE
• Tris- Borato-EDTA
• Solubilização do gel por esfriamento
 Aumento da viscosidade da amostra com glicerol
 Visualizaçãoda corrida da amostra com corante – bromofenol blue
 Visualização do DNA no gel por brometo de etídeo

Cuba de Eletroforese Horizontal

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