c c








 















 
Caroline Yuri Hayashida 

6828421













Eduardo Teodoro Carneiro 6827712
Felipe Garutti Thies 6828081
Fernanda Midori Seino 6828442
Silvia Satie Kawamura 6828456



!


06/05/2010















!"#

÷ eletroforese capilar é um método de separação baseado nas velocidades

de migração diferenciais de espécies carregadas em um campo elétrico cc.

÷ eletroforese capilar é utilizada por diversos motivos, como por exemplo:

menor custo de equipamentos, necessidade de menor quantidade de amostra,
maior velocidade e melhor resolução e, por fim, os métodos eletroforéticos são
mais sensíveis em termos de massa.

Neste método, aplica-se uma diferença de potencial num determinado

tempo, em alta freqüência, e verifica-se quanto tempo a espécie demora para
chegar num determinado ponto. O equipamento utilizado está demonstrado na
figura 1.

c
$
% Equipamento para eletroforese capilar.

O capilar é de sílica fundida (SiO2 e normalmente possui de 10 a 100 µm de

diâmetro e de 40 a 100 cm de comprimento. Entre os eletrodos (estes são
normalmente de platina é aplicado um potencial. O ambiente termostatizado
controla a temperatura para esta não alterar a viscosidade do solvente utilizado e
também é utilizado por uma questão de segurança.

c
 


Quando há alta voltagem, há o fluxo eletroosmótico que causa a migração

do solvente em direção ao cátodo. O motivo é a dupla camada elétrica que se
desenvolve na interface sílica/solução.

Em pH > 3, há a ionização dos grupos Si-OH (atua como um ácido fraco,

deixando a parede interna do capilar negativa. Os cátions do tampão congregam-se
numa dupla camada elétrica adjacente a esta camada. ÷ssim, os cátions, presentes
na amostra, que estão na camada difusa externa são atraídos para o cátodo, pela
presença de um campo elétrico, e os ânions são atraídos para o ânodo. Tanto os
cátions como os ânions arrastam consigo moléculas neutras do solvente, por
exemplo, a água. Porém, perto da parede do capilar, existem muitas cargas
positivas, dessa forma a água é empurrada junto com estas e vai para o cátodo. Os
-
ânions também empurram o solvente, mas em menor intensidade. Os grupos Si-O
sentem o campo o campo elétrico, mas não geram corrente elétrica pois não tem
liberdade de movimento.

Conforme as diferentes velocidades de deslocamento, as diferenças são

causadas pelo atrito, são formados vários cilindros dentro do capilar. Conforme o
tempo passa, cerca de nano segundos, todos estes cilindros se deslocam numa
mesma velocidade. Dessa forma, tudo que está presente se desloca por causa do
fluxo eletroosmótico e pela presença de um campo elétrico.

÷lguns dos efeitos deste fluxo são: bombeamento da solução dentro do

capilar; alteração da mobilidade das espécies presentes; é possível que este reverta
o sentido de deslocamento de um íon; pode prejudicar a resolução dos picos
obtidos, caso esteja no mesmo sentido de deslocamento do íon, pois este possuirá
uma velocidade maior, porque sua velocidade estará somada à velocidade do
solvente, assim seu tempo de migração final será menor e, paralelamente, todos os
íons terão as velocidades parecidas, portanto a leitura dos picos será dificultada.

Para minimizar o fluxo eletroosmótico, uma opção seria recobrir a parede

interna do capilar com um reagente que eliminasse os grupos silanóis. Poderia ser
utilizado o trimetilclorosilano C H ClSi. ÷ reação deste com o Si-OH resultaria na
perda de HCl e a formação do Si-O-O(CH, que não iria se dissociar e, portanto,
não formaria a camada negativa na parede do capilar.

    
  

> = µ2.E = µ2 (v/LT

> ² velocidade em m/s;

µ2 ± mobilidade eletroforética (proporcional à carga do íon e inversamente

proporcional à força de retardo por fricção sobre o íon. Esta é determinada pelo
2
tamanho e formato do íon e pela viscosidade do meio. Unidade: m /s.>;

E ² força do campo elétrico em >/m;

v ² voltagem aplicada (ddp em volts;

L T ² comprimento do capilar entre os eletrodos em m.

N = (µ2
2D

N - número de pratos de uma coluna de eletroforese capilar;

2
D ² coficiente de difusão do soluto em m /s.

Quanto maior o número de pratos de uma coluna de eletroforese capilar,

maior será a eficiência do processo e com isso, serão obtidos eletroferogramas
com melhores resoluções. Como N e v são diretamente proporcionais, a eficiência
será maior conforme se trabalha em valores altos de voltagem. É por este motivo
que trabalhamos em potenciais altos, como 30 k>. Porém, é necessário prestar
atenção pois o aumento do potencial também resulta numa maior geração de calor
e isso é prejudicial. Dessa forma, para trabalhar em altos potenciais, é necessário
diminuir a área do eletrodo utilizado. ÷ssim, o calor gerado será menor e haverá
uma maior dissipação de calor.

tm = L D/>

tm ² tempo de migração;

L D ± distância entre a injeção e a detecção.

÷ partir desta fórmula, podemos notar que o comprimento do capilar não

influi na eficiência, mas sim na resolução, pois está relacionada com o tempo de
migração.

@  

O eletroferograma mostra o tempo de migração das espécies. Este é o

tempo necessário para atingir o topo do pico e corresponde à análise qualitativa
dos íons. ÷ área ou a altura do pico irão quantificar a espécie identificada. Um
exemplo de eletroferograma encontra-se na figura 2.

c
$
&% Eletroferograma com C ðD.

Ä  


ö Hidrodinâmica: pressurização do reservatório da amostra; despressurização

do reservatório oposto; desnivelamento favorável ao reservatório da
amostra.

ö Eletrocinética: introdução da amostra sob ação de um campo elétrico.



'

Proporcionar a familiarização com a instrumentação para eletroforese

capilar com detecção condutométrica sem contato e sua aplicação para a
] ] ]2 ]2
determinação de cátions (K , Na , Ca e Mg  em água de coco utilizando a técnica
]
de padrão interno (Li .





(



÷parelhagem:

ö Equipamento: eletroforese capilar com detecção condutométrica

(oscilométrica, 580 kHz, eletrodos sem contato com a solução.

ö Coluna: tubo capilar de sílica fundida revestida, com diâmetro interno de

75Vm e comprimento de 80 cm.

ö Potencial aplicado: 30 k>.

ö Polaridade: positiva no ponto de injeção.

ö njeção: hidrodinâmica (160 mm, 20 s.

Reagentes:

ö Tampão de corrida: Ácido 2-N-[morfolino]etanosulfônico (MES 30 mmol/L,

histidina (His 30 mmol/L (pH 6,1.

ö Padrão interno: 100 Vmol/L Li+.

ö Soluções padrões: cada uma com uma mistura de diversos cátions

comumente presentes em água de coco (K+, Na+, Ca2+ e Mg2+.

ö ÷mostra: água de coco

!




Parte . dentificação dos picos

Foram preparadas cinco soluções padrões contendo diferentes

]
concentrações dos analitos, todas com a mesma concentração de Li (100 µmol/L.
Essas foram injetadas no aparelho, para que depois pudéssemos identificar os
]
componentes e também calcular o fator de resposta de cada íon em relação ao Li .

÷s soluções preparadas com a concentração indicada de cada íon seguem

na tabela abaixo.
 ¢ 
% Soluções padrões com as concentrações de cada íon indicadas.

Parte . Quantificação de alguns cátions da água de coco

Primeiramente, preparamos duas soluções, em balões de 100 mL, contendo

a amostra de coco. ÷ primeira continha a solução do padrão interno 100 µmol/L
]
de Li (solução estoque 1mM e a amostra de coco diluída num fator de 1:100. ÷
segunda continha a mesma quantidade de padrão interno 100 µmol/L, mas a
amostra de coco foi diluída num fator de 1:1000. Separamos 1 mL de cada solução
e transferimos para eppendorfs de 1,5 mL, que já estavam previamente
identificados. Em seguida, injetamos cada uma das soluções e obtemos o
eletroferograma nas mesmas condições anteriores.

Parte . Estudo de alguns parâmetros instrumentais

Utilizando-se o padrão 5 do procedimento parte , obtivemos um

eletroferograma através de uma injeção eletrocinética a 3 k> por 3 s, para assim
podermos comparar com o padrão 5 com injeção da amostra por processo
hidrodinâmico.

m!

!
#

] ] ] ]2 ]2
Na K Li Ca Mg

Raio iônico hidratado

(nm
0,
0 0,0 0,382 0,ð 0 0,ð0

Mobilidade ônica
Teórica
- 2 -
µ0 (10 m > s 
- 51,9 76,2 40,1 61,7 55,0

Mobilidade
Eletroforética Teórica
- 2 - -
µ0 (10 m > s  51,9 67,4 41,1 54,1 49,8

Tempo Mínimo (s 378 296 443 362 393

¢ 
&%
Características de cada um dos íons presentes na água de coco.

÷nalisando-se os dados da tabela 2, podemos identificar a seqüência

correta dos íons presentes nos padrões. De acordo com dados obtidos da literatura
[1], para íons monovalentes, tais como Na+ , Li+, K+, quanto maior o raio iônico
hidratado, menor o atrito e, portanto, maior a velocidade de migração, ou seja,
menor o tempo mínimo para percorrer a mesma distância no capilar. Uma outra
característica que devemos levar em conta é a mobilidade eletroforética, pois
quanto maior a mobilidade, menor será o tempo mínimo percorrido de
determinado íon.

É importante salientar que os íons monovalentes não podem ser analisados

com os mesmos parâmetros, uma vez que os íons divalentes possuem a tendência
de formar complexos com as substancias da corrida.

Sabendo-se disso, e comparando-se a mobilidade eletroforética com o

tempo mínimo, podemos perceber que quanto maior a mobilidade, mais rápido o
íon e, portanto, menor tempo mínimo. ÷ ordem de migração dos respectivos íons é
] ]2 ] ]2 ]
K , Ca , Na , Mg e, por fim, Li .

Gráficos

÷baixo estão representados os eletroferogramas obtidos das soluções

padrões da tabela 1. Em todos os gráficos obtidos em aula, nós pudemos notar
que, certo tempo após a passagem do último íon, no caso o lítio, havia uma queda
bastante grande da voltagem, para em seguida retornar para os níveis basais. ÷
existência dessa queda se deve ao seguinte fato: conforme um íon positivo sai do
] -
capilar, entra uma His e conforme um íon negativo sai, entra um MES . ÷pós a
corrida de todos os íons, há um gradiente de concentração no capilar. Em
] -
decorrência deste fato, na parte mais diluída, ou seja, onde há His e MES , há uma
queda de condutividade, o que ocasiona a queda brusca do potencial, uma vez que
o potencial é proporcional à condutividade . No gráfico, esta queda não está
representada, pois, para tal, seria necessário aumentar muito a escala do eixo y,
tornando as alterações de voltagem decorrentes da passagem dos íons
imperceptíveis.
 Y







 







  




c
$
)% Eletroferograma da solução padrão 1.

Y





 







  




c
$
*% Eletroferograma da solução padrão 2.

 Y





 





    




c
$
+% Eletroferograma da solução padrão 3.

Y





 


    




c
$
% Eletroferograma da solução padrão 4.

 Y



 


    




c
$
,% Eletroferograma da solução padrão 5.

Y



 
em 

100
o

0 5

250 350 450

Tempo 

c
$
-% Eletroferograma da solução padrão 5 por injeção eletrocinética

Deste modo, nós tínhamos dados dos diferentes íons de interesse em

diferentes concentrações, sendo possível fazer uma curva padrão para cada um.
Esta curva foi feita observando o pico de voltagem decorrente da passagem de
cada íon, sobre o pico do lítio obtido no mesmo eletroferograma. O lítio serviu no
experimento como um padrão interno. O padrão interno tem a finalidade de
compensar erros aleatórios e sistemáticos, efeitos de matriz e preparo de amostra
(no caso do Padrão nterno ser componente majoritário. ÷ correlação deve ser
feita entre concentração e razão do sinal de resposta do analito com sinal de
resposta do padrão interno. É importante salientar que o íon utilizado como
padrão interno não deve estar presente na amostra. ÷baixo, estão as curvas padrão
dos 4 íons de interesse, assim como sua correlação linear (R2 e a equação da reta.
 ‘  pad odo 

Reaçãoa a  a a!" 

150
       l

125 l


100

0 5
00 02 04 0 0 10
 
Reação  !" 

c
$
-% Curva padrão do potássio.
 
Equação da reta: r
.
/0*+
1
/0- , para um m&
.
/0-&,,.


‘ apadãodo‘a2
Reaçãoa a‘a2 a a!"

13
 
      l

12 l


11

10

0#
00 02 04 0 0 10
2 
Reação‘a  !" 

c
$
2% Curva padrão do cálcio.


Equação da reta: r
.
/0&++
1
/02&, , para um m&
.
/0-&-)%

 ‘ apadãodo$a

Reaçãoa a$a  a a!" 

11
 
      l

l


10

0#

0
00 02 04 0 0 10
 
Reação$a !"

c
$
/% Curva padrão do sódio.


Equação da reta: r
.
/0-/
1
/0-*+ , para um m&
.
/0-*.


‘  

%
    "

   
      l
  
l
  



& '   %








  
  
& '%   " 


c
$
% Curva padrão do magnésio.

Equação da reta: r
.
/0,/
1
/022) , para um m&
.
/0,,+-%

Quando a relação da concentração do íon de interesse e do lítio (eixo x da
curva padrão era 0,6, as respectivas relações da altura (eixo y ficam muito fora da
reta de linearidade. sto ocorreu para todos os gráficos de curvas padrão. Logo, a
origem deste erro provavelmente está em um erro de cálculo dos alunos. Portanto,
estes valores foram descartados.
 ÷inda, nenhuma das curvas padrão apresentou boa linearidade, o que pode
ser decorrente de erro de pipetagem dos alunos, erro para completar o volume dos
balões volumétricos ou ainda, erros do volume da vidraria fornecida, já que estes
volumes não foram aferidos pelos alunos.

Em seguida, nós analisamos nossa amostra de interesse, a água de coco

industrializada, diluída cem ou mil vezes.

÷ 
"

(


 



 
 



c
$
&% Eletroferograma da amostra de água de coco diluída 1000 vezes.

Podemos notar claramente, observando a figura 12, os picos do potássio e

do lítio, que foi adicionado à amostra como padrão interno. Porém, os picos
contendo o sódio, o magnésio e o zinco apresentam uma altura muito pequena,
indicando que estes íons estão presentes em baixa concentração no coco. ÷ssim,
foi necessário analisar nossa amostra em uma concentração mais elevada.

÷ 
"

(


 



 
    



c
$
)% Eletroferograma da amostra de água de coco diluída 100 vezes. O valor do tempo está
limitado para o aparecimento das ondas de cálcio, sódio e magnésio.
 Na figura 13, o tempo foi restringido para visualizarmos apenas a região
dos picos de cálcio, sódio e magnésio, pois o pico de potássio na amostra mais
concentrada estava muito alto.

Para o cálculo das concentrações abaixo, foi utilizada a relação entre os

picos dos íons de interesse e do lítio (para o potássio, foi utilizado o valor do pico
de lítio na amostra 1000 vezes concentrada, e para o cálcio, sódio e magnésio, na
amostra 100 vezes concentrada. ÷ssim, bastava colocar este valor na equação da
curva padrão do respectivo íon, achando assim a relação de concentração entre o
íon de interesse e o lítio, que estava a uma concentração de 100 uM, tanto na
amostra 100 vezes quanto na 1000 vezes diluída.



3 1 K+/Li+= 0.417 Õ K+ /100 = 0.417 ÕK+ = 417 uM.

Esta amostra, porém, foi diluída mil vezes. Logo, a concentração de potássio na
água de coco é de 417 mmol/L.

Do mesmo, achamos as concentrações de cálcio, sódio e magnésio,

lembrando que estes estavam cem, e não mil vezes diluído.

] ] ] ] ]
 3


($
4

"#

5 (6 417 36,5 91,9 58,7 

¢ 
)% >alores das concentrações dos íons potássio, cálcio, sódio e magnésio encontrados na
água de coco industrializada.

7

a Determinar as concentrações dos íons na amostra.

Questão resolvida acima.

b Obter da literatura o raio iônico hidratado dos cátions estudados e suas

mobilidades. Utilizar esses valores para avaliar a seqüência de migração dos
cátions e as diferenças nos perfis dos eletroferogramas obtidos com injeção
eletrocinética e hidrodinâmica.

÷ primeira parte desta questão sobre a seqüência de migração já foi

discutida anteriormente. ÷baixo, segue a discussão sobre injeção eletrocinética e
hidrodinâmica baseadas nas figuras 8 e 7, respectivamente.

Na injeção eletrocinética, um campo elétrico é aplicado no frasco da

amostra, causando a migração dos componentes da amostra para o interior do
capilar. Enquanto que na injeção hidrodinâmica, utiliza-se a aplicação de pressão
ou vácuo no sistema, por um determinado período de tempo, fazendo com que
uma pequena quantidade de amostra entre no capilar.

Como observado, é necessário empregar uma voltagem maior em injeção

eletrocinética do que a injeção hidrodinâmica. sto ocorre pelo fato de que além de
ter uma voltagem para a amostra percorrer o capilar, também é aplicado um
campo elétrico no frasco contendo a amostra para que esta possa ser sugada para
o interior do capilar vencendo as forças iônicas e a força da gravidade.

÷ injeção eletrocinética apresenta uma resposta mais linear de voltagem em

relação à injeção hidrodinâmica, obtendo-se assim uma melhor leitura das alturas
dos picos. Portanto, o modo de injeção eletrocinética mostrou-se mais
reprodutível. ÷lém disso a resposta analítica foi mais rápida, uma vez que para
aparecer a queda de voltagem no gráfico, no processo de injeção hidrodinâmica,
era necessário produção de vácuo no sistema, enquanto que no outro processo não
era preciso realizar este procedimento.

#

÷ aplicação do método de eletroforese capilar se mostrou bastante

adequada para a análise de sais minerais existentes na água de coco, no caso do
experimento realizado, íons cálcio, magnésio, sódio e potássio. É um ensaio rápido
e de baixo custo que necessita de pequenas quantidades de amostra para sua
realização, sendo apropriada para análises em que a amostra é valiosa. Tem alta
sensibilidade e proporciona uma separação muito eficaz das substâncias como
pode ser observado nos gráficos de voltagem em função do tempo, onde se
verificam picos bastante distantes uns dos outros e nenhuma sobreposição de
picos. Outra grande vantagem é a possibilidade de se analisar inúmeras espécies
no mesmo ensaio, economizando amostra e tempo, gerando um único gráfico
(eletroferograma com os sinais proporcionais à concentração de cada espécie em
estudo.

÷pesar de tantas vantagens, a fragilidade do capilar e os cuidados com o

uso da alta tensão devem ser mencionados, já que capilares quebrados ou muito
curtos acarretam em erros de cálculo e em separações menos eficientes. Como dito
o aparelho é sensível, já que o método de identific ação empregado foi o de
medição de corrente em um ponto do capilar, o que significa necessidade de
soluções de calibração de concentração altamente definida e com o mínimo de erro
possível no seu preparo. O contrário pode ser visto nos resultados obtidos neste
relatório em que alguns dados de calibração foram tão duvidosos que foram
descartados, logo o uso de material aferido e seu manuseio correto são
indispensáveis no preparo de todas as soluções a se analisar por eletroforese
capilar.

Outra condição que merece atenção para a realização da eletroforese capilar

é o pH de trabalho, pois este interfere nas condições das espécies em estudo que
podem sofrer alterações e interagir de maneira diferente com a diferença de
potencial aplicada e/ou capilar de SiO2. Neste experimento o pH mantido era
próximo do neutro, a explicação para tal condição foi: o pH não poderia ser alto, se
não o Ácido 2-N-[morfolino]etanosulfônico ficaria na sua forma aniônica; os metais
poderiam se tornar hidróxidos, estes por serem neutros, migrariam pelo capilar
somente pela presença do fluxo eletroosmótico e assim alterariam o resultado
obtido para os cátions; por fim, em pH baixo, as histidinas seriam protonadas.

O uso de concentrações conhecidas de lítio é importante, já que o aparelho

apesar de bastante robusto pode apresentar oscilações repentinas por problemas
na fonte de alimentação que gera a diferença de potencial, assim as relações lítio e
amostra auxiliaram o não comprometimento (por essas oscilações das curvas
padrões ou experimentais obtidas. Em casos que a adição de padrão interno não é
recomendada, as oscilações deixam de ser contabilizadas e podem gerar erros
consideráveis.
 Quanto às opções de injeção de amostra (hidrodinâmica ou eletrocinética, a
eletrocinética é mais eficiente quando se considera qualidade de resultados, pois
gera uma base de picos mais contínua e um tempo menor para passagem da
amostra pelo capilar sem necessidade de intervenção humana, gerando uma
grande reprodutibilidade de resultados finais. Em contrapartida essa técnica
demanda mais energia e pode causar aumento de temperatura do sistema, sendo a
hidrodinâmica mais indicada para situações em que não é favorável que ocorram
essas alterações.

nfelizmente a empresa fabricante da água de coco utilizada não informa as

quantidades de todas as substâncias estudadas em seus produtos, apenas o teor
de sódio é informado, sendo de 60mg/200mL de produto. Se convertermos o
resultado experimental calculado para a massa encontrada em 200mL de produto
obtém-se 423mg de sódio, um valor muito alto em comparação com o fornecido
pelo fabricante, o que pode ter ocorrido por imprecisão no prepara das soluções
do experimento ou uma variabilidade de padrão de produção na fábrica que
confeccionou essa remessa de água de coco e resultou em taxas maiores de sódio
do que o habitual.

m8



$9


SKOOG, D.÷.; HOLLER, F.J.; NEM÷N, T.÷. Y     
 , São
Paulo, e.5, 2002.

SKOOG, D.÷.;WEST, D.M.;HOLLER, F.J.;CROUCH, S.R. c
   
  

   8.ed. São Paulo: Thomson, 2006. 1026p.

OHLWELER, O.÷. c
  
 . 2.ed. Rio de Janeiro: Livros
Técnicos e Científicos, 1981. 486p.