Acta Farm.

Bonaerense 23 (3): 349-52 (2004) Trabajos originales

Recibido el 15 de diciembre de 2003
Aceptado el 21 de abril de 2004

Atividade Citotóxica de Extratos Brutos de

Lippia alba (Mill.) N.E. Brown (Verbenaceae)
Maria do Carmo Caldas Dias COSTA *1, Jaciana dos Santos AGUIAR 1
& Silene Carneiro do NASCIMENTO 2

Departamento de Biologia, Universidade Católica de Pernambuco,

1

Rua do Príncipe, 526, Boa Vista, Recife, PE, Brasil. CEP: 50050-900.
2 Departamento de Antibióticos, Universidade Federal de Pernambuco, Recife, PE, Brasil.

RESUMO. Extratos brutos da raiz, caule e folhas de Lippia alba (Mill.) N.E. Brown (Verbenaceae), foram
testados frente às células NCI-H292 (obtidas de carcinoma mucoepidermoide de pulmão humano) e célu-
las HEp-2 (derivadas de carcinoma epidermóide de laringe). O extrato etanólico da folha mostrou-se mais
citotóxico frente às células HEp-2 com CI50 igual 8,17 µg/mL. Para às células NCI-H292 observou-se que o
extrato clorofórmico da raiz foi o mais citotóxico, com CI50 igual 4,64 µg/mL. Os constituintes com maio-
res ações antineoplásica estão presentes, principalmente, na raiz e folhas da espécie.
SUMMARY. “Citotoxic Activity of Crude Extracts of Lippia alba (Mill.) N.E. Brown (Verbenaceae)”. Crude ex-
tracts of Lippia alba (Mill.) N. E. Brown (Verbenaceae) roots, stem and leaves, were tested against cells lines of
the pulmonary mucoepidermoid human carcinoma (NCI-H292) and cells lines derived from an epidermoid carci-
noma of the human larynx (HEp-2). Ethanolic extract of the leaves showed more citotoxicity against HEp-2 cells
with CI50 = 8.17 µg/mL. In the case of NCI-H292 cells the chloroformic extract of the root was the most citotox-
ic, with CI50 = 4.64 µg/mL. The constituents with higher antineoplasic action are present mostly in the root and
leaves of the studied species.

INTRODUÇÃO D-limoneno, germacreno-D e carvona 4 . Estu-

Lippia alba (Mill.) N.E. Brown (Verbenace-
ae), possui cerca de 175 gêneros e 2800 espé-
cies difundidas nos trópicos e subtrópicos em
regiões temperadas do Hemisfério Sul e poucas
espécies no Hemisfério Norte 1. Trata-se de um
arbusto aromático, cujo aroma está relacionado
aos constituintes predominantes nos óleos es-
senciais, os quais podem variar qualitativamente
e quantitativamente, em função de diversos fa-
tores, tais como: estações do ano, época de flo-
dos químicos realizados para extratos etanólicos
e aquosos das folhas, registraram a presença de
flavonóides glicosídicos e derivados fenilpropa-
nóides como principais constituintes 5. Análise
da composição química de óleos essenciais de
plantas encontradas no Nordeste do Brasil, reve-
lou a presença do nereal, geraneal e carvona
como principais constituintes químicos 6. Pre-
sença de saponinas foi registrada para as folhas
2 e presença de taninos não encontra-se referida

ração, idade da planta, e quantidade de água para a espécie.

circulante, resultante da precipitação, fatores ge-
ográficos e climáticos 2,3. Estudos fitoquímicos
realizados em plantas de L. alba coletadas em
diferentes estados brasileiros (Rio Grande do
Sul, Paraná e Goiás), permitiu o agrupamento
das plantas em quatro grupos distintos, para os
quais foram registrados a presença de linanol,
1,8 cineol, cânfora, óxido de cariofileno, β- mir-
A espécie é amplamente utilizada para dores
abdominais como digestiva, sendo consumida,
principalmente, na forma de chás produzidos a
partir das folhas. Também pode ser usada na
forma de compressas para combater hemorrói-
das; maceradas, para uso local, contra dor de
dente; e em forma de banhos, como febrífuga
2,7. A infusão alcoólica friccionada é recomenda-

ceno, transcariofileno, canfeno, p-cimeno, citral, da para combater resfriados e a raiz é usada no

PALAVRAS-CHAVE: Atividade citotóxica, Lippia alba, Planta Medicinal.

KEY WORDS: Citotoxic activity, Lippia alba, Medicinal plant.
* Autor a quem a correspondência deverá ser enviada. E-mail adress: mcarmoc@hotmail.com

ISSN 0326-2383 349

Costa, M. do C.C.D., J. dos S. Aguiar & S.C. do Nascimento
Nordeste como aperiente e no combate às
afecções hepáticas 2,7. Testes farmacológicos re-
alizados a partir das folhas comprovaram ativi-
dades analgésica, espasmolítica, antibacteriana e
peitoral, sem que nenhum efeito tóxico tenha si-
do verificado em animais 2,7. Efeitos citostáticos
indicando uma provável relação antitumoral, fo-
ram encontrados com a utilização do extratos
aquoso, alcoólico e acetônico de L. alba, frente
ao fungo Neurospora crassa 8.
Nesse trabalho foram avaliadas ações citotó-
xicas de extratos brutos de L. alba frente a duas
linhagens celulares, células HEp-2 (derivadas de
carcinoma epidermóide de laringe) e células
NCI-H292 (derivadas de carcinoma mucoepider-
móide de pulmão humano).
MATERIAL E MÉTODOS
Material botânico
As plantas utilizadas neste estudo foram co-
letadas nos meses de outubro, novembro e de-
zembro de 2002 na Empresa de Abastecimento
e Extensão Rural do Estado de Pernambuco
(EBAPE), onde a espécie é cultivada para fins
medicinais e produção de fitoterápicos. A con-
firmação da identificação botânica foi realizada
pela Dra. Rita de Cássia A. Pereira curadora do
Herbário Dárdano de Andrade Lima da Empresa
Pernambucana de Pesquisa Agropecuária (IPA),
onde um exemplar da espécie foi depositado
sob o N° 61004.
Preparo dos extratos
Extratos de raiz, caule e folhas foram prepa-
rados utilizando-se 35 g de planta seca para 300
mL de solvente (hexano, clorofórmio, acetona,
etanol, metanol e água) 9. A extração dos princí-
pios ativos foi feita por maceração em repouso
(oito dias), exceto para extratos aquosos, que
foram produzidos por maceração em agitação
(4h a 200 rpm). Em ambos os casos, a tempera-
tura de extração esteve entre 28-30 °C. O volu-
me total do extrato foi filtrado e evaporado a se-
cura em evaporador rotativo, exceto extratos
aquosos, que foram liofilizados. Após este pro-
cedimento, os extratos foram armazenados em
geladeira (4 °C), protegidos da luz, e então, uti-
lizados nos testes para avaliação da atividade ci-
totóxica.
Células neoplásicas utilizadas nos testes
Os testes de citotoxicidade foram realizados
frente a duas linhagens celulares: células NCI-
H292 e células HEp-2 obtidas da seção de cultu-
ras celulares do Instituto Adolfo Lutz (SP) e
350
mantidas de acordo com o protocolo estabeleci-
do pelo laboratório de cultura de células do De-
partamento de Antibióticos da UFPE.
As células NCI-H292, correspondem a uma
linhagem contínua de células mucoepidermói-
des obtidas a partir de carcinoma de pulmão
humano, que tem sido utilizada para o isola-
mento e propagação do Paramyxovirus huma-
no 10. As células HEp-2 (Human Epidermoide
Cancer Cells) são derivadas de tumor primário
de laringe humana.
Atividade citotóxica
As células foram mantidas em DMEM - Mini-
mum Essencial Médium Eagle modificado Dul-
becco’s (Sigma), suplementado com 10% de so-
ro fetal bovino (GIBCO), 1% de solução de anti-
biótico (penicilina 1000 UI/mL + estreptomicina
250 mg/mL) e 1% de L-glutamina 200 mM.
A viabilidade celular foi determinada utili-
zando-se o corante vital Azul Tripan (Merck)
0,4% p/v, em PBS 11, e a contagem das células
foi realizada em microscópio invertido LEITZ,
com a utilização de um hemocitômetro, preen-
chido com uma alíquota da suspensão de célu-
las homogeneizada.
A citotoxidade foi determinada através do
método colorimétrico do MTT 12 . Uma sus-
pensão celular (105 células/mL), preparada em
meio adaptado para cada linhagem celular, foi
distribuída em placas de cultura com 96 poços
(225 µL em cada poço), as quais foram incuba-
das por 24 h a 37 °C em estufa (Sedas, Milão-
Itália), com atmosfera úmida enriquecida com
5% de CO2. Após 24 h foram adicionadas às
substâncias testes (25 µL/poço) e as placas fo-
ram reincubadas a 37 °C 13. Após 72 h de conta-
to das células com o produto teste, foi adiciona-
do em cada poço, 25 µL de MTT ou brometo [3-
{4,5-dimetiltiazol-2-il}-2,5-difenil tetrazólio] a
uma concentração de 5 mg/mL em PBS(p/v) e
as placas foram deixadas por duas horas em es-
tufa 37 °C 14. Ao final desse período, o meio de
cultura, juntamente com o excesso de MTT, fo-
ram aspirados e em seguida, 100 µL de DMSO
foi adicionado a cada poço para a dissolução de
cristais Formazan 14.
A leitura óptica foi feita em leitor automático
de placas, do tipo BIO-RAD Modelo 3550 (595
nm), e a densidade óptica (DO) média dos
poços, foi comparada com a DO média, dos
poços controles.
As concentrações testadas foram (50,00,
25,00, 12,50 e 6,25 µg/mL), e as concentrações
que mataram aproximadamente 50% das células

(CI50), foram retestadas em mais 4 ensaios, para
confirmação dos resultados e cálculo da CI50. A
determinação da CI50 foi feita a partir de uma
regressão linear, relacionando-se o percentual
de inibição em função do logarítmo das concen-
trações testadas e admitindo-se um intervalo de
confiança de 99% (p<0,01), para a reta obtida 15.
A avaliação da atividade citotóxica foi feita de
acordo com o Protocolo do National Cancer Ins-
titute (NCI) 16.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Extratos brutos de L. alba produzidos a partir
de raiz, caule e folhas, mostraram atividades ci-
totóxicas significativas frente às duas linhagens
celulares utilizadas neste estudo. Células NCI-
H292, foram mais sensíveis ao extrato clorofór-
mico da raiz, enquanto as células HEp-2, foram
mais sensíveis ao extrato etanólico das folhas
(Figs. 1 e 2).
Entre os extratos de L. alba testados frente às
células NCI-H292, os extratos clorofórmico,
acetônico e etanólico da raiz, clorofórmico do
caule e hexânico das folhas, mostraram ativida-
des citotóxicas significativas com valores da CI50
iguais a 4,64, 16,30, 11,43, 19,74 e 25,12 µg/mL,
respectivamente. Entre os extratos de L. alba
testados frente às células HEp-2, os extratos clo-
rofórmico da raiz, etanólico e metanólico das
folhas, mostraram atividades citotóxicas signifi-
cativas com valores da CI50 iguais a 11,51, 8,17 e
14,44 µg/mL, respectivamente.
Figura 1. Determinação da CI50 para o extrato cloro-
fórmico da raiz de Lippia alba (Mill.) N.E. Brown
frente a célula NCI-H292, a parti da regressão linear,
relacionando o percentual de inibição do crescimento
celular, em função do logarítmo das concentrações
testadas (50, 25, 12,5 e 6,25 µg/mL), admitindo-se um
intervalo de confiança de 99% (p<0,01), para a reta
obtida.
acta farmacéutica bonaerense - vol. 23 n° 3 - año 2004
Segundo protocolo do National Cancer Insti-
tute (NCI) 14, valores de CI50 ≤ a 30 µg/mL de-
vem ser considerados significativos para extratos
brutos de origem vegetal, bem como valores de
CI50 ≤ a 4 µg/mL, devem ser considerados signi-
ficativos para substâncias puras.
Comparando-se os resultados obtidos no es-
tudo, com os resultados aceitos como significati-
vos para substâncias puras, de origem vegetal,
verificou-se que os valores de CI50 obtidos para
o extrato clorofórmico da raiz frente às células
NCI-H292 (4,64) e para o extrato etanólico da
folha frente as células HEp-2 (8,17), foram os
que mais se aproximaram do valor considerado
significativo para substâncias puras. Em se tra-
tando dos resultados observados para a vincris-
tina, verificou-se que a vincristina foi mais ativa
frente às células HEp-2, enquanto o extrato de
L. alba com melhor ação citotóxica exibiu essa
ação frente às células NCI-H292 (Tabela 1).
Estudos para avaliar a atividade citotóxica
em Lippia sidioides, frente às linhagens celulares
HL60 (leucemia promielocítica humana, SW1573
(carcinoma de pulmão) e CEM (leucemia linfo-
blástica aguda humana) 17, referem que a fração
clorofórmica, obtida do caule de L. sidioides, le-
vou ao isolamento de quinonas, entre as quais o
tectol e a lippsidoquinona, que apresentaram
boas atividades citototóxicas frente às linhagens
celulares HL60 e CEM. Outros estudos fitoquími-
cos realizados para L. sidioides, referem o isola-
mento e a caracterização de flavonóides obtidos
Figura 2. Determinação da CI50 para o extrato etanó-
lico da folha de Lippia alba (Mill.) N.E. Brown frente
a célula HEp-2, a parti da regressão linear, relacio-
nando o percentual de inibição do crescimento celu-
lar, em função do logarítmo das concentrações testa-
das (50, 25, 12,5 e 6,25 µg/mL), admitindo-se um in-
tervalo de confiança de 99% (p<0,01), para a reta ob-
tida.
351
Costa, M. do C.C.D., J. dos S. Aguiar & S.C. do Nascimento

Linhagens celulares REFERÊNCIAS BIBIOGRÁFICAS

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metanol 14,44* >30
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água >30 >30
Rural de Pernambuco, vol. 1, págs. 1-153.
Vincristina 0,00279 0,0438
8. Abraham, A.M.L., N.M.R. Hernández & C.A.J.
Tabela 1. Atividade citotóxica de extratos de Lippia Misas.(1979) Rev. Cub. Med. Trop. 31: 105-11.
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10. Morier, L., L. Pérez, R. Cancio, C. Savón, Z.
González & A. Goyenechea (1996) Rev. Cuba-
das folhas e caule da espécie, entre os quais a na Med. Trop. 48: 171-3.
quercertina, com boa atividade antitumoral 18. A 11. Weisenthal, L.M. (1983) Cancer Res. 43: 749-
falta de estudos que relatem atividade citotóxica 57.
para L. alba, faz desse estudo um trabalho pio- 12. Mosmann, T. (1983) J. Immunol. Methods 65:
neiro, que merece ser aprofundado em pesqui- 55-63.
sas futuras, principalmente, levando-se em conta 13. Pereira, E.C. (1994) Tokai J. Exp. Clin. Méd. 19:
que as principais substâncias encontradas nos 47-52,
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pertencem à classe dos flavonóides e fenilpro- 15. Nascimento, S.C. (1993) “Recherche de Pactivi-
panóides 19. té antitumorale de produits de synthese ou
d’origine naturalle. Utilisation du SAMBA pour
CONCLUSÕES l’analyse de modifications cellulaires induites”.
Os bons resultados de atividade citotóxica de Tese Doutorado, Université Joseph Fourier,
L. alba observados frente às linhagens celulares UFR de Pharmacie, Grenoble, France, págs. 1-
testadas (NCI-H292 e HEp-2), estimulam a conti- 173.
nuidade desses estudos considerando que, os 16. Geran, R.I., N.H. Greenberg, M.M. Macdonald,
A.M. Schumacher & B.J. Abbott (1972) Cancer
constituintes com maior ação antineoplásica es-
Chemother. Reports 3: 1-102.
tariam presentes, principalmente, nos extratos
17. Costa, S.M.O, T.L.G. Lemos, D.L Pessoa, C.
produzidos a partir da raiz e das folhas.
Pessoa, R.C. Montenegro & R. Braz-Filho
(2001) J. Nat. Prod. 64: 792-5.
18. Ashendel, C.L., J.M. Staller & R.K. Boutwell
Agradecimentos. Os autores agradecem à Empresa (1983) Cancer Res. 43: 4333.
de Abastecimento e Extensão rural do Estado de Per- 19. Ferreira, J.L.P., E. Velasco, R.B. Araújo, R.M.
nambuco, pelo fornecimento do material botânico e a Kuster & A.C.F. Amaral (2002) Variação sazo-
seção de culturas celulares do Instituto Adolfo Lutz nal de flavonóides e fenilpropanoides em Lip-
(SP), pelo fornecimento das linhagens de células utili- pia alba. XVII Simpósio de Plantas Medicinais
zada nesse estudo. do Brasil, Cuiabá, 2002.

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