Microscopia ptica

OBJETIVOS

Ao nal desta aula, voc dever ser capaz de: Conhecer o breve histrico da microscopia. Denir o que um microscpio. Conceituar poder de resoluo. Saber os princpios de funcionamento de um microscpio simples. Conhecer os principais tipos de microscpios pticos e suas aplicaes. Ter noes de preparo de amostras para microscopia ptica. Consultar links de interesse.

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Biologia Celular I | Microscopia ptica INTRODUO

O primeiro problema a enfrentar no estudo das clulas o seu tamanho: as clulas so pequenas demais para serem observadas a olho nu. Por esse motivo as primeiras clulas foram observadas e descritas apenas no sculo XVII, quando foi inventado o microscpio ptico. Voc tem idia de qual seja o tamanho de uma clula? As maiores clulas medem cerca de 0,2mm; mas, em mdia, uma clula 10 ou 20 vezes menor do que isso. Por outro lado, ns lhe perguntamos: qual o tamanho dos menores objetos que podemos distinguir a olho nu (sem ajuda de instrumentos especiais)? Podemos distinguir uma formiga de uma pulga, mas somos capazes de ver os olhos desses insetos? Os menores objetos que podemos distinguir (= resolver) tambm medem 0,2mm, mas no caso das clulas isso no ajuda muito, j que as estruturas internas das clulas so ainda menores.

Esse limite de resoluo depende do comprimento de onda da luz. Com o uso de lentes esse limite pode ser ampliado; esse princpio se aplica tanto observao do muito pequeno (como as clulas) como do muito grande mas muito distante, como o caso dos planetas e estrelas.

Voc deve se lembrar ainda da equao abaixo:

V= .f
onde V a velocidade da luz (300.000 km/seg) o comprimento de onda da radiao e f a frequncia da onda (nmero de ondas produzidas por segundo). Note que quanto maior o comprimento de onda, menor a freqncia; e vice-versa. Isso porque o produto (velocidade da luz) uma constante. A seguir esto representadas duas ondas de freqncia e comprimento de onda distintos.

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HISTRICO
No sculo XVII foram construdos os primeiros microscpios ( (Figura 1.1). Com um deles, Robert Hooke observou lminas de cortia, chamando clulas aos pequenos espaos regulares da sua estrutura (Figura 1.2). Mais tarde, tanto Hooke quanto outros pesquisadores da poca observaram ( que as clulas vivas no eram ocas como a cortia, mas o nome original permanece at hoje.

Figura 1.1: Microscpio semelhante ao usado por Hooke. As partes componentes so anlogas s dos microscpios usados at hoje.

Figura 1.2: R e p r o d u o d a s l m i n a s d e cortia observadas por Hooke. Cada um dos espaos foi por ele chamado clula.

No seria injusto ou incorreto dizer que o estudo da Biologia Celular comeou nessa poca. Robert Hooke (1635-1703) O ingls Robert Hooke foi, em pleno sculo XVII, o que hoje chamamos
homem dos sete instrumentos, atuando com contribuies relevantes nos campos da Fsica, Astronomia, Qumica, Biologia, Geologia, Arquitetura e Tecnologia Naval. Foi colaborador de cientistas como Isaac Newton, seu grande rival na poca, e Robert Boyle, a quem auxiliou na determinao das leis dos gases. Correspondeu-se com Antony van Leeuwenhoek conrmando suas observaes ao microscpio. Entre outros inventos, desenvolveu a junta universal, inventou ou melhorou instrumentos como o barmetro e o anemmetro e um mecanismo que tornou os relgios mais precisos. A Lei de Hooke, equao que descreve a elasticidade, empregada at hoje. Suas contribuies nos campos da Biologia e Paleontologia no foram menos importantes.

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A reputao de Hooke na histria da Biologia se deve em grande parte a sua obra Micrographia, publicada em 1665. Hooke desenvolveu o microscpio composto e o sistema de iluminao mostrados na Figura 1.1, utilizando-o para descrever detalhadamente uma grande variedade de organismos como insetos, esponjas, penas e aquela que parece ser sua maior contribuio, nas lminas de cortia ( (Figura 1.2). Em desenhos detalhados, Hooke descreveu a estrutura como pequenos poros, semelhantes a favos de mel, dando-lhes o nome de clulas (= pequenas celas, alojamentos dos monges nos conventos). Embora as s estruturas observadas correspondessem apenas s paredes celulares de clulas vegetais j mortas, o nome prevaleceu e dele derivaram os termos Citologia e, mais modernamente, a Biologia Celular. Sua obra permanece at hoje, embora no exista nenhum registro de sua prpria aparncia. Voc pode saber mais em: //www.ucmp.berkeley.edu/history/hooke

Outro pioneiro da microscopia e da biologia foi Antony van Leeuwenhoek, holands que construa seus prprios microscpios (Figura 1.3) com apenas uma lente, mas com resoluo suciente
parafuso de focalizao

para observar at mesmo protozorios e bactrias.

Figura 1.3: O microscpio montado por Leeuwenhoek.

lente

Antony van Leeuwenhoek (1632-1723) Embora tenha feito descobertas fundamentais em Biologia, como as bactrias e os protozorios (parasitas e de vida livre), Antony van Leeuwenhoek no era um cientista convencional para seu tempo. Ser lho de comerciantes, sem fortuna, sem educao universitria e sem dominar outros idiomas seno o holands j seria o bastante para exclu-lo do ambiente acadmico da poca. Ainda assim, com habilidade extraordinria para polir lentes, uma curiosidade innda e uma mente aberta e livre dos dogmas cientcos de sua poca (o sculo XVII), Leeuwenhoek foi o primeiro a descrever as hemcias, os espermatozides e muito mais. Acredita-se que, inspirado pelo livro de Hooke, Micrographia, Leeuwenhoek comeou a polir lentes e a fabricar seus microscpios, tendo montado mais de 500 deles. Seus microscpios (vide Figura 1.3), embora dotados de uma nica lente, eram capazes de aumentar at em 200 vezes os objetos. Por outro lado, a iluminao era deciente e sua manipulao bastante desconfortvel para o observador. Em 1673, Leeuwenhoek comeou a enviar cartas com suas observaes recm-criada Royal Society of London. Em 1680 foi eleito Membro Titular da mesma, juntando-se a Robert Hooke, Isaac Newton, Henry Boyle e outros cientistas de renome que so marcantes at nossos dias. Saiba mais em: //www.ucmp.berkeley.edu/history/leeuwen

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Os microscpios pticos atuais (Figura 1.4) guardam grande ( 4 semelhana com os primeiros modelos usados por Hooke ( (Figura 1.1).

Lente ocular

Foco Macromtrico Revlver com lentes objetivas Foco Micromtrico Platina Condensador (lente) Fonte de Iluminao

Figura 1.4: Principais componentes de um microscpio ptico simples.

Todos os microscpios pticos se baseiam em uma fonte de luz que concentrada por um sistema de lentes condensadoras sobre uma amostra montada sobre a lmina. O feixe luminoso atravessa a amostra e captado por uma lente objetiva que produz uma primeira imagem ampliada do objeto, que ser em seguida captada pela lente ocular que projetar a imagem final na retina do obser vador (Figura 1.5).

Lente Objetiva B A F C M F o A F1

Lente Ocular B

C1

F 1

AB - Objeto F - Distncia Focal

A'B' - Imagem de AB A''B'' - Imagem de A'B' (Imagem nal)

Figura 1.5: Esquema da formao da imagem em um microscpio ptico simples.

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PRINCPIOS DO FUNCIONAMENTO DE UM MICROSCPIO PTICO

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COMO SE OBTM O AUMENTO NUM MICROSCPIO PTICO

O aumento nal o resultado da multiplicao do aumento dado pela lente objetiva pelo aumento da lente ocular. Como existem vrias lentes objetivas num mesmo microscpio, uma grande variedade de aumentos pode ser facilmente atingida, bastando girar o revlver. Assim, se utilizamos uma objetiva de 20X e uma ocular de 10X o aumento nal ser de 200X (10x20=200). Hoje em dia a imagem nal pode tambm ser capturada por uma cmara fotogrca, de vdeo ou ainda por um sistema de computao. Uma ampliao suplementar pode ser obtida ampliando uma fotograa da imagem observada. As clulas e as estruturas que as compem so muito pequenas para serem medidas em centmetros ou milmetros, como os objetos do nosso cotidiano. Portanto, para elas usamos as unidades de medida dos micrmetros (smbolo m) e nanmetros (smbolo nm). O micrmetro vale 1 milsimo do milmetro e o nanmetro vale 1 milsimo do micrmetro.

1m = 103 mm ou = 106 m ou = 109 nm

Observao: 103 a maneira simplicada com que os matemticos escrevem as potncias de 10, isto , igual a 1.000; da mesma forma 106 1.000.000, e assim por diante.

O LIMITE DE RESOLUO
Na Figura 1.6 voc tem uma idia das dimenses relativas das clulas e de seus componentes, assim como que tipo de instrumento necessrio para que possam ser vistas. Observe que h um limite para o tamanho das estruturas que podemos observar a olho nu, ou mesmo ao microscpio ptico. Esse o limite de resoluo do microscpio(ou do seu prprio olho). Vrias estruturas celulares s podem ser vistas com o microscpio eletrnico, tema de nossa prxima aula.
Olho nu Microscpio ptico Microscpio eletrnico

Figura 1.6: Escala comparada do limite de resoluo da microscopia ptica e da eletrnica e os objetos que cada uma pode discriminar.

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0,1 nm (1 )
tomo

1 cm

1 mm

100 m

10 m

1 m

100 nm

10 nm

1 nm
pequena molcula
protena globular

vrus ribossoma

bactria

clula vegetal
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clula animal

O limite de resoluo dos microscpios pticos da ordem de 0,2 m, dependendo da qualidade das lentes e, principalmente, do comprimento de onda da luz utilizada. Para saber como esse valor foi calculado, veja a seguir. O limite de resoluo O ponto-chave da microscopia, seja ela ptica ou eletrnica, o limite de resoluo de um microscpio. O conceito de limite de resoluo bastante simples: trata-se da menor distncia entre dois pontos em que eles podem ser vistos como objetos distintos. Complicado? Nem tanto, olhe abaixo:

Os pontos A e B esto a uma distncia que nos permite separ-los como distintos, mas em

C D
os pontos C e D no podem ser nitidamente separados, ou seja, o limite, ou poder de resoluo dos nossos olhos no suciente para determinar os limites de cada ponto. Esse conceito universalmente expresso na frmula abaixo:

d = 0,61 onde d = limite de resoluo = comprimento de onda da radiao utilizada; no caso do feixe luminoso do microscpio ptico, 550 nm. = abertura da objetiva em radianos (0,5o= 0,01rad) assim, d= 0,2 m no microscpio ptico e, como voc se lembra, 1 m = 10-6 m

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Biologia Celular I | Microscopia ptica A prova disso que Antony van Leeuwenhoek j observara bactrias no sculo XVII, quando a tecnologia para construo de lentes e microscpios era muito inferior de nossos dias, mas as propriedades fsicas da propagao da luz eram as mesmas. Estruturas e objetos menores do que 0,2
Figura 1.7: As ondas de luz podem sofrer interferncia de objetos de um determinado tamanho mnimo (a). Abaixo disso (b), os objetos passaro despercebidos, a menos que um comprimento de onda menor seja usado (c).

m s podem

ser visualizados com auxlio dos microscpios eletrnicos. Caso voc esteja considerando ampliar indenidamente uma imagem observada ao microscpio ptico at conseguir enxergar a estrutura da membrana celular, por exemplo, podemos adiantar que isso ser to ecaz quanto ampliar uma foto 3x4 para contar quantos clios h na plpebra superior esquerda da pessoa. Concluindo: aumento e resoluo so coisas distintas e o aumento que no traz informao chamado aumento vazio, ou seja, no traz informaes adicionais sobre a amostra.

!
D uma paradinha: :
Imagine-se andando de bicicleta numa ciclovia. Voc segue em linha reta velocidade da luz. Voc um raio de luz! Pedrinhas, formigas e outros pequenos objetos no impedem que voc continue deslizando suavemente, sem interferncias. J uma chapinha de refrigerante ou um pedregulho podem fazer sua bicicleta se desviar do trajeto e, no caso de obstculos maiores, podem impedir sua passagem. Assim se comporta a luz ao atravessar as amostras observadas ao microscpio ptico. Agora, chega de passear: de volta ao estudo!

Por que ser que isso acontece? Tudo conseqncia da luz. Observe a Figura 1.7: a luz se propaga na forma de ondas. Elas colidem com as partculas que formam a amostra, interferindo com elas. Assim se origina a sensao de contraste (claro/escuro). A onda de cima representa a luz visvel: apenas objetos at um determinado tamanho so grandes o bastante para interferir com o trajeto do raio luminoso. Objetos menores passam despercebidos, no causando alterao na propagao da onda.

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OS DIFERENTES MICROSCPIOS PTICOS

Alm de pequenas, as clulas possuem outras caractersticas que tornam difcil sua observao: 1. em geral, so transparentes; 2. so muito hidratadas e frgeis; 3. quando em rgos ou tecidos, precisam ser cortadas em lminas nas que permitam a passagem do feixe luminoso. Por conta disso, foram sendo desenvolvidas ao longo dos anos tanto novas tcnicas de preparo das clulas, que lhes conferissem maior resistncia e contraste, quanto novas tecnologias na construo de microscpios que permitissem a observao de clulas vivas.

O preparo de amostras para o microscpio ptico de campo claro

Para que possam ser guardadas por muito tempo, as amostras de clulas e tecidos precisam em geral de um tratamento qumico que garanta sua preservao. Esse tratamento inclui vrias etapas: 1. Fixao: o tratamento da amostra com substncias qumicas, como o formol, que preservem sua forma original. 2. Desidratao: a substituio da gua presente dentro e fora das clulas por um solvente orgnico, como o etanol ou metanol. Esse solvente tanto pode ser removido, deixando a lmina secar, quanto pode ser substitudo por parana ou outra resina que torne o tecido rgido, permitindo que seja fatiado. 3. Microtomia: tecidos como fgado ou msculo so muito espessos e precisam ser cortados em fatias mais nas, que permitam a passagem parcial da luz. Uma vez embebidos em parana, deixa-se solidicar e o tecido pode ser cortado (fatiado). 4. Colorao: como a maioria das clulas e seus componentes no so naturalmente coloridos, uma srie de corantes foi testada e, devido a sua anidade qumica por determinados componentes celulares, usada, ajudando na identicao dos diferentes compartimentos celulares. O azul de metileno um desses corantes. Maiores detalhes sobre as tcnicas de preparo de amostras para microscopia ptica, voc ter na disciplina de Histologia.

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Figura 1.8: (A): Trajeto da luz num microscpio de campo claro como o representado em (B). A maior parte das clulas muito transparente para ser bem visualizada nesse tipo de microscpio. Observe como aparecem as clulas epiteliais que revestem a mucosa bucal sem nenhum tipo de corante (C). Que estruturas voc conhece? (D) hemcitos (clulas sanguneas) de caramujo corados. muito mais fcil observar o ncleo e o contorno da clula. (Imagens. C- Raul D. Machado, D- Marco Antonio V. Santos)

O resultado disso que existe hoje uma grande famlia de microscpios pticos, cada um com suas vantagens e limitaes sobre os demais. Dentre os de uso mais corriqueiro, essencial conhecermos: 1. Microscpio de campo claro, ou microscpio simples: o microscpio padro representado na Figura 1.8. Em geral, requer que a amostra seja preparada antes da observao (vide boxe pgina 15).
Duas ondas em fase Duas ondas fora de fase

(A)

Figura 1.9: A luz, ao interagir

com um slido (= clula), tem sua trajetria atrasada, criando um contraste em relao luz que no encontrou nenhum obstculo (A). Esse o princpio do microscpio de contraste de fase, e em (B) voc v as mesmas clulas j observadas em campo claro tal como aparece nesse microscpio. H um halo em torno da clula e de algumas de suas estruturas internas. Que estruturas voc reconhece?

Aumento de Brilho

Escuro

(B)

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2. Microscpio de contraste de fase: dispensa o uso de corantes, permitindo a observao de clulas vivas. Um sistema de ltros (anis de fase) interfere no trajeto da luz, criando um contorno claro/escuro em torno das estruturas celulares ( (Figura 1.9). Esse contraste permite a observao de clulas vivas, mas se elas estiverem muito aglomeradas, a imagem se torna confusa, requerendo um sistema ptico mais elaborado. 3. Microscpio de contraste interferencial: tambm utiliza ltros para criar contraste a partir de diferenas no trajeto da luz. A imagem nal mais agradvel para o observador, mas o sistema menos comum, pois mais caro que o contraste de fase. Tambm permite observar clulas vivas. Quando essas formam camadas, pode-se focalizar apenas um plano, obtendo-se assim cortes pticos sem que o tecido seja cortado. s

Figura 1.10: As mesmas

clulas epiteliais, observadas agora em contraste interferencial. A imagem sombreada d noo de relevo das estruturas celulares.

4. Microscpio de uorescncia: utiliza uma fonte de luz de comprimento de onda varivel (na faixa do ultravioleta) e requer o uso de corantes uorescentes (vide Aula 6) que, em ltima anlise, se ligam a componentes especcos das clulas. Esses corantes so capazes de absorver luz de um determinado comprimento de onda (ultravioleta, por exemplo) e emitir num outro, dentro do espectro visvel. Em algumas situaes as clulas podem ser observadas vivas; em outras, no.
Ocular 2 Filtro

Fonte de luz

Espelho reetor do feixe

Lente objetiva 1 Filtro objeto

Figura 1.11: No exemplo da foto foi usado um corante uorescente que se liga a lamentos do citoesqueleto do protozorio Giardia lamblia . (Foto: Loraine Campanatti).

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Biologia Celular I | Microscopia ptica O mais comum que um modelo possa ter seus jogos de lentes e fontes de luz alternados (intercambiados) para que se possa observar amostras pelos trs mtodos. 5. Microscpio confocal de varredura a laser: a conjugao da cincia da computao aos microscpios de uorescncia trouxe uma nova dimenso microscopia ptica. Imagens tridimensionais da distribuio de lamentos ou organelas celulares podem ser obtidas a partir de cortes pticos da amostra capturados e analisados em computador.

Alguns links interessantes - Apesar de serem em ingls, vale a pena visitar esses endereos na Internet. http://www.ucmp.berkeley.edu/histor y/leeuwenhoek.html - Dados biogrficos de Leeuwenhoek. http://www.ucmp.berkeley.edu/histor y/hooke.html - Dados biogrcos de Robert Hooke. http://micro.magnet.fsu.edu/primer/museum/index.html - Museu da Microscopia. Tutoriais sobre princpios de ptica. Galeria de imagens, vdeos on line. Vale a visita! http://www.ascb.org/- Pgina da Sociedade Americana de Biologia Celular, muitos links interessantes, imagens, vdeos. http://www2.uerj.br/~micron/Atlas - imagens de microscopia (ptica e eletrnica), organizado pelo departamento de Histologia da UERJ. http://www.molbio.princeton.edu/confocal/510image2/ Zeisslist2.html - Maravilhosas imagens de uorescncia obtidas em microscpio de uorescncia confocal. http://megasun.bch.umontreal.ca/protists/galler y.html Imagens de protistas em microscopia ptica de contraste interferencial e de fase. Links para imagens desses mesmos organismos em microscopia eletrnica, mostrando como vrios mtodos de observao devem ser conjugados na anlise de um organismo.
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Faa sua prpria busca na Internet a partir de palavras-chave como: Microscopia Microscope Fluorescncia Fluorescence Clulas E outras que certamente lhe ocorrero.

RESUMO

Os microscpios pticos comearam a ser construdos no sculo XVII e com eles foram observadas e batizadas as primeiras clulas. O aperfeioamento na construo de lentes, ltros e sistemas de iluminao deu origem a uma grande variedade de microscpios pticos. Alm dos de campo claro, que requerem que o material seja corado, existem microscpios de contraste de fase e de contraste interferencial, onde as clulas podem ser observadas vivas e sem colorao especial. Os microscpios de uorescncia permitem ver estruturas normalmente muito nas para serem observadas com os comprimentos de onda da luz visvel. O microscpio confocal a laser inaugurou uma nova era na microscopia ptica, mas a observao da maior parte das estruturas que compem a clula s possvel com um instrumento de maior poder de resoluo: o microscpio eletrnico, tema da prxima aula.

EXERCCIOS
1. Com base no que foi estudado, calcule o aumento nal de um microscpio ptico que utilize as seguintes combinaes de lentes oculares e objetivas:
ocular 5x 10x 20x 10x objetiva 40x 20x 10x 100x aumento nal

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Biologia Celular I | Microscopia ptica Observaes: As oculares mais comuns so as de 10x. As objetivas de 100x requerem o uso de leo de imerso. A maioria dos microscpios pticos vem com um jogo de objetivas intercambiveis de 5, 10, 20, 40 e 100x. 2. Por que as clulas receberam esse nome? 3. Compare o microscpio de Hooke (Figura 1.1) ao modelo atual (Figura 1.4) identicando as partes anlogas. 4. Qual a importncia de cada um dos componentes citados a seguir, para observao ao microscpio ptico: fonte de luz, lente condensadora, espessura e contraste da amostra? 5. Em que tipo(s) de sistema ptico podemos observar clulas vivas e sem a adio de corantes? 6. O que voc entende por microscopia de uorescncia? 7. O que limite de resoluo? Qual o limite de resoluo do microscpio ptico? 8. Uma hemcia mede 8 m. Quando observada sob um aumento total de 1.000 vezes, quanto medir? 9. Por que, em geral, o ncleo a nica estrutura claramente visvel dentro de uma clula observada ao microscpio ptico? 10. Converta para as unidades correspondentes: 5 mm = 0,5 mm = 100 m = 1.000 m = 60 nm =

nm m
nm mm

11. Uma clula foi fotografada com 2.000x de aumento no microscpio ptico. Uma estrutura que tenha na realidade 2 m aparecer com que comprimento na foto? 12. Procure determinar em que tipo de microscpio ptico as imagens que esto no encarte foram obtidas. Se conseguir identicar as amostras, melhor ainda, caso contrrio consulte o gabarito no nal do livro.

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