Criofratura

OBJETIVOS
Ao nal desta aula, voc dever ser capaz de: Conhecer os princpios da criofratura. Entender as informaes contidas numa rplica de criofratura. Correlacionar a criofatura construo do modelo do mosaico uido de membrana.

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Biologia Celular I | Criofratura INTRODUO

Uma das limitaes do microscpio eletrnico de transmisso sempre foi o fato de que as imagens observadas eram cortes ultranos das amostras, isto , imagens bidimensionais de estruturas (clulas) tridimensionais (Figura 3.1). Isto pde ser contornado com a observao de cortes seriados, uma tcnica bastante trabalhosa (Figura 3.2), e tambm com a microscopia de varredura. Entretanto, a resoluo do microscpio eletrnico de varredura menor que a do microscpio de transmisso, no permitindo a visualizao de vrios detalhes, principalmente do interior da clula (vide Aula 2) .

plano de corte perfil bidimensional, membrana de aspecto trilaminar

Figura 3.1: No microscpio de transmisso o corte ultrano de uma clula resulta numa imagem bidimensional onde se v o contorno (perl) trilaminar da membrana plasmtica e as organelas internas (no representadas).

planos de corte

O empilhamento" de vrios perfis bidimensionais em srie permite reconstruir o aspecto tridimensional da estrutura.

Figura 3.2: Cortes em srie de uma estrutura podem dar uma noo de sua forma tridimensional.

Em cortes ultranos, a membrana plasmtica aparece sempre como uma estrutura trilaminar, com uma faixa clara limitada por duas linhas mais escuras. O aspecto trilaminar da membrana plasmtica chamado unidade de membrana. Esse aspecto diculta a determinao da real estrutura da membrana, levando a concluses erradas acerca da distribuio de protenas e lipdeos (vide boxe), porm o desenvolvimento da tcnica da criofratura abriu um novo horizonte de informaes sobre as membranas celulares.

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observao da estrutura trilaminar da membrana em cortes ultranos levou concluso errada de que a estrutura da membrana seria um "sanduche" de protenas recheado por uma bicamada lipdica. Uma membrana com essa organizao seria no apenas muito rgida, dicultando os movimentos celulares, como seria quase impossvel que substncias passassem atravs dela: aquelas hidroflicas cariam impedidas de passar pela bicamada lipdica, assim como seria impossvel que as substncias hidrofbicas atravessassem a cobertura de protenas (veja o esquema na Figura 3.3).
Lipdeos e outras substncias hidrofbicas no cruzariam a couraa de protenas da membrana.

Protenas e outras molculas hidroflicas no atravessariam o miolo lipdico da membrana.

Figura 3.3: O "modelo do sanduche" da membrana era rgido e no explicava os movimentos celulares e o transporte atravs da membrana, embora correspondesse imagem de microscopia eletrnica de transmisso de cortes ultranos.

Fundamentos da tcnica
A tcnica da criofratura comeou a ser desenvolvida na dcada de 60 e a idia inicial foi reduzir ao mximo os artefatos decorrentes da xao qumica por aldedos. O objetivo era parar instantaneamente a atividade celular, provocando a xao das clulas sem que nenhum processo de decomposio celular tivesse tempo de acontecer. O procedimento bsico para criofratura consiste em 4 etapas : a. congelamento das clulas em nitrognio lquido; b. fratura das clulas; c, d. evaporao da superfcie fraturada com carbono e platina formando um "molde" da superfcie fraturada (chamado rplica); e, f. digesto dos restos celulares, de modo que apenas a rplica metlica observada ao microscpio eletrnico de transmisso.

protena lipdeo protena

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era composta principalmente de protenas e lipdeos; entretanto, a

H muito tempo j era sabido que a membrana plasmtica

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Figura 3.4: Principais etapas na produo de uma rplica.

CONGELAMENTO
Algumas adaptaes tiveram de ser feitas para que os cristais de gelo que se formavam no processo de congelamento no perfurassem as clulas, lesando-as gravemente e impedindo a observao de sua organizao. Assim, antes de congelar as amostras, elas so brevemente xadas em aldedos e inltradas com glicerol, uma substncia que diculta a formao de cristais de gelo (Figura 3.5). Um outro fator que impede a formao de cristais fazer um congelamento ultrarpido, o que requer equipamentos ainda mais sosticados.

Figura 3.5: Para criofratura, as clulas so inicialmente xadas com aldedos, a seguir inltradas com glicerol, que impedir a formao de cristais de gelo quando congeladas.

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FRATURA
Depois de congeladas, as amostras so colocadas numa cmara a vcuo e a fraturadas, tambm a baixa temperatura. Para observar a superfcie exposta aps a fratura, no seria possvel retirar a amostra do aparelho, pois temperatura ambiente ela simplesmente derreteria. Por esse motivo, necessrio fazer um molde que reproduza a superfcie fraturada com todos os detalhes.

Figura 3.6: O material congelado fraturado, expondo o interior celular.

REPLICAO
Ainda sob vcuo e baixa temperatura, a superfcie exposta recoberta com uma na camada de platina. Lembre que o carbono um tomo leve, pouco eciente para barrar os eltrons do microscpio eletrnico. A platina evaporada em ngulo lateral, assim no se deposita em toda a superfcie da amostra. Lembre tambm que a platina um metal pesado, barrando os eltrons que colidirem com seus tomos. Imediatamente aps, feito um sombreamento com carbono, que forma a base da rplica. Essa rplica de carbono e platina que ser observada ao microscpio eletrnico. Para que a rplica no sofra interferncia de restos celulares da amostra inicial, ela limpa com a ajuda de cido e bases fortes.

Figura 3.7: A platina evaporada em ngulo se deposita apenas em algumas partes da superfcie fraturada. O carbono forma um lme contnuo sobre a superfcie fraturada.

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INTERPRETAO DAS RPLICAS

O aspecto de algumas rplicas era muito diferente das imagens dos cortes ultranos. Embora algumas estruturas fossem identicadas (Figura 3.8), muitas vezes observava-se apenas grandes reas que pareciam corresponder superfcie celular (Figura 3.9). Nessas superfcies de membrana havia sempre um grande nmero de partculas distribudas: as partculas intramembranosas (Figura 3.9).
Foto: Raul D. Machado

Figura 3.8: Quando a clula fraturada em seu plano mdio possvel reconhecer o ncleo pelo seu envoltrio duplo e complexos de poro. Vacolos e organelas intracelulares so de identicao mais difcil.

Figura 3.9: Quando a fratura expe a superfcie da clula, observamos vrias partculas intramembranosas, setas que correspondem s protenas da membrana.

Em 1966 foi possvel demonstrar que a fratura ocorre preferencialmente no plano mdio da membrana, isto , separando as duas camadas de fosfolipdeos que a formam (Figura 3.10 ), e que as partculas inseridas nas membranas correspondiam a protenas delas. Essa foi uma das evidncias mais importantes para a sustentao do modelo do mosaico uido, proposto por Singer e Nicolson em 1972.
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Figura 3.10: O plano de fratura preferencial divide os folhetos da bicamada lipdica. Podem ser observados o folheto voltado para o citoplasma (face P) ou o lado voltado para o meio extracelular (face E) da membrana.

(A)

(B)

(C)

(D1)

(D2)

Figura 3.11: Esquema de uma hemcia (A) sendo fraturada (B) e (C) e expondo, ora a face E da membrana, voltada para o exterior (D1), ou a face P, voltada para o citoplasma (D2).

CONCLUSO
A criofratura continua sendo uma tcnica importante no estudo das clulas, entretanto, muitas variaes foram introduzidas, permitindo a obser vao no apenas do "miolo" da membrana, mas tambm das faces voltadas para o citoplasma, para o meio extracelular e tambm de estruturas citoplamticas, como os microtbulos.

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RESUMO
A tcnica de criofratura consiste em fraturar clulas ou tecidos depois de congelados. A fratura tem grande probabilidade de ocorrer entre as duas camadas de fosfolipdeos que formam as membranas, expondo uma matriz homognea (os lipdeos) com partculas de diversos tamanhos nela inseridas. Essas partculas "intramembranosas" correspondem a protenas que atravessam a bicamada lipdica. Para que a face fraturada possa ser observada feita uma rplica em carbono e platina da mesma. Finalmente, os restos da amostra so separados da rplica que colocada sobre uma grade e levada ao microscpio eletrnico de transmisso. O plano de fratura ocorre preferencialmente entre os dois folhetos de bicamada lipdica, expondo o plano hidrofbico do lado voltado para o citoplasma (face P) ou do lado voltado para o meio extracelular (face E).

EXERCCIOS
1. Liste as etapas do procedimento para criofratura, explicando os objetivos de cada uma. 2. Qual a parte da membrana que exposta na fratura? 3. A que correspondem as partculas intramembranosas observadas nas rplicas? 4. Qual a contribuio da criofratura na elaborao do modelo do mosaico uido?

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