CAMILA LIMA DIOGO ANANERE

HPV Papilomavirus Humano

Da Intima Relao com a Carcinogenese Cervical

Grande Ocorrncia na Populao Mundial

OBJETIVO De Baixo A Prevalncia HPV E a Incidncia de HPV E Alto Risco Oncognico Faixa Etria Mais Acometida Tcnica de Biologia Molecular

(Captura Hibrida IIR)

12.211 exames

Estado de Santa Catarina

2001 2005, coletados

OS DOIS GRUPOS

Banco de Dados do Setor de Doenas InfecciosasDNAnlise.

Resultado Positivo para HPV

De Baixo

Alto Risco

De Ambos Os Sexos

Independente da Faixa Etria

18 tipos de HPV O Grupo A

Divididos em Dois Grupos

Grupos conforme o Risco Oncognico

Possui Sondas para os HPV de Baixo Risco. (6, 11, 42, 43, e 44)

O Grupo B

Sondas para os HPV de Intermedirio/Alto Risco. (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 e 68)

As sondas consistem de molculas de RNA complementares ao DNA dos tipos acima especificados.

As molculas so conjugados com anticorpos monoclonais que contem um fosfato alcalino

Esse material lavado e depois, s permanecendo os anticorpos ligados ao RNA / DNA.

Um substrato quimioluminescente, que se liga ao fosfato alcalino e misturado ao material

E a leitura e feita em um luminometro, sendo a luz emitida em unidades relativas de luz que e comparada com o controle (RLU/PC).unidade de luz relativa (RLU)

A sensibilidade do mtodo e de 1 pg/ml de DNA-HPV, equivalente a 0,1 copia de vrus/clula

Por esta sensibilidade, o teste de Captura Hibrida e ao mesmo tempo qualitativo e quantitativo.

Quantitativo

Sensibilidade

Qualitativo

O Teste de Captura Hibrida

Negativos

Foram considerados positivos os resultados iguais ou superiores a 1 pg/ml. Equivalente a 0,1 copias virais/clula.

A Prevalncia do HPV de Baixo e Alto Risco

E a Incidncia por Faixa Etria

De acordo com as idades, agruparam-se casos, nos seguintes grupos

At 24 anos

25 a 35 anos

36 a 45 anos

E acima de 45 anos

Dentro dos 12.211 exames

Resultado positivo para HPV de baixo e/ou alto risco, o total de 6.120

FIGURA 1. Distribuio percentual do nmero de exames positivos e negativos para HPV no perodo de 2001-2005.

EXAME NEGATIVOS 46,2%

EXAME POSITIVOS 53,8%

No presente estudo foi encontrada alta porcentagem de HPV de alto risco, o que indica a importncia da realizao de um exame especifico para detectar o vrus do HPV, podendo assim diminuir a morbidade do cncer de colo de tero.

43,35% 30,33% 18,99%

< 25 anos 25 aos 35 anos 36 aos 45 anos

7,34%
> 45 anos

Esses dados demonstram que indivduos com menos de 25 anos, tiveram maior prevalncia para HPV positivo, e essa prevalncia foi diminuindo com o avano da idade.

Os resultados obtidos nesta pesquisa apresentam-se coerentes com os dados encontrados na literatura em relao a distribuio dos resultados positivos para HPV de baixo e/ou alto risco nas diferentes faixas etrias. As vitimas preferenciais desse vrus so as que esto entre 15 e 25 anos. A infeco por HPV e mais comum em pessoas sexualmente ativas entre 20 e 24 anos, independente do tipo viral. Apos esta idade, a incidncia declina gradativamente; como ilustra o grfico 1.

Verificando que abaixo dos 35 anos houve uma maior prevalncia do HPV de baixo risco. Este fato pode ser explicado, em partes, pelo aumento da freqncia sexual nesta idade. O que acarreta em uma maior periodicidade na pratica de exames de preveno, diminudo a incidncia de cncer de colo uterino. J na faixa etria acima de 35 anos, ha uma maior incidncia de HPV de alto risco, comparado com a de baixo risco.

Abaixo 25 anos (48%) < 35 anos (33%) 36 a 45 anos (22%)

acima de 45 (8%)

53,8% de positividade

66,4% foi HPV de alto risco

Com isso, destaca-se a importncia da deteco do HPV atravs de metodologias mais sensveis, como testes de biologia molecular (Captura Hibrida IIR), para garantir o diagnostico precoce deste que vem sendo considerado o maior agente causador de cncer de colo de uterino.

Tcnica de dot blot

Determinar a prevalncia e identificar os tipos de HPV mais frequentes em mulheres com leses de crvice uterina, agrupadas segundo diagnstico histopatolgico, em Belm, Par.

Materiais e mtodos
228 amostras de crvice uterina

adenocarcinoma (5/155)
A (155/228)

carcinomaepidermide invasor (150/155). Neoplasia intra-epitelial grau II (1/54)

(54/228)

Grau III (53/54) (NIC II ou NIC III)

cervicite crnica (19/228).

(19/ 228)

Baseou-se na descrio de Manos et al

Como controle de qualidade utilizaramse primers capazes de amplificar um fragmento do gene de globina humana.

Primers genricos

MY09 e MY11, que detectam ampla faixa dos diferentes tipos de HPV em uma rea bem delimitada de seus genomas regio L1).

Controles positivos (clulas HeLa ou clulas Caski)

Controle negativo (gua).

1l de cada amostra do DNA a ser testado 49l de uma mistura (MIX)

5,00l de cada um dos 4 trifosfatos de desoxinucleotdeo 5,00l de soluo tampo [100mM Tris-Hcl (pH:9),

1,00l de cada primer para HPV (MY09 e MY11), 0,50l de cada primer de globina G73 e G74, 0,25l de Taq DNA polimerase,

500mM KCl, 30mM MgCl2]

35,75l de gua bidestilada,

33 ciclos de amplificao em aparelho ciclador de temperatura

94oC por 1 min

72oC por 2 min, 55oC por 1 min,

10 min a 72oC

Aps eletroforese em gel de agarose a 2%, os produtos da PCR foram corados em soluo de brometo de etdio e visualizados luz ultravioleta.

Baseou-se na descrio de Manos et al17, com modificaes.

Utilizaram-se oligonucleotdeos especficos tornados radioativos pela incorporao de P32, em uma reao que envolveu a T4 polinucleotdeoquinase

Sondas especficas para os seguintes tipos de HPV: 5, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 66, 68, 70, 72, 73, Pap.155, Pap.291, W13B (os trs ltimos so tipos ainda no classificados) e sonda genrica.

A dcima parte do volume da reao de PCR foi desnaturada em placa de ELISA com hidrxido de sdio.

A mistura foi pipetada sobre uma membrana de nilon ajustada a uma placa de acrlico (d o t - m a c h i n e), ligada constantemente ao vcuo.

A membrana foi removida e colocada sobre um papel de filtro para marcar as posies das amostras.

Fixou-se o DNA expondo a membrana luz ultravioleta por 5 minutos.

A tipagem dos HPV foi realizada nas amostras que amplificaram ou no 450 pares de bases da regio L1 dos HPV.
6x soluo

citrato salina padro (SSC), (NaCl 900mM,

Na citrato 90mM)

10 x Denhardt's: (0,2% de soro de albumina, 0,2% de polyvinylpirrolidona, 0,2% ficoll)

0,5% de SDS, 100g/ml de esperma de salmo desnaturado

incubou-se
por 3h a 56oC

a sonda radioativa foi acondicionada no interior do saco plstico junto com a soluo de hibridizao e incubada por 12-18 horas a 56oC

aps o que as membranas foram removidas do saco plstico e lavadas a temperatura ambiente por duas vezes, por 15 minutos cada

seguindo-se duas vezes a 56oC por 20 minutos, com uma soluo de 2 x SSC e 0,1 SDS.

No final as membranas foram expostas a filmes de raio X por perodos de 12 a 24h.

A tipagem dos HPV foi realizada nas amostras que amplificaram ou no 450 pares de bases da regio L1 dos
HPV.

Todas as amostras foram testadas por PCR, enquanto que pela hibridizao por dot-blot analisaram-se 147 (de um total de 150) no grupo A, 49 (das 54) no grupo B e 17 (das 19) no grupo C.

100 80 60 40 20 0 A B Positivas por dot blot e PCR Positivas por dot blot e negativas por PCR Positivas por Dot blot e PCR no realizado

Figura 1
11,30%

Tipo 16

18,90%

Genrico 60,40%

9,40%

Tipo 31,33,45,52,58 ,59,73

160 140 120 100 80 60 40 20 0

Presena de HPV
Ausensia de HPV

Figura 2

3%

54,55% Tipo 16 genrico Tipo 31, 33, 58 Tipo 18

21,30%

21,21%

QUADRO III CARACTERSTICAS DOS TESTES DE DNA PARA DETECO DA INFECO POR HPV FACILIDADE PARA O SENSIBILIDADE ESPECIFICIDADE TESTE
Alta Alta Fraca

TESTE Southern Blot

COMENTRIOS Excelente para pesquisa e controle de qualidade, porm muito demorado e de difcil uso na clnica diria

Dot Blot
Hibridiza o in situ Hibridiza o in situ com filtro

Moderada
Moderada Fraca

Alta
Alta Fraca

Boa
Boa Boa

Rpido e relativamente barato

Localiza DNA do HPV em tecidos Simples execuo, porm pouco preciso Altssima sensibilidade, porm alto risco de falso-positivo exceto nos quando for realizado PCR "REAL TIME" com proteo bioqumica UDL (Uracil DNA glicosilase) pois zera a contaminao do TIPO "CARRYOVER" Rpido e pode ser usado na clnica diria

PCR

Muito alta

Alta

Boa

Captura hbrida

Alta

Alta

Boa

Os resultados aqui discutidos reforam a correlao entre certos tipos de HPV, especialmente o 16, no desenvolvimento de leso maligna de crvice uterina.

http://rsbweb.nih.gov/ij/docs/examples/dot-blot/dot-blot.jpg http://www.virushpv.com.br/novo/diagnostico.php www.dspace.espol.edu.ec/.../9029/.../D-39716.p... www.dms.ufsc.br/.../9560_AULA_BIO_MOL_Agosto_2009.ppt