Oi Line td bem ?

Fiquei aqui na IC para pesquisar sobre oq vc me pediu ontem, no encontrei muita i nformao sobre os buffers de restrio a maioria passa para artigos que ja supe que vc s abe exatamente como cada componente influi na reao. Um timo site que consegui encontrar, que explica os componentes mais importante e ste aqui: http://www.promega.com.br/resources/product-guides-and-selectors/restriction-enz yme-resource/applications-and-reaction-conditions-for-restriction-enzymes/?origU rl=http%3a%2f%2fwww.promega.com%3a81%2fresources%2fproduct-guides-and-selectors% 2frestriction-enzyme-resource%2fapplications-and-reaction-conditions-for-restric tion-enzymes%2f Ele tambm se refere a uma "atividade star" (star activity) normalmente uma enzima corta no seu stio especfico podendo cortar no prximo melhor sito (o mesmo sitio s qu e com uma base diferente, para a EcoRI o chamado sito cognato (cognate site) As enzimas de restrio requerem tanto uma faixa de pH especfica (Tris-HCl) para o se u funcionamento como tambm requer que certas concentraes de sais ou foras inicas comp onham a soluo, por isso o uso de NaCl, normalmente se tem nos buffers para esse u so, NaCl ou KCl uma concentrao 10x maior do que realmente se faz necessrio, tendo-s e que dilu-la, para se fazer o experimento. Assim como as DNAses precisam de cofatores para o seu funcionamento, as enzimas de restrio no so diferentes. O uso de MgCl2 tem a funo de oferecer essa fonte de ons agnsio para o funcionamento das enzimas de restrio. http://www.ehow.com/info_8506104_function-restriction-buffers.html O uso de dithioerythritol (DTE) na soluo foi para garantir a funcionalidade da enz ima, pois este age como agente redutor em sua via de ativao. Sobre a EcoRI eu encontrei que ela contm apenas um stio de restrio, inclusive prof comentou isso na aula prtica, pois usamos msm a EcoRI e ela disse que esta enzima cortava em apenas um stio se n me engano: A EcoRI atua reconhecendo o sitio de restrio na sequencia palindromica de 5' GAATT C 3' cortando s em cada fita entre os nucleotdeos G e A. Esse corte resulta em fra gmentos de DNA com extremidades coesivas, possibilitando a insero em outros fragme ntos com sequencias complementares ela. http://www.accessexcellence.org/AE/AEC/CC/restriction.php Em todo caso achei um video mto interessante sobre a EcoRI que demonstra o prime iro experimento da EcoR1, com ela da para se ter uma geral do experimento. http://highered.mcgraw-hill.com/sites/dl/free/0072921641/120078/bio38.swf Se no me engano clivamos o plasmidio usando duas enzimas ao mesmo tempo, se for e sse o caso a explicao se da da seguinte forma: Em uma digesto com duas enzimas, mesmo que as condies do buffer no seja a ideal para uma das enzimas participantes pode-se ainda se obter boa taxa de clivagem Digest with both enzymes in the same buffer. In many cases, even those a given b uffer is not optimal for an enzyme, you can still get quite good cleavage rates. Enzyme manufacturer catalogs usually contain a reference table recommended the best single buffer for conducting specific double digests.