SUMRIO

1.

INTRODUO As clulas, em geral, contm milhares de protenas diferentes, cada uma com uma

funo ou uma atividade biolgica diferente. As protenas consistem de cadeias polipeptdicas muito longas, tendo de 100 a mais de 2000 resduos de aminocidos unidos por ligaes peptdicas ( LEHNINGER, 2009). Cada protena tem uma funo e uma estrutura qumica especfica, sugerindo, fortemente que cada protena tem uma estrutura tridimensional nica ( LEHNINGER, 2009). Conceitualmente, a estrutura das protenas pode ser considerada em quatro nveis. A estrutura primria refere-se sequncia de aminocidos e localizao das pontes dissulfeto. A estrutura secundria refere-se relao espacial de aminocidos adjacentes. A estrutura terciria uma conformao tridimensional de toda a cadeia polipeptdica. E a estrutura quaternria envolve a relao espacial de cadeias polipeptdicas mltiplas que so firmemente associadas ( LEHNINGER, 2009). O desenvolvimento de metodologias para determinar protenas tem, cada vez mais, se tornado de fundamental relevncia em vrias reas do conhecimento (ZAIA et al .,1998) . Muitos mtodos espectrofotomtricos, ao longo dos anos , tm sido propostos para a determinao de protenas totais, mas no existe uma metodologia considerada de uso universal para todos os meios. Os mtodos geralmente mais utilizados so o do biureto, de Lowry, do Coomassie brilliant blue, BG-250 ou reagente de Bradford, do BCA ou reagente de Smith, e de absoro de protenas no ultravioleta ( ZAIA et al .,1998). De acordo com Zaia et al ( 1998), o mtodo de Biureto baseia-se na reao do reativo de biureto, onde o cobre presente no reativo, reage com as protenas formando um complexo quadrado planar com a ligao peptdica. O produto apresenta duas bandas de absoro, 270 nm e 540 nm, sendo a de 540 nm a mais utilizada para fins analticos, pois diversas substncias absorvem na regio de 270 nm, causando interferncia no mtodo. O objetivo da prtica registrar o espectro de absoro da albumina, verificar o comprimento de onda em que foram alcanados os picos de absoro, construir uma curva padro de absorbncia versus concentrao para albumina no comprimento de onda selecionado (mx) e lineariz-la passando pelo zero, com a curva padro obtida, calcular a concentrao de protena solvel nas amostras de casena e comparar os resultados.

2.

MATERIAL E MTODOS 2

2.1 Bquer; Pipeta;

MATERIAL

Tubo de ensaio;

Balo volumtrico; Espectrofotmetro UV/Vis de feixe duplo Banho-maria (37 C); Reagente de biureto: dissolver 3g de sulfato de cobre e 9g de tartarato de sdio e Potssio em 500 mL de soluo de hidrxido de sdio 0,2 M; Soluo padro de albumina 5 mg/Ml; Soluo aquosa de tirosina; Soluo de casena;

2.2

MTODOS Em 5 tubos de ensaio, numerar e proceder conforme o Quadro 1. Quadro 1. Procedimento para execuo da curva padro de albumina.

2.2.1 Curva padro de albumina

Nmero do Tubo Soluo de albumina V (mL) gua V (mL) NaOH 1M V (mL) Reativo de Biureto V (mL) Banho a 37 C t(min)

1 0,0 2,0 0,5 3,0 10

2 0,5 1,5 0,5 3,0 10

3 1,0 1,0 0,5 3,0 10

4 1,5 0,5 0,5 3,0 10

5 2,0 0,0 0,5 3,0 10

Realizar uma varredura na faixa de 200 a 800 nm da amostra do Tubo 3, obtendo o espectro de absoro do complexo formado. Observar o espectro obtido e escolher o comprimento de onde de mxima absoro para leitura dos demais pontos da curva padro, inclusive do Tubo 3. 2.2.2 Efeito do solvente Em 8 tubos de ensaio, numerar e proceder conforme Quadro 2. Obs.: O branco Tubo 1 deve ser usado para calibrar o espectrofotmetro.

Quadro 2 Volumes a adicionar e tratamento de cada tubo para quantificao de protenas nas amostras
Nmero do Tubo Amostra 1 2 Casena em soluo aquosa Volume de amostra gua V (mL) NaOH 1N V (mL) Reativo de Biureto V (mL) Banho a 37 C t(min) Absorbncia no mx 1,0 0,5 0,5 3,0 10 1,0 0,5 0,5 3,0 10 3 4 Casena em soluo salina (NaCl) 1,0 0,5 0,5 3,0 10 1,0 0,5 0,5 3,0 10 5 6 Casena em soluo cida (HCl) 1,0 0,5 0,5 3,0 10 1,0 0,5 0,5 3,0 10 7 8 Soluo aquosa tirosina 1,0 0,5 0,5 3,0 10 1,0 0,5 0,5 3,0 10 de

2.2.3 Quantificao de protenas nas amostras Extrair a protena solvel com 25 mL de soluo salina 0,9% e 5 g de amostra. Deixar sob agitao em blender durante 3 min. Filtrar e quantificar o sobrenadante. Obs.: realizar um ensaio em branco, idem ao Tubo 1 da curva padro.

3.

RESULTADOS E DISCUSSES

Curva padro de albumina 4

Para a execuo da curva padro de albumina adicionou- se os volumes listados no Quadro 1. Quadro 1: Volume adicionado de albumina para execuo da curva padro. Tubo 1 2 3 4 5 Volume de albumina adicionado (mL) 0 0,5 1,0 1,5 2,0

A concentrao de albumina foi calculada para cada tubo: Tubo 2: 5 mg/mL x0,5 mL = 2,5 mg/5,5 mL = 0,45 mg/mL Tubo 3: 5 mg/mL x 1,0 mL = 5 mg/5,5 mL = 0,9 mg/mL Tubo 4: 5 mg/mL x 1,5 mL = 7,5 mg/5,5 mL = 1,36 mg/mL Tubo 5: 5 mg/mL x 2 mL = 10 mg/5,5 mL = 1,81 mg/mL Quadro 2: Concentrao de albumina para cada tubo. Tubo 1 2 3 4 5 Concentrao de albumina na soluo (mg/mL) 0 0,45 0,9 1,36 1,81

Aps realizou-se uma varredura na faixa de 200 a 800 nm, obtendo um espectro de absoro do complexo formado. Observando o espectro obtido verificou-se que o comprimento de onde de mxima absoro foi o de 540 nm no qual foram realizados as leituras de absoro das curvas padres. Quadro 3: Absorbncias para diferentes concentraes de albumina. Tubo 1 2 3 4 5 Absorbncia (nm) 0 0,14 0,268 0,39 0,53

Para a realizao da curva padro foi calculado a equao da reta ( Equao 1) que tem seus parmetros descritos e calculados no quadro 4. Quadro 4: Calculo da curva padro de absorbncia versus concentrao para albumina . 5

X 0 0,45 0,9 1,36 1,81

Y 0 0,14 0,268 0,39 0,53

X.Y 0 0,063 0,241 0,530 0,95 =1,784

X 0 0,202 0,81 1,84 3,27 =6,12

X= concentrao Y=absorbncia a= X.Y/ X ( Equao 1) a= 1,784/6,12 a= 0,29 y=0,2954 x

Figura 1: Grfica absorbncia versos Concentrao para a Curva padro de Albumina. Efeito do Solvente Quadro 5: Efeito do solvente no valor de absorbncia no comprimento de onda mximo.
Nmero do Tubo Amostra 1 2 Casena em soluo aquosa 1,0 0,5 0,5 3,0 1,0 0,5 0,5 3,0 3 4 Casena em soluo salina (NaCl) 1,0 1,0 0,5 0,5 0,5 0,5 3,0 3,0 5 6 Casena em soluo cida (HCl) 1,0 0,5 0,5 3,0 1,0 0,5 0,5 3,0 7 8 Soluo aquosa de tirosina 1,0 0,5 0,5 3,0 1,0 0,5 0,5 3,0

Volume de amostra gua V (mL) NaOH 1N V (mL) Reativo de Biureto V (mL)

Banho a 37 C t(min) Absorbncia no mx

10 0,996

10 0,088

10 0,12 6

10 0,12 4

10 0,010

10 0,010

10 0,090

10 0,08 8

Quantificao de protenas nas amostras As protenas foram quantificadas de e suas concentraes calculadas abaixo e apresentadas no quadro 6. Banana Mdia de Absorbncia: 0,109 X=0,109/0,2954 X= 0,36 mg/mL x 5mL= 1,844 mg 1,844 mg ---- 1 mL X -----100 mL X= 184,49 mg a cada 100 mL Em 100 mL temos 5 g logo: 184,49 -----5g X-------100g X= 3689,9 mg de protena a cada 100 g de amostra X= 3,689 g/100 g X=3,689 %

Tomate Mdia de Absorbncia: 0,061 X=0,061/0,2954 X=0,21 mg/mL x 5mL= 1,051mg 1,051 mg ---- 1 mL X -----100 mL X= 105,17 mg a cada 100 mL Em 100 mL temos 5 g, logo: 105,17 -----5g X-------100g X= 2103,44 mg de protena a cada 100 g de amostra X= 2,103 g/100 g X=2,10 %

Tomate e Batata Foram analisadas duas amostras de tomate e uma de batata, que tiveram o mesmo valor para a absorbncia mdia, logo, temos a mesma porcentagem de quantificao de protenas nas trs amostras. Quadro 6: Porcentagem de protenas encontradas nas amostras. Amostra analisada Tomate Tomate Banana Batata Maa Protena encontrada (%) 2,10 2,10 3,68 2,10 1,0063

As diferenas em percentuais de protenas encontradas nos alimentos analisados mostrou certa discrepncia entre a maa e a banana dos demais. Essa diferena pode ser explicada atravs da Tabela Brasileira de Composio de Alimentos (UNICAMP, 2011), a igualdade de protena extrada do tomate e da batata se d devido a quantidade de protena existente a cada 100 g do alimento, sendo 0,9 g para a batata e 0,8 g para o tomate, j o maior valor encontrado referente banana d-se porque ela composta de 1,4 g de protena a cada 100g e a maa tem 0,2 g explicando o baixo valor de protena obtido na analise.
Os valores tericos descritos acima so referentes a quantidade existente de protena no alimento cru em uma poro de 100g, determinando-se coerente os resultados obtidos experimentalmente quando comparados aos valores encontrados na literatura proporcional para cada alimento.

4.

CONCLUSES

Com a varredura do espectro de absoro da albumina, verificou-se que o comprimento de onda em que foram alcanados os picos de maior absoro foi em 540 nm. A partir deste dado foi construdo uma curva padro de absorbncia versus concentrao para albumina no comprimento de onda 540 nm, e linearizou-se a curva passando pelo zero , com a curva padro obtida, foi possvel calcular a concentrao de protena solvel nas amostras de casena e comparando os resultados obtidos determinou-se que a diferena entre os valores de protenas extradas da banana, batata, ma e tomate obtidos experimentalmente so coerentes quando comparados aos valores encontrados na literatura.

BIBLIOGRAFIA LEHNINGER, A. Princpios de Bioqumica. 5 Ed. Porto Alegre: Artmed, 2009. ZAIA, D. A. M.; ZAIA, C. T. B. V.; LICHTIG, J. Determinao de protenas totais via espectrofotometria: vantagens e desvantagens dos mtodos existentes . Qumica Nova,p.787-793, 1998. ZAIA, D. A. M.; MARQUES, F. R.; BUSSAMRA, C. T.; ZAIA,V. Spectrophotometric determination of total proteins in blood plasma: a comparative study among dye-binding methods. Brazilian archives of biology and technology, v.4, p. 385-388, 2005. UNICAMP, Universidade Estadual de Campinas. Tabela Brasileira de Composio de Alimentos. 4 Ed. Ncleo de Estudos e Pesquisas em Alimentao, So Paulo, 2011. Disponvel em <http://www.unicamp.br>, acessado em 27/01/2013.

10

11