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Laboratrio de Fisiologia Respiratria Comparada Prof. Dr. Mogens Lesner Glass Adriana P. Sanches Schiaveto Jalile Amin Naves Ventura Humberto Giusti Marcelo dos Santos Fernandes Mirian Bassi INTRODUO
O oxignio transportado no sangue sob duas formas: 1) Dissolvido no plasma: Quando o oxignio entra no sangue, ele imediatamente se dissolve no plasma e no lquido intracelular eritrocitrio. Segundo a lei de Henry, a quantidade dissolvida de oxignio proporcional presso parcial deste gs. Sabendo que no sangue arterial normal a 37oC, com uma PaO2 de aproximadamente 100 mmHg, existe cerca de 0,3 ml/dl de oxignio dissolvido:
O2 dissolvido ( ml/dl ) = PO2 x 0,003 2) Combinado com a hemoglobina: A maioria do oxignio sanguneo transportado em combinao qumica com a hemoglobina nos eritrcitos. A hemoglobina uma protena conjugada composta por quatro cadeias polipeptdicas (globinas), sendo duas alfas e duas betas, cada uma combinada com um complexo porfirina denominado heme. As quatro cadeias polipeptdicas da hemoglobina formam um espiral em conjunto numa estrutura semelhante a uma bola, forma que determina a sua afinidade pelo oxignio. Cada complexo heme contm 1 on ferroso (Fe++) localizado centralmente, que estabelece ligao com uma molcula de O2. Dessa forma, cada molcula de hemoglobina pode carregar at 4 molculas de oxignio. Um grama de hemoglobina capaz de se combinar com 1,39 ml O2. Como o sangue normal possui cerca de 15g de Hb/100dl, a capacidade de O2 no sangue (transportado dessa forma) ser cerca de 20,8 ml de O2/100dl de sangue.
Contedo Total de O2 do sangue O contedo total de oxignio no sangue igual a soma de O2 dissolvido e do quimicamente combinado com a hemoglobina. O clculo do contedo total poder ser feito com a seguinte equao:
[O2]tot = (0,003 x PO2) + ([Hb]tot x 1,39 x SatO2/100) onde: [O2]tot o contedo total de O2; PO2 a presso parcial de O2 no sangue; [Hb]tot o contedo total de hemoglobina em g/dl; SatO2 a saturao da hemoglobina com O2; Assim, uma amostra de sangue arterial normal com uma PO2 de 100 mmHg, contendo 15 g/dl de hemoglobina 97% saturada, ter o seguinte contedo de oxignio:
CaO2 = (0,003 x 100) + (15 x 1,34 x 0,97) CaO2 = (0,3) + (19,5) CaO2 = 19,8 ml/dl Transporte de CO2 Aproximadamente 45 a 55 ml/dl de CO2 so normalmente transportados no sangue sob trs formas: 1) Dissolvidos numa soluo fsica: O CO2 produzido pelos tecidos dissolve-se no plasma e no lquido intracelular dos eritrcitos. No entanto, ao contrrio do O2, o CO2 dissolvido possui um papel importante no transporte, sendo responsvel por aproximadamente 10% do total liberado nos pulmes. Isso decorrente da alta solubilidade plasmtica do CO2. 2) Quimicamente combinado com protenas: Os compostos formados pela combinao do CO2 com protenas no sangue so denominados compostos carbamino. A reao entre o CO2 e a globina (carbamino-hemoglobina) ocorre rapidamente sem ao enzimtica. A Hb reduzida, ou seja, sem molculas de O2 liga-se mais facilmente ao CO2 do que a hemoglobina oxigenada, assim o
descarregamento do O2 nos capilares perifricos facilita o carregamento de CO2 enquanto a oxigenao no pulmo exerce efeito oposto. 3) Na forma de bicarbonato: cerca de 80% do CO2 sanguneo transportado como bicarbonato (HCO3-). CO2 + H2O
CA
H2CO3
HCO3- + H+
A reao entre o CO2 e a H2O rapidamente catalisada dentro do eritrcito devido presena da enzima anidrase carbnica (CA). O cido carbnico (H2CO3) resultante da reao se dissocia em hidrognio (H+) e bicarbonato (HCO3-). O HCO3 transportado, atravs de um trocador de membrana HCO3-/Cl- para fora do eritrcito e o H+ liga-se a hemoglobina presente no capilar.
Saturao da Hemoglobina (SaO2) A saturao uma medida da proporo de hemoglobina disponvel que est realmente transportando oxignio, e calculada atravs da relao entre a HbO2 (hemoglobina ligada ao O2) e a quantidade total de hemoglobina sangnea, sendo expressa em porcentagem: [HbO2] SaO2 (%) = [Hb] +[HbO2] onde: [HbO2] o contedo de oxiemoglobina; [Hb] o contedo de hemoglobina desoxigenada; [Hb] + [HbO2] o contedo total de hemoglobina. Assim se houver uma Hb total de 15g/dl no sangue (Hb + HbO2), sendo que h 7,5 g/dl de HbO2, a SaO2 calculada da seguinte maneira: 7,5 SaO2 = 15 Nesse exemplo, a hemoglobina considerada como sendo 50% saturada. Isso significa que somente metade da hemoglobina disponvel no sangue est realmente transportando O2, o restante permanece desoxigenado. x 100 = 50 % x 100 %
As variaes na afinidade da Hb pelo oxignio quantificada em uma medida denominada P50. A P50 a presso parcial do oxignio na qual a Hb se encontra 50% saturada, padronizada a um nvel de pH de 7,40. A P50 normal de aproximadamente 27 mmHg. Condies que causam uma diminuio da afinidade da Hb pelo oxignio (um desvio da curva da HbO2 para a direita) aumentam a P50 acima do seu valor normal. Condies associadas com um aumento da afinidade (um desvio da curva da HbO2 para a esquerda) diminuem a P50 abaixo do seu valor normal.
Curva de dissociao HbO2 A relao entre a saturao da hemoglobina e a presso de O2 no sangue demonstrada atravs da curva de dissociao HbO2 (Fig. 01). A saturao da hemoglobina com o oxignio varia com as alteraes da PO2. A forma sigmide da curva reflete as interaes entre as quatro cadeias dessa molcula e o oxignio. As partes inferior e superior da curva, relativamente achatadas, representam as faixas nas quais a ligao entre o O2 e a hemoglobina so mais difceis (pequenas alteraes da PaO2 tm pouco efeito sobre a SaO2), enquanto que a parte central, com uma inclinao mais acentuada, representa a faixa na qual as ligaes esto facilitadas (pequenas alteraes da PaO2 agora refletem grande efeito na SaO2). Fatores que afetam a posio da curva (carga e descarga de O2) A posio da curva depende de vrios moduladores. Entre os mais importantes esto: pH sanguneo, temperatura corprea, concentrao de certos fosfatos orgnicos nos eritrcitos (2,3 Difosfoglicerato) e a combinao qumica da hemoglobina com o monxido de carbono. Abordaremos neste contexto os efeitos do pH sanguneo e da temperatura sobre a posio da curva Hb-O2. Quando o pH sanguneo cai, a curva da HbO2 desviada para a direita, a saturao de Hb para uma determinada PaO2 fica reduzida (diminuio da afinidade da Hb pelo oxignio). Ao contrrio, quando o pH sanguneo aumenta a curva desloca-se para a esquerda, a saturao da Hb para uma determinada PaO2 aumenta (aumento da afinidade da Hb pelo oxignio). Assim podemos afirmar que quando o sangue nos capilares dos tecidos sistmicos recolhe CO2, seu pH cai de 7,40 para cerca de 7,37 causando um desvio da curva da HbO2 para a direita, diminuindo a afinidade da Hb pelo oxignio, dessa forma ajudando a sua descarga para os tecidos. De forma
inversa, quando o sangue venoso retorna aos pulmes, o CO2 eliminado e o pH volta para 7,40, trazendo a curva para a esquerda. H um aumento da afinidade da Hb pelo O2, aumentando sua captao nos alvolos. Outros fatores podem ocasionar acidose sangunea, o cido lctico produzido durante uma atividade fsica intensa diminui a afinidade entre hemoglobina e oxignio desviando a curva para direita. A queda da temperatura corprea sistmica desvia a curva da HbO2 para a esquerda, aumentando a afinidade da Hb pelo O2. Ao contrrio, o aumento de temperatura sistmica desvia a curva para a direita e a afinidade entre a Hb e o O2 diminui. Nos tecidos, as alteraes da temperatura esto relacionadas com a taxa metablica, pois as reas de grande atividade metablica apresentam temperaturas mais elevadas.
Figura 1. Curva de dissociao HbO2 e os efeitos que modulam a sua posio. Ventilao durante o Exerccio Como vimos anteriormente, a hemoglobina uma protena conjugada presente no eritrcito. Diferente da mioglobina, que tambm uma protena que se encontra nas fibras musculares (esquelticas e cardacas), sendo as fibras de contrao lenta (aerbias) as que possuem maior quantidade desta protena. Alm disso, a mioglobina possui maior afinidade pelo oxignio do que a hemoglobina e,
por isso, a curva de dissociao da mioglobina-O2 muito mais acentuada do que a da hemoglobina para valores de PO2 inferiores a 20mmHg (Fig. 02). Essa forma da curva implica num descarregamento de O2 em valores baixos de PO2, sendo importante em momentos de contrao, uma vez que a PO2 nas mitocndrias do msculo pode estar baixa (1-2mmHg).
Figura 2. Curva de dissociao Hb-O2 e mioglobina. Como se sabe, neurnios localizados no Bulbo (centro respiratrio) estimulam motoneurnios medulares que por sua vez controlam a musculatura respiratria. Receptores qumicos e estmulos nervosos ao crtex motor excitam o centro respiratrio e este modula a freqncia respiratria. O estmulo nervoso pode vir dos centros cerebrais superiores ou se originar nos receptores do msculo em exerccio. O estmulo qumico pode ser oriundo dos quimiorreceptores centrais (sensveis ao aumento de PCO2 e diminuio de pH), perifricos (sensveis principalmente a diminuio de PO2) e receptores pulmonares hipotticamente sensveis a aumentos de PCO2. Considerando uma atividade fsica moderada (esforo submximo), em que a PCO2 arterial permanece constante, a PO2 arterial cai ligeiramente e o pH arterial permanece constante, (Fig. 03), torna-se inexplicvel o estmulo responsvel pelo aumento da ventilao durante esta atividade. H hipteses de receptores
articulares ou musculares que durante o movimento sensibilizam o centro respiratrio; outra hiptese o aumento da temperatura entre outras que no esto completamente esclarecidas.
Figura 3. Alteraes da ventilao e das presses parciais de O2 e CO2 na transio de repouso para um exerccio submximo. No exerccio intenso h uma produo de cido lctico como conseqncia da gliclise. Isso acarreta numa diminuio do pH sanguneo podendo ser a explicao do aumento na ventilao durante o exerccio (Fig. 04). Outros fatores como o nvel srico de potssio, elevao da temperatura corporal, elevao de catecolaminas no sangue e possveis influncias nervosas, tambm contribuem para o controle ventilatrio durante o exerccio intenso.
PRTICA I: Curva de Dissociao Hb-O2 OBJETIVO - Construir a curva de dissociao hemoglobina-oxignio; - Verificar o efeito da Temperatura sobre a curva de dissociao.
MATERIAL E MTODOS
1) Animais: Ratos Wistar com peso mdio de 300g. 2) Coleta sangnea: O animal ser anestesiado com ter e em seguida uma inciso abdominal ser realizada para a retirada do maior volume sanguineo possvel (10 ml) em uma seringa heparenizada. 3) Gasometria de PO2, PCO2 e pH: As amostras sanguneas iniciais sero submetidas anlise da presso parcial de O2, CO2 e do pH. Para isso, parte da amostra de sangue ser injetada em uma cmara com eletrodo do tipo CLARCK. A calibrao do eletrodo de O2 realizada pela exposio deste ao ar atmosfrico ou ao nitrognio puro (N2). Ser estipulado zero mmHg de presso de oxignio com a aplicao do N2 e 150 mmHg com o ar atmosfrico. A amostra sangnea deve ser injetada na cmara logo aps a obteno da amostra. O valor da PaO2 ser anotado durante os primeiros 5 minutos, tempo suficiente para que o eletrodo se torne estvel. Em seguida, a mesma amostra sangunea ser submetida ao eletrodo de pH para a devida anlise desta varivel. A calibrao do eletrodo de pH realizada utilizando-se soluo tampo de SRENSEN e o eletrodo de CO2 ser calibrado com concentraes padro de CO2. Os eletrodos devem ser mantidos a uma temperatura prxima a do . Alm disso, a calibrao deve ser realizada na mesma corpo do animal (cerca de 38 C) temperatura. 4) Tonometria: a tonometria consiste na colocao de volumes similares de sangue (5 ml) em dois tonmetros ventilados com misturas gasosas diferentes. O primeiro tonmetro contm 30% de O2 e 6% de CO2, e balanceado com nitrognio (N2). O segundo tonmetro contm 0% de O2, 6% de CO2, tambm balanceado com N2. A temperatura deve ser mantida a 38 C. Aps 20 minutos de agitao, o sangue do tonmetro 1 apresentar saturao mxima de oxignio, enquanto que o sangue do tonmetro 2 se apresentar dessaturado. Misturando-se propores diferentes de sangue desses dois tonmetros, obter-se- diferentes valores de saturao. Exemplos:
Retirando-se 0,5 ml de sangue do tonmetro 1, com uma seringa de 1 ml, e misturandose com 0,5 ml do tonmetro 2, obtm-se uma saturao de 50%. 5) Construo da curva de dissociao HbO2: Para a construo da curva de dissociao HbO2 se faz necessrio plotar a saturao (10, 30, 50, 70 e 90%) no eixo Y contra seus correspondente valores de PO2 (mmHg) no eixo X. 6) Efeito da Temperatura: O efeito da temperatura sobre a curva de dissociao HbO2, ser avaliadao repetindo-se os procedimrentos anteriores, modificando-se apenas a temperatura do sistema para 25 C.
PRTICA II: Ventilao e PCO2 OBJETIVO - Analisar a frequencia respiratria e [CO2] durante atividade fisica. MATERIAL E MTODOS
1) Mensurao da frequncia respiratria: um voluntrio em repouso, em atividade leve e finalmente em atividade intensa, com as narinas vedadas (clip nasal) e a boca acoplada a um pneumotacgrafo ter o fluxo de ar (ventilao) registrado. Atravs do polgrafo (Narco Insumas Instrument - USA) sero registrados os grficos de frequencia respiratria nos 3 estados fsicos do voluntrio. 2) Registro do contedo de CO2: O fluxo de CO2 ser registrado atravs do analisador de CO2 Backmnan. E o polgrafo, como anteriormente, registrar o grfico do [CO2] que estar demosntrado nos 3 estados. REFERNCIAS BIBILIOGRFICAS
HLASTALA, M., BERGER, A.J., Physiology of Respiration (1996). Oxford University Press, New York. RANDALL, D., BURGGREN, W., FRENCH, K. (1997). Eckert Animal Physiology: Mechanisms and Adaptations. 4 ed. W. H. Freeman and Company, New York. RANG, H.P., DALE, M.M., RITTER, J.M. (2001). Farmacologia. 4 ed., Editora Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, R.J. SCANLAN, C.L. & WILKINS, R.L. & STOLLER, J.K. (2000). Fundamentos da Terapia Respiratria de Egan. Editora Manole. So Paulo, S.P. WEST, J.B. (1995). Respiratory Physiology: the essentials. 5 ed., Williams &wilkins, Baltimore.