TCNICAS IMUNOLGICAS UTILIZADAS NO DIAGNSTICO DAS INFECES PRECIPITAO: As tcnicas de imunoprecipitao, baseadas na quantificao de precipitados formados pela reao

antgeno-anticorpo. A quantidade de precipitado formado quando, a uma concentrao constante de anticorpo, se vai adicionando antgeno caracterizada por uma curva parablica,essa quantidade de precipitado depende de vrios fatores fsico-qumicos e imunolgicos, mas principalmente das concentraes relativas do antgeno e do anticorpo. Quando as quantidades de antgeno e de anticorpo so equivalentes, a precipitao mxima, decrescendo quando h excesso de antgeno ou de anticorpo. Precipitados j formados podem se dissolver quando expostos a um excesso de um dos reagentes, devido reversibilidade da ligao antgenoanticorpo. O fenmeno de prozona ocorre quando h um excesso de anticorpo e pode causar um erro de interpretao dos resultados, sendo necessrio que se faa uma titulao do anticorpo com quantidades fixas de antgeno, para evitar tais erros. Imunodifuso Simples em uma dimenso: O mtodo de Oudin para a anlise qualitativa e quantitativa dos sistemas de precipitao baseia-se na difuso simples em uma dimenso. Nesta tcnica, o anti-soro incorporado ao gar, sendo essa mistura colocada em um tubo at formar uma coluna de 35-45 mm de altura. Aps a gelificao, o antgeno colocado no topo da coluna. Os tubos so selados, para evitar evaporao, e deixados a uma temperatura constante durante o perodo de observao, que , em geral, de uma semana. A fim de induzir a difuso do reagente externo no gel, sua concentrao deve ser bem maior do que a do reagente contido no gel. Imunodifuso Radial Simples: Mancini introduziu uma tcnica de difuso simples para a determinao quantitativa de antgenos. Neste mtodo, o gar misturado com a diluio apropriada do anticorpo especfico para determinado antgeno e a mistura colocada em placa de Petri ou lmina de vidro. Em locais apropriados do gel so feitos orifcios em que se colocam volumes preciosos das solues de antgeno a serem testadas, bem como solues-padro com pelo menos trs concentraes conhecidas do antgeno. O suporte incubado em cmara mida at que ocorra a difuso (48 a 72 horas), sendo ento determinada rea do halo de precipitao formado. Para uma dada concentrao de anticorpo, a rea do halo formado, ao trmino da difuso diretamente proporcional concentrao do antgeno. A sensibilidade do teste pode variar com a concentrao do anti-soro. Uma concentrao baixa de anti-soro aumenta a sensibilidade, mas no permite a medida de concentraes de antgeno em excesso. Por outro lado, uma alta concentrao de anti-soro diminui a sensibilidade, mas permite a quantificao de concentraes maiores de antgeno. Pelo mtodo de Fahey, os halos de precipitao podem ser medidos antes do trmino da difuso e, neste caso, o logaritmo da concentrao do antgeno proporcional ao dimetro do halo. Empregando-se antgenos-padro diludos em srie possvel construir curvas-padro, e as equaes que descrevem tais curvas podem ser utilizadas para a determinao da concentrao de antgeno correspondente a qualquer dimetro. A sensibilidade destes mtodos varia de 1 a 3 g/ml de antgeno. Uma importante aplicao desta tcnica a quantificao das concentraes de imunoglobulinas sricas. Dupla Imunodifuso de Ouchterlony: O mtodo baseia-se na precipitao que ocorre na regio de equivalncia quando o antgeno e o anticorpo se difundem no gar. O complexo antgeno-anticorpo se apresenta sob a forma de linha ou arco de precipitao. A velocidade de difuso de cada substncia regida pelas leis da difuso e depende da concentrao e do tamanho da molcula, do tamanho dos poros do gel, da temperatura, da concentrao do gar e de sua pureza. O teste realizado colocando-se uma camada de gar em lminas de vidro ou placas de Petri previamente recobertas com uma fina camada de gar. Aps a gelificao, so feitos orifcios no gar, de acordo com o sistema a ser analisado. As solues contendo o antgeno e o anticorpo so colocadas nos orifcios do gar, as placas ou lminas so incubadas em cmara mida com vedao a uma temperatura conveniente e constante por 18 a 24 horas. Cada linha em um espectro de precipitao corresponde a um par de antgeno-anticorpo. A ausncia do antgeno ou do anticorpo indicada pela ausncia da linha. Cada precipitado funciona como uma barreira para os reagentes que o formam e impede sua difuso alm do stio da precipitao. Essa barreira imunoespecfica e a difuso de outros reagentes no impedida, a menos que a densidade dos agregados provoque um obstculo mecnico.O mtodo de Ouchterlony permite a comparao de vrios sistemas antignicos, desde que colocamos em orifcios adjacentes contra um mesmo sistema de anticorpos, formando vrios padres que indicam a existncia, ou no, de determinantes antignicos comuns. As linhas formadas podem ser completamente coalescentes, no caso de antgenos com os mesmos determinantes (identidade imunolgica); podem apresentar um esporo, como no caso de antgenos parcialmente relacionados (identidade parcial); ou podem formar uma interseo, indicando a ausncia de relao entre os antgenos (noidentidade). Quando os reagentes esto em quantidades balanceadas, a linha de precipitao formada ter a curvatura voltada para o orifcio que contm a substncia de maior peso molecular, que se difunde mais lentamente.O mtodo pode ser utilizado para avaliaes semiquantitativas quando se conhece a especificidade das linhas de precipitao, como, por exemplo, na titulao de antgenos ou de anticorpos. Podem-se caracterizar antgenos de vrios agentes infecciosos empregando-se anticorpos de especificidade e reatividade conhecidas. A

formao de uma nica linha de precipitao d indcios da pureza do antgeno ou do anticorpo, porm de um modo muito preciso.O mtodo apresenta vrias limitaes pois requer 18 a 24 horas de difuso para que a reao se processe, no sendo til em casos em que se necessita de um mtodo rpido de diagnstico. Ao mesmo tempo, apresenta uma sensibilidade baixa e limita-se deteco de reaes antgeno-anticorpo em que h formao de precipitados. Eletroimunodifuso Dupla Unidimensional: O princpio bsico do mtodo a eletroforese do antgeno e do anticorpo simultaneamente, que migram em direes opostas a partir dos orifcios separados do gel, resultando na precipitao em um ponto intermedirio entre as suas origens. Este mtodo requer que o antgeno e o anticorpo em teste apresentem diferentes mobilidades eletroforticas. O pH do tampo deve ser escolhido a fim de otimizar os efeitos eletroendosmticos do anticorpo para o catodo (plo negativo), enquanto o antgeno se move em direo do anodo (plo positivo). Eletroimunodifuso Simples Unidimensional: Nesta tcnica, o anti-soro especfico para o antgeno ou antgenos que se quer quantificar incorporado ao gel, que colocado em lmina de vidro numa posio fixa de modo que o anticorpo no migre. O material contendo o antgeno colocado em um pequeno orifcio e submetido a uma eletroforese. O padro de imunoprecipitao resultante se assemelha a um foguete. Esse padro ocorre porque a precipitao se forma nas margens laterais dos limites do antgeno vai precipitando, sua concentrao diminui, e as margens laterais convergem para uma ponta. A distncia total de migrao do antgeno para uma dada concentrao de anti-soro linearmente proporcional concentrao do antgeno. Teste de Aglutinao Direta: Na reao de aglutinao direta utilizam-se partculas antignicas insolveis em sua forma ntegra ou fragmentada. Hemcias, bactrias, fungos, protozorios podem ser aglutinados diretamente por anticorpo. Os testes para detectar anticorpos especficos so realizados empregando-se diluies em srie do anticorpo, frente a uma quantidade constante de antgeno. Aps um perodo de incubao, a aglutinao se completa e o resultado geralmente expresso como o ttulo do anti-soro, isto , a mxima diluio em que ocorre a aglutinao. Teste de Inibio de Hemaglutinao Direta: A inibio da hemaglutinao direta baseada na capacidade que certos antgenos virais tm de, espontaneamente, aglutinarem certos tipos de hemcias. Os anticorpos, se presentes na amostra, revestem as partculas virais, resultando na inibio da aglutinao, indicando um teste positivo para a presena de anticorpos. Estes testes no distinguem entre IgG e IgM. Este mtodo usado para detectar anticorpos contra o vrus da rubola, sarampo, influenza e certos enterovrus. Teste de Aglutinao Passiva ou indireta: Para o teste de aglutinao passiva, as hemcias e as partculas inertes (ltex, bentonita, sepharose, leveduras, etc.) podem ser sensibilizadas por adsoro passiva, devida ao contato direto com os antgenos solveis, por adsoro via agentes qumicos, como cido tnico, cloreto de cromo e por conjugao do antgeno, por meio de ligaes qumicas covalentes, fornecendo reagentes estveis. Devido grande diversidade de antgenos que podem se ligar s clulas ou partculas, a aplicao dos testes de aglutinao passiva muito variada. Teste de Hemaglutinao Passiva: A verificao de Boyden, em 1951, de que protenas podiam ser adsorvidas a hemcias tratadas com cido tnico e que essas clulas podiam ser aglutinadas por anticorpos especficos possibilitou o emprego dos mtodos de aglutinao para a deteco de anticorpos contra vrias substncias.Hemcias esto entre os melhores suportes de antgenos para os testes de aglutinao, pois h uma srie de antgenos que pode ser ligada sua superfcie para fornecer um sistema indicador sensvel na deteco de anticorpos. Alm disso, os testes em placa permitem que a determinao do ponto final da reao seja feita diretamente. Hemcias possuem uma superfcie complexa, o que facilita a ligao de muitos antgenos e, freqentemente, acarreta a presena de anticorpos heterfilos no soro de muitos animais. Tais anticorpos devem ser removidos antes da execuo do teste. Antgenos polissacardeos prontamente aderem a hemcias, enquanto antgenos proticos requerem pr-tratamento com cido tnico ou cloreto de cromo.O teste em placa utiliza pequenas quantidades de reagentes e considerado positivo quando se verifica a formao de tapete cobrindo o fundo da cavidade da placa em V, e negativo quando as hemcias sedimentam formando um boto compacto. O ttulo da amostra testada ser a mxima diluio em que ainda se observa a formao do tapete. O teste detecta anticorpos das classes IgG e IgM e, embora os anticorpos IgM sejam 750 vezes mais eficientes na aglutinao que os IgG, a quantidade de antgeno necessria para se obter a mxima reatividade com IgM muito maior do que a necessria para a mxima reatividade com IgG. Empregando-se hemcias sensibilizadas com antgenos proticos, quando adequadamente padronizado, o teste detecta anticorpos em nveis de

concentrao de 0,01 g/ml. H vrios sistemas comerciais para a pesquisa de anticorpos que utilizam esta tcnica, entre eles, os sistemas de Trypanossoma cruzi, Treponema pallidum, Toxoplasma gondii, etc. Teste de Inibio de Hemaglutinao Passiva: O teste de inibio de hemaglutinao passiva sensvel e especfico na deteco de pequenas quantidades de antgenos solveis, haptenos ou anticorpos que competem com a substncia homloga com que a hemcia foi sensibilizada.O princpio do teste baseia-se na competio, pelos stios de combinao do anticorpo, entre o antgeno fixado hemcia e o antgeno solvel ou o hapteno. O grau de inibio relaciona-se com a quantidade do antgeno presente na amostra e, tambm com a afinidade pelos stios de combinao do anticorpo.Este mtodo requer pequenas quantidades de reagentes, detecta antgeno na ordem de 0,1 a 10 g/ml, apresenta especificidade elevada e pode ser empregado em sistemas em que antgenos solveis ainda no foram obtidos. Tem sido empregado na deteco de antgeno na hepatite e na hemofilia. Teste de Aglutinao do Ltex: Partculas de ltex so esferas de poliestireno que podem ser utilizadas como suportes na adsoro de protena solvel e antgenos polissacardicos, funcionando como sistema indicador da reao antgeno-anticorpo.O teste pode ser empregado na pesquisa de antgenos ou de anticorpos. A aplicao mais comum na deteco do fator reumatide , que anticorpo da classe IgM pentamrico dirigido contra IgG. Adsorvendo IgG passivamente s partculas do ltex, haver a exposio dos determinantes de IgG que reagem com o fator reumatide, resultando em aglutinao. Este mtodo mais sensvel e menos especfico que a hemaglutinao passiva para a deteco de fator reumatide. O fator reumatide deve ser um auto-anticorpo poro Fc de IgG agregada ou alterada, ocorrendo doenas auto-imunes, em processo agudos ou crnicos, em doenas reumticas, em doenas infecciosas, degenerativas, etc..Tambm empregada na pesquisa da protena C que aparece no soro de pacientes na fase aguda de vrias infeces, como estafiloccica ou estreptoccica, febre reumtica, etc. Teste de Fixao do Complemento: A ligao antgeno-anticorpo promove a fiao do complemento, cujo consumo, invitro, pode ser empregado para detectar a presena de anticorpos, antgenos ou ambos. O teste utiliza um sistema homogneo (no preciso a separao entre fases) e realizado em duas etapas. Na primeira etapa, o antgeno incubado, na fase fluida, na presena de uma quantidade definida de complemento. Se o antgeno e o anticorpo correspondentes estiverem presentes, a cascata do complemento ser ativada pela via clssica e haver consumo de complemento. Na segunda etapa, adiciona-se o sistema indicador da reao que consiste em hemcias de carneiro sensibilizadas com hemolisina (anticorpo anti-hemcias de carneiro obtido em coelhos). A medida da atividade hemoltica do complemento no sistema indicador permite determinar a presena ou no de antgeno ou anticorpo na mistura inicial e sua quantidade. A atividade hemoltica remanescente pode ser quantificada empregando-se diluies seriadas da amostra a ser analisada. Tanto o anticorpo como o antgeno devem ser destitudos de ao anticomplementar, ou seja, no podem ativar o complemento separadamente. O complemento deve ser obtido de soro de cobaia e colhido e estocado de maneira apropriada para preservao da atividade hemoltica. Anticorpos humanos IgM, IgG1, IgG2 e IgG3 fixam complemento pela via direta, enquanto o IgA fixa complemento pela via alternativa.O teste pode ser qualitativo ou quantitativo. O mtodo qualitativo baseia-se na titulao do complemento residual que no foi consumido pela reao antgenoanticorpo com o sistema indicador. Esse mtodo, embora sensvel, muito laborioso para fins diagnsticos. O mtodo quantitativo possui muitas variaes tcnicas, entre as quais o micromtodo, que permite revelar quantidades mnimas de complemento fixado.Atualmente, embora haja testes bem mais sensveis, ainda utilizado na sorologia da doena de Chagas, da sfilis e de vrios vrus, rickettsias e fungos. Apresenta a vantagem de poder ser empregado para diferentes sistemas sem mudar os parmetros do teste, porm complexo e trabalhoso. Teste de Imunofluorescncia Direta: O teste de imunofluorescncia direta empregado na pesquisa e na localizao de antgenos em clulas ou tecidos atravs de um anticorpo especfico marcado com fluorocromo (conjugado). O conjugado se fixa ao antgeno, formando um imunocomplexo estvel. O anticorpo no ligado removido por lavagens e o preparado observado em microscpio de fluorescncia. O teste tem sido utilizado para a pesquisa de Chlamydia trachomatis, Treponema pallidum, Legionnella sp, Escherichia coli, estreptococos -hemoltico do grupo A e vrios vrus, com os do herpes simples tipo 1 e 2, o citomegalovrus, os da influenza tipo A e B, os da parainfluenza 1,2 e 3, o da varicela-zoster e o adenovrus.

Teste de Imunofluorescncia Indireta: A sensibilidade dos testes de imunofluorescncia limitada ao nvel de fluorescncia detectvel pelo olho humano; por isso, o teste de imunofluorescncia indireta tem sido empregado

para amplificar o sinal e aumentar a sensibilidade. Pode ser empregado na pesquisa de antgenos ou de anticorpos. Para a Pesquisa de Antgenos:Consiste na incubao da clula ou tecido em que se quer pesquisar o antgeno com o anticorpo especfico obtido em animal conhecido ou monoclonal, levando a formao de um imunocomplexo. Aps a lavagem, a preparao incubada com um conjugado de antiimunoglobulina produzida em outra espcie de animal. Para a Pesquisa de Anticorpos: Antgenos padronizados so fixados a lminas de vidro. O soro do paciente diludo, colocado sobre o antgeno e incubado para permitir a formao do complexo antgeno-anticorpo. Aps lavagens, a preparao incubada com o conjugado fluorescente e, se houver anticorpo no soro, o conjugado reage com o anticorpo especfico para o antgeno. Imunoperoxidase:As tcnicas para localizao de constituintes celulares seguem o mesmo princpio da imunofluorescncia, com a diferena de que, em vez do fluorocromo, emprega-se a enzima, que tem maior capacidade de amplificao. A enzima converte o componente cromgeno (substrato+doador de hidrognios) em produto insolvel que precipita no stio da reao. Esses precipitados podem ser visveis ao microscpio eletrnico. Enzimaimunoensaio: O enzimaimunoensaio um mtodo quantitativo em que a reao antgeno-anticorpo monitorada por medida da atividade enzimtica. Desempenha um papel muito importante no laboratrio clnico, pois, alm da elevada sensibilidade comparvel do radioimunoensaio, apresenta vantagens de utilizar reagentes estveis, estar livre das exigncias de trabalhar com radioistopos e poder ser adaptado tanto a testes simples como automao sofisticada. Uma caracterstica comum entre radioimunoensaio e enzimaimunoensaio que ambos medem, diretamente, a interao entre o antgeno e o anticorpo, no dependendo de um segundo fenmeno como precipitao, aglutinao ou fixao de complemento. O enzimaimunoensaio foi classificado em dois tipos: homogneo e heterogneo. Nos ensaios homogneos no necessria a separao entre os complexos antgeno-anticorpo e o antgeno e/ou o anticorpo livres, pois a interao antgeno-anticorpo modula a atividade da enzima. Nos ensaios heterogneos, a separao necessria, pois a atividade da enzima no alterada pela reao antgeno-anticorpo. Os ensaios homogneos so mais utilizados para a deteco de haptenos e os heterogneos para a deteco de molculas maiores. ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay): Esse teste foi desenvolvido como uma alternativa ao radioimunoensaio para a deteco de antgenos e anticorpos. O seu princpio bsico a imobilizao de um dos reagentes em uma fase slida, enquanto outro reagente pode ser ligado a uma enzima, com preservao tanto da atividade enzimtica como da imunolgica do anticorpo. O teste detecta quantidades extremamente pequenas de antgenos ou anticorpos, podendo ter elevada preciso se os reagentes e os parmetros do ensaio forem bem padronizados. Especial ateno deve ser dada a fase slida, cujas propriedades podem variar de acordo com a composio. O grau de pureza do antgeno ou do anticorpo da fase slida muito importante, pois qualquer material heterlogo competir pelo espao na placa. O objetivo do ensaio a quantificao ou verificao da presena de um antgeno ou anticorpo SLFIA (Substrate-Labelled Fluorescent Immunoassay): Pode ser utilizado para detectar reagentes de alto e baixo peso molecular. Foi desenvolvido pela Ames Company of Miles Laboratories. No ensaio, um substrato fluorognico da -galactosidase ligado covalentemente a um antgeno protico ou hapteno. Se o anticorpo especfico reage com antgeno, a enzima -galactosidase no cliva o substrato, por impedimento estrico. Se a amostra tiver antgeno, este se ligar ao anticorpo e o substrato ligado ao antgeno ficar livre e reagir com a enzima para formar o produto fluorescente. O grau de fluorescncia proporcional quantidade de antgeno na amostra.