Artigo convidado

Aplicaes Industriais da Biotecnologia Enzimtica

Valdirene N. Monteiro & Roberto do Nascimento Silva
As enzimas so protenas especializadas na catlise de reaes biolgicas que aceleram a velocidade de uma reao e que so aplicadas industrialmente. Os processos catalisados por enzimas so geralmente mais rpidos, eficientes e ambientalmente sustentveis. As enzimas podem ser obtidas de fontes vegetais, animais e microbiana. Esto presentes em vrios processos industriais como nas indstrias txtil, farmacutica, de alimentos e de papel e celulose. O mercado mundial de enzimas industriais representa 60% do mercado de enzimas. O surgimento de novos campos de aplicao de enzimas e o desenvolvimento de novas tecnologias que utilizem enzimas industriais esperado para os prximos anos. Palavras-chave: Biotecnologia enzimtica, processos qumicos, enzimas industriais. Enzymes are proteins specialized in catalysis of biological reactions that accelerate the velocity of reaction and that are applied industrially. The processes catalyzed by enzymes are often faster, efficient and environmentally sustainable. The enzymes can be obtained from vegetal, animal and microbial sources. The enzymes participate in various industrial processes such as in food, textile, cellulose and paper and pharmaceutical industries. The global market of industrial enzymes represents 60% of the enzymes market. The appearing of new fields of enzyme applications and the development of new technologies that use enzymes are expected for the upcoming years. Keywords: Enzymatic biotechnology, industrial processes, industrial enzymes.

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Introduo
Os processos industriais que envolvem reaes qumicas esto presentes na maioria das manufaturas de produtos ou bens consumidos pelo homem. Muitas dessas reaes so catalisadas por catalisadores qumicos que podem ser substitudos por enzimas. As enzimas so molculas capazes de acelerar os processos qumicos com grandes vantagens frente aos catalisadores qumicos, principalmente por serem ecologicamente mais viveis. A cada dia presenciamos mais processos industriais que utilizam enzimas como catalisadores, dentre as quais se destacam enzimas na rea de alimentos, sade humana e animal e bens como papel e indstria txtil. Diante desse fato, a pesquisa de novas enzimas ou o melhoramento do desempenho de catlise de enzimas j conhecidas se faz necessrio. A busca de microrganismos que possam produzir essas enzimas constante e vrias tcnicas de biologia molecular esto disponveis hoje para utilizao nesse processo. Talvez a maior dificuldade da indstria seja encontrar enzimas que possam suportar algumas condies industriais como variao de temperatura e pH. Outro grande desafio o desenvolvimento de pesquisas na prpria indstria. O grande abismo que existe entre as empresas e os centros de pesquisas universitrios dificulta ainda mais a produo de enzimas industriais. No Brasil, essa situao tende a diminuir uma vez que o Governo Federal instituiu a produo e desenvolvimento de enzimas como rea estratgica de desenvolvimento. Nesse contexto, existe um aumento mundial no consumo de enzimas industriais. O Brasil, hoje, um pas essencialmente importador de enzimas, alm de apresentar um uso ainda reduzido de enzimas em processos industriais quando comparado com outros pases. Assim, a insero e consolidao do Brasil como produtor de tecnologia enzimtica faz-se necessrio. Na presente reviso abordaremos uma anlise tcnica cientfica do uso de enzimas em processos industriais, ressaltando as reas de maior uso e demanda como as indstrias txtil, farmacutica, de alimentos e de papel e celulose. Abordaremos tambm a produo e as novas tcnicas utilizadas na descoberta de novas enzimas. Por fim faremos uma anlise do mercado das principais enzimas utilizadas em indstria e os setores da aplicao em relao importao e exportao de enzimas. Enzimas como catalisadores biolgicos Enzimas so catalisadores biolgicos, em sua maioria de origem protica que catalisam a maioria das reaes em organismos vivos. Talvez as enzimas sejam as molculas biolgicas usadas h mais tempo pelo homem, mesmo que de forma inconsciente, na produo de pes e vinho, na antiguidade. A cincia que estuda as enzimas denominada de enzimologia. O termo enzima foi introduzido pela primeira vez por volta de 1878 por Willian Khne (do grego en = dentro zyme = levedura) para designar as substncias contidas nos extratos de levedura usados em fermentao. Em 1897, Eduard Buchner descobriu que os extratos de levedo podiam fermentar o acar at lcool e provou que as enzimas envolvidas na fermentao continuavam funcionando mesmo quando removidas das clulas vivas, o que lhe renderia o prmio Nobel de Qumica em 1907. Porm, um dos grandes momentos da enzimologia aconteceu em 1926, quando James Summer isolou e cristalizou a urease e demonstrou sua origem protica. Em 1930, Northrop e Stanley realizaram estudos mais detalhados de cristalografia de trs enzimas digestivas, a pepsina, a tripsina e a quimotripsina, o que os levou ao recebimento de um Prmio Nobel da Qumica mais tarde, em 1946. A partir dessa data, com o desenvolvimento de novas tcnicas de cristalografia e, sobretudo a tecnologia do DNA recombinante, vrias enzimas foram isoladas, purificadas e cristalizadas. Hoje temos o conhecimento de estrutura e funo de mais de duas mil enzimas de origem animal, vegetal e microbiana. Devido aos grandes avanos no isolamento e identificao de novas enzimas, em 1956 a Unio Internacional de Bioqumica criou uma Comisso Internacional de Enzimas para estabelecer critrios para a nomenclatura e a classificao das enzimas, a fim de se evitar a nomenclatura aleatria de uma mesma enzima estudada por diferentes pesquisadores. As enzimas foram divididas em seis classes de acordo com o tipo de reaes que catalisam:
i. Oxirredutases: catalisam transferncia de eltrons reaes de oxidao-reduo ou

ii. Transferases: transferem grupos funcionais como amina, fosfato, acil, carboxil, entre molculas iii. Hidrolases: catalisam reaes de hidrlise de ligao covalente

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iv. Liases: adio de grupos a duplas ligaes ou remoo de grupos deixando dupla ligao v. Isomerases: reaes de interconverso entre ismeros ticos ou geomtricos vi. Ligases: condensao de duas molculas, sempre s custas de energia, geralmente do ATP

Cada enzima descrita recebe um nmero de classificao, conhecido por E.C. (Enzyme Commission), que composto por 4 dgitos:
i. Classe ii. Sub-classe dentro da classe iii. Grupos qumicos especficos que participam da reao. v. A enzima propriamente dita

qumicos, na sua maior parte aminocidos, que podem sofrer ionizaes e adquirir cargas momentneas, o que promove uma mudana conformacional da estrutura da enzima, afetando o modelo chave-fechadura. J a temperatura influencia a atividade enzimtica, no sentido de aumentar a energia cintica das molculas e conseqentemente aumentando a probabilidade de encontro entre a enzima e o substrato. Porm, a altas temperaturas a maioria das enzimas sofre mudanas conformacionais devido ao rompimento de ligaes e interaes fracas, um processo denominado de desnaturao que, para o caso da temperatura, um processo irreversvel. Cada enzima possui um valor timo de pH e temperatura, no qual a atividade da enzima mxima (Figura 3).

Frente aos catalisadores qumicos, as enzimas possuem algumas vantagens que justificam seu amplo uso:
i. So produtos naturais biolgicos e biodegradveis ii. Tm alta especificidade nas reaes iii. No so consumidas durante o processo iv. Aumentam a velocidade das reaes por diminurem a energia de ativao v. So estreo seletivas vi. Atuam em pH e temperaturas brandas

Os reagentes que participam das reaes catalisadas pelas enzimas so denominados de substratos. Efetivamente, quando se compara a converso de um substrato em produto catalisado por enzima e outro por um catalisador qumico, observa-se uma rpida converso com o uso das enzimas. Alm disso, as enzimas no alteram o equilbrio qumico das reaes e aceleram uma reao reversvel em ambos os sentidos1 (Figura 1). Talvez uma das caractersticas mais importantes das enzimas seja sua alta especificidade. Em 1894, Emil Fischer postulou que essa especificidade se deve ao fato de que tanto as enzimas quanto os substratos so complementares geometricamente, um modelo que ficou conhecido com modelo chave-fechadura (Figura 2). Apesar das vantagens no uso de enzimas em processos industriais, algumas desvantagens so observadas, dentre elas a sensibilidade das enzimas a variaes de pH e temperatura. O efeito do pH na atividade das enzimas se d devido ao fato de essas serem formadas por grupos
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Figura 1: Esquema e curva de converso de substrato em produto catalisado na presena e na ausncia de enzima. E= enzima.

Figura 2: Modelo de complementaridade estrutural (chave-fechadura de Emil Fisher).

Considerando uma reao catalisada por uma enzima, em seu sentido mais simples, existe um nico substrato formando um nico produto. Todavia, nem sempre esse sistema to simples assim. Existem processos onde uma reao qumica envolve varias enzimas e formao de vrios produtos com participao de coenzimas e cofatores, que
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so molculas s vezes requeridas para o funcionamento da enzima. Em todo caso uma reao enzimtica pode ser descrita como se segue abaixo:

Onde: E = enzima S = substrato ES = complexo enzima-substrato P = produto K1, K2, Kp = constantes de equilbrios

sendo esta cintica conhecida como cintica de HenriMichaelis-Menten2. A equao desenvolvida por esses cientistas de grande valia no campo da enzimologia industrial, pois permite clculos de velocidade e medidas de afinidade de ligao entre enzimas obtidas por diferentes fontes e um determinado substrato. A atividade de uma enzima pode ser descrita em termos de Vmax, ou seja, a quantidade mxima de produto formado num determinado tempo, e tambm da constante de Michaelis-Menten, KM, que representa a concentrao de substrato na qual se detecta uma velocidade de reao igual a metade de Vmax (Figura 4).

Figura 4: Curva de saturao numa reao enzimtica, mostrando a relao entre a concentrao de substrato ([S]) e a velocidade (V), bem como a equao de Henri-Michaelis-Menten.

Figura 3: Grficos esquemticos do efeito do pH (A) e da temperatura (B) na atividade enzimtica.

Esse mecanismo de reao foi estudado primeiramente em 1902 por Victor Henri, que props uma teoria quantitativa de cintica enzimtica e posteriormente, em 1909, por Leonor Michaelis e Maud Leonora Menten, 12
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Outro fator importante na catlise enzimtica e que explorado comercialmente a inibio enzimtica. As enzimas podem ser inibidas por substncias que se ligam enzima livre ou ao complexo enzima-substrato ou competem pelo stio cataltico da enzima. O resultado final uma diminuio ou abolio da atividade enzimtica. Um inibidor competitivo se liga enzima livre e impede a ligao da mesma ao seu substrato. Neste caso, o substrato e o inibidor possuem semelhanas estruturais. Na inibio competitiva, a velocidade mxima da reao no alterada, e ocorre um aumento no valor de Km (Figura 5A). Existe ainda a inibio acompetitiva, onde o inibidor no liga enzima no estado livre, mas sim ao complexo enzima-substrato e neste caso o complexo fica inativo (Figura 5B). Existem ainda casos onde os
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dois tipos de inibio podem ocorrer ao mesmo tempo, chamado de inibio mista, representada na figura 5C.

de interesse industrial. A metagenmica o estudo simultneo do DNA de uma comunidade inteira de microrganismos. Essa tcnica se baseia na extrao de DNA de todos os microorganismos existente em uma comunidade em determinado ambiente. Esse extrato contm milhes de fragmentos randmicos de DNA que podem ser clonados e mantidos em bactrias utilizadas no laboratrio para desenvolver bibliotecas que incluem os genomas de todos os microorganismos encontrados naquele habitat natural6.

Figura 5: Esquema da inibio enzimtica competitiva (A), acompetitiva (B) e mista (C). S= substrato; I= inibidor.

Produo de Enzimas de interesse biotecnolgico H milhares de anos, as enzimas vm sendo utilizadas em processos tradicionais. Esses biocatalisadores podem ser extrados de tecidos animais, vegetais e de microrganismos. Embora as enzimas obtidas de fontes vegetais e animais sejam muito utilizadas, as de origem microbiana so mais utilizadas por vrias razes como, por exemplo: produo independente de fatores sazonais, possibilidade da utilizao de substratos baratos como os resduos agrcolas e o fato de o rendimento na produo poder ser elevado a partir da otimizao das condies nos processos fermentativos por mutaes ou a partir da tecnologia do DNA recombinante3. A tecnologia do DNA recombinante um conjunto de tcnicas com ampla aplicao. So tcnicas que podem produzir mudanas genticas em microrganismos melhorando aspectos bioqumicos e fisiolgicos e que possam ser exploradas comercialmente. Mas recentemente so conhecidas as plataformas micas, a Genmica, Transcriptmica, Protemica e Metabolmica, que so ferramentas que permitem a descoberta de novas enzimas4,5. Recentemente, a metagenmica vem sendo utilizada para a busca de microrganismos produtores de enzimas
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Figura 6: Representao esquemtica da tcnica de metagenmica.

As possibilidades do uso industrial de enzimas podem ser ampliadas quando se trata de microrganismos extremoflicos do domnio Archea. Esses microrganismos habitam lugares atpicos com temperaturas superiores a 100 C, concentrao salina elevada, valores de pH muito baixos ou muito elevados abaixo de 2,0 e acima de 10,0 respectivamente ou mesmo sob condies de estresse nutricional. Dessa forma, extremozimas produzidas por esses microrganismos recebem ateno especial, pois essas protenas apresentam potencial industrial considervel oferecendo melhores rendimentos sob condies operacionais extremas. Alm do exemplo mais marcante que a enzima taq polimerase, de Thermus aquaticus, amplamente utilizada em procedimentos de PCR (Reao de Polimerizao em Cadeia), temos tambm o emprego dessas enzimas em detergentes e na indstria de alimentos. Alm disso, so largamente clonadas e caracterizadas3,7. A obteno de microrganismos que produzam enzimas com aplicao industrial pode ser feita de vrias maneiras, tais como isolamento a partir de recursos naturais, compra em colees de culturas, obteno de
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mutantes naturais, obteno de mutantes induzidos por mtodos convencionais e obteno de microrganismos recombinantes por tcnicas de engenharia gentica9. Aps a obteno do microrganismo, este cultivado em fermentadores para a produo de quantidades industriais do biocatalisador. Nesse caso, fundamental a otimizao do meio de cultivo. Esses fatores a serem otimizados so: pH e temperatura, condies de aerao e agitao adequada. O processo fermentativo industrial consiste de vrias etapas, que so divididas em: operaes de upstream (pr-tratamento da matria-prima), que so as etapas prfermentao, ou seja, as que antecedem a operao do reator e cuja finalidade colocar o sistema nas condies previamente escolhidas, para que as transformaes, no reator, se desenvolvam em condies timas; e operaes de downstream (obteno do produto), que so as etapas que ocorrem aps a fermentao e que englobam a separao e purificao dos produtos e subprodutos obtidos, bem como o tratamento dos resduos formados10. O processo fermentativo comea com a escolha do agente biolgico adequado (microrganismo ou enzima); segue com a transformao da matria-prima, em condies que podem exigir esterilizao, aerao e controle do processo (pH, temperatura etc.); e finaliza com a separao e purificao do produto final11. Dois mtodos de fermentao podem ser usados para produo de enzimas, a fermentao submersa e a fermentao em substrato slido7,12. A fermentao em estado slido (FES) ou em meio slido (FMS) ou ainda em substrato slido (FSS) pode ser definida como aquela que ocorre em substratos slidos na ausncia ou quase ausncia de gua. Porm, os substratos devem conter umidade suficiente para que possa ocorrer o crescimento e sustentabilidade ao metabolismo do microrganismo13. Esse tipo de fermentao provavelmente o mais antigo utilizado pelo homem. Em pases orientais, esse mtodo de fermentao data de 1000 a.C. Nessa poca, j eram produzidos, entre outros, bebidas alcolicas e molho base de soja. Foi no final do sculo XIX que as atenes foram novamente voltadas para os processos fermentativos em meio slido, com a produo da enzima Takadiastase oriunda do fungo Aspergillus orysae em farelo de trigo como substrato, produzida por 14
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Takamine14. Os substratos utilizados so produtos agrcolas como arroz, trigo, paino, cevada, milho e soja, alm dos substratos no-convencionais como cana-de-acar, sabugo de milho, farelo de trigo e palha de arroz7. Amilases, proteases, xilanases, celulases e pectinases, entre outras, so produzidas por fermentao em meio slido. Os microrganismos que mais se adaptam a esse tipo de fermentao so os fungos filamentosos por apresentarem hifas e boa tolerncia baixa atividade de gua e elevada presso osmtica15. A fermentao em estado slido apresenta vantagens como: a utilizao de substratos com baixo valor agregado, adio de nutrientes suplementares ao substrato, volume do meio reduzido, menor investimento em biorreatores, os esporos dos fungos podem ser usados diretamente na inoculao, no necessitando de etapas prvias de prcultivo, o crescimento dos fungos ocorre em condies semelhantes ao seu habitat natural, a baixa atividade de gua reduz problemas de contaminao, aerao facilitada devido ao maior espao entra as partculas e pela difuso do oxignio na gua para umidificar o meio, altos rendimentos na formao de metablitos e facilidade nas etapas de purificao16,17,18,19. Por outro lado, esse tipo de fermentao apresenta restries quanto a sua aplicao como: restrio a microrganismos que so capazes de crescer em sistemas com baixa umidade e dificuldade no controle dos parmetros da fermentao, sobretudo em controlar a elevada temperatura gerada pela atividade metablica dos microrganismos. So fatores devidos, na maioria dos casos, dificuldade de homogeneizao do meio reacional e tambm pelos problemas difusionais. Esses so problemas tpicos de processos que envolvem os meios slidos20,18,21. O processo de fermentao submersa (FS) consiste na introduo do microrganismo em meio lquido na forma de um inoculo. Nesse processo, o meio fica contido em fermentadores providos e controlados de agitao e aerao medidores de pH, temperatura e concentrao de oxignio dissolvido, entre outros. Os nutrientes encontram-se dissolvidos no meio lquido tornando-se facilmente acessveis para utilizao pelos microrganismos22. Os processos de fermentao submersa foram
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utilizados amplamente no mundo todo com a produo de antibiticos, devido importncia da penicilina durante a Segunda Guerra mundial. A fermentao pelo mtodo de cultura submersa executada em fermentadores fechados, equipados com agitadores, dispositivos de aerao para introduo de ar estril e camisas e serpentinas para o controle de temperatura. E se o processo de fermentao submersa exigir assepsia, esta se consegue mediante a esterilizao do meio (dentro ou fora do fermentador), a desinfeco ou esterilizao do equipamento por injeo de vapor ou mediante o calor gerado por serpentinas, sendo essa medida extensiva a todos os ductos de entrada e sada e s vlvulas correspondentes e a esterilizao do ar mediante filtros adequados11. Comparados com os processos em superfcie, os processos submersos oferecem vrias vantagens como: facilidade na manipulao, maiores volume de meio, a massa de microrganismo fica totalmente submersa no meio de maneira uniforme, a absoro de nutrientes e excreo de metablitos so executados com mais eficincia, o que acarreta menor tempo de fermentao e, consequentemente, maior produtividade7. A segunda parte dos bioprocessos a seo de recuperao do produto (Downstream processing). Essa fase compreende a separao e purificao do produto e deve-se atentar para os aspectos citolgicos e fisiolgicos do microrganismo em questo onde a fisiologia microbiana indica tanto a gerao como a localizao do produto. Se o produto excretado, as etapas de

recuperao seguem um roteiro diferente daquele produto que no excretado, ou seja, intracelular7. Para o produto que no excretado h a necessidade de romper a estrutura celular sendo importante a escolha de tcnicas adequadas para a liberao do produto. A opo pela operao de separao ser influenciada pelo tamanho do prprio bioprocesso e pelo valor do produto. O grau de pureza depender da opo do produto, extrato bruto ou enzima purificada. O produto final poder apresentar nas formas; cristalizado, liofilizado ou lquido concentrado. A seqncia de operaes pelas quais o meio contendo a substncia a ser separada deve passar para obteno de um produto de alta pureza constitui-se, basicamente, de quatro etapas: remoo do material insolvel, isolamento primrio, purificao e isolamento do produto final. A remoo do material insolvel se d por filtrao, centrifugao, decantao ou sedimentao. O isolamento primrio se d pela extrao por solventes, precipitao e ultracentrifugao7,12. O processo de purificao destina-se a remoo de impurezas bem como a concentrao do produto. Pode-se optar pelos vrios tipos de cromatografia, a adsoro ou a precipitao fracionada. A ltima etapa, o isolamento do produto final, compreende a formulao final ou comercializao direta. As operaes incluem centrifugao e subseqente secagem de um produto cristalizado, liofilizado ou seco por spray drying3,7,9. A Figura 7 resume todas as etapas utilizadas na produo e purificao de enzimas de interesse industrial.

Figura 3: Grficos esquemticos do efeito do pH (A) e da temperatura (B) na atividade enzimtica. Jan / Jun de 2009 Revista Processos Qumicos

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Enzimas na Indstria de Alimentos As enzimas vm sendo utilizadas h muitos sculos na indstria alimentcia. Um exemplo o dos pastores da antiguidade que observaram que, ao guardar leite no estmago de um animal degolado, se produzia um alimento slido, conhecido hoje como queijo. Plnio (2379 d.C.) narrava ter visto um soldado romano que mexia o leite com uma rama de figueira. A enzima era a ficina, responsvel pela solidificao. Os microrganismos, atravs de suas enzimas, tambm apresentam uma grande importncia econmica e social para a produo de bebidas e alimentos. A fermentao alcolica, por exemplo, conhecida desde 3500 a.C. e a produo de vinho j se encontrava em seu apogeu entre os egpcios e assrios. Os babilnios, em 2800 a.C., preparavam cerveja de po ou cevada malteada23. A produo de enzimas industriais para uso no processamento de alimentos data de 1874, quando Christian Hansen extraiu a renina de estmagos secos de bezerros para fabricao de queijo. Atualmente, a quimosina produzida por microrganismos que sofrem modificaes pela tecnologia do DNA recombinante na qual o gene proquimosina bovina foi inserido na Escherichia coli K-12 e a enzima aprovada para uso em alimentos pelo Food and Drug Administration (FDA). Muitas enzimas usadas em alimentos so derivadas de microrganismos recombinates como a-amilases e proteases obtidas de microrganismos recombinates como B. subtilis , B. licheniformi e B. subtilis24. Embora as enzimas sejam utilizadas na indstria de alimentos por terem as propriedades de inocuidade, eficincia e adequao s matrias-primas utilizadas, apenas poucas variedades de enzimas, na maioria hidrolases, so usados em grande escala. Assim, amilases (a-amilases e glicoamilases), proteases (quimosina, papana, bromelina e pepsina) e pectinases possuem uso consagrado dentre as hidrolases e a glicose-isomerase como representante de enzimas de larga utilizao dentro das isomerases7,25,26,27,28. Na panificao, as enzimas so utilizadas para promover a decomposio do amido, funo realizada pela a-amilase, levando formao de maltose, o que aumenta a maciez e a textura da massa e do miolo, mantendo o po fresco por mais tempo. A xilanase d

estabilidade massa, enquanto que a protease altera a elasticidade e a textura do glten e melhora a cor e o sabor do po. No processamento de amidos, enzimas como glicose isomerase, alfa-amilase, beta-amilase, pululanase e isoamilase convertem o amido em dextrose ou xaropes ricos em acares simples. As a-amilases bacterianas so mais utilizadas para o preparo de massas doces para bolos, biscoitos e crakers por serem mais estveis a temperaturas. Essas so utilizadas para a hidrlise do amido em maior grau diminuindo a viscosidase29. As proteases esto presentes na indstria de laticnios com a utilizao da quimosina, que promove a coagulao do leite (para a produo de queijos), e a lactase, que decompe a lactose em acares mais simples, impedindo assim, a tendncia que a lactose possui para adsoro de odores, alm de ser higroscpica, causando o endurecimento de laticnios em p. As lipases so utilizadas na produo de alguns queijos como o roquefort. No amaciamento da carne so usadas proteases como papana, bromelina e ficina30,31. Na indstria de sucos de frutas, a pectinase facilita a extrao, clarificao e filtrao do suco e promove a desgeleificao da polpa durante a macerao e extrao do suco, proporcionando a diminuio da viscosidade. Age desestabilizando as substncias floculantes, provoca coagulao e precipitao com conseqente clarificao17, a celulase liquefaz o tecido vegetal e permite extrair pigmentos do fruto e a glicoamilase decompe o amido, evitando turvao e gelatinizao durante o processamento. No caso das bebidas destiladas, a a-amilase e a glicoamilase decompem o amido. No caso dos vinhos, a pectinase facilita a prensagem, a filtrao e a clarificao e reduz o tempo de processamento. Nos dois tipos de bebidas, as proteases quebram protenas. As cervejarias usam diferentes enzimas para liquefazer e fermentar a matria-prima atravs da a-amilase, aumentar o teor de certos acares (glicoamilase), aumentar a velocidade de filtrao (glucanase), remover compostos indesejveis (pentosanases) e a papana e a bromelina evitam a turbidez do produto final32. A Tabela 1 mostra um resumo das principais enzimas utilizadas na indstria de alimentos, bem como sua origem e sua aplicao.
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Tabela 1: Resumo das principais enzimas utilizadas no processamento industrial de alimentos.

Enzimas na Indstria de Papel e Celulose O papel um produto composto constitudo basicamente por fibras de celulose. Para a obteno do papel h a necessidade de reduzir a madeira a fragmentos bem pequenos e transform-los em polpa. Para isso, a indstria em muitos pases, incluindo o Brasil, utiliza compostos qumicos como hidrxido de sdio e sulfito de sdio para a retirada da hemicelulose, da lignina e de certas resinas32. Esse tipo de tratamento causa vrios problemas ambientais que podem ser minimizados com a utilizao de enzimas que vm em substituio a esses produtos qumicos. Na indstria de papel e polpa a utilizao de enzimas foi considerada por muitos anos uma tcnica invivel at o surgimento de novas enzimas que favorecem tecnicamente o processo alm de minimizarem a carga poluente dos efluentes desta indstria7. Foi na dcada de 1950 que as enzimas foram primeiramente utilizadas na manufatura de celulose e papel com a utilizao de amilases no processo de produo de amido modificado. Para melhorar a impresso e a resistncia do papel empregado o amido. Essa prtica muito limitada at hoje. As enzimas que
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mais se destacam na indstria de papel e celulose so as xilanases, as quais possuem grande aplicao desde a dcada de 198026. As xilanases so as enzimas mais utilizadas no branqueamento da polpa. Essas enzimas atuam liberando fragmentos de lignina por hidrolisar a xilana residual, reduzindo consideravelmente a utilizao de cloretos no branqueamento da polpa25. A madeira tende a apresentar um excesso de resina natural formando manchas no papel. Para reduzir esse problema utiliza-se lipases nas fbricas de polpa mecnica para reduzir os problemas de resina. A adio dessas enzimas tornou-se obrigatria em muitas fbricas durante a estao de aumento de formao de breu. A reduo dos custos do gerenciamento de resduos tambm de particular interesse para muitas fbricas, e as enzimas tm um importante papel a desempenhar aqui26. Durante a fabricao de papel, pectinases podem ser usadas na fabricao de papel para despolimerizar substncias pcticas e diminuir a demanda catinica das solues pcticas e do filtrado resultantes do branqueamento com perxido, solucionar problemas de reteno no branqueamento mecnico da celulose e no tratamento dos efluentes dos moinhos de papel27. Como ocorre com os produtos txteis, a cobertura do papel feita para proteger o papel contra danos mecnicos durante o processamento, alm de melhorar a qualidade final do papel. Essa cobertura feita com amido, aumentando assim a resistncia do papel e melhorando a qualidade de impresso33. Atualmente vrios trabalhos vm sendo publicados apresentando a aplicao de enzimas oxidativas como lacases e peroxidases. Essas enzimas teriam atuao no branqueamento da polpa e, tambm so atribudas a essas enzimas, a degradao de extrativos. Vrias tcnicas, como microscopia eletrnica de varredura (MEV), microscopia eletrnica de fora atmica (MFA), espectroscopia de infravermelho (FTIR) e de infravermelho prximo (FTNIR), espectroscopia fotoeletrnica de raios X (XPS) e espectrometria de ressonncia magntica nuclear de hidrognio e carbono-13 (RMN-1H/RMN-13C), so empregadas para determinao das alteraes sofridas na composio e morfologia de madeiras, ligninas e polpas de celulose
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durante o processo de branqueamento, com ou sem a utilizao de enzimas34. Essas tcnicas permitiram analisar as propriedades fsicas de polpas Kraft de eucalipto submetidas a um branqueamento, mostrando que houve mudanas no perfil da superfcie das fibras e que o efeito mais comum atribudo a xilana o lixiviamento parcial com remoo das fibrilas presentes junto s fibras. Entretanto, os trabalhos realizados enfatizam que no diferenas evidentes entre as superfcies como clivagem ou distoro, mas apenas uma certa eroso, o que mostra que houve uma ao conjunta na remoo das camadas subseqentes da superfcie das fibras resultando em um polimento35,36. Acredita-se ainda que o tratamento com xilanases seja responsvel pela abertura de poros na parede celular de polpas Kraft e as modificaes morfolgicas vistas no microscpio possam ser atribudas ao enzimtica34. Enzimas na indstria txtil Os processos enzimticos podem ser utilizados para alterar as propriedades das fibras txteis e tm como principal vantagem, sobre a utilizao de reagentes qumicos, o fato de no implicarem qualquer efeito nocivo ao meio ambiente. Fato que levou, nos ltimos anos, com a crescente conscientizao e preocupao com o meio ambiente, ao desenvolvimento de muitas pesquisas com o objetivo de aplicar enzimas nas diferentes etapas do beneficiamento txtil. A utilizao de enzimas no processo txtil visando remoo das impurezas no celulsicas denomina-se biopreparao, biopurga, ou purga enzimtica e apresenta inmeras vantagens, contribuindo para o melhoramento ecolgico do processo, pois substitui produtos qumicos normalmente utilizados em alguns processos txteis, reduzindo consideravelmente o impacto ambiental assim como os danos s fibras. A primeira aplicao enzimtica na Indstria Txtil foi por volta de 1857, quando se utilizou o extrato de malte para retirar a goma de amido de um tecido a ser estampado35. No acabamento txtil, as enzimas so utilizadas para vrios fins. Na indstria txtil as lipases so usadas para remoo dos lubrificantes, e, recentemente, para melhorias do polister36. As lacases tambm podem ser utilizadas no alvejamento de algodo e tambm para limpeza de 18
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efluentes. Em 1996, a empresa Novozymes lanou no mercado o produto DeniLiteTM em uma preparao contendo lacase para aplicao em ndigo37. As proteases so utilizadas para impedir o encolhimento, diminuio de feltragem, biopolimento (bio-polishing), melhoria de qualidade de tingimento e melhoria do brilho38,39. Enzimas proteolticas tambm possuem aplicao no processamento da seda por facilitar o manuseio e aumentar a qualidade da fibra7. As amilases so utilizadas nos processos de desengomagem. Convencionalmente, as a-amilases utilizadas na indstria txtil so obtidas de culturas de bactrias como Bacillus amyloliquefaciense e Bacillus subtilis que trabalham em temperaturas entre 50 a 80 C, sendo sensveis a variaes de pH. Porm as termoestveis de B. licheniformis apresentam temperaturas de trabalho entre 90 a 105 C40. A utilizao de xilanases no pr-tratamento da polpa antes do branqueamento mostrou-se efetiva na reduo do cloro necessrio nessa fase. Pectinases so utilizadas na indstria txtil com diversas atuaes tais como degradar a camada de pectina que recobre as fibras de celulose, liberando-as para posterior processamento, tratar o resduo lquido e a degomagem das fibras naturais, macerao das fibras vegetais, como linho, cnhamo e juta, na biopreparao de algodo e, no polimento enzimtico de tecidos mistos de juta e algodo, a degomagem de fibras de rami com pectina liase produz fibras com qualidade superior quelas produzidas por complexos enzimticos comerciais ou utilizando processo qumico com soda alcalina. Em algodo cru, a remoo da pectina, cera e agentes de goma com a utilizao de pectinases em conjunto com amilases, lipases e hemicelulases em condies adequadas substitui o uso da soda custica e gera produtos de alta qualidade para posterior tingimento e processo de tecelagem com menor consumo de energia27. As celulases so as enzimas mais utilizadas na indstria txtil, sendo aplicadas na lavagem do jeans e de outros tecidos para obteno de aspecto envelhecido e so utilizadas em novos tecidos sintticos como o Lyocell, tambm chamado Tencel. O Lyocell uma fibra de celulose regenerada com alta tenacidade resistncia e maciez, obtido com a remoo de minsculos filamentos projetados na superfcie dos fios, o denominado pilling.
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A Figura 8 mostra um resumo das etapas de processamento do algodo na indstria txtil.

produo. As principais enzimas utilizadas em terapia esto resumidas na Tabela 2.

Tabela 2: Principais enzimas utilizadas em terapia. Adaptado de Said e Pietro (2004).
Enzima Plasmina Uroquinase Estreptoquinase EC E.C. 3.4.21.7 E.C. 3.4.21.73 E.C. 3.4.21.31 bovino Urina humana Streptococcus -hemolticos grupo C Lancefield; Cultura de bactrias recombinantes L-asparaginase Papana E.C. 3.5.1.1 E.C. 3.4.22.2 Escherichia coli Ltex de Carica papaya Agente anticancergeno Auxiliar na digesto de protenas em pacientes com dispepsia crnica e gastrite. Pode ser utilizada tambm como nematicida. Quimiotripsina Tripsina E.C. 3.4.21.1 E.C.3.4.21.4 Pncreas de bovino Pncreas de bovino Auxiliar de digesto/protease Auxiliar de digesto; debridamento de ulceras/ protease Bromelina E.C. 3.4.22.32 Caule de ananas comosus Empregada em processos inflamatrios de origem traumtica, cirrgico infecciosa, vascular e reumtica. A Bromelina tambm pode ser usada como auxiliar na digesto e para o tratamento de queimaduras de grau elevado. -amilase E.C. 3.2.1.1 Pncreas de suno Usada no tratamento da deficincia de secreo do suco pancretico e nas inflamaes crnicas do pncreas, entre outros benefcios. Lipase E.C. 3.1.1.3 Rhizopus arrhizus Indicada nos casos de deficincia em enzimas pancreticas e indigesto. Pepsina Celulase Lisozima Colagenase Hialuronidase Ribonucelase E.C. 3.4.23.1 E.C. 3.2.1.4 E.C. 3.2.1.17 E.C. 3.4.24.3 E.C. 3.2.1.35 E.C. 3.1.27.5 Estmago de suno Trichoderma viride Clara do ovo Clostridium histolyticum Testculo bovino Pncreas bovino Auxiliar de digesto/protease Auxiliar digesto/carboidrase Antibitico Debridamento de queimaduras e lceras drmicas Agente de disperso, antiinflamatrio Cicatrizante de feridas Fonte Plasma humano ou Aplicao Agente fibrinoltico, cicatrizante de feridas Agente fibrinoltico, cicatrizante de feridas Agente fibrinoltico

Figura 8: Principais enzimas utilizadas nas etapas de beneficiamento industrial do algodo.

Enzimas na Indstria Farmacutica Aps os antibiticos, enzimas so os produtos microbianos mais explorados na indstria biotecnolgica. Podemos afirmar que hoje a indstria farmacutica representa um dos maiores produtores e usurios de enzimas. Elas podem ser aplicadas tanto na produo de medicamentos e desenvolvimento de novos produtos, quanto em diagnstico clnico e terapia. Somado a isso, na rea de cosmtica, tambm chamado de Enzimocosmtica, as enzimas esto inseridas cada vez mais em produtos de higiene pessoal, esfoliao de pele e anti-sinais. O mercado de enzimas considerado hoje o mais promissor para as indstrias farmacuticas, e uma nica enzima com aplicao teraputica pode, por exemplo, custar US$ 5 mil/grama8 . Hoje, a diversidade de aplicao de enzimas na indstria farmacutica vai desde auxiliar em digesto, debridamento e cicatrizao de feridas at terapia anticncer. Entretanto, a terapia enzimtica apresenta algumas limitaes que devem ser resolvidas atravs de pesquisas cientficas, dentre elas, baixa potncia e seletividade, regulao inadequada da atividade, instabilidade, imunogenicidade e altos custos de manufatura, principalmente na recuperao e purificao final do produto. De acordo com a finalidade, as formulaes que contm enzimas podem ser administradas por via tpica, oral ou parenteral, sendo que estas devem apresentar alto grau de pureza, o que pode aumentar o custo de
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As enzimas aplicadas em cosmtica esto resumidas na Tabela 3.

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Tabela 3: Enzimas aplicadas diretamente na cosmtica.
Enzima Proteases EC E.C. 3.4.. Fonte Vrias fontes Aplicao Peeling, estrias, depiladores progressivos, controle de oleosidade e seborria Antienvelhecimento cutneo Anti-sinais, combate radicais livres Renovao ou preveno da placa dentaria Glicose oxidase Lipase Lactase Uricases Hialuoronidase Fosfatase alcalina Tirosinase Celulase Lisozima Colagenase Hialuronidase Ribonucelase E.C. 1.10.3.1 E.C. 3.2.1.4 E.C. 3.2.1.17 E.C. 3.4.24.3 E.C. 3.2.1.35 E.C. 3.1.27.5 E.C. 3.1.1.3 E.C. 3.2.1.23 E.C. 1.7.3.3 E.C. 3.2.1.35 E.C. 3.1.3.1 Aspergillus niger Aspergillus niger Aspergillus oryzae Arthrobacter protophormiae Testculo bovino Intestino de bezerro Lentinula boryana Trichoderma viride Clara do ovo Clostridium histolyticum Testculo bovino Pncreas bovino Auxiliar no tratamento de celulite Estimulo a proliferao dos fibroblasrtos Bronzeamento Auxiliar digesto/carboidrase Antibitico Debridamento de queimaduras e lceras drmicas Agente de disperso, antiinflamatrio Cicatrizante de feridas Enxaguantes bucais Limpeza profunda da pele, tratamento de acne e caspa Tinturas de cabelos Tintura de cabelos

vrias reas e representada na Figura 9.

Superxidodismutase Catalase Glicoamilase

E.C. 1.15.1.1 E.C. 1.11.1.6 E.C. 3.2.1.3

Eritrcito bovino Penicillium amagasakiense Aspergillus oryzae

Figura 9: Distribuio da demanda de enzimas industriais em diferentes reas.

O mercado de enzimas industriais no Brasil Segundo estudos realizados por analistas de mercado da Freedonia Group Incorporated, Word Enzyme to 2009, a indstria mundial de enzimas obteve um faturamento total de US$ 3,7 bilhes em 2004, com uma previso de crescimento da demanda mundial de 6,5% ao ano at 2009. Existe uma projeo segundo a qual s nos EUA a demanda de enzimas deve chegar US$ 2,5 bilhes at 2012. O mercado de enzimas est divido em enzimas industriais (enzimas tcnicas, enzimas para indstria de alimentos e enzimas para rao animal) e enzimas especiais (enzimas teraputicas, enzimas para diagnstico, enzimas para qumica quiral e enzimas para pesquisa). Hoje, as enzimas de uso industrial representam 60% do mercado mundial. Dentre elas se destacam o grande uso de amilases, com uma projeo de 25,4%, celulases (17,1%) e lipases (7,2%), s para este ano de 2009. A demanda dessas enzimas est distribuda em 20
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A Amrica Latina representa 3,4% da demanda mundial de enzimas, sendo o Brasil o pas mais expressivo desta regio, respondendo por 60% do consumo de enzimas na regio. Em termos mundiais, dados de 2005 mostram que o Brasil representa 3,7% do mercado internacional com uma movimentao em tono de US$ 147 milhes. Mesmo assim, ainda somos um pas que importa uma quantidade expressiva de enzimas, 86%, frente a 14% de exportao, revelando um atraso tecnolgico e estratgia em termos de produo de biocatalisadores. Este quadro pode se modificar com um avano no mercado de bicombustveis, seja ele de origem amilcea ou celulsico, alm de outras reas promissoras como a de raes para alimentao animal. Outros mercados devem crescer, porm em menor proporo, como o caso do de polpa e papel. Aliado a esses fatores, o Brasil instituiu em 2007 uma poltica de Desenvolvimento da Biotecnologia PDB, que inclui a produo e o uso industrial de enzimas no Brasil (Decreto n 6.041, de 8 de Fevereiro de 2007). Dados do Ministrio do Desenvolvimento, Indstria e Comrcio Exterior do Brasil mostram que s no ano de 2008 o Brasil importou cerca de 7,2 mil toneladas de enzimas industriais, perfazendo um total de US$ 72,5 milhes, frente a um volume aproximado de 4,5 mil toneladas (US$ 30,5 milhes) de enzimas industriais exportadas. As porcentagens das principais enzimas de aplicao industriais importadas e exportadas esto
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Figura 10: Distribuio das enzimas industriais importadas e exportadas no ano de 2008 pelo Brasil.

apresentadas na Figura 10. Consideraes finais O mercado de enzimas tem crescido muito nos ltimos anos. Isso se deve a um aumento na produo industrial de enzimas e desenvolvimento de novas tecnologias e novos campos de aplicao de enzimas. Os fatores que dificultam a produo de enzimas no Brasil vm sendo vencidos com novas leis e parcerias principalmente entre o setor privado e as universidades. A transferncia de tecnologia para as empresas de fundamental importncia para a gerao de conhecimento de novos processos. Novos campos esto sendo criados, como a produo de bicombustveis atravs da degradao de biomassa vegetal, bem como a produo de enzimas como aditivos a rao animal. Na rea de produo de papel, esperase o desenvolvimento de novos processos que diminua a
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poluio qumica gerada atualmente e, na rea alimentcia, um aumento no desenvolvimento de novos alimentos funcionais esperado. Talvez a rea que mais cresa seja a enzimologia industrial farmacutica. Aqui se espera a produo de novos frmacos mais especficos e mais individualizados principalmente na terapia de reposio enzimtica e vacinas e grandes avanos na rea de terapia cosmtica antienvelhecimento. A busca no desenvolvimento e descoberta de novas enzimas mais tolerantes aos processos industriais deve ser aumentada nos prximos anos. O uso de engenharia enzimtica aliada tecnologia do DNA recombinante e expresso heterloga de enzimas vo ter um novo salto na prxima dcada e ser um dos pontos bsicos no desenvolvimento de novos produtos industriais produzidos por via enzimtica. Outra rea bastante promissora para a tecnologia enzimtica se refere ao controle ambiental. A preocupao do mundo em poluir menos e despoluir mais acarretar na substituio gradual dos processos qumicos por processos enzimticos, a chamada tecnologia branca. Entretanto, as enzimas no podem ser consideradas como a nica ferramenta para um ganho nos processos industriais. necessrio o conhecimento da fisiologia, bioqumica e a gentica dos microrganismos. Portanto, a contribuio de novas reas da biologia, como a genmica, protemica e metabolmica sero de fundamental importncia para a aplicao de microrganismos em escala industrial e o desenvolvimento de tecnologias mais eficazes. Referncias 1. Gama, M., Aires-Barros, M. R., Cabral, J.; Engenharia Enzimtica, Lidel: Portugal, 2003. 2. Michaelis L., Menten M.; Biochem. Z. 1913, 49; 333. 3. Said, S.; Pietro, R.; Enzimas de Interesse industrial e biotecnolgico, Ed Eventos: Rio de Janeiro, 2002. 4. Brando, R. L; Castro, I.M.C.; A Biologia Molecular e a Produo de Enzimas de Interesse Comercial. In: Suraia Said; Rosemeire C.L.R. Pietro. (Org.). Enzimas como agentes biotecnolgicos. 1 ed. Ribeiro Preto: Legis Summa Ltda, 2004. 21

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Valdirene Neves Monteiro1 & Roberto do Nascimento Silva*2

Unidade Universitria de Cincias Exatas e Tecnolgicas da Universidade Estadual de Gois-UnUCET/UEG, BR 153, Km 98, Campus Henrique Santillo, Anpolis, GO, CEP 75000-000. 2 Universidade Federal de Gois, Instituto de Cincias Biolgicas, Laboratrio de Enzimologia, Campus II Samambaia, Goinia, GO, CEP 74001-970
1 *

Email: rsilva@icb.ufg.br

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