CENTRO UNIVERSITRIO BARO DE MAU CURSO FARMCIA INTEGRAL

FATORES DE TRANSCRIO RESPONSVEIS PELA REGULAO GNICA DA BIOSSNTESE DE LIGNINA

AUTOR: VANESSA DE OLIVEIRA RODRIGUES

ORIENTADOR: JOS LUIZ FERRARI DE SOUZA

RIBEIRO PRETO SP 2012

VANESSA DE OLIVEIRA RODRIGUES

FATORES DE TRANSCRIO RESPONSVEIS PELA REGULAO GNICA DA BIOSSNTESE DE LIGNINA

Monografia apresentada ao Curso de Farmcia do Centro Universitrio Bro de Mau como prrequisito para obteno do Titulo de Bacharel em Farmcia.

Orientador: Prof. Dr. Jos Luiz Ferrari de Souza

RIBEIRAO PRETO Setembro de 2012

RESUMO
O papel de liderana do Brasil na produo de etanol a partir da cana de acar, alm de seu sucesso no uso como recurso sustentvel e renovvel, poder se consolidar ainda mais com o aproveitamento da celulose presente no bagao, resultante da moagem da cana, o que aumentaria a produo total sem a necessidade de expanso da rea plantada. Porm, a celulose proveniente do bagao da cana ainda vem sendo pouco explorada na produo de etanol. Um dos motivos a limitao das tecnologias disponveis para a retirada do contedo de lignina, alm de grandes problemas ambientais e gastos energticos que a tecnologia vigente utiliza para a remoo da mesma, devido ao fato de que altos teores de lignina dificultam ao de enzimas hidroliticas, que quebram a celulose, interferindo negativamente no processo de converso da biomassa em combustvel. Quanto menos lignina contiver o material, mais fcil o processo de obteno do lcool advindo da celulose, porm, a lignina de extrema importncia para a sustentao da planta, no podendo ser retirada totalmente da mesma, uma vez que sem ela a planta no sobreviveria, sendo assim necessrio o desenvolvimento de estudos que possam elucidar o mecanismo de regulao e produo da lignina, afim de no retirala totalmente da planta, mas sim modifica-la estruturalmente para que se possa obter uma lignina que seja removida mais facilmente. Recentemente diferentes genes envolvidos com a biossntese de lignina foram identificados e caracterizados, porm pouco se sabe, at o momento, sobre sua regulao. Molculas que participam desses processos regulatrios, como fatores de transcrio, tm sido estudados, para que se possa desvendar os mecanismos envolvidos nessa regulao. Nesse sentido, este trabalho tem por objetivo fazer uma reviso, enfatizando este tipo de regulao em diferentes organismos vegetais, mas principalmente em cana de acar; identificando possveis lacunas existentes e apontando alvos para estudos posteriores, a fim de se promover o entendimento sobre uma das formas de se modificar a lignina para melhor aproveitamento desta matria prima na produo do etanol de segunda gerao. Palavras chave: cana-de-acar; lignina, fatores de transcrio, celulose, etanol de segunda gerao.

. SUMRIO

1. INTRODUO....................................................................................................01 2. OBEJETIVO........................................................................................................04 3. MATERIAIS E MTODOS..................................................................................05 4. RESULTADOS E DISCUO............................................................................06 4.1 A BIOSSINTESE DA LIGNINA.......................................................................... 06 4.2 FATORES DE TRANCRIO...........................................................................09 4.3 FATORES DE TRANSCRIO DA FAMLIA NACs.........................................10 4.4 FATORES DE TRANSCRIO DA FAMLIA MYBs.........................................12 4.5 ELEMENTOS AC...............................................................................................16 4.6 DESCOBERTA DE UM NOVO FATOR DE TRANSCRIO: SHINE................18 5. CONCLUSO.................................................................................................... 22 6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS..................................................................25

1. INTRODUO

A energia est na base da estruturao da sociedade humana em diversos aspectos, desde o bem estar pessoal at no desempenho das indstrias. O petrleo tem tido uma imensa importncia, sendo responsvel pelo fornecimento de um tero da energia primria consumida no planeta. A populao enfrenta atualmente a escassez e o aumento do preo desta fonte no renovvel de energia (ODAC, 2007). A crescente queima destes combustveis fsseis gera, juntamente com o desmatamento, o acmulo na atmosfera de gases, como odixido de carbono (CO 2), responsveis pelo efeito estufa. Essa atual situao exige mudanas nos padres de industrializao e de consumo da sociedade humana, de forma a reduzir a emisso de gases do efeito estufa (PEREIRA Jr. et al., 2008). O etanol vem sendo utilizado como alternativa para combustveis fsseis, como a gasolina, apesar de ser um combustvel, ou seja, libera significativas quantidades de calor ao se queimar. O etanol apresenta algumas diferenas importantes em relao a esses combustveis convencionais derivados de petrleo. A principal delas o elevado teor de oxignio, que constitui 35% em massa do etanol. As caractersticas do etanol possibilitam a combusto mais limpa e o melhor desempenho dos motores, contribuindo para a reduo das emisses poluidoras. Alm disso, comporta-se como um verdadeiro aditivo para a gasolina (GOLDEMBERG et al., 2008). Como consequncia de sua composio, a combusto da gasolina com etanol e do etanol puro em motores produz menores emisses de monxido de carbono (CO), xidos de enxofre (SOx), hidrocarbonetos e outros compostos poluentes em relao gasolina convencional (GOLDEMBERG et al., 2008). Baseado em todas as vantagens proporcionadas pelo uso do etanol comparado gasolina, registrou um grande aumento das vendas desse biocombustvel, devido a esse crescente aumento na produo de bioetanol de primeira gerao no Brasil, a rea de cultivo de cana-deacar dever ser expandida para atender crescente demanda nacional e internacional. Entretanto, para evitar a expanso desmedida das reas de cultivo, tmse desenvolvido processos biotecnolgicos que permitam a utilizao de biomassas residuais de composio lignocelulsica, abundantemente geradas nos setores

agrcolas, para a produo de bioetanol de segunda gerao. Os materiais lignocelulsicos so constitudos,em sua maioria, por celulose, hemicelulose e lignina, eles so separados de acordo com as caractersticas do produto desejado, sendo necessrio desenvolver processos que disponibilizem os monmeros (acares), para a transformao destes atravs de processos de fermentao (PEREIRA Jr. et al., 2008). A Lignina um componente importante presente na biomassae e representa o segundo polmero mais abundante na planta depois da celulose (Boerjan, W et al 2003). A lignina predominantemente presente nas paredes celulares secundrias das clulas que formam tecidos, tais como: esclernquima, xilema e periderme (Boudet, 1998). Um evento importante no surgimento das plantas terrestres a lignificao da parede celular. Este processo atua em vrias funes como a regulao da gua, proteo contra pragas e patgenos, alm de contribuir, tambm, para a resistncia mecnica e a rigidez da planta (Kenrick and Crane, 1997). Ainda, a lignina um polmero composto principalmente por trs monolignis: pcoumaril, coniferil e sinapil. (Boerjan et al., 2003), sendo os monolignis denominados unidades de hidroxifenil (H), guaiacil (G) e siringil (S), respectivamente, ao serem incorporadas no polmero de lignina. Estudos mostram uma extensa variabilidade nas paredes celulares das plantas, evidenciando que a rigidez da parede celular, esta diretamente relacionada com a composio da lignina por meio destes monolignis, juntamente com o tipo de ligao que existe entre eles (Zhong & Ye, 2009). Plantas compostas por monolignis do tipo G resultam em plantas com uma parede celular mais macia (gimnospermas), enquanto que, plantas como as angiospermas, compostas por G e S apresentam uma parede celular mais rgida (Baucher et al., 2003). No entanto, por mais importante que seja para sobrevivncia das plantas, altos teores de lignina dificultam a ao de enzimas hidroliticas que quebram a celulose, interferindo negativamente tambm no processo de converso da biomassa em combustvel; j que apesar das tecnologias para converso da biomassa lignocelulsica em etanol estarem sendo otimizadas, vrios estudos apontam que menores nveis de lignina ajudam no processo da converso, uma vez que ela pode adsorver enzimas que so utilizadas para decompor a celulose em acares

fermentveis, e tambm pode inibir as mesmas enzimas com subprodutos de sua degradao (EMBRAPA milho e sorgo, 2012). A tendncia dos estudos atuais desenvolverem processos biotecnolgicos que permitam a utilizao de biomassas lignocelulsica, como palha de milho e arroz, bagao de cana-de-acar e resduos da indstria de celulose, abundantemente geradas nos setores agrcolas e florestais, para a produo de etanol de segunda gerao (VSQUEZ et al. 2007). As tecnologias para a obteno deste etanol envolvem a hidrlise dos polissacardeos da biomassa em acares fermentveis e posteriormente sua fermentao. Para executar essa tarefa, o processo de hidrlise utiliza tecnologias complexas e multifsicas, com base no uso de rotas cidas e/ou enzimticas para a separao dos acares e remoo da lignina (PEREIRA Jr. et al., 2008). Residuos obtidos a partir de pr-tratamentos, usados para reduzir o teor de lignina na produo de etanol, podem inibir o crescimento de microorganismos utilizados durante a fermentao do mesmo. Portanto, a engenharia gentica vem sendo utilizada na inteno de aperfeioar essa produo de etanol de segunda gerao, obtendo, desta forma, a lignina com uma composio desejvel em plantas, dedicadas produo de etanol (Vogel e Jung, 2001).

2. OBJETIVOS

A descoberta do funcionamento da via biossintetica de lignina, bem como ocorre a deposio deste polmero em paredes secundrias de clulas vegetais, foi de extrema importncia para o desenvolvimento de pesquisas que elucidaram a necessidade de controlar essa via metablica, afim de desenvolver plantas contendo um tipo de lignina que nao atrapalhe; ou mesmo, que sua retirada da biomassa celulsica seja menos laboriosa, facilitando assim sua extrao, fornecendo matriaprima mais adequada para a produo industrial de etanol de segunda gerao. O presente trabalho tem por objetivo mostrar a importancia dos fatores de transcriao (FTs) na regulaao dessa via biossintetica, alm de fazer uma revisao bibliografica detalhada sobre os estudos e pesquisa ja realizados a esse tipo de regulao gnica, enfatizando a necessidade de estudos mais aprofundados sobre este assunto em gramineas, como na cana-de-acar, pois a maioria das pesquisas realizadas foram realizadas em Arapidopsiss sp, uma planta modelo. H relatos de que algumas regulaes e FTs, presentes e estudados em alguns organismos vegetais, agem de forma diferenciada em outras plantas, elucidando a importncia de se caracterizar a regulao em cada modelo vegetal a ser estudado.

3. MATERIAIS E MTODOS

Para o alcance do objetivo proposto, foi utilizado o metodo de reviso bibliografica, o que possiblitou analizar e aproveitar as pesquisas j concludas, de forma a se obter novas conclusoes sobre a importancia dos Fatores de Trasncriao na regulaao da via biossintetica de lgnina e apontar possveis alvos de pesquisas para serem analisadsos em modelos vegetais de importncia econmica, comoa cana deaucar. O levantamento bibliogrfico foi realizado atravs de buscas em um banco de dados internacional (Pubmed www.ncbi.nlm.gov/pubmed), utilizando as seguintes palavras chave: lignin pathway, transcription factors, lignocellulosic ethanol and second generation ethanol. De forma complementar, foi realizada uma busca tambm por essas informaes utilizando como base o livro Advances in Botanical Research, LIGNINS: BIOSYNTHESIS, BIODEGRADATION AND BIOENGINEERING. A literatura encontrada e utilizada na confeco deste TCCfoi disponibilizada nas referencias, em ordem alfabtica.

4. RESULTADOS E DISCUSSO

4.1 A BIOSSINTESE DA LIGNINA

A quantidade e a composio de lignina depositada nas paredes celulares, difere, dependendo do tipo de parede celular (J.P. Joseleau 2004). As paredes celulares geralmente so classificadas em dois tipos principais: paredes primrias e paredes secundrias. As paredes primrias surgem durante a citocinese e modificada durante a expansoda clula. J as paredes secundrias so estabelecidas aps o trmino daexpanso celular. As paredes celulares das plantas so responsveis diretas por formarem tecidos tais como: parnquima, colnquima eesclernquima. O Parnquima e as clulas do colnquima tm apenas paredes primrias, enquanto que o esclernquima contm tanto a parede primria e secundria. Paredes celulares em parnquima normalmente so finas e uniformes, mas sua composio pode variar drasticamente entre diferentes clulas do parnquima. (Mitsuda N, 2005) . A lignina predominantemente presente nas paredes celulares secundrias das clulas que formam tecidos, tais como: esclernquima e xilema (Boudet, 1998).

Figura 1-Heterogeneidade das paredes celulare em diferentes tipos de tecidos. (a) Corte transversal de uma raiz de Smilax mostrando o arranjo ordenado de vrios tipos de clulas com diversas arquiteturas na parede. Observe a deposio irregular de lignificados nas paredes secundrias (vermelho manchado) na endoderme. (b) corte transversal do caule de Sambucusmostrando colnquima lamelar com espessamento da parede adicional (verde manchado; setas) desigualmente colocado ao redor das clulas. (c) corte transversal de um tronco de linho mostrando fibras do floema (verde manchado) com paredes extremamente grossas devido falta de lignina. Note-se a colorao com vermelho de lignina

nas paredes das clulas do xilema. (d) Corte transversal de uma pea de madeira de Quercus mostrando fibras e vasos. Os cortes foram corados com safranina e verde. Paredes lignificadas foram manchadas de vermelho. ep epiderme,, co, crtex; en, endoderme; lc, colnquima lamelar; mx, metaxilema; pf, floema fibras; px, protoxilema; rp, raio parnquima; sc, esclernquima; ve navio,; xf, xylary fibra; xy, xilema.Figura retirada de: Zhong and Ye. 2007.

Como descrito acima, a quantidade e a composio da parede celular podem variar entre os tipos de clulas. Assim, os genes envolvidos na biossntese da parede celular so compostos por diferentes componentes e so expressos de forma coordenada e especfica em cada tipo celular. Pouco se sabe dos mecanismos moleculares que regulam a expresso dos genes envolvidos na biossntese da celulose, hemicelulose, e pectina durante a formao da parede primria. No entanto, foram descobertos, atraves de pesquisas recentes, os processos e os elementos envolvidos na regulao da formao da parede secundria e seus componentes. (Zhong et al., 2007) A parede celular secundria altamente lignificada, e enriquecida em subunidades S ao gerar fibras, originando a chamada lignina no condensada. Logo aps enriquecida em subunidades G ao gerar o xilema, chamada de condensada. Alm disso, a porcentagem do polimero final H de lignina em gramineas um pouco maior do que em outras plantas monocotiledneas ou dicotiledneas, (J.P. Joseleau, 2004). Tambm, a biossntese de lignina compartilha enzimas e mecanismos de regulao com outras duas vias tambm pertencentes ao metabolismo de compostos secundrios como a via do chiquimato e a via dos fenilpropanides. A via metablica da lignina e as enzimas envolvidas na sua sntese vm sendo caracterizadas nos ltimos anos. Uma srie de genes que codificam diferentes enzimas envolvidas em sua biossntese foi identificada em diferentes espcies de plantas, porem pouco se sabe sobre a regulao destes genes. Como citado acima, a biossntese de lignina est acoplada ao metabolismo dos fenilpropanides, apresentando enzimas compartilhadas entre essas duas vias, tais como fenilalanina amnio liase (PAL), cinnamato 4-hidroxilase (C4H) e cido cafico O-metiltransferase (COMT). Entretanto, a via de lignina tambm possui enzimas especficas como: cinamoil-CoA redutase (CCR) e cinamil lcool desidrogenasse (CAD) (Schoch G. et al, 2001). A CCR e a CAD so responsveis pelos ltimos passos de converso do aminocido fenilalanina nas subunidades S, G e H. A primeira enzima responsvel por catalisar a reduo das ligaes tioesters, e as CADs convertem os

hidroxinamaldeidos nos hidroxinamilalcoois, que so os monolignis, encerrando assim o ultimo passo da via. (Bomati & Noel, 2005).

Figura 2 -Via de biossntese defenilpropanide. Ramocomum: PAL, fenilalanina amnia-liase; C4H, cinamato4-hidroxilase; 4CL, 4-cumarato-CoA-ligase. Oramobiossintticamonolignol: A CCR, cinamoiloCoA redutase, CAD,cinamillcool desidrogenase; HCT,hydroxycinnamoyl-CoA chiquimato/quinatohydroxycinnamoyltransferase; C3H, 4-coumarato-3-hidroxilase; cidocafeicoCOMTometiltransferase; CCoAOMT, cafeoil-CoA o-metiltransferase; F5H, cido ferlico-5-hidroxilase. Oflavonidesramobiossinttica: CHS,chalconasintase; CHI,chalconaisomerase; F3H, flavanona3hidroxilase; F3H,flavonides3-hidroxilase;FLS,sintaseflavonol.As enzimasmostradasjunto setaseparampassosmetablicos.Setastracejadasreferem-se avrios passosno especificadosdeuma via metablica Enzimas emazulse referem agenespara os quaisum reguladortranscricionaltem sidodescritosin vivo.POLrefere-se polimerizao oxidativamediadaporperoxidasese enzimas. Cadeias Marrons e verdes na forma de hexgonoreferem-se celuloseepolissacridos, arabinoxilano, respectivamente. Os smbolos Freferem-se aligaesferulatogeradosentre as diferentesunidades (glucurono) arabinoxilano.Figura retirada de Gray et al 2012.

O que instiga a curiosidade elucidar quem e o que determina o inicio a cadeia de reaes presentes na via biosinttica da parede secundaria. Estudos recentes revelaram que Fatores de Trancriao (FTs) da familia NAC e MYB so chaves fundamentais na regulao da biossintese da parede celular secundria. (Zhong et al, 2007) A descoberta de reguladores da transcrio (FTs), capazes de controlarem a biossntese da lignina, fornece a oportunidade da descoberta de novas ferramentas para a modificaao e melhor entedimento dessa via, com base nas necessidades que se apresentem ao longo do desenvovimento academico, humano e industrial. Foram indetificados certo nmero de Fts que so, preferencialmente, expressosno desenvolvimento da parede secundaria eforam propostospara regular a via biossintetica da lignina na atividade cambial (Karpinska, B. , 2004)

4.2 Fatores de Transcrio

Fatores de transcrio (FTs) correspondem a uma classe de protenas que interagem com DNA. Eles podem associar-se a outros fatores regulatrios, a fim de impedir o acesso de uma RNA polimerase ao seu respectivo DNA alvo. Os FTs so considerados o maior ponto de controle na regulao de diversos processos biolgicos (Rushton et al., 2008), so geralmente encontrados trabalhando em conjuntos, formando mltiplas interaes (homo ou hetero dmeros) que permitem diferentes graus de controle sobre as taxas de transcrio.Existe uma regio promotora a montante do gene, ou regies potenciadoras a jusante a partir do gene, com motivos especficos que so reconhecidos pelos vrios tipos de FT. (Bourguet W. et al, 2000) FTs podem associar-se a outros fatores regulatrios, a fim de impedir o acesso de uma RNA polimerase ao seu respectivo DNA alvo. (Rushton et al., 2008) Muitos dos genes que codificam as enzimas do metabolismo fenilpropanide, tais como PAL, (C4H), (4CL), e as enzimas envolvidas na sntese dos precursores de lignina, tais como (COMT) e (CAD),.possuem motivos conservados dentro de seus promotores que se modelam de uma forma que os FTsda famlia MYB reconheam esses motivos(Ye et al, 1995)e num nmero de casos, estes motivos tem sido demonstrado serem envolvidos funcionalmente no controle da expresso dos genes

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presentes na via dos fenilpropanides. (Sablowski et al, 1994). Apesar da aparente complexidade da via que leva biossntese delignina, a regulao da transcrio de genes envolvidos nesta via metablica mediado por um subconjunto bastante limitado de motivos cis-acting, que so sequncias de DNA na proximidades da parte estrutural dogene necessrias para aexpresso dos mesmos.

4.3FATORES DE TRANSCRIO DA FAMLIA NACs

O procmbiose inicia com quatro clulas centraisdurantea embriognese, estas ento se tornam clulasprocambial, um processo que tambm ocorrena formao das nervuras nsa folhas,em seguida,estas clulaspodemdiferenciar-se em xilema efloema, os FTs NACs, desempenham um papelimportanteno incio nadiferenciao positiva doxilema. Analises de bioinformatica indentificaram vrios outros FTs NACs, suscetveis no envolvimentona regulao do metabolismo daparede celular secundria (Yamaguchi M. et al 2008).Em particular,VND6, VND7( dominios NAC relacionados ao sistema vascular 6 e7),NST1 e NST2( Fator NAC relacionado a promoao espessamento da paredesecundria), e NST3/SND1(Dominio NAC associada ligam a primeira cascata de deFtsR2R3-MYB do a

proteina 1 relacionada com a parede secundaria) funcionam como interruptores que transcrioque regulama expresso deduas camadas quepor sua vezregulam genes metabolicos daligninaassim como

genes da biossintese de celulose [Hatfield R, Vermerris W. [2001].

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Figura 3-Modeloatual da redetranscricionalda biossnteseda parede celularsecundriaem Arabidopsis.NST1/2/3eMYB46/MYB83podem ativartoda a biosntese da paredecelularsecundria.F5H regulada porNST3/snd1, ao passo de que outrosgenesda via biossintetica de ligninaso regulados porMYB58/63/85atravs do elementoAC.MYB4 sao ativados porferimento, luz e sacarose, sofrendo autoregulaao.Auxinainduz expressao deMYB32, masreprimeBP.As setas indicam ativao eas barraslinear-finais indicaminibio

Estudos recentes sobre aregulao da transcrioda biossintese da parede secundariaemArabidopsis, revelaram que aregulao da transcrioda biossntese delignina est sob o controlede uma rede de fatores que ativam a viabiossintticada parede secundria.Nesta rede, o domnio dos FTs NAC,snd1e seus homlogosprximos, NST1, NST2, VND6eVND7, agem como chaves que levam ativao dosgenesbiossintticos de celulose,xilana elignina. (Sassi JF, 2000). Experiencias em Arapidopsis, envolvendo a supressao simultneadesnd1eNST1bloqueia completamenteespessamento da parede secundaria ea deposio de ligninanas fibras, (Zhong R,et al 2006) comprovando quea biossntese dalignina, juntamente com outros componentes da parede secundaria como a celuloseexilanoestao sob o controletranscricional dos mesmoscontroladores, os FTssnd1eNST1, evidenciando que osnd1 e seus homlogosregulamuma srie de FTs, envolvidosna biossntese daparede secundaria,alguns membros da famila NAC(NAM, ATAF1/ 2 eCUC2)so tambem conhecidoscomo chavesmestras dedesenvolvimentoda parede celular secundaria.Sao compostos por(NST1, 2, 3/snd1)especficospara as fibras, eo (VND1, 2, 3, 4, 5,6, 7)especfico paravasosvasculares(Yamaguchietal, 2008,

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2010).Os NST1 eNST2, so capzes de induzirem oespessamentos ectopico da parede secundria em vrios tecidos quando superexpressos(Mitsuda et al., 2005). Cada vez mais provasquesugerem os FtsNACs atuam na regulaao da trancriao da via biossintetica dos componentes da parede secundaria, seja ela positiva ou negativa. Um exemplo deregulaode a feedback cujos positivo, genesso as protenasde emvasos 2008). etal., domnioLBD18/ASL20LBD30/ASL19, imaturos,aumentando regulaao expressos

porVND6eVND7(Soyano

Recentemente,foram descobertos LBD18eLBD30 que mostraram seremalvos diretos doVND7(Yamaguchi etal., 2011)

FIGURA 4-Fluxograma da complexaregulaao que os FTsNACs iniciam de uma forma geral. (A) o modelo simplificado mostrando funes do dominio do FT NAC. (B) O FT NAC snd1 sob auto regulaao positiva e regulao negativa por seus jusante FTs MYB. Figura retirada de Wang & Dixon 2012.

OsNACstambm esto sob-regulao por feedbacknegativo, usando oAtMYB32, que um regulador negativo relacionado comAtMYB4, que por sua vez ativado porAtMYB46(Ko etal., 2009) Os ensaios de trans-ativaao in vivo, indentificaram atraves de estudos em transgenicos uso, que oAtMYB32 um alvo direto do sdn1, mostrando tambem que a expressao do snd1 negativamente regulada peloAtMYB32 (Wang etal. 2011)

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4.4 FATORES DE TRANCRIODA FAMILIA MYB

Em plantas superiores, extensa a famlia de genes que codificam FTs MYB (Martin e Paz-Ares, 1997), e as funes da maioria desses membros no so conhecidas. No entanto, diversos estudos vm sendo realizados, mostrando que o envolvimento dos FTs MYB, podem se estender alm do controle do metabolismo de flavonides e incluir outros ramos do metabolismo de fenilpropanidesinclusive, a lignina. OsAmmyb305 e Ammyb340 foram as primeiras protenas a serem caracterizadas nas flores de Antirrhinum (Jackson et ai., 1991), elas so capazes de trans-ativar os genes que codificam fenilalanina amnia-liase (PAL) no tabaco e controlam os principais passos do metabolismo do fenilpropanide em flores de Antirrhinum, assim como os passos posteriores envolvidos no metabolismo flavonoides (Tamagnone L, ET AL 1998) A sobreexpresso das protenas MYB,encontradas em Antirrhinum, no tabaco transgnico levou a reduo na expresso de diversos genes de biossntese de lignina ocasinando a diminuiao no teor da mesma, sugerindo que os MYBs de Antirrhinum so capazes de regular a expresso de genes da biossntese de lignina afetando assim a produaoda mesma. Desde ento, vrios MYBs de Arabidopsis tm sido mostrados para alterar a expresso de genes biossintticos de fenilpropanide e biossntese de lignina.(Zhong et al 2009). Os MYB46,MYB83 deArabidopsis(Fig.1A),so alvos diretos do grupo de FTs, da familia NAC (Snd1, NST1, NST2, VND6eVND7), que por sua vez, regulam outros MYBs como MYB 58, MYB63 e o MYB 65, estes, se ligam a elementos AC, formando assim uma rede de ligaoes e regulaoes, que por fim, regulam toda a via da lignina, (Zhouetal.2009).Entre os poucos Fts que foram bem estudados e caracterizados, se destacam os MYBs de pinheiro (PtMYB1, PtMYB4 e PtMYB8) e o de eucalipto (EgMYB2). EstesMYBs, vem sendo utilizados para promoverem a deposio ectpica de lignina ou alteraao do metabolismo de fenilpropanides, quando sao sobrexpresso em tabaco ( Bomal et al. 2008). Tudo graas a sua capacidade para se ligar aos elementos AC, que so comumente presentes nos genes promotores da biossntese de lignina. Sendo grandes candidatos a pesquisas que envolvem a regulaao da via biossintetica damesma.(Mitsudaet al. 2007, Zhong et al. 2007)

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OPtMYB1,PtMYB426, elementosACinduzem desenvolvimento, eEgMYB2, disso, quando de a quesofre

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e dos

oEgMYB228 genes da

ao parede

se

ligaremaos em de

expressao

secundaria

oespessamentopromovendo a expresso

abiossntese dealguns

lignina.Estudos, realizados em plantas de tabaco confirmaram que os FTsPtMYB4 sobrexpressos,induzem genesde biossntesede lignina levando a um maior espessamento da paredesecundria.Alm amadeira pinhoeassociadoPtMYB1PtMYB8tambm Arabidopsis, cuja causoudeposio diferenciada de ligninae espessamento da paredequandosobrexpresso.PtMYB8 um homlogoprximodoMYB61em sobreexpressopode causardeposiodiferenciadade lignina, mas as suas verdadeiras funescontinuam a serestudadas.Concluiu-se queestesMYBsde pinheiro e eucaliptoesto envolvidos na regulaoda biossntese deligninadurante a formao demadeira(Zong et al 2007).

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Figura 5 -Superexpresso doPtrMYB3(PtrMYB3-OE) ou PtrMYB20(PtrMYB20-OE) nos resultados de Arabidopsisna deposioectpicadelignina(A-F), celulose(G-I) exilano de(J-L) nas paredes dasclulas da epiderme (setas)de folha com 4 semanas de idade, emmudastransgnicascomparadocom o tipo selvagem. Lignina, celuloseexilanoforam examinados usandoUVe autofluorescncia, Calcofluor decoloraobrancae imunocoloraocom o anticorpoLM10xilana, respectivamente(R. L. McCarthy et al.)

Examinando as folhas na figura acima (Fig. 2A-F), revelou-se a deposio ectpica de lignina nas paredes da epiderme das clulas das mudas trangenicas, nestas superexpressadas, quando comparado com o tipo selvagem, evidenciando o fato deque as paredes lignificadas destas clulas epidrmicas ficaramsignificantemente mais espessas do queas paredes nolignificadas. Uma analise paralela mostra

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que,diferentes componentes da parede celular secundaria como acelulose e xilano, tambemforam depositados de forma ectopica nas paredes dessas celulas (Fig. 4). Da mesma forma, ocorre a deposio ectpica decelulose, a xilana e lignina, observadasnas paredescorticais das celulas ou na medula de celulas nos caules quandoPtrMYB3 e PtrMYB20 sao superexpressados (Fig. 6 A-I). Estes resultados evidnciam quePtrMYB3 e PtrMYB20 so capazes de ativar as vias de biossntese de todos os trsprincipais componentes de paredes secundrias

Figura6 -(A-I) a deposioectpicadelignina, celulose exilanonas paredes dasclulas corticaisoumedula das celulas nos caules(setas) quandoPtrMYB3ePtrMYB20 saosuperexpressados comparadocom o tipo selvagem. Co = crtex, se = fibrainterfascicular; xy=xilema ;pi=medula..(J)A deteco de que osPtrMYB3ePtrMYB20transcritos notransgnicamyb46myb83mutante duplo. (K)mostra a diminuiao d crescimento (seta =ampliao de myb46myb83)e odefeito da parede do vaso(ponta de seta)o espessamento da parede pelosmyb46myb83foram complementadospela expresso dePtrMYB3ouPtrMYB20. As veias(ve) de folhasmanchadas comfloroglucinol-HCl foram exibidasabaixo das

17 plantascorrespondentes.(L-O)Anlisede trans-ativaoem protoplastosde Arabidopsismostrou quePtrMYB3ePtrMYB20 foram capazes deativar os genespromotores das viasbiossintticadecelulose (PtrCesA8), xilano (PtrGT43B) e lignina (PtrCCoAOMT1) pf= fibra de floema, sx= xilema secundario. Imagem retirada de McCarthy , et al2010.

A superexpresso doEgMYB2em protoplastosde Arabidopsisfoicapaz deativara expresso dosgenesde biossntese decelulose, e lignina, mostrando queEgMYB2e tambmPtMYB4soortlogosdeMYB46 de Arapidopsis,capazes de regularem outros Fts da familia MYB, segundo assim a rede de regulaoes que formam via biossinttica da ligninadurante a formaoda parede secundria.(Zhonget al 2009).Plantas Transgnicasde tabacocom superexpressoEgMYB2,apresentaramum notavel aumentoda espessura da parede secundaria e alteraonos perfisde lignina(aumento darelao S /G).Porem as anlises detranscrio degenesfenilpropanidesnessas plantasno revelarammudanas significativas no aumentotranscrio degenesenvolvidos na via geral dos fenilpropanides(PAL,C4H), mas revelouum aumento significativo naexpressodegenesconhecido por estar envolvidona porodos monolignois especficodessa via. Isso evindecia queos genes, envolvidos com a codificaao de CCR e CAD,foram aumentados cerca queosgenesenvolvidosnas .(Zhou da etal., 2009).A decinco vezesa sua regulaao,enquanto 40vezessuperxpressos. viasdiferenciaisaos hiptese de de ligninafoi

monmerosmonolignolque a codificaoC3H,F5H, CCoAOMTe COMTforam at queAtMYB58eAtMYB63soativadores transcriodebiossntese

posteriormenteapoiada pelasdescobertas de queelesse ligamaos elementosACe diretamenteativama expresso dosgenesde biossntesede lignina.(Zhouetal., 2009).

4.5Elementos AC
Elementos ricos em AC (adenosina e citosina) foram identificados como sendo de extrema importncia para a regulao dos genes que participam da biossntese dos fenilpropanides e flavonoides, tambm se destacam na expresso de genes que regulam a lignina (Sivadon e Grima-Pettenati, 2004). Essa descoberta levou a um grande avano na compreenso de comoa via biossntetica de lignina coordenadamenteregulada. Anlise de bioinformtica dos promotores da biossintese de

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lignina em Arabidopsis levou a constataao da presena dos ElementosAC na maioria dos estudos realizados (Raes J,et al2003.) Os elementosACesto localizados em motivos conservadosque esto presentesnos promotoresde genes que codificam as enzimasda via dofenilpropanide. Os elementos AC presentes na regio promotora dos genes que participam da biossintsede lignina,auxiliam noaumento de sua expressono xilemae, ao mesmo tempo, para impedir a suaexpressoem tecidos perifricos (Pedro e Neale, 2004). Tambm foram realizadas anlises funcionais dos promotores da PAL e genes da 4CL, revelando sua organizao modular, o que levou a identificao dos elementos AC como sendo de extrema importncia para assegurar a expresso coordenada da parede secundria em xilema (tecido altamente lignificado). Mutaes de ambos os elementosAC-I (ACCTACC) ou AC-II (ACCAACC) resultou na diminuio da expresso do xilema associadaa um aumento na expressao do floema, e mutaoes de elementos AC-III (ACCTAAC) causou uma ligeira diminuio da expressao do xilema. Concluiu-se que a atividade combinada dos elementos AC determinaa especificidade da expressao do xilema. (Zhou et al., 2009) Os elementos AC, foram primeiro identificados no promotor PAL1 de salsa .A hiptese de que os elementos ricos em AC so necessrias para dirigir a expresso especfica do xilema foi apoiada pela descoberta do AC-II ligado ao viirus mosaico da couve-flor, sendo capaz de conduzir a expresso especfica do gene reprter GUS no xilema. (Zhao et al 2011). A presena dos elementos AC foi observado para a maioria dos genes que participam do expessamento da parede celular, porem existem excees, como os promotores da C4H, F5H e COMT, que aparentemente nao possuem os elementos AC. Estudos mostraram que a C4H e a COMT possuem substancias que degradem os elementos AC, o que impede que eles apaream nas analizes de bioinformatica, interferido assim nos resultados. (Zhou et al.,2009). Estudos e pesquisas realizadas, que elucidaram a importancia dos elementos ricos em AC na regulalao da expresso de genes, levaram a um avanona compreenso de como a biossntese de lignina regulada. Como consequencia, grandes investimentos tm sido realizados na caracterizao de FTs que se ligam a esses elementos ricos emAC (Seguin et al., (1997) Sequencias rica em AC so conhecidas por serem supostos alvos para Fatores de transcrio (FTs) pertencentes famlia MYB. A famlia dos MYB uma das classes

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mais

abundantes

desses

FTs

em

plantas

(Dubos

et

al,

2010).

O MYB305 (Antirrhinum),foi descoberto, sendo capaz de se ligar a elementos AC e ativar a expresso do promotor PAL2, por isso, foi fundamentado que fatores de transcrio que se ligam aos elementos de AC em genes biossintticos de lignina so tambm protenas MYB. A primeira linha de evidncia gentica sobre o possvel envolvimento de MYBs na regulao da biossntese de lignina veio do estudo de duas protenas MYB, AmMYB308 AmMYB330 e, a partir de Antirrhinum (Zhong et al 2009)

4.6 DESCOBERTA DE UM NOVO FATOR DE TRANSCRIAO: SHINE

Diversos fatores de transcrio (FTs) foramdemonstrados ao longo desse trabalho, responsaveis por afetarem a biossintese de componentes da parede celular como a celulose e lignina.(Zhonget al, 2006;. Zhong e Ye, 2009). A regulaao transcricional alcanada pelos FTs de nvel superior NAC (Snd1,NST1 / 2, VND6 / 7) que ativam um nexo de FTs intermedirios, principalmente MYBs. Estes FTs intermedirios, por sua vez ativam FTsMYBs que estao um nivela baixo que se ligam a elementos AC, ativando a via biossinttica de paredecelular, atingindo assim altos nveis de especificidade, essa complexa rede mostra, a possibilidade da existncia de vrios outros interruptores que podem ser ajustados,afim tambem, de executar regulaao especfica de diferentes vias da produao de parede celuar. (Jakob et al.,2009). O indutor SHINE /WAX (cera), (SHN /WIN), emArabidopsis, FT pertencente familia AP2 /ERF, foi anteriormente mostrado por ser envolvido com a produao de cera naregulao lipdica e tolerncia seca emArabidopsis (Broun et al, 2004.;Kannangara et al., 2007). Estudos descrevem a descoberta de uma profunda ligaao entre SHN e a regulaao da ligninae celulose, pelas vias de biossntese de parede clular secundaria, levando a uma diminuiao da biossntese de ligninae o aumento da regulao da celulose,alem da regulaao da trancriao deoutros genes da via biossntetica de parede celular.(Karaba, 2007).

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Gentipos de arroz que expressam o gene SHN2 em Arabidopsis, foram chamados de AtSHN. Anlises de expresso gnica das linhagens de arroz utilizando AtSHN revelou uma regulao coordenada de genes participantes da biossntese da parede celular secundaria, com um aumento diferenciado da regulao da celulose. (Karaba, 2007) Alm disso,foi mostrado que a expressodeumAtSHNdo arroz ( Oryza sativa)causa um aumentode 34%emcelulose, e uma reduo de 45% no conteudo delignina .Usando umaanlise de sistemasnveldetalhado deexpresso gnicaglobal em arroz,os autores propuseram eVND6), e queSHN/ reprimem WINreprime os Fts NAC 9SND1/NST1/NST2 chavesprincipais (NAC) diretamenteAtMYB58eAtMYB63 FTs (MYBs) especficospara

eativamAtMYB20eAtMYB43. Devido a estastrs atividades, SHNpode ignoraras seletivamenteregular genesbiossintticos de lignina eoutros componentes, como a celulose na parede celular secundaria(Ambavaram etal., 2011).)

Figura 7 -Modelo hipottico deregulao da transcrioda bissintese de componentes da parede celular biossnteseem arroz.Setastracejadas sohiptese deinteraes baseada nacoexpressode redee as alteraesde expresso de genes. Setas espessasrepresentam a interaodoSHNcom as regiesa montante dos FTs.Mostrando tambem a regulaao exercida sobre os NACs,principais chaves na regulaao dosMYBceMYBlrepresentam a hiptese de serespecfico para genes da celulose de parede celular egeneslignina, respectivamente.Figura retirada de (Ambavaram etal., 201).

21

Ensaios realizados na modificaaodaligninae celulose, em cortes transversais decaulesde arroz dotipo selvagemeLinhagens de arrozAtSHNforam histoquimicamentecoradas comfloroglucinol e soluoes decalcofluor.Floroglucinol reage comgruposconiferaldedoemlignina, a intensidade da cor reflete aproximadamente ototal de lignina, enquantooutros componentes da parede celular, como acelulose, mostramcoloraode fluorescncia comcalcoflor. A cor evidencia diferenaas, na deposiao desses componentes, entre o tipo selvagem (Fig. 8,A [esquerda], B e D) eSHN(Fig. 8,A [direita], C e E), indicando uma diminuio aparente naquantidadede ligninaeumaumento nvel de celuloseem plantasSHN. Anlise de microscopiaeletrnica demonstrou queaslinhas de arrozAtSHNtambm mostroufortementeespessada paredes das clulas(Fig.8 Gesclerenquimticas) eumaespessada a estrutura da paredecelularcruzados(Fig. 8,IeJ), em comparao com a dotipo selvagem(Fig. 8,FeH).Estes As anlisesem conjuntosugeremum espessamentosecundrio paredes devido deposio deceluloseemlugar de ligninaem linhas deSHN.

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Figura 8-Caracterizao fenotpicadearroz: cortes de caule de arroz, TIPO SELVAGEM (A [esquerda], B e D) eSHN(Fig. 3,A [direita], C e evidenciando a deposiao de lignina e celulose nas paredes celulares. Os cortesforam visualizados pormicroscopia de luz(A, 53 ampliao; BeC, 203 de ampliao). De A C foi colorido com Floroglucinol , D e E com soluoes de calcoflorLignina em tecido epidrmico(ep) e tecidovascular(v) so significativamente reduzidosem linhasSHN. Corte do caule da especie selvagem(D)e a SHN(E) ,mostra oaumento

23 deceluloseemparedes celulares deesclernquima(sc)efeixes vasculares(v) em Linhagemde SHN. F eG,microscopia eletrnica de varredura das secestransversais de caule dotipo selvagem(F)e em linhagens de SHN(G). Ha J,eletrnica de transmisso Micrografiasdetipo selvagem(H)e em linhagens deSHN(I eJ) parede celular do parnquima. As setas mostram aespessura dobrada dasparedes . Barras= 200 mmemA, 40 mm deBeC, 50mm deDe E,de 10 mm deFe G,e 4 mm deHparaJ Figura retirada de. Ambavaram etal., 2011).

A mudana da concentrao de celulose e lignina, no afetam de forma negativa linhagem de AtSHN arroz, medida a forma fenotpica da continua normalmente, assim como a maturidade e a produo de sementes em condies de estufa . Alm disso, a fora do caule destas linhagens de arroz AtSHN no sofreu alteraes. O aumento da celulose no nas paredes secundrias da linhagem SHN, provvel mente acontece de forma compensatria, pela reduo da lignina. (Dhugga, 2007). Expresso deSHNcordena a regulaodasvrias etapasnas vias de biossintese dos monolignoisecelulose. Levou a uma represso moderada da via delignina, essa reduo moderadaem nveis de expresso,indica quea expresso do gene nocompletamente desligado, mas sim permitindoum fluxode fundo atravs da via. Alm disso, represso dos genes 4CL e CAD que catalisam ramos especficos da biossintese de lignina,sugerepossveis alteraesna composiode lignina juntamente comuma reduo total da mesmaem resposta aexpressao do SHN.

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5.CONCLUSO

Durante a ltima dcada, grandes descobertas vm sendo descritas, rumo a uma melhorcompreenso de como regulada a transcrioda biossintese de lignina. Foram identificados e caracterizados muitos reguladores transcricionaisa partir de diferentesgenes de espcies distintas.Tambem foi estudado e muito aceito os elementos ricos em AC, envolvidos tambem naregulao da expresso do gene da lignina. Estudos recentes sobrea sntese da parede celular secundria em Arabidopsis.revelou que a produo de lignina coordenadamente regulada, com o mesmo grupo de FTs (NACs) juntamente com os dois outros componentes principais da da parede celular secundaria, a celulose e xilano. A identificao de chamada"chaves mestras",que ativam toda a formao da parede secundriaparede, tem proporcionado um bom ponto de partida para novos estudos sobre a regulaao da biossintese de lignina.

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Nome do Gene AmMYB308 AmMYB330 AtMYB4 AtMYB32 EgMYB1 ZmMYB31 ZmMYB42 PttMYB21a AtSHN AtMYB46 AtMYB83 AtMYB58/63 AtMYB85 AtMYB61 PtMYB1 PtMYB4 PtMYB8 EgMYB2 PtrMYB3 PtrMYB20 AtNST1/NST3 AtNST2 AtMYB26

Espcie Antitthinum majus Antitthinum majus Arabidopsis thaliana Arabidopsis thaliana Eucalyptus gunnii Zea mays Zea mays Populus tremula Arabidopsis thaliana Arabidopsis thaliana Arabidopsis thaliana Arabidopsis thaliana Arabidopsis thaliana Arabidopsis thaliana Pinus taeda Pinus taeda Pinus taeda Eucalyptus gunnii Populus tremula Populus tremula Arabidopsis thaliana Arabidopsis thaliana Arabidopsis thaliana

Ortlogo em Arapidopisis AtMYB4 AtMYB4

Funo Repressor Repressor Repressor Repressor Repressor Repressor Repressor

AtMYB52

Repressor Repressor Ativador Ativador Ativador Ativador Ativador

AtMYB85 AtMYB46 AtMYB46 AtMYB46 AtMYB46 AtMYB46

Ativador Ativador Ativador Ativador Ativador Ativador Ativador Ativador Ativador

Figura 9 -Funao dos Fatores de transcrio nas redes reguladoras da biossntese de lignina modificada de Zhao Q. and Dixon 2011,

At o momento, a maioria dos dados com relao regulao da sntese de lignina, foi obtida em Arabidopsis. Entretanto, recentemente foi mostrado por Shen et al. (2012) que dados obtidos anteriormente em Arabidopsis (dicotilednea) no se repetiram em Panicum virgatum (switch Grass). Foi mostrado que PvMYB4, um FT Ortlogo a AtMYB4 e ZmMYB31, quando superexpresso tanto em switch Grass como em tabaco ambos tiveram diminuio na quantidade final de lignina. Contudo, foram mostradas diferenas com relao composio de monolignis nestas duas plantas transgnicas mostrando que essa regulao possa ser feita de maneira especfica

dentro de cada espcie (Shen et al., 2012). Essa necessidade de se validar FT e respectivos alvos tambm foi recentemente revisado por Gray et al. (2012). Assim, apesar deste rascunho bem avanado, sobre a regulao da biossntese de lignina, obtido em Arabidopsis, faz-se necessria validao destes FTs em outros organismos vegetais e principalmente em cana-de-acar, um modelo interessante de estudo principalmente pelo destaque internacional desta cultura na gerao de biocombustvel e alto potencial para a produo de etanol de segunda-gerao, ou etanol celulsico. Com intuito de validar esses FTs em cana de acar, Esta sendo realizado atravs do Instituto Agronmico de Campinas (IAC), Pelo Dr. Michael Santos Brito,26 sobre a superviso do Dr. Paulo Mazafera, a identificao e validao de FTs de Transcrio envolvidos com a via de biossntese de lignina em acarPROJETO INSERIDO NO PROJETOTEMTICO 08/58035-6 BIOEN. Este ser o primeiro trabalho a mostrar uma viso geral de diferentes FTs e como estes se comportam na regulao da sntese de lignina em gentipos contrastantes para o contedo deste polmero.Assim, faz-se necessrio a continuao deste projeto, bem como, a contribuio com outros grupos de pesquisas como o do Dr. Erich Grotewold, para um avano no que tange ao conhecimento da regulao da sntese de lignina e como podemos manipular geneticamente esta sntese afim de modificar e/ou alterar a lignina sem afetar o desenvolvimento da planta. cana-de-

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