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ENGENHARIA GENTICA
Manual
de
apoio
s
Prticas
Laboratoriais
2012-2013
Carlos Sinogas
www.ensino.uevora.pt/biotec
www.ensino.uevora.pt/engen
NDICE
PROCEDIMENTOS
DE
SEGURANA
.................................................................................................................................................................
3
Vesturio
e
comportamentos
...................................................................................................................................................................
3
Riscos
fsicos
....................................................................................................................................................................................................
4
Riscos
qumicos
..............................................................................................................................................................................................
4
Riscos
biolgicos
............................................................................................................................................................................................
5
Planeamento
....................................................................................................................................................................................................
5
Procedimentos
gerais
..................................................................................................................................................................................
5
REGISTOS
E
RELATRIOS
....................................................................................................................................................................................
6
TCNICAS
LABORATORIAIS
BSICAS
EM
MICROBIOLOGIA
................................................................................................................
7
Meios
de
cultura
.............................................................................................................................................................................................
7
Esterilizao
....................................................................................................................................................................................................
8
Tubos
de
cultura
e
Placas
de
Petri
.........................................................................................................................................................
8
Instrumentos
para
transferncia
de
culturas
...................................................................................................................................
8
Cmaras
de
cultura
.......................................................................................................................................................................................
9
Frigorfico
.........................................................................................................................................................................................................
9
MTODOS
DE
ESTERILIZAO
.......................................................................................................................................................................
10
Esterilizao
pelo
calor
............................................................................................................................................................................
10
Esterilizao
por
gases
.............................................................................................................................................................................
11
Radiaes
.......................................................................................................................................................................................................
11
Filtrao
estril
...........................................................................................................................................................................................
11
Desinfectantes
e
antisspticos
..............................................................................................................................................................
12
PROTOCOLOS
EXPERIMENTAIS
.....................................................................................................................................................................
13
1.
PIPETAGENS,
SOLUES
E
DILUIES
.......................................................................................................................................
13
2.
CULTURA
DE
BACTRIA
RECOMBINANTE
(E.coli)
................................................................................................................
18
3.
PREPARAO
DE
DNA
PLASMDICO
-
Lise
Alcalina
..............................................................................................................
19
4.
PREPARAO
DE
DNA
PLASMDICO
-
MiniPrep
.....................................................................................................................
20
5.
DIGESTO
COM
ENZIMAS
DE
RESTRIO
.................................................................................................................................
21
6.
ANLISE
DE
DNAS
EM
GEL
DE
AGAROSE
..................................................................................................................................
22
7.
PREPARAO
DE
BACTRIAS
COMPETENTES
........................................................................................................................
23
8.
TRANSFORMAO
................................................................................................................................................................................
24
9.
ANLISE
DE
PROTENA
RECOMBINANTE
Induo
da
Expresso
...............................................................................
25
10.
ANLISE
DE
PROTENA
RECOMBINANTE
PAGE
..............................................................................................................
26
ANEXOS
.....................................................................................................................................................................................................................
28
Plasmdio
pCS11
.........................................................................................................................................................................................
28
Plasmdio
pCS62
.........................................................................................................................................................................................
29
Plasmdio
pCS71
.........................................................................................................................................................................................
30
Plasmdio
pCS84
.........................................................................................................................................................................................
31
Plasmdio
pSK+
...........................................................................................................................................................................................
32
Enzimas
de
Restrio
................................................................................................................................................................................
33
Tabela
Peridica
.........................................................................................................................................................................................
34
TRABALHO
AUTNOMO
....................................................................................................................................................................................
35
PROCEDIMENTOS
DE
SEGURANA
(Adaptado
de
Biotechnology
Explorations,
ASM
Press)
Ensinar
e
aprender
no
laboratrio
de
Biotecnologia
envolve
sempre
um
certo
nvel
de
risco
para
o
operador
e
companheiros.
Novos
equipamentos,
reagentes
e
materiais
biolgicos
so
parte
integrante
dos
trabalhos
experimentais
que
envolvem
cidos
nucleicos
e
protenas.
Os
estudantes
esto
a
aprender
novas
tcnicas,
usando
reagentes
e
materiais
biolgicos
e
novos
equipamentos
que
apresentam
algum
risco
no
contexto
da
sua
utilizao
laboratorial.
No
sendo
possvel
fazer
a
experimentao
sem
usar
os
equipamentos,
os
reagentes
e
o
material
biolgico,
espera-se
dos
estudantes
que
adoptem
as
atitudes
adequadas
para
minimizao
dos
riscos
associados.
Alerta
permanente,
um
conceito
importado
dos
pilotos
de
avio,
cria
o
enquadramento
para
a
manuteno
da
segurana
apropriada
face
aos
riscos
inerentes.
Tal
como
o
piloto
deve
estar
alerta
para
a
sua
envolvente,
com
constante
vigilncia
para
a
sua
segurana
e
a
dos
outros,
assim
os
estudantes
de
biotecnologia
devem
fazer
no
laboratrio.
O
piloto
tem
sempre
de
saber
onde
est,
para
onde
vai
e
como
l
chegar.
Traduzido
para
o
ambiente
laboratorial,
os
estudantes
devem
estar
concentrados
nas
tarefas
que
desenvolvem,
compreender
o
equipamento,
os
reagentes
e
os
materiais
biolgicos
que
usam,
devendo
seguir
os
passos
adequados
conduo
da
experincia.
Ao
mesmo
tempo
cada
estudante
deve
conhecer
o
que
os
seus
colegas
fazem
e
os
protocolos
que
seguem.
Neste
enquadramento
so
quatro
as
principais
questes
de
segurana
que
se
colocam:
Vesturio
e
comportamentos
Riscos
fsicos
Riscos
qumicos
Riscos
Biolgicos
Vesturio
e
comportamentos
Reduzir
ao
mnimo
os
pertences
pessoais
e
outros
materiais
na
bancada
de
trabalho.
Casacos,
sacos
e
outros
pertences
devero
ser
depositados
no
bengaleiro
entrada
do
laboratrio.
Uso
de
bata
obrigatrio
(Sempre),
para
evitar
sujar
ou
contaminar
a
roupa.
Cabelo,
quando
comprido,
devidamente
apanhado
para
evitar
a
sua
ignio
na
chama
ou
a
contaminao
qumica
ou
biolgica.
Sapatos
fechados
so
recomendados,
pois
os
abertos
no
protegem
de
eventuais
respingos
que
possam
cair.
Proteo
dos
olhos
e
pele
nua
aquando
da
utilizao
de
UV
Luvas
descartveis
so
exigveis
quando
se
manipulam
certos
reagentes
ou
microrganismos.
desaconselhado
o
uso
de
joias,
em
especial
anis
e
pulseiras
que
impedem
o
adequado
uso
das
luvas.
Comer,
beber,
mascar
pastilhas
elsticas,
aplicar
cosmticos
proibido
no
laboratrio,
para
que
eventuais
contaminaes
no
sejam
dirigidas
para
zonas
no
protegidas.
Roer
as
unhas,
lpis,
canetas
e
dedos
na
boca
igualmente
proibido,
pelas
mesmas
razes.
Os
estudantes
devem
conhecer
e
compreender
bem
o
trabalho
a
fazer.
Uma
boa
programao
meio
caminho
para
uma
boa
execuo.
O
docente
dever
ser
questionado
sempre
que
surjam
dvidas
sobre
os
procedimentos
a
seguir.
As
mos
devem
ser
sempre
lavadas
antes
de
iniciar
o
trabalho
e
depois
de
concluda
a
experimentao,
para
que
contaminantes
no
sejam
introduzidos
nem
transportados
para
fora
do
laboratrio.
As
bancadas
de
trabalho
devem
ser
sempre
limpas
e
sanitarizadas
com
lcool
antes
do
incio
do
trabalho
e
depois
deste
concludo.
No
se
conhece
o
que
outros
estudantes
possam
ter
deixado
no
laboratrio,
nem
se
pretende
deixar
contaminaes
para
quem
vier
a
seguir.
Riscos
fsicos
U
Fogo
Riscos
qumicos
Prestar
ateno
s
notas
dos
protocolos
sobre
os
riscos
associados
a
alguns
reagentes
e
seguir
as
instrues
do
docente.
Nunca
pipetar
boca.
Usar
pipetadores
mecnicos.
Os
restos
de
produtos
qumicos
no
devem
ser
rejeitados
para
o
esgoto.
Localizar
o
chuveiro
e
o
sistema
de
lavagem
de
olhos.
A
roupa
atingida
por
reagentes
qumicos
dever
ser
de
imediato
removida
e
a
pele
em
contacto
ser
abundantemente
lavada.
Riscos
biolgicos
Desinfectar
a
rea
de
trabalho
antes
e
depois
de
manipular
microrganismos.
Usar
lixvia
diluda
(10%
de
hipoclorito
de
sdio)
para
descontaminar
reas
e
instrumentos
eventualmente
contaminados.
Evitar
as
mos
na
boca
ou
nos
olhos.
Flamejar
cuidadosamente
instrumentos
e
tubos
para
evitar
a
formao
de
aerossis.
No
remover
microrganismos
do
laboratrio.
Tratar
todas
as
amostras
de
DNA,
plasmdeos
e
bactrias
como
material
contaminado.
Rejeitar
as
culturas
e
outro
material
contaminado
no
tabuleiro
para
autoclavar.
No
juntar
material
no
contaminado
no
tabuleiro
para
autoclavar.
No
rejeitar
no
lixo
comum
o
que
quer
que
seja
que
tenha
contactado
bactrias.
Se
bem
que
os
microrganismos
a
usar
na
experimentao
(E.
coli)
no
coloquem
riscos
biolgicos
particulares
deve
ter-se
sempre
em
mente
que
so
criadas
condies
de
crescimento
dos
mesmos.
O
risco
naturalmente
aumenta
com
a
quantidade
de
bactrias
e
outros
microrganismos,
eventualmente
patognicos,
podem
contaminar
as
culturas
e
ser
amplificados.
Planeamento
No
iniciar
qualquer
experincia
sem
o
conveniente
planeamento.
O
conhecimento
e
compreenso
prvios
dos
procedimentos
experimentais,
grelhas
adequadas
para
registo
dos
resultados
e
a
efetiva
disponibilidade
de
todos
os
recursos
materiais
necessrios
constituem
elementos
importantes
para
o
sucesso
das
experincias.
O
tempo
"perdido"
num
planeamento
inicial
largamente
compensado
pelo
nvel
da
aprendizagem
conseguido
e
pela
preveno
da
necessidade
de
repetio
de
experincias
eventualmente
bloqueadas.
Procedimentos
gerais
Todos
os
procedimentos
devero
ser
efectuados
tendo
em
mente
a
minimizao
dos
riscos
associados
manipulao,
numa
perspectiva
de
proteo
do
prprio
operador
e
de
terceiros.
Mais
importante
que
um
conjunto
de
regras
a
obedecer
a
utilizao
do
bom
senso
do
operador
nos
trabalhos
a
realizar.
U
REGISTOS
E
RELATRIOS
conveniente
usar
um
bloco
ou
caderno
para
registo
de
todas
as
ocorrncias
e
dos
resultados
da
experimentao.
Sugere-se
o
uso
de
caderno
de
laboratrio,
de
preferncia
com
folhas
no
amovveis,
para
que
no
sejam
eliminadas
notas
ou
registos
considerados
irrelevantes
na
altura,
como
sucede
com
frequncia
quando
se
passam
os
apontamentos
"a
limpo",
mas
de
grande
utilidade
para
consulta
futura
na
elaborao
do
relatrio
final
ou
para
a
eventual
repetio
da
experincia.
O
rigor
e
pormenor
dos
registos
efectuados
durante
a
execuo
do
trabalho
experimental
facilitaro
a
aprendizagem
e
a
interpretao
dos
resultados
obtidos,
em
especial
quando
estes
so
inesperados.
Um
qualquer
relatrio
de
uma
experincia
laboratorial
dever
documentar
de
forma
to
completa
quanto
possvel
o
procedimento
executado
e
os
resultados
obtidos.
Para
alm
disso
dever
ser
tambm
objectivo
do
relator
redigir
um
documento
compreensvel
para
o
leitor
e
susceptvel
de
apoiar
a
eventual
repetio
da
mesma
experincia
em
idnticas
condies.
Para
a
elaborao
dos
relatrios
sugerem-se,
como
orientao,
as
seguintes
seces:
Ttulo
Resumo
Objectivo
Introduo
Palavras-chave
Material e reagentes
Protocolo
experimental
Resultados
Discusso
Concluso
Nota crtica
Bibliografia
Materiais
Meios
de
cultura
A
sobrevivncia
e
o
suporte
de
vida
dos
microrganismos
dependem
do
fornecimento
adequado
de
nutrientes
e
convenientes
condies
para
o
seu
crescimento.
Quanto
aos
nutrientes,
grande
parte
dos
microrganismos
apenas
necessitam
de
substncia
solveis
de
baixo
peso
molecular,
usualmente
originadas
pela
degradao
enzimtica
de
outros
nutrientes
mais
complexos.
Uma
soluo
contendo
estes
nutrientes
designada
como
meio
de
cultura.
Em
geral,
os
meios
de
cultura
so
lquidos,
semisslidos
ou
slidos.
Um
meio
lquido
sem
agente
solidificante
designado
por
caldo
nutritivo.
Um
caldo
nutritivo
suplementado
com
um
agente
solidificante,
usualmente
o
agar,
origina
um
meio
slido
ou
semisslido.
O
agar
um
extracto
de
algas
marinhas,
um
carbo-hidrato
complexo
que
contem
maioritariamente
galactose
e
possui
muito
pouco
valor
nutritivo.
O
agar
muito
adequado
como
agente
solidificante
porque
se
liquefaz
a
cerca
de
100C
e
solidifica
a
40C.
Devido
a
estas
propriedades,
os
microrganismos,
em
especial
os
patognicos,
podem
ser
cultivados
a
temperaturas
da
ordem
dos
37C
sem
receios
de
liquefaco
do
meio
solidificado.
Um
meio
de
cultura
bem
solidificado
exige
uma
concentrao
de
agar
da
ordem
dos
1,5
a
1,8%.
Uma
concentrao
inferior
a
1%
resulta
num
meio
semisslido.
Para
alm
das
necessidades
nutritivas,
vrios
outros
factores
ambientais
precisam
de
ser
controlados
para
o
sucesso
da
cultura
dos
microrganismos,
como
sejam
o
pH,
a
temperatura,
o
ambiente
gasoso
ou
a
presso
osmtica.
Esterilizao
A
esterilizao
um
dos
pontos-chave
para
o
sucesso
do
trabalho
em
microbiologia.
Para
trabalhar
em
condies
de
esterilidade
fundamental
o
uso
de
material
estril
e
a
aplicao
de
tcnicas
adequadas.
A
esterilizao
processo
pelo
qual
so
eliminadas
todas
as
formas
de
vida
de
qualquer
meio
ou
material.
As
principais
tcnicas
para
a
esterilizao
de
rotina
em
laboratrio
so
as
seguintes:
Calor
Filtrao
Produtos
qumicos
calor
seco
ou
hmido,
conforme
o
tipo
de
material
de
que
so
constitudas.
Apesar
de
tradicionalmente
serem
instrumentos
para
"pipetar
boca"
proibido
usar
a
boca
para
aspirar
microrganismos.
Existem
auxiliares
mecnicos
disponveis
para
o
efeito,
como
peras
de
borracha
ou
corpos
de
seringa
que
se
adaptam
na
extremidade
larga
da
pipeta.
As
pipetas
Pasteur,
tubos
de
vidro
no
graduados
com
uma
das
extremidades
afiladas
so
tambm
de
uso
muito
frequente
em
trabalhos
de
microbiologia,
tambm
pela
sua
facilidade
de
esterilizao
extempornea.
Cmaras
de
cultura
Das
condies
para
crescimento
dos
microrganismos,
uma
das
mais
relevantes
a
sua
temperatura
ptima
de
crescimento.
As
estufas
so
usadas
para
a
manuteno
da
temperatura
ptima
dos
microrganismos
em
crescimento
durante
o
perodo
de
cultura.
So
cmaras
em
que
a
temperatura
ambiente
interior
controlada
por
termstato,
para
que
a
mesma
seja
mantida
dentro
de
limites
apropriados
para
o
crescimento
celular.
Usam
em
geral
um
sistema
de
circulao
de
ar
aquecido
e,
para
evitar
a
desidratao
dos
meios
em
incubao,
devero
conter
tambm
uma
fonte
de
vapor
de
gua
(um
recipiente
com
gua
no
seu
interior,
quando
no
venham
preparadas
para
o
efeito
de
origem).
Os
banhos
de
gua
(banho-maria)
com
gua
a
temperatura
controlada
por
termstato
constituem
outro
dos
instrumentos
frequentemente
empregues
para
a
criao
das
condies
de
temperatura
ptima
de
crescimento
dos
microrganismos.
O
ntimo
contacto
da
gua
a
temperatura
controlada
com
o
recipiente
onde
crescem
os
microrganismos
apresenta
a
vantagem
de
permitir
uma
mais
rpida
e
eficaz
transferncia
do
calor.
Alm
disso,
os
banhos
com
agitao
facilitam
tambm
o
arejamento
das
culturas,
de
grande
importncia
para
o
crescimento
dos
microrganismos
aerbios.
A
desvantagem
do
banho
de
gua
reside
no
facto
de
s
poder
ser
usado
para
as
culturas
em
meio
lquido,
ao
contrrio
das
estufas
de
ar,
que
servem
tanto
para
culturas
em
meio
lquido
como
em
meio
slido.
Frigorfico
O
frigorfico
outra
das
peas
fundamentais
em
laboratrio
de
microbiologia.
O
ambiente
de
baixa
temperatura
que
disponibiliza
da
maior
relevncia
para
a
manuteno
e
armazenamento
das
culturas
celulares
em
fase
de
no
crescimento
entre
os
perodos
de
subcultura
e
para
a
conservao
dos
meios
esterilizados
e
outros
reagentes.
Tambm
as
solues
e
compostos
termo-lbeis
tm
perodos
de
conservao
mais
alargados
quando
armazenados
a
baixas
temperaturas.
MTODOS
DE
ESTERILIZAO
Esterilizao
um
processo
que
elimina
todos
os
organismos
vivos
que
se
encontrem
superfcie
ou
no
interior
de
um
material,
podendo
ser
alcanado
pela
exposio
do
material
a
agentes
letais
fsicos
ou
qumicos
ou,
no
caso
dos
lquidos,
pela
separao
mecnica
dos
organismos
atravs
de
filtraes.
Existem
muitas
formas
de
esterilizar
materiais
e
meios,
e
a
sua
escolha
depende
da
natureza
dos
materiais
a
serem
esterilizados
bem
como
da
disponibilidade
de
meios
de
trabalho.
A
noo
de
esterilidade
(estril
=
infecundo)
encontra-se
frequentemente
associada
a
duas
outras:
a
de
assepsia
(ausncia
de
sepsis
=
putrefaco)
e
a
de
desinfeco
(livrar
da
infeco).
Estes
significados
literais
correspondem,
de
facto,
s
noes
tcnicas
destas
terminologias.
Em
microbiologia
referimo-nos
a
esterilizao
quando
se
pretende
impedir
a
propagao
de
microrganismos;
a
assepsia
quando
se
pretende
trabalhar
em
ambiente
desprovido
de
microrganismos
e
a
desinfeco
quando
se
aplicam
tcnicas
destinadas
a
eliminar
microrganismos
potencialmente
patognicos
para
o
operador.
Destas
noes,
a
aprofundar
no
exerccio
da
experimentao
que
se
desenvolver
na
disciplina,
importa
considerar
em
particular
as
tcnicas
que
se
utilizam
em
microbiologia
para
a
eliminao
de
microrganismos
viveis:
a
esterilizao.
10
Purga
O
ar
relativamente
frio
na
cmara
de
esterilizao
muito
mais
pesado
que
o
vapor
temperatura
de
esterilizao.
Se
no
for
permitida
a
sada
do
ar
cria-se
uma
estratificao
na
autoclave
que
conduz
a
uma
falta
de
uniformizao
das
temperaturas
desenvolvidas.
Uma
vez
que
o
ar
e
o
vapor
so
lentos
a
misturarem-se,
as
diferenas
de
temperatura
entre
camadas
pode
ser
muito
grande,
por
isso
a
necessidade
de
se
substituir
todo
o
ar
por
vapor
(purga).
Natureza do carregamento
Geralmente,
os
materiais
mais
volumosos
requerem
um
maior
tempo
de
esterilizao,
sendo
prefervel
esterilizar
pequenos
volumes
de
cada
vez,
por
exemplo
prefervel
esterilizar
5
bales
de
litro
de
cada
vez
do
que
esterilizar
apenas
um
balo
com
cinco
litros.
Os
frascos
devem
ser
tapados
com
algodo
ou
papel.
Se
for
necessrio
usar
tampas
roscadas,
devem
ir
pouco
apertadas
para
a
autoclave
de
modo
a
permitirem
a
sada
de
ar
e
entrada
de
vapor,
evitando-se
assim
o
rebentamento
de
frascos
na
autoclave.
B. Calor seco
O
calor
seco
usado
para
esterilizar
material
de
vidro,
outros
materiais
slidos
termo-estveis
e
alguns
componentes
de
meios
ou
alimentos
que
ficariam
imprprios
se
expostos
ao
vapor.
Trata-se
tambm
de
um
dos
mtodos
de
esterilizao
mais
usados
e
de
muito
fcil
aplicao.
O
equipamento
indispensvel
apenas
uma
estufa
de
alta
temperatura
(160
-
200C).
Para
alm
de
ter
de
ser
tida
em
conta
a
resistncia
trmica
dos
materiais
a
esterilizar
por
esta
tcnica,
a
outra
precauo
a
considerar
prende-se
com
a
minimizao
da
possibilidade
de
contaminar
esses
materiais
depois
da
esterilizao.
Radiaes
Alguns
processos
comerciais
usam
as
radiaes
para
a
esterilizao
a
frio
de
certos
materiais
como
produtos
farmacuticos,
por
exemplo.
A
irradiao
o
uso
de
radiaes
ionizantes
de
alta
energia
que
incluem
raios
gama
produzidos
a
partir
de
cobalto-60
ou
csio-139
e
de
raios
catdicos
produzidos
em
geradores
e
aceleradores
de
electres.
A
irradiao
com
luz
ultravioleta
no
uma
forma
muito
satisfatria
de
esterilizao
dada
a
sua
fraca
capacidade
de
penetrao
nos
materiais
e
produtos
a
esterilizar.
,
contudo,
de
utilizao
frequente
na
diminuio
do
nvel
de
contaminao
de
espaos
confinados,
como
salas
estreis
ou
pequenos
ambientes,
sendo
particularmente
teis
tambm
para
a
reduo
da
infeciosidade
viral
devido
s
alteraes
induzidas
no
material
gentico
das
partculas
virais
expostas.
Filtrao
estril
O
principal
mtodo
para
a
esterilizao
de
lquidos
que
contenham
componentes
termo-sensveis
tais
como
vitaminas,
protenas
sricas
e
antibiticos,
por
exemplo,
a
filtrao.
Tradicionalmente
os
microbiologistas
esterilizavam
estes
produtos
recorrendo
a
filtros
feitos
a
partir
de
terra
de
diatomceas
e
fibras
de
asbesto,
previamente
esterilizados
em
autoclave.
Presentemente
estes
filtros
foram
substitudos
por
filtros
de
acetato
de
celulose
ou
policarbonatos
nos
quais
os
tipos
de
poros
desenvolvidos
permitem
filtraes
com
elevados
graus
de
11
preciso.
Existem
atualmente
disponveis
no
mercado
filtros
esterilizantes
de
vrios
poros
e
capacidades
filtrantes.
Os
mais
frequentes
e,
por
isso,
mais
acessveis
so
filtros
de
poros
de
0,45
m
ou
0,2
m
de
dimetro,
que
retm
os
microrganismos
presentes
nas
solues.
Para
esterilizar
uma
soluo
por
filtrao,
no
h
mais
que
passar
essa
soluo
atravs
de
um
destes
filtros
pela
aplicao
de
uma
presso
positiva
no
lquido
a
filtrar
(filtros
de
seringa,
por
exemplo)
ou
na
rarefaco
do
ar
no
contentor
que
recebe
o
filtrado.
Em
qualquer
dos
casos
esta
tcnica
requer
a
recolha
do
filtrado
em
condies
de
assepsia
para
impedir
a
contaminao
do
lquido
esterilizado.
Salvo
raras
excees,
a
filtrao
estril
no
retm
as
partculas
virais.
No
podendo
ser
considerado
como
mtodo
de
"esterilizao
de
vrus".
A
filtrao
estril
mesmo
uma
tcnica
frequentemente
usada
em
virologia
para
a
purificao
de
suspenses
virais
pela
eliminao
de
bactrias
potencialmente
contaminantes.
Desinfectantes
e
antisspticos
Mltiplos
reagentes
qumicos
so
diariamente
utilizados
para
controlo
da
disseminao
de
microrganismos.
Os
produtos
usados
na
"limpeza"
de
utenslios
diversos,
frequentemente
demasiado
txicos
para
ser
usados
diretamente
no
Homem,
so
chamados
de
desinfectantes.
Os
produtos
que
aplicamos
na
pele,
com
o
mesmo
objectivo
de
eliminar
eventuais
microrganismos,
so
antisspticos.
Particularmente
eficaz
e
muito
til
no
laboratrio,
para
eliminao
de
vrus
e
microrganismos
a
soluo
de
hipoclorito
de
sdio
(lixvia)
com
que
se
tratam
os
materiais
de
laboratrio
aps
exposio
a
agentes
infecciosos.
12
PROTOCOLOS
EXPERIMENTAIS
1. PIPETAGENS,
SOLUES
E
DILUIES
Introduo
O
rigor
nas
diluies
a
efetuar
com
alguns
materiais
biolgicos
e
reagentes,
no
contexto
de
vrios
dos
trabalhos
experimentais
que
aqui
se
incluem,
crtico
e
fundamental
para
o
sucesso
e
para
a
fiabilidade
dos
resultados.
Porque
se
observa
com
frequncia
alguma
inabilidade
dos
estudantes
para
a
manipulao
adequada
das
micropipetas
e
para
um
raciocnio
operacional
tanto
das
diluies
expressas
como
potncias
de
10
como
na
forma
de
preparar
solues
tituladas,
introduz-se
este
trabalho
preliminar.
Material e reagentes
Procedimento (por grupo)
Diluies decimais
1.
2.
Solvente (mL)
4,5
4,5
4,5
4,5
4,5
Corante (mL)
5,0
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
Diluio (10 x )
3.
4.
5.
Determine a absorvncia das solues a 600-660 nm (ler da mais diluda para a mais concentrada).
13
2.
Solvente (mL)
Corante (mL)
5,0
2,5
2,5
2,5
2,5
2,5
2,5
2,5
2,5
Diluio (10 x )
3.
4.
5.
Determine a absorvncia das solues preparadas a 600-660 nm (comear pela mais diluda)
TPC
Diluio nica
A
partir
da
soluo
concentrada
de
azul-de-metileno
como
procederia
para
a
preparao
de
5
mL
de
cada
uma
das
seguintes
diluies:
Diluio
de
5x10 2
Diluio
de
5x10 -2
P
Preparao de solues
Pretendendo-se
obter
100
mL
de
cada
uma
das
solues
que
se
listam,
indique
as
quantidades
de
produtos
a
misturar
para
a
sua
preparao
no
laboratrio:
NaOH
0,1
N
SO 4 H 2
0,1
N
NaCl
0,1
M
NaCl
100
mM
Glicerol
10%
(frmula
C 3 H 8 O 3 )
Glucose
10%
(frmula
C 6 H 12 O 6 )
Etanol
70%
(frmula
C 2 H 6 O 2 )
B
14
Data:
____/____/____
Diluies decimais
Tubo
Amostra
Concentrao
calculada
DO 600nm
/
mL
B
Observaes
Tubo
Amostra
Concentrao
calculada
DO 600nm
/
mL
B
Observaes
15
Grfico
Notas:
16
SOLUES
Operador:
Data:
____/____/____
Componentes
Peso / volume
Diluio
5 X 10 2
Diluio
5 X 10 -2
NaOH
0,1
N
(100
mL)
SO 4 H 2
0,1
N
(100
mL)
NaCl
0,1
M
(100
mL)
NaCl
100
mM
(100
mL)
Glicerol
10%
(100
mL)
Glucose
10%
(100
mL)
Etanol
70%
(100
mL)
Notas:
17
Bactria
recombinante
LB
10X:
Bacto-triptona
100
g
Extracto
de
levedura
50
g
NaCl
100
g
H2O
destilada
at
1000
mL
pH
7,5.
Autoclavar.
Conservar
estril
a
4C.
Diluir
extempornea
e
esterilmente
a
1:10
com
gua
estril.
Ampicilina
1000X
50
mg/mL
em
gua.
Esterilizar
por
filtrao,
conservar
a
20C
Protocolo Experimental
1.
2.
3.
18
Bactria
recombinante
LB
1X
com
ampicilina.
Lisozima
(p)
Isopropanol
5
M
NaCl
Etanol
puro
e
70
%
TE
pH
8,0
10
mM
Tris-HCl
pH
8,0
1
mM
EDTA)
Pronase
20
mg/mL
em
gua
Auto-digerida
durante
2
horas
a
37C.
Conservar
a
20C
Pronase
Mix:
Pronase
50
L
10
%
SDS
86
l
H2O
860
l
RNAse
A
10
mg/mL
em:
10
mM
Tris-HCl
pH
7,5
15
mM
NaCl
Incubada
por
15
minutos
a
100C
e
arrefecimento
lento.
Conservar
a
20C
RNAse
mix:
RNAse
A
40
l
TE
pH
8,0
10
mL
Soluo
I:
25
mM
Tris-HCl
pH
8,0
50
mM
Glucose
10
mM
EDTA
Soluo
II:
0,2
N
NaOH
1
%
SDS
Soluo
III:
5
M
KOAc
60
mL
Ac.actico
glacial
11,5
mL
H2O
destilada
28,5
mL
pH
4,8
Fenol:clorofrmio:
Fenol
destilado
50
mL
Clorofrmio
50
mL
Alcool
isoamlico
1
mL
8-hidroxiquinolena
0,1
g
TE
pH
8,0
15
mL
(usar
apenas
a
fase
orgnica,
de
cor
amarela,
no
agitar)
Protocolo Experimental
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
19
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
20
Protocolo Experimental
1.
H 2 O estril
b.
Soluo de DNA
1 L
c.
T. enzima 10X
2,5 L (1 X final)
d.
Soluo de enzima
1 L
2.
Misturar no vortex.
3.
4.
5.
6.
a.
Adicionar 25 L de fenol:clorofrmio.
b.
Misturar bem.
c.
d.
21
Protocolo Experimental
1.
Preparao
do
gel
a.
b.
c.
d.
e.
f.
g.
h.
i.
Deixar solidificar
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Observar o gel
8.
9.
22
E. Coli XL1B
LB
10X
Tetraciclina
1000X:
12,5
mg/mL
em
50
%
etanol.
Conservar
a
20C.
100
mM
CaCl 2
(filtrao
estril)
Glicerol
50
%
(v/v)
(filtrao
estril)
Protocolo Experimental
1.
2.
3.
4.
Incubar a 37C sob forte agitao at 0,2 UDO a 600 nm (cerca de 2 X 10 7 bactrias/mL) (2 a 4 horas).
5.
6.
7.
Decantar.
8.
9.
As bactrias competentes podero ser usadas, sem congelao, imediatamente antes da adio do glicerol.
23
8. TRANSFORMAO
Material e Reagentes
Bactrias
competentes
Soluo
de
DNAs
plasmdico
(pDNA)
LB
10X
Ampicilina
1000
X
Placas
de
Agar/LB/Amp:
Bacto-Agar
7.5
g
LB
10X
50
mL
H 2 O
at
500
mL
Autoclavar,
Deixar
arrefecer
a
50C.
Adicionar
500
L
de
Ampicilina
1000X.
Repartir
de
imediato
pelas
placas
de
petri.
B
Protocolo Experimental
1.
2.
3.
4.
Homogeneizar no vortex.
5.
6.
7.
8.
9.
10. Decantar.
11. Ressuspender
as
bactrias
em
200
L
de
meio
LB.
12. Espalhar
sobre
placa
de
Agar/LB/Amp
at
secar.
13. Incubar
a
37C
em
estufa
durante
uma
noite.
14. Picar
colnias.
24
Protocolo experimental
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
a.
Centrifugar 2 minutos
b.
c.
25
Soluo
de
colorao:
Persulfato
de
amnio
10%
(extemporneo)
Azul
de
Coomassie
0,2%
Tampo
Laemmli
10X:
Metanol
50%
Tris
250
mM
cido
actico
glacial
10%
Glicina
1,92
M
Soluo
de
diferenciao
SDS
1%
Metanol
10%
pH
8.3
cido
actico
glacial
10%
Tampo
de
elctrodos:
T.
Laemmli
1X
Protocolo Experimental
Preparao do gel
1.
2.
Acrilamida 50%
6 mL
b.
Bisacrilamida 1,25%
c.
7,5 mL
d.
SDS 10%
300 L
e.
H2O
f.
TEMED 10%
150 L
g.
150 L
4,5 mL
11,4 mL
3.
4.
Verter no molde
5.
6.
7.
Acrilamida 50%
750 L
b.
Bisacrilamida 1,25%
800 L
c.
625 L
d.
SDS 10%
e.
H2O
f.
TEMED 10%
75 L
g.
75 L
75
L
5,1
mL
8.
9.
Colocar o pente
26
Electroforese
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Homogeneizar
7.
8.
9.
Ligar a corrente elctrica (70 volts) at ao indicador de migrao se posicionar no fim do gel (5 horas)
2.
3.
4.
5.
6.
7.
27
ANEXOS
Plasmdio
pCS11
28
Plasmdio pCS62
29
Plasmdio pCS71
30
Plasmdio pCS84
31
Plasmdio pSK+
32
Enzimas
de
Restrio
U
BamH I
Origem:
Bacillus
amyloliquefaciens
H
Reao
Enzimtica:
150
mM
NaCl
10
mM
Tris-HCl
10
mM
MgCl2
1
mM
dithiothreitol
100
g/mL
BSA.
pH
7.9
Incubao
a
37C.
Eco RI
Origem:
E.
coli
RY
13
Reao
Enzimtica:
50
mM
NaCl
100
mM
Tris-HCl
10
mM
MgCl2
0.025%
Triton
X-100
pH
7.5
Incubao
a
37C
Sal I
Origem:
Streptomyces
albus
G
Reao
Enzimtica:
150
mM
NaCl
10
mM
Tris-HCl
10
mM
MgCl2
1
mM
dithiothreitol
100
g/mL
BSA
pH
7.9
Incubao
a
37C.
33
Tabela Peridica
34
TRABALHO
AUTNOMO
Cada
grupo
receber
um
DNA
plasmdico
no
identificado,
em
quantidade
vestigial
Problema:
Identificar
o
plasmdeo
Relatar
a
estratgia
adoptada,
os
procedimentos
utilizados
e
os
resultados
obtidos
Estratgia sugerida
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Comparar os perfis obtidos com os dos plasmdeos includos neste manual, para identificao.
Carlos
Sinogas
35