Quim. Nova, Vol. 27, No.

4, 615-622, 2004 ESTRATGIAS DE CULTIVO PARA PRODUO DOS PLSTICOS BIODEGRADVEIS POLI(3HIDROXIBUTIRATO) E POLI(3-HIDROXIBUTIRATO-co-3-HIDROXIVALERATO) POR BACTRIAS Cludia Regina Squio e Glucia Maria Falco de Arago* Departamento de Engenharia Qumica e Engenharia de Alimentos, Universidade Federal de Santa Catarina, CP 476, 80040-970 Florianpolis - SC Recebido em 13/5/03; aceito em 12/12/03; publicado na web em 27/05/04

CULTIVATION STRATEGIES FOR PRODUCTION OF THE BIODEGRADABLE PLASTICS POLY(3-HYDROXYBUTYRATE) AND POLY(3-HYDROXYBUTYRATE-CO-3-HYDROXYVALERATE) BY BACTERIA. Polyhydroxyalkanoates (PHAs) are carbon and energy storage materials that are accumulated as intracellular granules in a variety of microorganisms during unbalanced growth. PHAs have drawn attention due to their properties similar to conventional plastics and complete biodegradability. They can be used for food and cosmetics packaging, and in medicine and agriculture. However, their applicability is reduced because of their high production cost compared to conventional plastics. An overview on production strategies of poly(3-hydroxybutyrate) and poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) aiming at reducing the production costs is presented. Keywords: polyhydroxyalkanoates; biopolymer; Ralstonia eutropha.

INTRODUO Os plsticos tm papel fundamental na sociedade moderna, sendo utilizados de inmeras formas, inclusive em algumas aplicaes para as quais anteriormente eram usados outros materiais, como metais, vidro, madeira e papel. Possuem, dessa forma, um grande mercado e tambm representam um mercado em crescimento. Entretanto, estes materiais tm despertado grande preocupao devido sua rpida descartabilidade como, por exemplo, na aplicao em embalagens, e sua grande dificuldade de degradao no meio ambiente1. Para contornar esse problema, esto sendo estudadas alternativas como a reciclagem de produtos constitudos de plsticos e a substituio por plsticos biodegradveis, mais compatveis com a filosofia de preservao ambiental2. Os plsticos biodegradveis so polmeros que se degradam completamente por ataque microbiano em curto espao de tempo, sob condies apropriadas do meio ambiente. Dentre os biopolmeros em desenvolvimento esto os poli-hidroxialcanoatos (PHAs). Alm da vantagem em serem biodegradveis, ainda apresentam outras importantes caractersticas como serem biocompatveis, serem produzidos a partir de recursos renovveis como acares e cidos graxos e por terem propriedades termoplsticas e caractersticas fsicas e mecnicas semelhantes s do polipropileno, polmero derivado do petrleo3,4. PHAs so polisteres estruturalmente simples, sintetizados por muitos microorganismos como substncias naturais de reserva de carbono e de energia. So acumulados pela clula microbiana em forma de grnulos, podendo chegar at 90% de seu peso seco4. O PHA formado em condies de crescimento no balanceadas proporcionadas pela limitao de um nutriente, entre outros, como fonte de nitrognio e fsforo e excesso da fonte de carbono5,6. Mais de 100 monmeros diferentes j foram identificados como constituintes de PHAs sintetizados por organismos naturais ou recombinantes, o que demonstra a grande diversidade de PHAs que podem ser produzidos1. Entre os PHAs mais estudados e produzidos

*e-mail: glaucia@enq.ufsc.br

industrialmente, esto o poli(3-hidroxibutirato) (P(3HB)) e o poli(3hidroxibutirato-co-3hidroxivalerato) (P(3HB-co-3HV)), sendo que o segundo possui propriedades mecnicas superiores ao primeiro, sendo mais flexvel, o que o torna mais atrativo para fins industriais7. Muitos so os microorganismos produtores de PHAs, sendo que a espcie Ralstonia eutropha (anteriormente Alcaligenes eutrophus) tem sido utilizada na produo industrial, por apresentar altas taxas de produo de polmero e obter altos rendimentos. Entretanto, a cepa original (Alcaligenes eutrophus H16) s utiliza alguns tipos de acares e, embora espcies mutantes ( R. eutropha DSM 545, Alcaligenes eutrophus NCIMB 11599) possam crescer em glicose, no podem hidrolisar sacarose8. Outro microorganismo com grande potencial para a produo industrial Burkholderia sacchari (anteriormente Burkholderia sp. IPT 101), isolado de solo de canavial brasileiro9. Os PHAs podem ser utilizados como matria-prima em um amplo campo de aplicaes, como embalagens para produtos de limpeza, higiene, cosmticos e alimentos. Tambm servem para produzir sacos descartveis, vasos para mudas, brinquedos e material escolar. Alm disso, por serem biocompatveis podem ser empregados na rea mdico-farmacutica em fabricao de fios de sutura, prteses sseas, suportes de culturas de tecidos para implantes e encapsulao de frmacos para liberao controlada1,10. Apesar desta grande possibilidade de aplicaes, os plsticos biodegradveis ainda tm participao mnima no mercado internacional, em virtude de seu alto custo em relao aos plsticos petroqumicos e s dificuldades de processamento. A reduo dos custos de produo depende da obteno de linhagens altamente eficientes na converso dos substratos no produto desejado, de utilizao de substratos de baixo custo, do desenvolvimento de processos que permitam explorar ao mximo o potencial dessas linhagens e do desenvolvimento de processos de extrao-purificao, de forma a tornar os custos de recuperao do produto os menores possveis1. Com relao ao processamento, como o P(3HB) quimicamente instvel a altas temperaturas, o tempo de processo deve ser reduzido, ajustando-se s propriedades do polmero11. Algumas das estratgias do bioprocesso, envolvendo decises sobre microorganismo produtor, tipo de biorreator, substratos utilizados e tipos de alimentaes,

Reviso

616

Squio e Arago

Quim. Nova

visando a melhoria dos processos de produo de PHAs, esto apresentadas a seguir. ESTRATGIAS DE PRODUO DE POLI(3HIDROXIBUTIRATO) E POLI(3-HIDROXIBUTIRATO-co-3HIDROXIVALERATO) A produo industrial de PHAs tem utilizado R. eutropha, por sua capacidade de acumular grande quantidade de polmero com alto peso molecular8,12. Dentre os principais PHAs produzidos industrialmente esto o P(3HB) e o copolmero P(3HB -co- 3HV). O homopolmero P(3HB) tem baixa estabilidade na fuso, pois se decompe a aproximadamente 200 oC, que uma temperatura muito prxima sua temperatura de fuso; altamente cristalino e relativamente frgil. A incorporao de unidades 3HV, torna o copolmero P(3HB-co-3HV) mais flexvel e com maior resistncia ruptura, medida que aumenta a frao 3-hidroxivalerato. Com o aumento desta frao, ocorre o decrscimo da temperatura de fuso, sem afetar a temperatura de degradao, permitindo melhor processamento trmico do copolmero, o que o torna mais atrativo para produo industrial12. Byrom7 descreve o processo de produo industrial de P(3HB) da ICI, hoje adquirido pela Metabolix, Inc., que utiliza cultura em batelada alimentada, realizada em duas etapas. Durante a primeira fase, no limitada, R. eutropha cresce em um meio mineral contendo glicose, como nica fonte de carbono, e fosfato suficiente para o crescimento celular, at se atingir uma determinada biomassa desejada. Quando ocorre a limitao por fosfato, inicia-se a segunda fase, na qual os microorganismos comeam a produzir e estocar P(3HB). O processo prossegue com adies de glicose, at que se obtenha a quantidade desejada de polmero. O tempo total de cultura de aproximadamente 110 a 120 h, com o acmulo de mais de 75% do peso seco celular total em polmero. O copolmero P(3HB-co-3HV) produzido de forma semelhante, em duas fases, sendo que, a partir do incio da fase de acmulo, so adicionados glicose e cido propinico. P(3HB-co-3HV) com 0 30 mol% de unidades 3HV produzido e essa frao pode ser controlada pela razo glicose/cido propinico adicionada. Como o cido propinico, em nveis acima de 0,1% no meio, txico ao microorganismo e inibe a sntese de polmero, sua taxa de alimentao precisa ser bem controlada7. Utilizao de substratos de baixo custo na produo de PHAs O maior obstculo na comercializao de PHAs seu alto custo. Segundo Choi e Lee13, aproximadamente 40% do total do custo de produo de PHAs so devidos aos custos dos substratos. Assim, para se conseguir reduzir os custos de produo necessrio a utilizao de fontes de carbono mais baratas. Uso de sacarose, melao e acar invertido Em pases como o Brasil, onde a cana-de-acar abundante, a sacarose, o melao e o acar invertido so substratos de baixo custo e sua utilizao como fonte de carbono na produo de PHAs poderia diminuir os custos de produo regionais. A produo de P(3HB) e copolmeros, integrada produo de acar e lcool em usinas de processamento de cana-de-acar, pode representar uma grande oportunidade de produzir polmero a baixo custo e expandir a indstria de cana. Neste caso, a energia necessria aos processos de produo provm da queima do bagao de cana, os efluentes do processo e a biomassa resultante aps extrao do polmero podem ser utilizados como fertilizantes na plantao da cana e os solventes utilizados na purificao do polmero so deriva-

dos da fermentao alcolica, naturais e biodegradveis, portanto, sem representar impacto ambiental14. A nica produo industrial de P(3HB) e P(3HB-co-3HV) a partir de cana-de-acar, utilizando essa produo integrada em usina sucroalcooleira, est sendo realizada pela indstria brasileira PHB Industrial S.A. A resina, comercialmente conhecida como Bio Cycle, est sendo produzida em escala-piloto e destinada a universidades, empresas e centros de pesquisa e desenvolvimento. At 2005, a empresa pretende produzir cerca de 10 mil toneladas por ano. Os custos de produo da PHB industrial so os menores do mundo. Enquanto na Europa o polmero produzido a US$ 10-20/kg, no Brasil esses custos esto entre US$ 2,5 5/kg, porm ainda cerca de 4 a 5 vezes o custo dos polmeros convencionais14-16. Como R. eutropha, o microorganismo utilizado industrialmente, no capaz de assimilar sacarose, necessria a inverso prvia deste substrato, o que aumenta os custos de produo. Com o objetivo de desenvolver uma cepa derivada da R. eutropha DSM 545 com a capacidade de crescer em meio com sacarose como nica fonte de carbono, Fava17 construiu a cepa R. eutropha 290/sac. Os resultados demonstraram a habilidade desta nova cepa em consumir sacarose, embora sua eficincia de crescimento e produo de P(3HB) fosse relativamente inferior em relao ao que produzido utilizando-se glicose e frutose como substratos. Nos estudos em frascos agitados, utilizando glicose e frutose, foram obtidas velocidade especfica mxima de crescimento de 0,29 h-1 e quantidade de P(3HB) equivalente a 79% do peso seco celular, enquanto em sacarose obteve-se velocidade especfica mxima de crescimento de 0,24 h-1 e P(3HB) com apenas 58% do peso seco. O autor sugere que novos melhoramentos possam aumentar o desempenho da cepa construda. Em vista do menor custo da sacarose como fonte de carbono, mais estudos com essa cepa poderiam levar a significantes redues dos custos de produo. Gomez et al.18 avaliaram a eficincia de produo de PHAs por diversas bactrias gram-negativas, isoladas do solo de plantaes de cana-de-acar. As culturas foram realizadas sob limitao de nitrognio e utilizando como carboidratos sacarose, glicose e frutose. Quando foi usada sacarose, alguns microorganismos mostraram valores de rendimento global de carboidrato em produto, Y0P/c, maiores que em glicose e/ou frutose. Os autores explicaram o fato afirmando que a mesma massa de sacarose gera 5% mais acetil-CoA e, por conseqncia PHA, que glicose e frutose. Entre os microorganismos isolados, a Burkholderia sp. IPT 101 foi capaz de acumular 75% do seu peso seco em P(3HB) a partir de glicose mais frutose e 69% a partir de sacarose, com uma eficincia maior que 80% do mximo rendimento terico, que de 0,48 g/g quando se utiliza glicose e/ou frutose, de acordo com Yamane19, e 5% maior, de 0,5 g/g quando se usa sacarose. A bactria ainda foi capaz de crescer com velocidade especfica de crescimento (0,4 0,45 h-1), maior que R. eutropha (0,3 h-1). A produo de P(3HB) a partir de hidrolisado de bagao de cana, resduo da indstria sucroalcooleira, utilizando B. sacchari, tambm est sendo estudada como forma de reduzir os custos de produo do polmero16. Alcaligenes latus um microorganismo que produz P(3HB) associado ao seu crescimento, mesmo em condies de no limitao de nitrognio, porm, normalmente produz baixo contedo de P(3HB), em torno de 50%20. Wang e Lee20 estudaram o efeito da aplicao de limitao de nitrognio sobre a produo de P(3HB) por A. latus DSM 1123, a partir de sacarose. A limitao de nitrognio ocorreu quando a concentrao de biomassa era de 76 g/L e, ao final da fase de acmulo, obtiveram 111,7 g/L de biomassa seca, 98,7 g/L de P(3HB), correspondente a 88% e produtividade de 4,94 g/L h. Segundo os autores, esta alta produtividade foi principalmente obtida porque durante a fase de acmulo, sob limitao de

Vol. 27, No. 4

Estratgias de Cultivo para Produo dos Plsticos Biodegradveis

617

nitrognio, no houve crescimento celular, apenas produo de P(3HB). Melhorias no processo produtivo de P(3HB) por Alcaligenes latus DSM 1123 a partir de sacarose como nica fonte de carbono, tambm foram propostas por Grothe et al.21. Os autores investigaram os efeitos da temperatura, pH inicial, concentrao de elementos traos, tipo da fonte de nitrognio e da razo carbono/nitrognio (C/N). Nas melhores condies verificadas, obtiveram a produo de 63% de P(3HB) com um coeficiente de converso de sacarose em biomassa igual a 0,4 kg/kg. O melao um subproduto industrial que tem sido largamente utilizado como fonte de carbono em fermentaes com leveduras para produo de lcool22. Alm de ser mais barato que a glicose, o melao contm elementos traos e vitaminas que podem ser usados como potencializadores do crescimento23. Melao de cana foi usado como suplemento nutricional na produo de P(3HB) por R. eutropha DSM 545 crescendo em glicose23. Os autores concluram que a suplementao com melao de cana em concentraes de 0,3% maximizou a produo de P(3HB), pois aumentou a formao de biomassa na fase de crescimento no-limitada, resultando em maior quantidade de clulas para acmulo de polmero. Liu et al . 22 estudaram a produo de P(3HB) por E. coli recombinante HMS174/pTZ18u-PHB, utilizando melao de beterraba hidrolisado como nica fonte de carbono. A cultura foi realizada em batelada alimentada e resultou em 39,5 g/L de peso seco celular, 80% de P(3HB) com produtividade de 1 g/L h. Relataram que a concentrao de melao teve efeito significante na sntese de P(3HB) e no crescimento das clulas. No estudo, a concentrao de melao no meio foi gradualmente aumentada de 26,5 para 144 g/L. Observou-se que a biomassa residual foi inibida pela alta concentrao de melao, enquanto o contedo de polmero aumentou at o final da cultura, ou seja, altas concentraes de melao resultaram em altos contedos de P(3HB). Pinto24 comparou o crescimento de R. eutropha DSM 545 em glicose e em acar invertido, em culturas em frascos agitados. Concluiu que as velocidades especficas de crescimento celular obtidas para os dois substratos foram bastante similares, indicando que R. eutropha capaz de se desenvolver to bem em acar invertido quanto em glicose, podendo dessa forma ser um substituto de baixo custo. Confirmando este estudo, Marangoni et al.25 encontraram que em acar invertido, tambm em culturas em frascos agitados, a velocidade especfica mxima de crescimento de R. eutropha DSM 545 foi ligeiramente superior obtida em glicose. Uso de soro de leite Soro de leite um grande efluente da indstria de laticnios, resultante da fabricao de queijo ou casena, representando cerca de 80-90% do volume de leite transformado26. Uma vez que o soro de leite rico em nutrientes, sendo a lactose seu maior constituinte, apresenta-se como outra alternativa de substrato de baixo custo na produo de PHAs. Wong e Lee26 estudaram a produo de P(3HB) em culturas de alta densidade de clulas de Escherichia coli recombinante GCSC 6576, em batelada alimentada, utilizando soro de leite concentrado como fonte de carbono. Obtiveram 87 g/L de clulas e 69 g/L de P(3HB), perfazendo um total de 80% de polmero com produtividade de 1,4 g/L h. Apesar de terem obtido valores de concentrao e produtividade de polmero menores que com fontes puras de carbono, relataram que sua produo pode ser econmica principalmente se incorporada a uma indstria de laticnios, agregando valor ao efluente. Embora tenham conseguido boas concentraes de P(3HB), o meio de cultura precisava ser constantemente removido, devido

limitao volumtrica do fermentador causada pela baixa solubilidade da lactose na soluo de alimentao (210 g/L), se comparada da glicose (700 800 g/L)26. Para tentar resolver esse problema de remoo do meio de cultura, Kim27 estudou a produo de P(3HB) por E. coli recombinante GCSC 6576 em soro de leite no concentrado, tentando controlar a biossntese do polmero fazendo com que as clulas comeassem a produzir mais cedo durante a cultura e acumulassem mais P(3HB) sem precisar remover o meio de cultura. Assim, realizou fermentaes com e sem limitao de oxignio. Na cultura com limitao obteve 80% de P(3HB) com produtividade de 0,48 g/L h, enquanto na cultura sem limitao obteve 57% de P(3HB) com produtividade de 0,9 g/L h. Embora E. coli no necessite de limitao de nutriente para produzir o polmero, na condio de oxignio insuficiente houve aumento da produo de P(3HB), por diminuio da velocidade de crescimento celular. No mesmo intuito de desenvolver estratgias para produo de P(3HB) a partir de soro de leite sem remoo do meio de cultura, Ahn et al.28 conseguiram resultados ainda melhores. Desenvolveram uma nova estratgia para produo de P(3HB) utilizando E.coli recombinante GCSC 4401 crescendo em soluo de soro de leite altamente concentrado (280 g/L de lactose), com controle apropriado da concentrao de oxignio dissolvido. Durante a fase inicial ativa de crescimento de E. coli, na qual o fornecimento suficiente de oxignio importante para conseguir concentraes finais elevadas de clulas e polmero, mantiveram a concentrao de oxignio dissolvido em 40%. Na fase seguinte, de maior acmulo de polmero, a concentrao de oxignio dissolvido foi diminuda primeiramente de 40 para 30% e depois para 15%. Dessa forma, obtiveram 119,5 g/L de clulas, 96,2 g/L de P(3HB) num total de 80% do peso seco, com alta produtividade de 2,57 g/L h, sem remoo do meio de cultura. Os resultados mostraram que altas concentraes de clulas e polmero podem ser obtidas pela otimizao do tempo e forma de reduo do oxignio dissolvido em cultura de E. coli, alm de demonstrar que P(3HB) pode ser eficientemente produzido a partir de um efluente altamente poluente como o soro de leite. O crescimento de R. eutropha DSM 545 em lactose hidrolisada25 e em soro de leite29 foi investigado. A bactria mostrou-se capaz de se desenvolver muito bem em ambos substratos, sendo que, em lactose hidrolisada, observaram-se duas fases distintas de crescimento, a primeira correspondente ao consumo de glicose e a segunda, ao consumo da galactose, com velocidades especficas mximas de crescimento de 0,2 e 0,11 h-1, respectivamente. Quando o soro de leite foi utilizado como nica fonte inicial de carbono, com adies de acar invertido e cido propinico, na forma de pulsos, observou-se uma fase de crescimento exponencial, com velocidade especfica mxima de 0,23 h-1, bastante similar aos resultados com R. eutropha crescendo em outros substratos, como glicose e acar invertido. Apesar de ter produzido pouco contedo de polmero, em torno de 37%, a frao de unidades 3HV foi bastante elevada, 38%, com rendimento de converso de propionato em unidades 3HV de 0,22 mol mol-1. Estes resultados sugerem a possibilidade da existncia de precursores de 3HV no soro de leite e mostram que o soro de leite uma alternativa interessante para a produo de PHAs, com composio atrativa comercialmente, tambm utilizando R. eutropha. Uso de leos e gorduras Outro estudo visando a reduo de custos de produo de PHAs usa leos vegetais, que so produtos agrcolas renovveis e de baixo custo. Fukui e Doi30 estudaram a capacidade de R. eutropha H16 crescer e produzir PHAs a partir de leos vegetais como leo de oliva, de milho, dend e cido oleico como nicas fontes de carbono. Os

618

Squio e Arago

Quim. Nova

resultados mostraram que a bactria cresce muito bem nesses substratos, acumulando alto teor de P(3HB), entre 79-82% de seu peso seco. Utilizao de diferentes nutrientes limitantes na produo de PHAs O acmulo de polmero pelos microorganismos favorecido pela limitao de um nutriente como oxignio, magnsio, potssio, enxofre, nitrognio ou fsforo5. O nitrognio e o fsforo tm sido os elementos mais estudados como nutrientes limitantes, sendo analisadas tanto estratgias em carncia como com alimentao do nutriente na fase de acmulo, visando a mxima produo de polmero8,24,31-35. Ramsay et al.8 utilizaram limitao de nitrognio em cultura de R. eutropha DSM 545. Para tanto, usaram glicose como nica fonte de carbono, em concentrao inicial de 30 g/L e sulfato de amnia como fonte de nitrognio em concentrao inicial de 9 g/L. Assim que esses substratos foram totalmente consumidos, houve sua reposio ao nvel inicial. Aps a segunda exausto, apenas glicose foi adicionada continuamente ao reator para manter sua concentrao entre 5 e 16 g/L. Assim, os autores obtiveram produtividade mxima de P(3HB) de 2 g/L h. O efeito da alimentao de amnia na fase de produo de P(3HB) por A. eutrophus H16, em batelada alimentada foi investigado31. Quando uma baixa concentrao de amnia foi adicionada a uma taxa de 0,00065 g/h, a produtividade de P(3HB) aumentou de 0,1 g/L h para 0,99 g/L h, durante as 10 h em que a amnia foi adicionada. Estes valores so duas vezes maiores que os obtidos sob carncia de amnia. Aps 29 h de fermentao, cessou-se a adio de amnia sendo que, neste instante, o teor de P(3HB) era 62% do peso seco para a cultura com alimentao e 42,5% para a cultura em carncia. Esses resultados mostraram que a alimentao de amnia durante a fase de produo de P(3HB) pode aumentar o acmulo de polmero. Este trabalho confirma os resultados anteriormente obtidos por Suzuki et al.32, em que a alimentao com pequena quantidade de amnia durante a fase de acmulo, em culturas de Protomonas extorquens, resultou em mais rpido aumento do contedo de P(3HB) que em culturas com deficincia de amnia. Por outro lado, uma alimentao excessiva de amnia causou no s degradao do P(3HB) acumulado, mas tambm reduziu a atividade microbiana de sntese do polmero pelo microorganismo. Estratgias de carncia e alimentao com nitrognio e carncia de fsforo durante a fase de produo de P(3HB) por R. eutropha DSM 545, em batelada alimentada, foram estudadas por Arago33. Com relao ao teor de P(3HB) obteve 51, 73,5 e 60% nas culturas em carncia de nitrognio, alimentao de nitrognio e carncia de fsforo, respectivamente. Por outro lado, os valores de converso de glicose em polmero e produtividade foram maiores para a cultura em carncia de fsforo, obtendo 0,42 gP(3HB)/gglicose e 2,21 g/L h contra 0,33 e 0,31 gP(3HB)/gglicose e 0,45 e 1,16 g/L h para as culturas em carncia e alimentao de nitrognio, respectivamente. O autor considera que a maior produtividade obtida sob carncia em fsforo, em relao carncia e alimentao de nitrognio, se deve ao fato de que o fsforo no participa diretamente da composio de protenas das clulas e, dessa forma, sua limitao permite um crescimento celular residual por algum tempo, uma vez que esse elemento faz parte dos intermedirios energticos reciclveis (ATP/ADP), levando a um acrscimo da produo de polmero. Resultados obtidos por Pinto24, utilizando R. eutropha DSM 545 em batelada alimentada, com acar invertido como nica fonte de carbono, tambm demonstraram valores de produtividade de P(3HB) maiores nas culturas sob carncia/limitao de fsforo que de nitrognio. No caso da limitao em nitrognio, assim como Bitar e

Underhill31, o autor relata que alimentao controlada durante a fase de produo permitiu obter maior produtividade de P(3HB) que sob carncia. Entretanto, as culturas sob carncia/limitao de fsforo obtiveram produtividades ainda maiores. O efeito de vrias estratgias de alimentao em nitrognio na produo de P(3HB-co-3HV) em culturas de R. eutropha DSM 545 foi estudado por Arago et al.34. Para a cultura sob carncia em nitrognio obtiveram resultados comparveis aos de Ramsay et al.8, ou seja, 5 mol% de 3HV por mol de PHA, enquanto as culturas com alimentao de nitrognio durante a fase de acmulo, mostraram-se mais favorveis produo do copolmero, com produtividade de 0,72 g/L h, frao de 3HV final de 13 mol% e fator de converso de cido propinico em 3HV de 0,15 mol3HV/molc. prop.. O fator de converso de propionato em 3HV teve valor mximo de 0,4 mol3HV/molc. prop. no incio da fase de produo, diminuindo continuamente at o final da cultura. A anlise do fator de converso de glicose em polmero, mostrou que uma frao do cido propinico poderia, via acetil-CoA, ser convertido em unidades 3HB por vias similares do metabolismo da fonte principal de carbono. Dessa forma, a produo do copolmero foi favorecida pelo uso da estratgia de alimentao de nitrognio em que o crescimento celular foi mantido, mesmo durante a fase de acmulo de polmero. No s as taxas de produo foram melhoradas, como tambm a composio molar do polmero que obteve maior frao de unidades 3HV. A utilizao de alimentao de fosfato durante a fase de acmulo de P(3HB-co-3HV), mantendo uma pequena velocidade de crescimento residual (rx) em Ralstonia eutropha DSM 545, de 0,02 gXr/L h, aumentou o contedo de polmero acumulado em relao carncia do nutriente35. A limitao de oxignio, durante a fase de acmulo de P(3HB) por E. coli recombinante XL1-Blue (pSYL107), contendo genes de biossntese de PHA de A. eutrophus, foi relatada por Wang e Lee36. A cultura em batelada alimentada foi realizada utilizando glicose como fonte de carbono. A concentrao de oxignio dissolvido foi mantida entre 13% de saturao de ar durante a fase de acmulo de P(3HB). Sob essas condies os autores obtiveram 204,3 g/L de concentrao de biomassa, 157,1 g/L de P(3HB) correspondente a 77% e produtividade de 3,2 g/L h. Utilizao de culturas com alta densidade de clulas na produo de PHAs Culturas com alta densidade de clulas apresentam vantagens como alta concentrao de produto, maior produtividade e reduo dos custos de recuperao do polmero. Kim et al.37, no intuito de melhorar a produtividade de P(3HB), estudaram a produo de polmero por R. eutropha NCIMB 11599, em batelada alimentada com alta densidade de clulas, utilizando dois mtodos para manter a concentrao de glicose em um valor timo: um mtodo usando a medida da taxa de evoluo de CO2 (CER), em mol/h, por espectrometria de massa para estimar a concentrao de glicose e outro, utilizando um analisador de glicose on-line, que controlava diretamente a concentrao de glicose no meio de cultura. Segundo os autores, controlando a concentrao de glicose entre 10 20 g/L, o crescimento do microorganismo seria otimizado, resultando em produo mais eficiente de P(3HB). Tambm estudaram o efeito da limitao de nitrognio em diferentes concentraes de biomassa (30, 55 e 70 g/L) sobre a produo de P(3HB). Encontraram os melhores resultados de concentrao de clulas, de P(3HB) e de produtividade com o analisador de glicose on-line e limitao de nitrognio, quando a biomassa era de 70 g/L. Nessas condies, obtiveram 164 g/L de concentrao celular, 121 g/L de P(3HB) correspondente a 76% do peso seco celular, com produ-

Vol. 27, No. 4

Estratgias de Cultivo para Produo dos Plsticos Biodegradveis

619

tividade de 2,42 g/L , em 50 h. Testaram ainda a limitao de nitrognio quando a biomassa era de 90 g/L, j que obtiveram os melhores resultados quando a limitao ocorreu na maior concentrao de biomassa, porm a cultura mostrou-se instvel, com baixa concentrao de polmero, devido a causas desconhecidas pelos autores. Uma cultura sem o controle da concentrao de glicose tambm foi realizada para comparao dos resultados. Neste caso, a concentrao de glicose esteve entre 020 g/L e cada vez que o pH subia rapidamente como sinal da exausto da glicose, ela era adicionada para voltar a 20 g/L. Dessa forma obtiveram em 44 h, apenas 58 g/L de concentrao celular com 10 g/L de P(3HB), sendo que a limitao de nitrognio ocorreu quando a biomassa era de aproximadamente 45 g/L. Assim, pode-se obter alta concentrao e produtividade de P(3HB) em culturas de A. eutrophus, controlando a concentrao de glicose e o momento da limitao do nutriente. Culturas de A. eutrophus NCIMB 11599 em fermentador de 60 L, regime de batelada alimentada com alta densidade de clulas, foram estudadas por Ryu et al.38. Eles utilizaram limitao em fosfato em vez de nitrognio e controlaram a concentrao de glicose, que ficou entre 0 20 g/L, pela concentrao de oxignio dissolvido. Investigaram tambm o efeito da concentrao inicial de fosfato na produo do polmero. Em todos os casos, o teor final de P(3HB) obtido foi de 80% do peso seco celular. Entretanto, a cultura com maior concentrao de fosfato inicial, 5,5 g/L, foi a que produziu maior concentrao de biomassa e de P(3HB), resultando em 281 g/L de biomassa e 232 g/L de P(3HB) com produtividade de 3,14 g/L h em 75 h. Dessa forma, os autores mostraram que a quantidade de clulas e P(3HB) produzida pode ser maior com o aumento da concentrao inicial de fosfato. Para comparao de resultados, os autores tambm avaliaram uma cultura nas mesmas condies, porm com limitao em nitrognio. Entretanto, no conseguiram alta densidade de clulas devido significante lise das mesmas, causada pela toxicidade da soluo de NaOH excessivamente adicionada para controle de pH. No caso de limitao em fosfato, a soluo utilizada para controle de pH foi amnia e as clulas mantiveram boas condies durante toda a fermentao, sem lise, o que pode ter contribudo para a produo de P(3HB) com alta produtividade38. Choi et al.39 estudaram a produo de P(3HB) por E. coli recombinante XL1-Blue(pJC4) contendo genes de biosssntese de PHA de A. latus. A cultura foi realizada em batelada alimentada com glicose como fonte de carbono. Ao final, foram obtidos 194,1 g/L de concentrao de biomassa, 141,6 g/L de P(3HB), correspondendo a 73% de polmero, com alta produtividade de 4,63 g/L h. Assim, os autores relataram que E. coli recombinante pode ser usada para produo de P(3HB), com alto nvel de competitividade econmica. Produo do copolmero P(3HB-co-3HV) Uma vez que o P(3HB) um material rgido e quebradio, a incorporao de unidades 3HV responsvel pela melhoria das caractersticas do copolmero P(3HB-co-3HV). Como resultado da incorporao de unidades 3HV, ocorrem alteraes de parmetros, como nveis de cristalinidade e ponto de fuso, acarretando na diminuio da rigidez do polmero e no aumento da resistncia ao impacto. Teores de 3HV entre 17 e 20 mol% permitem a obteno de um produto com propriedades termoplsticas, que levam maior aplicao do polmero40. A partir de fontes de carbono como glicose e frutose, Ralstonia eutropha produz apenas o homopolmero 3HB. Para a produo do copolmero, so necessrios precursores como cido propinico ou valrico, que podem ser metabolizados a unidades 3HV7. Utilizao de cido propinico como precursor de unidades 3HV A produo industrial do copolmero P(3HB-co-3HV) por R.

eutropha feita adicionando-se cido propinico cultura para a incorporao de unidades 3HV. O teor de 3HV incorporado ao polmero controlado pela variao da razo de glicose e cido propinico da alimentao. necessrio um controle apropriado da concentrao de propionato adicionado pois, se presente no meio em concentraes maiores que 0,1%, pode ser txico ao microorganismo e inibir a sntese do polmero7 . Entretanto, a frao de 3HV incorporada ao polmero geralmente baixa, uma vez que, alm de servir como co-substrato para unidades 3HV, o cido propinico tambm pode ser assimilado para o crescimento celular41. O cido propinico rpida e eficientemente degradado por clulas bacterianas, e seu uso, durante a fase de multiplicao celular, implica em maior desperdcio desse substrato, impedindo que ele cumpra seu principal papel nesse processo, ou seja, a sntese de unidades 3HV1. O baixo teor de P(3HB-co-3HV) e produtividade so atribudos ao efeito txico do co-substrato, s estratgias imprprias de alimentao do cido propinico42 e ao fato de que a maioria dos microorganismos apresenta baixo fator de converso de cido propinico em unidades 3HV43. Vrios estudos tm sido realizados no intuito de melhorar a produo de P(3HB-co-3HV). Ramsay et al.8 estudaram a produo do copolmero por R. eutropha DSM 545 a partir de glicose e cido propinico, utilizando uma razo de alimentao cido propinico/glicose (P/G) constante e igual a 0,33 mol/mol. Obtiveram 17 g/L de P(3HB-co-3HV) contendo 5 mol% de unidades 3HV com produtividade mxima de 0,74 g/L h. Relataram que 0,1 g de monmero de 3HV foram produzidos para cada grama de cido propinico metabolizado, correspondendo a uma converso molar de 0,074 mol3HV/molc.prop.. Kim et al.44 verificaram o efeito do cido propinico na produo de P(3HB-co-3HV) por A. eutrophus ATCC 17699 a partir de frutose e cido propinico, sob limitao de nitrognio. Relataram que o crescimento microbiano foi completamente inibido em concentraes de cido propinico maiores que 1,5 g/L e que a maior velocidade de produo de unidades 3HV (0,06 g/g h) foi obtida quando a concentrao de cido foi de 0,5 g/L. Realizaram culturas em batelada, mantendo essa concentrao tima de cido propinico durante a fase de acmulo, e obtiveram mais de 70% de polmero com frao de unidades 3HV de 50%. Kim et al.45 tambm analisaram a produo de copolmero em batelada alimentada, com controle on-line da concentrao de glicose. No momento da limitao em nitrognio, quando a biomassa era de 60-70 g/L, a soluo de alimentao foi alterada de glicose para uma mistura de glicose e cido propinico com razes P/G constantes variando de 0,17 a 0,52 (mol/mol). As concentraes de biomassa e P(3HB-co-3HV) finais diminuram conforme aumentou a razo P/G. O teor de P(3HB-co-3HV) e a produtividade tambm caram, de 74 para 56,5% e de 2,55 para 1,64 g/L h, respectivamente, com o aumento de P/G. A frao 3HV do copolmero aumentou continuamente at 14,3 mol% com o acrscimo de P/G, entretanto, a converso de cido propinico em 3HV caiu de 0,344 para 0,293 g3HV/gc.prop.. Estes autores sugeriram que o baixo contedo de PHA obtido com o aumento de P/G se deve ao fato de que a maior quantidade de cido propinico inibiu a sntese do polmero. A produo de P(3HB-co-3HV), com R. eutropha DSM 545 a partir de glicose e propionato de sdio em batelada alimentada com limitao de nitrognio e baixa concentrao de oxignio dissolvido, foi estudada por Lefebvre et al.46. A adio de glicose e propionato de sdio foi feita de maneira descontnua, atravs de pulsos. Quando o teor de oxignio dissolvido foi mantido entre 1 e 4% de saturao de ar durante a fase de acmulo, a frao molar de 3HV obtida no polmero foi de 27-31 mol% e a converso de propionato em 3HV foi de 0,48 a 0,73 mol3HV/molprop., enquanto no experimento controle com 5070%

620

Squio e Arago

Quim. Nova

de saturao de ar obtiveram-se valores menores, com 21 mol% de 3HV e converso de propionato em 3HV de 0,25 mol3HV/molprop.. Ambos experimentos resultaram em teor de PHA de 7580% do peso seco celular, entretanto, a produtividade foi um pouco menor com a utilizao de baixas concentraes de oxignio dissolvido. Os autores citam que foi anteriormente demonstrado por Doi et al.47 que, durante a fase de acmulo do copolmero, R. eutropha incorpora o on propionato, via propionil-CoA a unidades 3HV aps sua condensao com acetilCoA, enquanto as unidades 3HB so formadas pela condensao de duas molculas de acetil-CoA. No entanto, propionil-CoA pode perder um grupo carbonil gerando acetil-CoA, liberando CO2 e assim resultando em unidades 3HB. Sendo que essa converso de propionilCoA a acetil-CoA requer 1,5 mol de oxignio por mol de propionilCoA, Lefebvre et al.46 sugerem que a baixa concentrao de oxignio dissolvido utilizado no estudo, limitou a descarbonilao do propionilCoA, fazendo com que melhorasse sua converso a unidades 3HV. Do ponto de vista econmico, esta estratgia levaria reduo de custos de produo, uma vez que necessitaria de menos aerao durante toda a fase de acmulo, alm de melhorar a converso de propionato em 3HV, cujo custo elevado para ser usado para produo de biomassa ou de unidades 3HB. Marangoni48 estudou diferentes estratgias de alimentao de cido propinico em diferentes substratos na produo de P(3HB-co3HV) com R. eutropha DSM 545, em batelada alimentada. Quando utilizou soro de leite, a estratgia de alimentao do cido propinico por pulsos obteve baixa produtividade porm, com grande frao de unidades 3HV, cerca de 38%, com converso de propionato em 3HV de 0,22 mol3HV/molc. prop., sugerindo a possibilidade da existncia de precursores de 3HV no soro. Com acar invertido, utilizou alimentao de cido propinico como regulao de pH, em pulsos de 1 g/L e de forma contnua, sendo que as fraes molares de 3HV obtidas foram 17,5 e 26 mol% 3HV, respectivamente. Quanto aos fatores de converso foi obtido 0,03 mol3HV/molc. prop. para as estratgias de regulao de pH e pulsos, e 0,13 mol3HV/molc. prop. para a alimentao contnua, mantendo a concentrao de cido propinico em 0,4 g/L no meio. Os efeitos de diferentes estratgias de alimentao de cido propinico na produo de P(3HB-co-3HV), com R. eutropha a partir de glicose e limitao em nitrognio, foram estudados por Du et al.42. Experimentos em frascos agitados revelaram que o momento e a concentrao de cido propinico adicionado tm efeitos significantes no crescimento celular, na sntese de copolmero e na frao 3HV. Segundo os autores, quando o cido propinico foi adicionado muito cedo, na fase de crescimento, inibiu o crescimento celular e o acmulo de polmero, especialmente em altas concentraes devido ao seu efeito txico, resultando em baixas concentraes de biomassa residual e concentrao de polmero. Por outro lado, quando a adio foi muito tardia, grande quantidade de P(3HB) j havia sido sintetizada pelas clulas e a incorporao de 3HV foi relativamente baixa, pois a diminuio da sntese de polmero levou fraca utilizao do cido propinico. O momento timo de adio do cido foi, ento, no incio da limitao de nitrognio e acmulo de polmero. Neste caso, houve alta concentrao de polmero com alta frao 3HV ao mesmo tempo. Em geral, com o aumento da concentrao de cido adicionado, houve aumento da frao 3HV porm a biomassa residual, a concentrao de copolmero produzido e a converso em unidades 3HV decresceram. Nos experimentos em batelada alimentada, Du et al.42 utilizaram a alimentao contnua de cido propinico e glicose (P/G) na fase de acmulo, pois a adio em pulsos poderia causar uma elevada concentrao pontual no meio, levando inibio do crescimento celular e da formao de polmero. A fonte de nitrognio foi adicionada de forma a manter no meio uma razo carbono/nitrognio igual

a 50. Dessa forma, utilizaram-se diferentes razes de alimentao P/G. Uma baixa razo P/G=0,1 levou a altas concentraes de biomassa, teor de P(3HB-co-3HV) e produtividade, porm baixa frao de unidades 3HV. Uma maior razo P/G= 0,2, por outro lado, resultou em alta incorporao de unidades 3HV porm, baixo teor de copolmero e produtividade. A velocidade especfica de produo de P(3HB-co-3HV) decresceu linearmente com o tempo, sendo que a maior velocidade foi obtida com menor P/G, e a queda de produo mais acentuada ocorreu em maior P/G, quando o acmulo de cido no meio pode ter inibido a sntese do polmero. A velocidade especfica de formao de 3HV foi maior inicialmente em maior razo P/G, na qual havia mais cido propinico inicial para a formao das unidades. Porm, o acmulo de cido no meio inibiu a atividade metablica, resultando em rpido declnio desta velocidade de formao. Os autores relatam que a capacidade das clulas utilizarem o cido propinico decresceu com o tempo, sendo que a alimentao em razes P/G constantes pode resultar em acmulo de cido, fato que no s desperdia substrato caro como tambm inibe a sntese do polmero. Assim, a partir destes resultados, desenvolveram uma estratgia otimizada para a produo de copolmero. Nas primeiras 10 h de acmulo, utilizaram a maior razo de alimentao P/G, ou seja, 0,2, nas 15 h seguintes utilizaram P/G = 0,15 e nas ltimas 10 h utilizaram P/G = 0,1. Assim obtiveram 52,1 g/L de biomassa, 40,8 g/L de P(3HB-co-3HV), perfazendo um total de 78,3% do peso seco celular e frao molar de 3HV de 16,2 mol% com converso de 0,38 mol3HV/molc. prop.. Dessa forma, a estratgia otimizada levou minimizao do acmulo de cido propinico, aumento do teor de copolmero, da produtividade, com frao de 3HV em teores desejveis tcnica e comercialmente, sendo uma maneira simples e efetiva de produzir o copolmero sem desperdcio de cido propinico e com reduo de custos. Utilizao de suplementos nutricionais Alguns pesquisadores tm estudado o uso de suplementos nutricionais, como cido oleico no processo de produo do copolmero. Choi e Lee49 desenvolveram estratgias de cultura para produo de altas concentraes de P(3HB-co-3HV), com diferentes fraes de 3HV por E. coli recombinante contendo genes de biossntesde de PHA de A. latus. Utilizando apenas glicose e cido propinico (20mM), obtiveram baixo teor de PHA (42,5%) com 10 mol% 3HV, converso de cido propinico em 3HV de 0,23 g3HV/gac. prop. e grande acmulo de cido propinico no meio, o que pode ter sido a razo para o relativo baixo teor de PHA obtido. Para estimular a assimilao do cido propinico, foram feitos experimentos utilizando induo com cido actico e/ou suplementao com cido oleico. A induo com cido actico a utilizao do mesmo como a nica fonte de carbono at determinado crescimento microbiano, quando ento se adicionam glicose e cido propinico. Neste caso, obtiveram 62,1% de PHA com 15,3 mol% 3HV. No caso da suplementao com cido oleico, os autores relatam a produo de menos polmero (41,8%), porm com maior frao de unidades 3HV (19,3 mol%). Em ambos os casos, mesmo em menor proporo, houve acmulo de cido propinico no meio. Quando utilizaram cido propinico na concentrao de 10 mM, cido actico e cido oleico, obtiveram 71,4% de polmero com 14,8 mol% de 3HV, entretanto, os melhores resultados foram obtidos quando se utilizaram concentraes ainda menores de cido propinico (5 mM) para reduzir o acmulo, alm da induo com cido actico e suplementao com cido oleico. Neste caso, os autores obtiveram em 55 h, 203,1 g/L de concentrao celular, 158,8 g/L de P(3HB-co-3HV) correspondente a 78,2% do peso seco com 10,6 mol% de 3HV. O fator de converso de cido propinico em unidades 3HV obtido foi de 0,47 g3HV/gac. prop, com

Vol. 27, No. 4

Estratgias de Cultivo para Produo dos Plsticos Biodegradveis

621

produtividade de 2,88 g/L h. Assim, usando soluo de alimentao com baixa concentrao de cido propinico, foi possvel obter alta concentrao e teor de polmero, porm com menor frao de 3HV. A induo com cido actico aumentou a concentrao de clulas, de polmero e a produtividade, enquanto a suplementao com cido oleico levou, principalmente, ao aumento da frao 3HV no polmero. A converso do cido propinico em unidades 3HV aumentou bastante com as estratgias utilizadas. A influncia da utilizao do cido oleico como suplemento nutricional na produo de P(3HB -co-3HV) em culturas de R. eutropha DSM 545, a partir de acar invertido, foi estudada por Marangoni et al.50. Obtiveram aumento da produtividade do polmero de 0,14 para 0,28 g/L h e, tambm, aumento de polmero acumulado, de 18,3 para 28,3%, com a suplementao de cido oleico. Entretanto, ao contrrio de Choi e Lee49, obtiveram menor frao de unidades 3HV, com igual converso de cido propinico. Assim, relataram que o cido oleico atuou como indutor de unidades 3HB, j que gera principalmente acetil-CoA, aumentando a produo de polmero, sem alterar a converso do cido propinico. Utilizao de microorganismos recombinantes incapazes de crescer em cido propinico O cido propinico adicionado como co-substrato precursor de unidades 3HV na produo do copolmero, porm, somente uma pequena frao dele incorporada dessa forma ao biopolmero, sendo que o restante desviado para outras rotas metablicas, como crescimento celular e formao de unidades 3HB. Como o cido propinico ou o propionato de sdio so bem mais caros que as outras fontes de carbono que podem ser consumidas pelos microorganismos durante a fermentao, a otimizao do seu aproveitamento na forma de unidades 3HV no copolmero de grande importncia na reduo dos custos de produo43. Lee et al.41 desenvolveram, a partir de A. eutrophus NCIMB 11599, uma cepa mutante A. eutrophus BK-23, que incapaz de assimilar o cido propinico para o crescimento celular. As duas cepas foram comparadas quanto habilidade de acumular P(3HB-co-3HV) e composio do polmero produzido. Os experimentos foram realizados em batelada alimentada utilizando a razo de alimentao P/G de 0,21 e limitao em nitrognio. Nveis finais similares de contedo de clulas e de copolmero foram obtidos para as culturas, entretanto, observou-se para a cepa mutante, uma frao de unidades 3HV duas vezes maior (22 mol%), enquanto para a cepa original foi menor que 10 mol%. A taxa de converso de cido propinico em unidades 3HV durante a fase de acmulo foi de 0,4 g3HV/gac. prop. para a mutante, contra 0,1 g3HV/gac. prop. para a cepa original. Assim, os autores relataram que com essa cepa torna-se possvel produzir P(3HB-co-3HV) com maior frao de unidades 3HV, usando menos cido propinico. Em estudo semelhante, Sartori51 obteve uma cepa mutante A. eutrophus UV1, derivada de R. eutropha DSM 545, incapaz de crescer em propionato, visando seu melhor aproveitamento para a biossntese das unidades 3HV do copolmero. A cepa mutante UV1 acumulou 37 mol% de 3HV, enquanto a cepa original acumulou apenas 8,6 mol% e se mostrou capaz de converter 60,7% de todo o propionato fornecido a unidades 3HV, sendo que, nas mesmas condies, a cepa original s converteu 18,5%. Alm disso, a cepa mutante ainda mantm, ou at supera, a capacidade de produo de polmero total da cepa original. Dessa forma, esse novo mutante apresentado como tendo um timo potencial de aproveitamento industrial. Outro microorganismo que est sendo estudado para a produo de PHAs Burkholderia sp52. Burkholderia sp. IPT 101 apresentada como boa produtora de polmero, entretanto, a converso de cido propinico em unidades 3HV restrita a menos de 10% do rendimento mximo terico, que de 1,35g 3HV/g cido propinico

de acordo com Gomez et al.18. No intuito de aumentar essa eficincia de converso e utilizao do cido propinico, Silva et al.43 desenvolveram mutantes da Burkholderia sp IPT 101 incapazes de crescer em cido propinico, mas ainda capazes de acumular unidades 3HV do cido. A mutante Burkholderia sp. IPT 189 e a cepa original foram comparadas crescendo em biorreator com razo de alimentao de cido propinico e sacarose (P/S) de 0,44 para a cepa original e de 0,09 para a mutante, j que era esperado que a mutante tivesse melhor utilizao do cido propinico. Com a mutante IPT 189 obtiveram uma alta taxa de converso de cido propinico em unidades 3HV, de 1,2 g3HV/gac. prop., enquanto para a cepa original obtiveram apenas 0,05 g3HV/gac. prop.. Entretanto, as clulas acumularam pouco polmero, sendo cerca de 50% para a IPT 189 e 65% para a IPT 101. Os autores sugerem que a elucidao dos mecanismos de decrscimo do acmulo de PHA na cepa mutante pode levar a novos rumos para garantir a reduo de custos na produo de P(3HB-co-3HV) usando esta mutante e aplicando estratgias adequadas de cultivo. CONSIDERAES FINAIS As estratgias de produo de P(3HB) e de P(3HB-co-3HV) aqui abordadas, alm de levarem reduo dos custos de produo dos polmeros, tambm podem contribuir como base para novas pesquisas e desenvolvimentos na rea. Sendo a matria-prima responsvel por grande parte do custo dos PHAs, a utilizao de substratos mais baratos uma importante estratgia para reduzir os custos de produo. Nesta rea, o Brasil apresenta grande potencial de competitividade, com o uso dos derivados da cana-de-acar. O uso desses substratos e a utilizao de outras estratgias complementares levam significante reduo dos custos de produo de PHAs. O momento da aplicao da limitao de nutriente exerce grande influncia sobre a produo de polmero e a alimentao do elemento limitante, durante a fase de acmulo, permite obter maior contedo de polmero e produtividade. Quanto aos elementos limitantes, o fsforo apresenta melhores resultados com R. eutropha e o oxignio melhora a produo por E. coli recombinante. Na produo do copolmero, um dos fatores importantes a razo P/G. O aumento dessa razo leva obteno de maior frao de unidades 3HV, porm s custas da diminuio do contedo total de polmero e da produtividade. necessrio utilizar uma razo prxima a 0,2 que resulte, ao mesmo tempo, em um copolmero com frao de 3HV desejada tecnicamente e com maior contedo de polmero e produtividade, para que seja economicamente vivel. O cido propinico, sendo um co-substrato de alto custo, precisa ser eficientemente convertido a unidades 3HV para no ser desperdiado. Algumas estratgias desenvolvidas nessa rea indicam que baixas concentraes de oxignio dissolvido durante a fase de acmulo por R. eutropha resultam em melhor aproveitamento do cido propinico em unidades 3HV, ou seja, maiores fatores de converso. Ainda a utilizao de suplementos nutricionais como cido oleico aumenta a frao 3HV e a converso do cido propinico em E. coli recombinante. A utilizao de microorganismos incapazes de crescer em cido propinico aumentou bastante a converso do cido em unidades 3HV e parece ser um caminho bem promissor na busca da reduo de custos na produo do copolmero. Dessa forma, o desenvolvimento de melhores estratgias de produo de PHAs est conseguindo, aos poucos, diminuir os seus custos, tornando-os mais competitivos. Este fato, aliado necessidade de preservao ambiental, maior conscientizao da populao e s importantes e diferenciais caractersticas dos PHAs, permitir que, em futuro prximo, seu uso seja ampliado e os plsticos biodegradveis possam estar presentes nas mais diversas aplicaes.

622

Squio e Arago

Quim. Nova

REFERNCIAS
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. Gomez, J. G. C.; Bueno Netto, C. L.; Rev. Bras. Eng. Qum. 1997, 17, 24. Braunegg, G.; Lefebvre, G.; Genser, K. F.; J. Biotechnol. 1998, 65, 127. Sudesh, K.; Abe, H.; Doi, Y.; Prog. Polym. Sci. 2000, 25, 1503. Madison, L. L.; Huisman, G. W.; Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1999, 63, 21. Dawes, E. A.; Senior, P. J.; Adv. Microbiol. Physiol. 1973, 10, 135. Lee, S. Y.; Tibtech 1996, 14, 431. Byrom, D.; Tibtech 1987, 5, 246. Ramsay, B. A.; Lomaliza, K.; Chavarie, C.; Dub, B.; Bataille, P.; Ramsay, J.; Appl. Environ. Microbiol. 1990, 56, 2093. Brmer, C. O.; Vandamme, P.; Silva, L. F.; Gomez, J. G. C.; Steinbchel, A.; Int. J. Syst. Bacterior. Evol. Microbiol. 2001, 51, 1709. Williams, S. F.; Martin, D. P.; Horowitz, D. M.; Peoples, O. P.; Int. J. Biol. Macromol. 1999, 25, 111. Hnggi, U. J.; FEMS Microbiol. Rev. 1995, 16, 213. Lee, S. Y.; Biotechnol. Bioeng. 1996, 49, 1. Choi, J.; Lee, S. Y.; Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999, 51, 13. Nonato, R. V.; Mantelatto, P. E.; Rossell, C. E.; Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001, 57, 1. http://www.ipt.br/imprensa/midia/?ID=260, acessada em Novembro 2002. http://www.ipt.br/imprensa/midia/?ID=962, acessada em Novembro 2002. Fava, A. L. B.; Dissertao de Mestrado, Universidade de So Paulo, Brasil, 1997. Gomez, J. G. C.; Rodrigues, M. F. A.; Alli, R. C. P.; Torres, B. B.; Bueno Netto, C. L.; Oliveira, M. S.; Silva, L. F.; Appl. Microbiol. Biotechnol. 1996, 45, 785. Yamane, T.; Biotechnol. Bioeng. 1993, 41, 165. Wang, F.; Lee, S. Y.; Appl. Environ. Microbiol. 1997, 63, 3703. Grothe, E.; Moo-Young, M.; Chisti, Y.; Enzyme Microb. Technol. 1999, 25, 132. Liu, F.; Li, W.; Ridgway, D.; Gu, T.; Biotechnol. Lett. 1998, 20, 345. Beaulieu, M.; Beaulieu, Y.; Mlinard, J.; Pandian, S.; Goulet, J.; Appl. Environ. Microbiol. 1995, 61, 165. Pinto, R. O.; Dissertao de Mestrado, Universidade Federal de Santa Catarina, Brasil, 1999. Marangoni, C.; Furigo Jr., A.; Arago, G. M. F.; Braz. J. Chem. Eng. 2001, 18, 175. Wong, H. H.; Lee, S. Y.; Appl. Microbiol. Biotechnol. 1998, 50, 30. Kim, B. S.; Enzyme Microb. Technol. 2000, 27, 774. Ahn, W. S.; Park, S. J.; Lee, S. Y.; Appl. Environ. Microbiol. 2000, 66, 3624.

19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28.

29. Marangoni, C.; Furigo Jr. A.; Arago, G. M. F.; Process Biochem. 2002, 38, 137. 30. Fukui, T. E; Doi, Y.; Appl. Microbiol. Biotechnol. 1998, 49, 333. 31. Bitar, A. E; Underhill, S.; Biotechnol. Lett. 1990, 12, 563. 32. Suzuki, T.; Yamane, T.; Shimizu, S.; Appl. Microbiol. Biotechnol. 1986, 24, 366. 33. Arago, G. M. F.; These Doctorat , Linstitut National des Sciences Appliquees de Toulouse, France, 1996. 34. Arago, G. M. F.; Lindley, N. D.; Uribelarrea, J. L.; Pareilleux, A.; Biotechnol. Lett. 1996, 18, 937. 35. Squio, C. R.; Marangoni, C.; De Vecchi, C.; Arago, G. M. F.; Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003, 61, 257. 36. Wang, F.; Lee, S. Y.; Appl. Environ. Microbiol. 1997, 63, 4765. 37. Kim, B. S.; Lee, S. C.; Lee, S. Y.; Chang, H. N.; Chang, Y. K.; Woo, S. I.; Biotechnol. Bioeng. 1994, 43, 892. 38. Ryu, H. W.; Hahn, S. K.; Chang, Y. K.; Chang, H. N.; Biotechnol. Bioeng. 1997, 55, 28. 39. Choi, J.; Lee, S. Y.; Han, K.; Appl. Environ. Microbiol. 1998, 64, 4897. 40. Holmes, P. A.; Phys. Technol. 1985, 16, 32. 41. Lee, S. Y.; Kim, G. J.; Choi, D. K.; Yeon, B. K.; Park, Y. H.; J. Ferment. Bioeng. 1996, 81, 255. 42. Du, G. C.; Chen, J.; Yu, J.; Lun, S.; Biochem. Eng. J. 2001, 8, 103. 43. Silva, L. F.; Gomez, J. G. C.; Oliveira, M. S.; Torres, B. B.; J. Biotechnol. 2000, 76, 165. 44. Kim, J. H.; Kim, B. G.; Choi, C. Y.; Biotechnol. Lett. 1992, 14, 903. 45. Kim, B. S.; Lee, S. C.; Lee, S. Y.; Chang, H. N.; Chang, Y. K.; Woo, S. I.; Enzyme Microb. Technol. 1994, 16, 556. 46. Lefebvre, G.; Rocher, M.; Braunegg, G.; Appl. Environ. Microbiol. 1997, 63, 827. 47. Doi, Y.; Kunioka, M.; Nakamura, Y.; Soga, K.; Macromolecules 1987, 20, 2988. 48. Marangoni, C.; Dissertao de Mestrado, Universidade Federal de Santa Catarina, Brasil, 2000. 49. Choi, J. E.; Lee, S. Y.; Appl. Environ. Microbiol. 1999, 65, 4363. 50. Marangoni, C.; Furigo Jr., A.; Arago, G. M. F.; Biotechnol. Lett. 2000, 22, 1635. 51. Sartori, D. M.; Dissertao de Mestrado, Universidade de So Paulo, Brasil, 1998. 52. Gomez, J. G. C.; Fontolan, V.; Alli, R. C. P.; Rodrigues, M. F. A.; Bueno Netto, C. L.; Silva, L. F.; Simes, D. A.; Rev. Microbiol. 1997, 28, 43.