Testes Sorolgicos

1- Precipitao
Baseada nos precipitados formados pela reao antgeno-anticorpo,
A precipitao mxima quando a quantidade de Ag e Ac so
equivalentes (precipitados formados podem dissolver quando expostos a excesso de
reagentes, devido reversiilidade da reao!,
1.1- Imunodifuso
"ifuso# processo pelo qual a sust$ncia transportada, de um lado para
outro, como resultado do movimento molecular ao acaso%
& taman'o dos imunoprecipitado formados fica maior que o di$metro
dos poros da fase fixa e evita-se a difuso dos complexos Ag-Ac%
1.1.1- Tipo de imunodifuso:
Iminodifuso simples em uma dimenso#
o Ac incorporado ao agar, sendo esta mistura colocada em um tuo at
formar uma coluna% Ap(s a gelificao, o Ag colocado no topo do tuo%
&s tuos so selados para evitar evaporao e colocados em temperatura
constante durante um perodo, geralmente uma semana,
Dupla imunodifuso#
o )recipitao ocorre na regio de equival*ncia, perpendicular lin'a
de eixo entre os orifcios, apresenta so a forma de lin'a ou arco de
precipitao%
o +eali,ao# coloca-se uma fina camada de gar nas placas de )etri,
ap(s gelificao fa, orifcios onde so colocados Ag e Ac e incuada em
c$mara -mida por ./-0/ ', a 1234%
o Aus*ncia de Ag ou Ac indicada pela aus*ncia de lin'a%
o 5ensiilidade aixa e limita-se a deteco de complexos Ag-Ac em
que ' precipitao%
Imunodifuso radial simples#
o 6gar misturado com diluio apropriada do Ac especfico e
colocados em placa de )etri% 5o feitos orifcios onde coloca as solu7es
de Ag a serem testadas 8 pelo menos tr*s dilui7es diferentes e um
padro% 9ncuado em c$mera -mida% :avendo precipitao, o di$metro
do 'alo correlaciona com a concentrao do Ag%
1.2- Tcnica que utiliam eletroforese
;letroimunodifuso#
;letroimunodifuso simples unidimencional (Ac incorporado ao gel,
colocado em l$mina% & p: secol'ido de forma que os Ag fiquem com
carga negativa e os Ac no migrem% )adro de precipitao assemel'a a
foguete e caudo proporcional concentrao do Ag!,
;letroimunodifuso dupla unidimencional (Ag e Ac migram,
simultaneamente, em dire7es opostas a partir de orifcios iniciais,
resultando em precipitao em ponto intermedirio!,
9munoeletroforese,
+eali,ado em duas etapas# a! separao dos componentes por
eletroforese, ! imunodifuso de cada componente, a partir do seu
centro de difuso, contra o anti-soro especfico, (formando lin'a ou
arco de precipitao!%
2- !glutinao
4aracteri,a-se pela formao de agregados visveis como resultado da
interao de Ac especficos e partculas insol-veis que cont*m determinantes
antig*nicos em sua superfcie,
Aglutinao direta# ocorre com partculas que apresentam determinantes
antig*nicos naturais em sua superfcie ('emcias, actrias, proto,orios!,
Aglutinao indireta ou passiva# ocorre com partculas inertes (partculas
de ltex, poliestireno, entonita! ou mesmo com clulas antigenicamente no
relacionadas ('emcias, actrias! s quais se adsorvem ou fixam antgenos
sol-veis%
5e possuir elevado ttulo de Ac aglutinantes, pode-se oservar o
fen<meno de pro,ona, otendo falsos reultados negativos% ;ste efeito
eliminado empregando-se dilui7es seriadas do soro%
=12.>?@=>%doc .
2.1- Teste da aglutinao "ireta
&s testes para detectar Ac especficos so reali,ados empregando
dilui7es em srie do Ac, frente a uma quantidade constante de Ag,
& resultado geralmente expresso como ttulo do anti-soro (mxima
diluio que ocorre aglutinao!,
;mpregado# tipagem de grupos sanguneos do sistema AB& e +'%
2.2- Teste de ini#io da $emaglutinao direta
Baseado na capacidade que certos antgenos virais t*m de,
espontaneamente, aglutinarem certos tipos de 'emcias,
&s Ac, se presentes, revestem as partculas virais, resultando na iniio
da aglutinao, indicando teste positivo para presena de Ac,
Ao distinguem entre 9gB e 9gC,
;mpregado# detectar Ac contra os vrus da ruola, sarampo, influen,a e
certos enterovirus%
2.%- Teste de $emaglutinao passi&a
)rotenas podem ser adsorvidas a 'emcias tratadas com cido t$nico e
podem ser aglutinadas por Ac especficos,
;mprega 'emcias de carneiro ou 'umanos do grupo &,
Deste considerado positivo# verifica formao de tapete corindo o fundo
da cavidade da placa em EFG (ttulo ser a mxima diluio em que se oserva a
formao de tapete!,
Deste considerado negativo# 'emcias sedimentam formando EotoG
compacto%
;mpregado# sistemas comerciais para pesquisa de Ac para Trypanosoma
cruzi, Treponema pallidum (sfilis!, Toxoplasma gondii, etc%
2.'- Teste de ini#io de $emaglutinao passi&a
Baseia-se na competio, pelos stios de cominao do Ac, entre o Ag
fixado 'emcia e o Ag sol-vel ou 'apteno,
& grau de iniio relaciona-se com a quantidade do Ag presente na
amostra e com a afinidade pelos stios de cominao do anticorpo,
;mpregado# deteco de Ag na 'epatite e na 'emofilia%
2.(- Teste de aglutinao do l)te*
)artculas de ltex so esferas de poliestireno utili,adas como suporte na
adsoro,
;mpregado na pesquisa de Ag ou ac,
Aplicao mais comum na deteco de fator reumat(ide#
o Anticorpo da classe 9gC dirigido contra 9gB, 9gA, 9gC e 9g;, tamm ' fator
reumat(ide da classe 9gB e 9gA%
o Auto-anticorpo poro Hc de 9gB, ocorrendo em doenas auto-imunes, em
processos agudos ou cr<nicos, em doenas reumticas, infecciosas, degenerativas!%
;mpregado# detectar Ag polissacardicos acterianos 8 Haemophilus
influenzae, Ricettsia sp, !taphylococcus aureus, "eisseria meningitidis,
estreptococos do grupo B, deteco de drogas, 'orm<nios# I-gonadotrofina
cori<nica'umana, pesquisa de Ac na ruola, protena 4%
2.+- Teste de aglutinao de cristais de colesterol
;mprega cristais de colesterol que so sensiili,ados com lecitina e
cardiolipina, para pesquisa de anticorpos na sfilis (F"+J!
"etecta Ac antilipdios que formam no 'ospedeiro como resposta ao material de
nature,a lipdica, lierado pelas clulas lesadas no incio da infeco e ao material lipdico
do pr(prio treponema%
Jeitura macrosc(pica contra fundo escuro, ap(s agitao#
o )ositivo# formao de fl(culos,
o Aegativo# aspecto 'omog*neo%
%- Teste de imunofluoresc,ncia
Ktili,ado para pesquisa de Ac e Ag,
Baseia na capacidade das molculas de Ac se ligarem covalentemente a
fluorocromos sem perder a reatividade especfica com Ag,
Ac marcado deve ser purificado, para aumentar efici*ncia e evitar
colora7es no especficas%
=12.>?@=>%doc =
%.1- Teste de imunofluoresc,ncia direta
;mpregado na pesquisa e locali,ao de Ag em clulas ou tecidos (por
intermdio de um Ac especfico marcado!,
Ac no ligado removido por lavagens,
& preparado oservado em microsc(pio de fluoresc*ncia,
Deste de elevada sensiilidade e especificidade, mas requer um
conLugado para cada sistema,
)rincipal aplicao# imunocitoqumica, pesquisa de #lamydia trachomatis,
Treponema pallidum, estreptococos I-'emolticos, etc!,
%.2- Teste de imunofluoresc,ncia indireta
;mpregado para amplificar o sinal e aumentar a sensiilidade,
%.2.1- Para pesquisa de !g
9ncuao da clula ou tecido em que se queira pesquisar Ag com o Ac
especfico,
Ap(s lavagem, a preparao incuada com conLugado
antiimunogloulina produ,ida em outra espcie animal,
%.2.2- Para pesquisa de !c
Ag padroni,ados so fixados em l$minas de vidro,
5oro do paciente diludo e incuado com Ag,
Ap(s lavagem, a preparao incuada com conLugado fluorescente (anti-
9g marcada, se 'ouver Ac no soro o conLulgado reage com Ac especfico para o Ag!,
)ode-se detectar 9g de determinadas classes e suclasses%
)ara pesquisa de 9gC, pode 'aver falso positivo, pois o fator reumat(ide
9gC e utili,a anti-9gC 8 quando a 9gB se liga ao Ag, exp7e novos stios
na poro Hc, aos quais 9gC se liga 8 necessrio asoro ou separao
do fator reumat(ide,
Deste de refer*ncia de muitas doenas,
%.2.%- Sistema a&idina#iotina
Dcnica de amplificao,
Avidina (glicoprotena derivada da alumina! possui alta afinidade por iotina
(vitamina do complexo B!,
Biotina contm domnio ativo que se liga a aminocidos, portanto se ligar
a Ac,
Avidina pode ser satura com fluorescena sem perder a afinidade pela
iotina,
Ap(s reao Ag-Ac no marcado, iotina marcada com segundo Ac
adicionada (como muitas molculas de iotina se liga ao Ac, ' amplificao do sinal! e
em seguida adicionado a avidina marvada com fluorescena,
'- Tcnicas Imunoenim)tica
Baseadas na utili,ao de Ag ou Ac marcados com en,imas e permitem a
deteco, titulao e quantificao de sust$ncias de interesse iol(gico%
'.1- Imunopero*idase
;mprega mesmo princpio da imunofluoresc*ncia, com a diferena de
que utili,a en,ima em ve, de fluorocromo,
A en,ima converte o crom(geno (sustrato M doador de eltrons! em
produto insol-vel (pode ser colorido! que precipita no stio de reao (sendo
visuali,ado ao microsc(pio (ptico!,
)ode ser utili,ada na pesquisa de Ac, como na imofluoresc*ncia indireta,
'.2- -nimaimunoensaio
N um mtodo quantitativo, em que a reao Ag-Ac monitorada por
medida da atividade en,imtica,
Fantagens# elevada sensiilidadeO utili,a reagentes estveisO pode ser
adaptado a testes simples como a automao,
'.2.1- -.IS! /-n0me-lin1ed immunosor#ent assa02
=12.>?@=>%doc 1
)rincpio sico a imoili,ao de um dos reagentes na fase s(lida,
enquanto o outro reagente pode ser ligado a uma en,ima, com preservao
tanto da atividade en,imtica como da imunol(gica do Ac,
Ap(s o desenvolvimento de cor, a determinao pode ser feita
visualmente para resultados qualitativos, ou medindo-se a densidade (ptica
da soluo, espectrofotometricamente,
'.2.1.1- -nsaio para anticorpos
!2 3todo Indireto
o )lacas plstica so sensiili,adas com Ag, reage com Ac da amostra,
o 4onLugado anti-9g 'umana reage com Ac capturado,
o +eao revelada com soluo crom(gena (reao interrompida e a
intensidade de cor estimada a ol'o nu ou fotometricamente!%
o Fantagens# utili,a um -nico conLugado para diferentes sistemasO
determinao de Ac de classes diferentes%
42 3todo de captura para anticorpo Ig3
o Hase s(lida sensiili,ada com anti-9gC especfico para regio Hc,
o 5oro teste incuado, 'avendo a captura de qualquer 9gC da
amostra,
o A seguir, incua-se com Ag marcado ou no marcado, seguido de Ac
especfico marcado%
o "eteco de 9gC pelo mtodo indireto pode 'aver resultado falso
positivo devido presena simult$nea de Ac 9gB e fator reumat(ide, que
pode reagir com conLugado anti-9gC%
o )ode ocorrer, tamm, falso negativo se 'ouver excesso de 9gB, que
competir pelos stios de ligao com maior afinidade%
'.2.1.2- -nsaios para ant5genos
!2 3todo de captura
o Hase s(lida sensiili,ada com anticorpo especfico,
o Amostra teste incuada com fase s(lida,
o A seguir, incua-se com excesso de Ac especfico marcado,
o +evela-se com adio do sustrato (taxa de degradao
proporcional concentrao do Ag!%
42 3todo de competio com ant5geno marcado
o )lacas sensiili,adas com Ac especfico,
o 9ncua as placas com conLugado Ag-en,ima e amostra (ou padro!,
o Ap(s oteno do equilrio, lava-se e incua com soluo do
sustrato da en,ima,
o +eao interrompida e fa, a leitura, espectrofomtrica (relao
inversamente proporcional concentrao de Ag!%
62 3todo da competio com anticorpo marcado
o Ag ligado placa e a ligao do Ac marcado competitivamente
iniida pelo Ag da amostra (ou padro!,
o "emais etapas semel'antes s mtodo da competio com anticorpo
marcado e densidade (ptica tamm inversamente proporcional%
"2 3todo da ini#io para $aptenos
o )lacas sensiili,adas com 'aptenos,
o 9ncuadas com amostra (pesquisa de 'aptenos! e Ac contra 'apteno,
o Ap(s lavagem adiciona anti-9g marcada com en,ima,
o Ao mesmo tempo executa um teste sem 'apteno e a diferena da
asor$ncia na amostra e na refer*ncia reflete o nvel de 'apteno%
=12.>?@=>%doc 0